Механизм работы CRISPR Cas. Применение в биотехнологии CRISPR Cas. Роль белков Cas в механизме CRISPR

Размещено на http://www.Allbest.Ru/

Министерство науки и высшего образования РФ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования

Московский политехнический университет

Факультет химической технологии и биотехнологии

Кафедра биотехнологии

КУРСОВАЯ РАБОТА

По учебной дисциплине: Основы биотехнологии

На тему:

Механизм работы CRISPR Cas. Применение в биотехнологии CRISPR Cas. Роль белков Cas в механизме CRISPR

Выполнила: Логинова Н.А.

Студентка 2 курса, группа: 191-542

Научный руководитель: к.х.н,

доцент Кудров А.Н.

Москва 2021



Содержание

Введение

1. Характеристика CRISPR систем

1.1 Характеристика CRISPR систем и их предназначение

1.2 Предназначение белка Cas 9 для систем CRISPR

1.3 Участие системы CRISPR в развитии адаптивного иммунитета

2. Механизм работы CRISPR систем

2.1 Приобретение спейсеров

2.2 Экспрессия и образование crРНК

2.3 Интреференция

3. Типы систем CRISPR

3.1 Характеристика систем CRISPR

3.2 Система CRISPR I типа

3.3 Система CRISPR II типа

4. Белок Cas 9

4.1 Описание и применение белка Cas 9

4.2 Белок Cas 9 в генной инженерии

5. Механизм геномного редактирования с помощью CRISPR-Cas9

6. Применение системы CRISPR в биотехнологии

Вывод

Заключение

Список литературы

Термины и понятия



Реферат

Курсовая работа 33 страницы, 6 глав, 29 литературных источников, 27 терминов и понятий.

Ключевые слова: CRISPR системы, CRISPR Cas9, Cas9.

Объектом курсовой работы является система CRISPR Cas9.

Цель курсовой работы: анализ всех типов систем CRISPR и белка Cas9, выявление его роли в механизме CRISPR, а также, анализ применения CRISPR-систем в биотехнологии.

Задачи:

1) Изучить типы систем, принцип организации и работы всех типов систем CRISPR.

2) Изучить строение и роль в механизме CRISPR белка Cas9.

3) Описать современные методы применения генетических изменений в клетках архей, бактерий и эукариот с помощью механизма CRISPR в биотехнологии.

Аннотация: В данной курсовой работе особое внимание акцентируется на характеристиках различных систем CRISPR, зависимости систем CRISPR от белков Cas, в том числе от Cas9. Выявлена роль CRISPR-систем в развитие адаптивного иммунитета. Описан механизм CRISPR по трем стадиям: приобретение спейсеров, экспрессия и образование crРНК, интерференция. Дана общая характеристика систем CRISPR Cas. Описано возникновение и эволюция этих систем. А также охарактеризованы системы: CRISPR I, II и III типа. Отдельно описан белок Cas 9 и его роль в приобретении адаптивного иммунитета в работе с системой CRISPR. Также, в данной работе, показано противодействие фагов CRISPR-системам. Приведены примеры использования данной методики редактирования генома в сельском хозяйстве, медицине, биотехнологии и эпидемиологии.



Введение

Актуальность исследования: До открытия функций и механизмов действия систем CRISPR-Cas в качестве методов для локус-специфичного редактирования генома наиболее интенсивно разрабатывались методы, основанные на использовании нуклеаз, содержащих цинковые пальцы (англ. Zinc-finger nucleases, ZFNs), а также эндонуклеазы TAL (англ. Transcription activator-like effector nuclease, TALEN). Эти методы довольно трудоёмки, не очень эффективны и дорогостоящи: для каждого нового локуса-мишени требуется разработка, экспрессия и проверка совершенно новой пары полипептидов, что значительно ограничивает область применения этих методов.

В 2012-2013 годах в генной инженерии появились принципиально новые методы манипулирования генетическим материалом, основанные на применении систем CRISPR-Cas. Данные методы пригодны для целенаправленного редактирования геномов как прокариот, так и эукариот (хотя последние не имеют собственных систем CRISPR-Cas, однако выяснилось, что искусственно введённые в эукариотную клетку элементы системы CRISPR-Cas бактериального происхождения способны функционировать и в новой среде).

CRISPR-Cas системы активно изучаются и на настоящий момент. Работа белков Cas имеет важное значение, особенно интересен именно белок Cas9, т.к. Cas9 выполняет проверку посредством раскручивания инородной ДНК и определения её комплементарности с двадцатью спаренными основаниями спейсера управляющей РНК. Если субстрат комплементарен управляющей РНК, Cas9 расщепляет чужую ДНК. В этом смысле механизм CRISPR-Cas9 имеет ряд параллелей с механизмом РНК-интерференции у эукариот. Безопасность практического применения данного метода определяется в том числе и тем фактом, является ли искомая последовательность двадцати спаренных оснований уникальной в модифицируемой ДНК.

Объект исследования: система CRISPR-Cas9.

Предмет исследования: Система CRISPR и ее тип CRISPR-Cas9.

Цель курсовой работы: анализ всех типов систем CRISPR и белка Cas9, выявление его роли в механизме CRISPR, а также, анализ применения CRISPR-систем в биотехнологии.

Задачи:

1) Изучить типы систем, принцип организации и работы всех типов систем CRISPR.

2) Изучить строение и роль в механизме CRISPR белка Cas9.

3) Описать современные методы применения генетических изменений в клетках архей, бактерий и эукариот с помощью механизма CRISPR в биотехнологии.



1. История открытия и изучения CRISPR

1.1 Определение CRISPR систем и их предназначение

CRISPR (от англ. clustered regularly interspaced short palindromic repeats - короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группам) - особые локусы бактерий и архей, состоящие из прямых повторяющихся последовательностей, которые разделены уникальными последовательностями (спейсерами). Спейсеры заимствуются из чужеродных генетических элементов, с которыми сталкивалась клетка (бактериофагов, плазмид). РНК, транскрибирующиеся с локусов CRISPR, совместно с ассоциированными белками Cas обеспечивают адаптивный иммунитет за счёт комплементарного связывания РНК с нуклеиновыми кислотами чужеродных элементов и последующего разрушения их белками Cas. Впрочем, к настоящему моменту имеется немало свидетельств участия CRISPR в процессах, не связанных с иммунитетом. [10]

Использование методик CRISPR-Cas для направленного редактирования геномов является перспективным направлением в современной генной инженерии. На 2016 год учёные широко используют подходы, основанные на системах CRISPR-Cas; возможно, в будущем эти подходы будут применять в медицине для лечения наследственных заболеваний. Также CRISPR-Cas имеет значение для адресной доставки лекарств и их высвобождения при внешнем воздействии - для этого используются материалы, в состав которых входят участки ДНК. [29]

Системы CRISPR-Cas различаются как структурно, так и функционально. Тем не менее, всем системам CRISPR-Cas присущ ряд общих черт. Локусы CRISPR могут выполнять функцию иммунитета только при наличии генов cas, которые обычно располагаются в непосредственной близости от CRISPR. Набор генов cas определяет тип системы CRISPR-Cas. Локусы CRISPR представлены короткими (обычно около 30-40 нуклеотидов длиной) прямыми повторами, которые отделяются друг от друга неповторяющимися спейсерами, произошедшими из ДНК тех чужеродных генетических элементов, с которыми сталкивалась клетка или её предшественники. Длина спейсеров обычно сопоставима с длиной повторов. Перед рядом повторов и спейсеров располагается лидерная последовательность, содержащая, как правило, промотор, с которого начинается однонаправленная транскрипция повторов и спейсеров CRISPR. Спейсеры полностью интегрированы в геном клетки и передаются её потомкам при делении. У бактерий интеграция новых спейсеров в геном сочетается с утратой избыточных и чужеродных генов; поэтому бактериям удаётся избежать значительного увеличения размера генома - в отличие от высших эукариот, у которых повторяющиеся последовательности, произошедшие из экзогенных генетических элементов, составляют существенную часть генома.[26]

Кроме структурного сходства, различные системы CRISPR-Cas объединяют три ключевых этапа работы CRISPR-опосредованного иммунитета: приобретение (англ. acquisition), или адаптация (англ. adaptation), экспрессия (англ. expression) и интерференция (англ. interference). На этапе приобретения в CRISPR встраивается новый спейсер, образованный из инородного генетического элемента, проникшего в клетку. На стадии экспрессии происходят транскрипция CRISPR и процессинг коротких CRISPR-РНК (crРНК), нацеленных на определённую мишень. В ходе интерференции рибонуклеопротеиновый комплекс crРНК-Cas распознаёт нуклеиновую кислоту-мишень за счёт комплементарного спаривания оснований мишени с crРНК, после чего разрезает мишень благодаря эндо- и/или экзонуклеазной активности белков Cas. [10]

Интересно, что работа систем CRISPR-Cas имеет много общих принципиальных моментов с работой иммунной системы млекопитающих. Так, иммунизацию CRISPR (то есть вставку нового спейсера) может вызвать даже дефектный бактериофаг - подобно тому, как иммунный ответ млекопитающих может развиться и при введении убитого патогена. [3]

Системы CRISPR-Cas могут передаваться от микроорганизма к микроорганизму с помощью горизонтального переноса генов. Противодействие вторжению в бактерию чужеродных генетических элементов не всегда оказывается полезным для бактерии. Например, у бактерии Staphylococcus epidermidis[en] может наблюдаться снижение устойчивости к антибиотикам, обусловленное уничтожением системой CRISPR-Cas тех конъюгативных плазмид, которые обеспечивали эту устойчивость. У Staphylococcus aureus пониженное количество локусов CRISPR приводит к увеличению числа профагов, плазмид и мобильных генетических элементов в клетке, что усиливает вирулентность бактерии. Впрочем, локусы CRISPR-Cas, препятствующие распространению полезных в данных условиях мобильных генетических элементов, могут исчезать. [3,5]

1.2 Зависимость систем CRISPR от белка Cas

Cas9 выполняет проверку посредством раскручивания инородной ДНК и определения её комплементарности с двадцатью спаренными основаниями спейсера управляющей РНК. Если субстрат комплементарен управляющей РНК, Cas9 расщепляет чужую ДНК. В этом смысле механизм CRISPR-Cas9 имеет ряд параллелей с механизмом РНК-интерференции (RNAi) у эукариот. Безопасность практического применения данного метода определяется в том числе и тем фактом, является ли искомая последовательность двадцати спаренных оснований уникальной в модифицируемой ДНК. [11]

1.3 Участие системы CRISPR в развитии адаптивного иммунитета

Несмотря на обнаружение систем CRISPR-Cas у самых разнообразных прокариот, о функциях CRISPR практически ничего не было известно вплоть до 2005 года. В 2005 году Мохика и его коллеги опубликовали результаты своих новых исследований, в которых было установлено, что спейсеры соответствуют последовательностям из геномов бактериофагов, а также участкам плазмид. Они также обнаружили, что штаммы E. coli, чьи локусы CRISPR содержат спейсер, соответствующий фагу Р1, устойчивы к этому фагу, и сделали вывод о связи локусов CRISPR с адаптивным иммунитетом прокариот. В том же году появились публикации ещё двух исследовательских групп, которые пришли к такому же заключению. [22]

В 2006 году была разработана классификация известных CRISPR и предложен возможный механизм работы основанного на CRISPR адаптивного иммунитета. В 2007 году исследовательской группой во главе с Филиппом Хорватом было окончательно установлено и экспериментально доказано участие CRISPR в обеспечении работы специфичного к последовательностям-мишеням адаптивного иммунитета; одновременно была выявлена ключевая роль белков Cas в этом процессе. За это достижение в 2015 году он был удостоен премии Мэссри (англ. Massry Prize) вместе с другими учёными, внёсшими значительный вклад в изучение CRISPR (Дженнифер Дудна и Эммануэль Шарпентье). В 2008 году было показано, что для работы системы CRISPR необходима особым образом процессированная CRISPR-РНК (crРНК), а также была продемонстрирована способность системы CRISPR осуществлять ДНК-интерференцию. Интерференция, направляющие РНК и нацеленность против специфических последовательностей ДНК - три открытия 2007-2008 годов, которые положили начало развитию основанных на CRISPR методов генетической инженерии. [28]



2. Механизм работы CRISPR систем

2.1 Приобретение спейсеров

Поскольку опосредованный CRISPR приобретённый иммунитет закодирован в ДНК, процесс иммунизации включает копирование и вставку чужеродных генетических элементов в CRISPR в качестве новых спейсеров. Спейсеры составляют иммунологическую память, в которой хранится информация о прошлых инфекциях, и именно она лежит в основе ответа на повторное вторжение сходных генетических элементов. Большая часть данных о молекулярных механизмах приобретения новых спейсеров получена при изучении системы CRISPR I типа Escherichia coli и II типа Streptococcus thermophilus[en]. Правильная ориентация и вставка нового спейсера происходит при участии последовательности, расположенной непосредственно выше первого повтора; таким образом, новые спейсеры добавляются к 5-концу локуса CRISPR. Интеграция нового спейсера в промежуток между лидерной последовательностью и первым повтором осуществляется комплексом Cas1-Cas2-протоспейсер. У некоторых систем CRISPR-Cas в этом процессе участвуют дополнительные белки. При вставке нового спейсера происходит дупликация повтора, за счёт чего сохраняется правильная структура локуса, который должен начинаться с повтора. [10]

Поскольку спейсеры передаются от предков к потомкам при делении клеток, при наличии схожих спейсеров можно устанавливать филогенетические связи между штаммами, имеющими общие предковые спейсеры, а также штаммами, имеющими новые, недавно приобретённые спейсеры. [6]

У систем I и II типа может происходить вставка спейсера лишь от тех инородных элементов, у которых к протоспейсеру прилегает особая последовательность PAM (англ. protospacer adjacent motif - мотив, смежный с протоспейсером). Кроме того, бактерия должна отличать инородный генетический материал от своего, чтобы не вставить в качестве спейсера фрагмент собственной хромосомы и не нацелить систему CRISPR-Cas на свой геном, что было бы для клетки фатальным. Система CRISPR-Cas I типа E. coli отличает свою ДНК по наличию Chi-сайтов[en] - 8-нуклеотидных мотивов, которые повторяются в её геноме в среднем каждые 5 тысяч пар оснований. [1] Хотя из одного и того же инородного генетического элемента можно образовать множество спейсеров, в генетическом элементе некоторые мотивы оказываются при выборе будущего спейсера более предпочтительными. Вероятно, такие мотивы были зафиксированы в результате естественного отбора, связанного с эффективностью работы спейсеров; так, некоторые спейсеры дают начало crРНК, нацеливающим белки Cas и на частично комплементарные последовательности. [10]

При столкновении с одним и тем же фагом разные клетки будут вставлять в качестве спейсера несколько отличающиеся фрагменты его генома, так что большие популяции, имеющие большое разнообразие спейсеров против одного и того же фага, оказывают более эффективное сопротивление: если фаг мутирует так, что один из имеющихся в популяции спейсеров станет неэффективен, то другие по-прежнему будут обеспечивать защиту. [3]

2.2 Экспрессия и образование crРНК

После интеграции в CRISPR частей чужеродных генетических элементов требуется перевести их в форму, способную нацеливать белки Cas на последовательности-мишени для их распознавания и разрушения. Такой формой служит направляющая crРНК, которая содержит уникальную последовательность, комплементарную определённой мишени. Сначала ряд повторов и спейсеров CRISPR транскрибируется в единый длинный транскрипт - пре-crРНК, который далее разрезается на короткие crРНК. Большинство повторов в CRISPR являются палиндромами, поэтому соответствующие им участки пре-crРНК формируют шпильки. Во многих случаях именно эти шпильки распознаются белками Cas, процессирующими пре-crРНК в crРНК. [28]

Как правило, транскрипция CRISPR зависит от лидерной последовательности и происходит постоянно, но с низкой скоростью. Однако скорость значительно увеличивается в стрессовых условиях или при столкновении клетки с фагами, обеспечивая ей быструю и эффективную защиту. Промоторные элементы были найдены не только в лидерной последовательности, но и в повторах. Несмотря на то, что за один раз может транскрибироваться весь локус, было показано, что некоторые спейсеры в локусе транскрибируются чаще других - в частности, таковы первые несколько спейсеров, располагающиеся после лидерной последовательности и первого повтора. Действительно, для клетки гораздо более выгодно иметь более сильную защиту от инвазивных элементов, с которыми она сталкивалась в недавнем прошлом, чем от тех, с которыми она встречалась давно. [10]

2.3 Интреференция

На стадии интерференции crРНК связываются со своими мишенями за счёт спаривания оснований и, таким образом, направляют эндонуклеазы Cas на разрезание и разрушение мишени. Формирование комплекса crРНК и белков Cas обеспечивает эндонуклеолитическое разрушение комплементарных crРНК последовательностей НК. Хотя мишенями, в основном, являются двуцепочечные ДНК (дцДНК), некоторые системы CRISPR-Cas могут разрушать комплементарные одноцепочечные РНК (оцРНК). Системы CRISPR-Cas, распознающие дцДНК, требовательны по отношению к соседним с протоспейсером последовательностям: в частности, в системах типов I и II распознаются только мишени, содержащие мотив PAM (требование наличия PAM может служить для защиты от разрезания системой CRISPR-Cas клеточного генома). У систем, работающих с оцРНК, подобных требований нет. После начальной эндонуклеолитической атаки (внесения разрыва в мишень), производимой Cas, дальнейшее разрушение мишени может происходить под действием других нуклеаз. [2]



3. Типы систем CRISPR

3.1 Общая характеристика систем CRISPR

Все известные системы CRISPR-Cas можно подразделить на два основных класса, 5 типов и 16 подтипов на основании наличия или отсутствия определённых генов cas, строения оперона cas, аминокислотных последовательностей белков Cas и механизмов, обеспечивающих работу CRISPR-опосредованного иммунитета. [10]

Кроме того, существует система CRISPR-Rx (CRISPR-CasRx), которая нацелена на РНК (в отличие от других CRISPR, в частности, CRISPR-Cas9, мишенью которой является ДНК). За счёт этого CRISPR-Rx может подавлять экспрессию гена при неизменном генетическом коде. [7]

Системы первого класса характеризуются мультибелковыми эффекторными комплексами (Cascade, Cmr, Csm). К этому классу относятся системы типов I, III и IV. Системы типа I являются наиболее распространёнными CRISPR-Cas-системами. Их мишенями служат дцДНК, содержащие мотив PAM, а разрушение осуществляет эффекторный мультибелковый комплекс Cascade, связанный с белком Cas3. Системы типа III часто встречаются у архей и характеризуются мультибелковыми комплексами Csm и Cmr. Они могут распознавать как ДНК, так и РНК, причём для распознавания ДНК нет необходимости в PAM. В системах этого типа разрушение мишеней осуществляет белок Cas10 вместе с эффекторными нуклеазами, а именно Cmr4 у подтипа IIIA (РНКаза, входящая в состав комплекса Cmr) и Csm3 у подтипа IIIB (РНКаза, входящая в комплекс Csm). Системы типа IV довольно редки, их распространение и механизм действия изучены недостаточно. [28]

Системы второго класса имеют единственный эффекторный белок. К этому классу относятся типы II и V. Системы типа II активно используются в генной инженерии; для них характерно наличие эндонуклеазы Cas9. В системах этого типа направляющей РНК выступает не одна crРНК, а дуплекс crРНК и дополнительной РНК - tracrРНК. Дуплекс crРНК:tracrРНК направляет никазные домены RuvC и HNH Cas9 для внесения разрывов с образованием тупых концов в ДНК-мишени, которая должна иметь PAM около 3'-конца. Системы типа V редки и характеризуются наличием нуклеазы Cpf1, которую crРНК направляет к ДНК-мишени. Эта RuvC-подобная нуклеаза производит разрез на участке, находящемся дистально от 3'-конца PAM. В отличие от Сas9 эта нуклеаза режет дцДНК с образованием не тупых, а липких концов длиной 5 нуклеотидов. [8]

В основу различения типов в рамках классов положена разница в эндонуклеазах:

Тип 1 - это эндонуклеаза Cas3, которая разрезает одну из двойных нитей вирусной ДНК.

Тип 2 - это Cas9, которая разрезает обе двойных нити ДНК.

Тип 3 - Cas10 (в определенных местах разрезает таргетную РНК).

Тип 4 - Csf1 (уничтожает двойную ДНК, но пока не известно, каким образом).

Тип 5 характеризуется Cas12, которая делает два надреза в двойной нити ДНК.

Тип 6 - Cas13 («крошит» однонитевую матричную РНК на множество мелких кусочков).

PAM участвуют в работе систем типа 1, 2, 5 и 6. Каждый из этих 6 типов имеет свои подразделения: сейчас различают 19 подтипов. [26]

3.2 Система CRISPR I типа

Системы I типа, и системы III типа используют мультибелковые эффекторные комплексы. Их также объединяет использование белка Cas6 для процессинга пре-crРНК (иногда его заменяет ортолог, Cas5). Эти и некоторые другие сходства между системами типов I и III говорят в пользу их происхождения от общего предка. Схема функционирования системы CRISPR-Cas I типа. Несколько белков Cas, в том числе Cas6 (пурпурный) и Cas7 (зелёный), но не Cas1 или Cas2, собираются в комплекс Cascade, связанный с пре-crРНК. Cascade разрезает транскрипт в области повтора на crРНК и остаётся связанным с образовавшейся молекулой crРНК. После связывания Cascade с ДНК-мишенью с ним связывается белок Cas3 - белок систем I типа. Он производит одноцепочечный разрыв в мишени, отсоединяется от Cascade и движется вдоль ДНК, внося дополнительные разрывы и разрушая её. [10]

Системы типа I подразделяют на шесть подтипов (I-A, I-B, I-C, I-D, I-E, I-F) на основании аминокислотных последовательностей белков эффекторного комплекса и взаимного расположения их генов (синтении). Наиболее изучена система подтипа I-E E. coli. [28]

В системах I типа эффекторный комплекс - Cascade - включает Cas6 в качестве интегральной субъединицы, так что процессинг crРНК происходит в пределах эффекторного комплекса, и зрелая crРНК остаётся связанной с ним. После этого комплекс ищет свою последовательность-мишень; при этом он, вероятно, сначала распознаёт её РАМ и лишь после этого проверяет ключевые позиции протоспейсера на комплементарность crРНК. Поскольку в повторах CRISPR нет PAM, геном бактерии, имеющей систему CRISPR-Cas I типа, надёжно защищён от разрушения этой системой. При связывании с Cascade протоспейсер в дцДНК-мишени образует R-петлю, для чего необходима отрицательная сверхспирализация; вероятно, это облегчает расплетание ДНК, независимое от нуклеотидтрифосфатов (НТФ). Комплекс Cascade-протоспейсер распознаётся белком Cas3. Cas3 имеет нуклеазный домен HD, а также расплетающий-транслоцирующий домен, для работы которого необходимы НТФ. Cas3 может расплетать дуплексы ДНК:ДНК и ДНК:РНК. Домен НD, как правило, располагается на N-конце Cas3. Домен HD вносит одноцепочечный разрыв в мишень вблизи РАМ, после этого Cas3 отделяется от Cascade и использует свой домен гидролиза нуклеозидтрифосфатов для дальнейшего продвижения вдоль ДНК, по пути внося дополнительные одноцепочечные разрывы. [2]

Структура Cascade (свободного и связанного с ДНК) E. coli была визуализирована с околоатомным разрешением. Мишень распознаётся за счёт Уотсон-Криковского спаривания оснований, хотя каждый шестой нуклеотид протоспейсера не комплементарен соответствующему нуклеотиду crРНК. В связи с этим общая геометрия комплекса ДНК с crРНК не соответствует двойной спирали: повторяющиеся полуспиральные витки дуплекса прерываются неспаренными основаниями, что позволяет ДНК перегнуться через crРНК, не обвиваясь вокруг неё. Связывание Cascade с мишенью и родственной ей последовательностью имеет разную кинетику и структурные особенности, что позволяет комплексу различать мишень и близкие к ней последовательности. В первом случае следует интерференция и разрушение мишени, а во втором - вставка нового спейсера. Такая направленная адаптация, в отличие от первичной, «наивной» адаптации, требует работы не только белков Cas1 и Cas2, но и Cas3. [10]

Помимо 6 подтипов систем I типа (I-A - I-F) известен ещё один подтип, I-U (U от англ. uncharacterized - неохарактеризованный, так как для него неизвестны механизм разрезания пре-crРНК и архитектура эффекторного комплекса). В отличие от большинства систем I типа, у белка Cas3 в I-U домен HD находится на С-конце. [28]

3.3 Система CRISPR II типа

Системы CRISPR-Cas II типа стоят особняком из-за своей необычной генетической основы и молекулярных механизмов. В частности, мультибелковые комплексы, осуществляющие процессинг crРНК в системах типов I и III, в системах типа II заменены единственным белком - Cas9, который принимает участие во всех трёх фундаментальных этапах работы этой системы. Таким образом, системы II типа - наиболее простой тип системы CRISPR-Cas. Более того, в биогенезе crРНК принимают участие дополнительные элементы, уникальные для систем II типа. Системы II типа встречаются только у бактерий и среди систем типов I, II и III являются самыми малораспространёнными. Тем не менее, именно системы II типа нашли применение в качестве средства для редактирования геномов. Среди систем II типа на основании наличия и последовательностей ассоциированных генов cas выделяют три подтипа: II-A, II-B и II-C. Помимо генов cas1 и cas2, присущих всем системам типов I-III, системы типа II имеют дополнительный ген cas9, который кодирует эндонуклеазу Cas9. Cas9 принимает участие в приобретении новых спейсеров, накоплении crРНК и интерференции. Помимо этого, системы II-A содержат ген csn2, чей белковый продукт принимает участие в приобретении спейсеров. В системах II-B этот ген заменён геном cas4, а системы II-C не имеют ни csn2, ни cas4. Длина Cas9 варьирует в разных подтипах, причём для систем II-C, как правило, характерны самые короткие ортологи. Коровая часть Cas9, которую составляют нуклеазный домен и характерный для этого белка обогащённый аргинином кластер, вероятнее всего, кодируется генами, произошедшими от мобильных генетических элементов, никак не связанных с CRISPR. Принимая во внимание значительное сходство в последовательностях аминокислот между Cas9 и его гомологами, которые не связаны с системами CRISPR-Cas, Cas9 нельзя рассматривать как в полном смысле сигнатурный белок систем II типа. Тем не менее, его можно считать отличительным признаком этих систем. [2]

Биогенез crРНК в системах II типа имеет ряд уникальных особенностей. В частности, для него необходим процессинг РНКазой III и связывание с пре-crРНК особых транс-кодируемых CRISPR-РНК (tracrРНК). В составе tracrРНК присутствует участок, комплементарный той области crРНК, которая была транскрибирована с повтора CRISPR. В ходе процессинга crРНК tracrРНК связывается с ещё не вырезанными crРНК в составе пре-crРНК, благодаря чему образуются зрелые crРНК. Получающийся в результате зрелый комплекс crРНК-tracrРНК-Cas9 содержит короткую crРНК, у которой 20-24 нуклеотида комплементарны 3'-концу спейсера и 20-24 нуклеотида комплементарны 5'-концу повтора. Первый этап процессинга пре-crРНК происходит в областях, комплементарных повторам CRISPR; в результате образуется 3'-конец crРНК. Последующая стадия обрезания 5'-конца неизвестными нуклеазами происходит внутри последовательностей, соответствующих спейсерам CRISPR. Для накопления crРНК в клетках необходим белок Cas9, хотя неизвестно, вызвано ли это участием Cas9 в процессинге crРНК или стабилизацией crРНК при помощи Cas9 после процессинга, или же и тем, и другим. [2]

Комплекс crРНК-tracrРНК-Cas9 распознаёт ДНК-мишени, комплементарные crРНК и содержащие РАМ. Как и в системах I типа, отсутствие РАМ в локусах CRISPR предохраняет клеточную ДНК от разрезания. Сначала Cas9 распознаёт РАМ, а после этого прилегающая ДНК проверяется на комплементарность crРНК. Разрезание ДНК-мишени осуществляется путём внесения двух одноцепочечных разрывов мотивами RuvC и HNH белка Cas9, в результате чего образуется двуцепочечный разрыв с тупыми концами в ближнем к РАМ конце протоспейсера в R-петле, за три нуклеотида до РАМ. [2]

В системах III-C (в частности, в CRISPR-Cas системе Neisseria meningitidis) был описан альтернативный механизм биогенеза crРНК, который использует промоторы, располагающиеся в повторах CRISPR. Альтернативное направление транскрипции может происходить даже без участия РНКазы III. [2]

палиндромный адаптивный спейсер редактирование геном

3.4 Система CRISPR III типа

Системы III типа подразделяются на два подтипа: III-A и III-B. Для них характерно наличие белка Cas10 - самой крупной субъединицы эффекторного комплекса Csm (в случае подтипа III-A) и Cmr (в случае подтипа III-B). Кроме того, все системы III типа кодируют один белок Cas5 и, как правило, несколько паралогичных белков Cas7. Для обоих подтипов характерно использование ортолога Cas6 для процессинга пре-crРНК, хотя процессирующий фермент не всегда является стабильным компонентом соответствующего эффекторного комплекса (как у систем I типа). В 2008 году было показано, что система III-A Staphylococcus epidermidis работает с ДНК-мишенями, а в 2009 году было установлено, что система III-B Pyrococcus furiosus - с РНК. Для успешного распознавания мишеней системам III-A и III-B не требуется наличие мотива РАМ. [2]

Дальнейшее изучение систем III типа обнаружило новые загадки субстратной специфичности подтипов III-A и III-B. Так, выяснилось, что система III-A S. epidermidis может работать только с транскрибирующимися протоспейсерами. Кроме того, оказалось, что комплексы Csm S. thermophilus и Thermus thermophilus имеют скрытую РНК-деградирующую активность, причём они вносят разрывы в РНК через каждые 6 нуклеотидов. Такая же активность была показана и для комплексов Cmr. Система III-A S. epidermidis не только разрушает синтезирующиеся транскрипты, но и разрезает ДНК-мишень зависимым от транскрипции образом за счёт специфических аминокислотных остатков Cas10, которые не связаны с распознаванием мишени. Гидролиз РНК, опосредуемый комплексами Csm и Cmr, катализируется не белком Cas10, а субъединицами Csm3 и Cmr4, соответственно. Таким образом, система III-A может разрушать как ДНК, так и РНК; предполагается, что хорошо описанная РНК-деградирующая активность систем III-B дополняется способностью разрушать ДНК. [2]

Поскольку системы III типа не требуют наличия РАМ у мишеней, в их случае должен существовать другой, нежели у систем I, механизм различения своей дцДНК и чужой. В случае комплекса Csm crРНК комплементарна не только спейсеру CRISPR, но и прилежащему повтору. Таким образом, при связывании с молекулой-мишенью crРНК будет связываться только с протоспейсером, а при связывании с ДНК клетки - ещё и с соседним повтором, на основании чего система III может отличить ДНК клетки от чужеродной. Интересно, что в системах типа III ДНК разрезается очень близко к местам, где соответствующие основания crРНК и ДНК-мишени не спарены. О механизмах приобретения новых спейсеров в системах типа III практически ничего не известно. [2]

Кроме обычно выделяемых подтипов III-A и III-B, в 2015 году было предложено выделять также подтипы III-C и III-D, встречающиеся у некоторых архей. В системах типа III-C у белка Cas10 наблюдается инактивация циклазного домена; кроме того, его аминокислотная последовательность значительно отличается от таковой у Cas10 систем III-A и III-B. В системах III-D у Cas10 отсутствует домен HD; кроме того, имеется уникальный ген csx10, похожий на cas5. И у систем III-C, и у систем III-D отсутствуют гены cas1 и cas2. [9]

В феврале 2016 года появились сведения, что у некоторых бактерий с системами CRISPR-Cas III типа (например, морской бактерии Marinomonas mediterranea) вместо обычного белка Cas1 функционирует химерный белок Cas1-RT, сшитый с обратной транскриптазой. Благодаря наличию такого белка бактерия может интегрировать в свой геном спейсеры, образованные от геномов патогенов с РНК-геномами посредством обратной транскрипции. [10]

Обнаружено, что системы типа III, в частности Cas10, производят циклические олигоаденилатные вторичные мессенджеры, превращая АТФ в циклический продукт, который аллостерически активирует Csm6, который затем помогает разрушить РНК вируса. [10]



4. Белок Cas 9

4.1 Описание и применение белка Cas 9

Cas9 (англ. CRISPR associated protein 9, CRISPR-ассоциированный белок) - это управляемая при помощи РНК-гидов эндонуклеаза, связанная с адаптивной иммунной системой CRISPR у ряда бактерий, в частности Streptococcus pyogenes. S. pyogenes использует Cas9 для запоминания, последующей проверки и разрезания чужеродной ДНК, например, ДНК бактериофагов или плазмид. [11]

Cas9 выполняет проверку посредством раскручивания инородной ДНК и определения её комплементарности с двадцатью спаренными основаниями спейсера управляющей РНК. Если субстрат комплементарен управляющей РНК, Cas9 расщепляет чужую ДНК. В этом смысле механизм CRISPR-Cas9 имеет ряд параллелей с механизмом РНК-интерференции (RNAi) у эукариот. Безопасность практического применения данного метода определяется в том числе и тем фактом, является ли искомая последовательность двадцати спаренных оснований уникальной в модифицируемой ДНК. [22]

4.2 Белок Cas 9 в генной инженерии

Кроме изначальной функции в бактериальном иммунитете, белок Cas9 активно используют для создания точечных разрывов в двойной спирали ДНК, такие разрывы могут приводить к инактивации генов или созданию гетерологичных генов посредством соединения негомологичных концов и соответствующей гомологичной рекомбинации. Вместе с белками ZFN и TALEN, Cas9 становится значимым инструментом редактирования генома. Более того, создана технология, позволяющая вносить точечную мутацию не разрезая цепь ДНК, а путём преобразования одного нуклеотидного основания в другое. Варианты Cas9, которые связываются с ДНК, но не расщепляют её могут быть использованы для создания искусственных факторов транскрипции для избирательного регулирования транскрипционной активации и репрессии. [11]

К 2012 году Cas9 приобрёл популярность, потому что он позволяет расщеплять практически любую нуклеотидную последовательность, комплементарную управляющей РНК. Поскольку избирательность Cas9 является следствием комплементарности управляющей РНК и ДНК, а не модификации самого белка (в отличие от случаев TALEN и ZFN), для новых ДНК-мишеней возможна выработка специфических Cas9. Варианты Cas9, которые связывают ДНК, но не расщепляют её (dCas9), могут быть использованы для доставки транскрипционных активаторов или репрессоров к специфичным последовательностям ДНК с целью регулирования транскрипционной активации и репрессии. Хотя природный Cas9 требует составления управляющей РНК из двух в корне различных РНК - CRISPR-РНК (crRNA), и транс-активационную РНК (tracrRNA), нацеливание Cas9 было упрощено при помощи выработки единой химерной управляющей РНК. Предполагается, что Cas9 можно будет использовать для изменения генома целых популяций организмов. В 2015 году посредством Cas9 впервые был модифицирован геном человеческого эмбриона. Разработана технология иммуногеномной инженерии гибридом, позволяющая быстро перепрограммировать специфичность их антител с помощью Cas9. [22]



5. Механизм геномного редактирования с помощью CRISPR-Cas9

Для распознавания последовательности-мишени, которая располагается рядом с PAM, используется РНК, и направляемая ею нуклеаза Cas9 производит двуцепочечный разрыв в сайте-мишени. При редактировании генома эукариот, впрочем, результатом работы CRISPR-Cas9 является не разрушение всей молекулы ДНК, а репарация двуцепочечного разрыва, произведённого Cas9. Репарация может проводиться как за счёт негомологичного соединения концов (англ. non-homologous end joining, NHEJ), так и путём гомологичной рекомбинации. В результате репарации, сопровождавшейся негомологичным соединением концов, часто возникают небольшие вставки или делеции, способные разрушить рамку считывания белок-кодирующих генов, что приводит к утрате функции гена-мишени. Вызвав множество двуцепочечных разрывов, можно добиться появления крупных делеций и даже инверсий. [2]

Репарация путём гомологичной рекомбинации, напротив, подразумевает замену удалённой последовательности новой последовательностью, комплементарной матрице для репарации, которую создаёт сам исследователь. Таким образом, гомологичная рекомбинация может использоваться для удаления нежелательных мутаций, создания новых аллелей, вставки или слияния функциональных доменов. Кроме того, мутационная инактивация доменов RuvC или HNH Cas9 превращает этот белок в РНК-направляемую никазу, производящую не двуцепочечные, а одноцепочечные разрывы. Инактивация обоих доменов превращает Cas9 в направляемый РНК ДНК-связывающий белок, не разрезающий мишень. В этом случае к ДНК-связывающему домену можно присоединить домен с другими функциями, что, в свою очередь, может вызвать различные изменения в локусе-мишени: активацию или репрессию транскрипции, модификацию хроматина, усиление образования петель и многие другие. Кроме того, инактивированная форма Cas9 (dCas9, «мёртвая» Cas9) служит основой для новых исследовательских приёмов - например, визуализации посредством флуоресценции или создания меток для последующей физической изоляции локусов. [28] Несмотря на эффективность использования систем CRISPR-Cas, происхождение Cas9 накладывает некоторые ограничения на выбор ДНК-мишеней: например при использовании Cas9 Streptococcus pyogenes в качестве мишеней можно выбирать только последовательности, за которыми следует PAM, а именно 5'-NGG (где N - любой нуклеотид). Впрочем, необходимость в PAM не накладывает серьёзных ограничений на применение систем CRISPR-Cas9: в человеческом геноме такие последовательности встречаются почти каждые 8-12 нуклеотидов. Перед использованием в генетических конструкциях ген Cas9 должен быть предварительно оптимизирован по используемым кодонам в соответствии с организмом, геном которого предполагается модифицировать: ген cas9 S. pyogenes отличается низким GC-составом (35 %), и для организмов, чьи геномы имеют высокий GC-состав, может быть необходима оптимизация кодонов Cas9. [10]

В настоящий момент для редактирования генома применяют систему CRISPR-Cas II типа, причём чаще всего используется белок SpyCas9 (нуклеаза Cas9 бактерии S. pyogenes); однако ведётся разработка альтернативных белков Cas9, которые позволят увеличить область применения CRISPR-Cas. Например, укороченные формы Cas9 могут распознавать различные последовательности PAM. Хотя редактирование генома можно эффективно осуществлять с помощью crРНК и tracrРНК, транскрибируемых отдельно, разработка технологии единой направляющей РНК (sgРНК) позволила упростить эту систему. В этом случае четырёхкомпонентная система РНКаза III: crРНК: tracrРНК: Cas9 заменяется двухкомпонентной системой sgРНК:Cas9. В настоящее время sgРНК используется значительно чаще, чем раздельные crРНК и tracrРНК. Наконец, ведутся разработки по улучшению специфичности Cas9 и уменьшению побочных эффектов. [2]

6. Применение системы CRISPR в биотехнологии

Разработаны методы редактирования геномов с помощью CRISPR-Cas для модельных организмов (например, мышей, плодовой мушки Drosophila melanogaster, нематоды Caenorhabditis elegans, рыбки данио-рерио и других). Такие методы применялись для редактирования генома грибов, в частности, нитчатого гриба Aspergillus oryzae, который используют в промышленности для сбраживания сои и шампиньона. Важное значение имеют работы по редактированию с помощью CRISPR-Cas культур клеток млекопитающих, в том числе человека. В 2017 году этим методом был отредактирован геном человеческих эмбрионов. [28]

Ведутся работы по редактированию геномов с помощью CRISPR-Cas у крупного рогатого скота, свиней и других животных, имеющих важное хозяйственное значение, например, пчёл. В ноябре 2015 года были опубликованы результаты эксперимента, в ходе которого при помощи технологии CRISPR-Cas в геноме свиньи были разом инактивированы 62 эндогенных ретровируса. Авторы исследования надеются, что благодаря этим результатам в будущем станет возможной ксенотрансплантация органов от свиньи к человеку. Наконец, мутагенез с использованием CRISPR-Cas может использоваться в борьбе с инвазивными видами (например, инвазивной мухой Drosophila suzukii). [10]

Технология CRISPR-Cas успешно применяется в генной инженерии растений, в том числе декоративных растений (например, петунии) и многих важных сельскохозяйственных культур: риса, сои, пшеницы, сорго, кукурузы, томата и апельсина. Исследуются возможности внедрения систем CRISPR-Cas в культурные растения для создания противовирусного иммунитета. Для генной инженерии растений также может использоваться система CRISPR-Cpf1. [10]

Методы, основанные на CRISPR-Cas, могут найти применение и в медицине для лечения самых разнообразных заболеваний: вирусных (в том числе ВИЧ-инфекции и герпесвирусных инфекций), аллергии и иммунологических заболеваний (в том числе аутоиммунных), онкологических, сердечно-сосудистых заболеваний и даже ревматизма, а также наследственных расстройств - таких, как синдром Дауна, серповидно-клеточная анемия, пигментный ретинит и в-талассемия. В 2013 году появилась публикация с сообщением о том, что исследователи сумели отредактировать аномальный ген в стволовых клетках пациента, больного муковисцидозом. Возможно, система CRISPR-Cas может помочь в лечении мышечной дистрофии Дюшенна (DMD): показано, что с помощью CRISPR-Cas можно восстановить ген дистрофина в культуре клеток DMD. Предполагается, что такие клетки с «отремонтированным» геномом можно трансплантировать в организм больного, где они смогут заменить больные клетки и выполнять необходимые функции. В октябре 2016 года в Китае было произведено редактирование генома взрослого человека с помощью CRISPR/Cas: пациенту с раком лёгких ввели модифицированные с помощью CRISPR-Cas Т-лимфоциты. Исследователи полагают, что редактирование генома малярийного комара с помощью CRISPR-Cas способно помочь в борьбе с малярией. Показана возможность редактирования с помощью CRISPR-Cas генома другого важного патогенного простейшего - Toxoplasma gondii. [28]

Система CRISPR-Cas может быть использована для получения из человеческих плюрипотентных клеток тканей, устойчивых к воспалению. Методы CRISPR-Cas показали себя эффективными при манипуляциях с локусом PRPN, кодирующим прионный белок, ответственный за ряд нейродегенеративных заболеваний человека и других млекопитающих. [28]

Линии клеток, модифицированных при помощи CRISPR-Cas, могут использоваться в качестве моделей различных заболеваний человека. Например, при помощи CRISPR-Cas из линии плюрипотентных клеток человека были получены клетки с мутациями, соответствующими двум заболеваниям почек (поликистозу почек и фокальному сегментарному гломерулосклерозу). Позже из этих клеток были выращены мини-органы, соответствующие почкам человека с данными болезнями. Этот же метод был использован для моделирования синдрома длинного QT на кардиомиоцитах. Подобные модели могут помочь в изучении заболеваний и разработке новых лекарственных препаратов. [28]

В ноябре 2018 года стало известно, что команде китайских учёных под руководством Хэ Цзянькуя удалось создать первых в мире людей с искусственно изменёнными генами (отключён CCR5) - двух девочек-близнецов, которые, как предполагается, невосприимчивы к вирусу иммунодефицита человека. Данный эксперимент был раскритикован из-за нарушения многочисленных научных и этических правил. [19]

При промышленном производстве кисломолочных продуктов вирусы-бактериофаги, случайно попадающие в ферментеры (огромные чаны с молоком и внесенными туда молочнокислыми бактериями), нарушают ферментацию, что приводит к огромным убыткам. Для того чтобы этого избежать, нужно использовать устойчивые к вирусам бактерии. Вывести такие бактерии просто: достаточно в лабораторных условиях отобрать клоны бактерий, способные к росту в присутствии вируса. Эту процедуру и провели в компании Danisco, но при выборке заметили одну важную особенность. Оказалось, что в CRISPR-кассетах клонов, ставших устойчивыми к вирусу, появлялись новые спейсеры, соответствовавшие участкам вирусного генома. Тогда ученые провели прямой эксперимент и методами молекулярной генетики вставили спейсер с последовательностью ДНК вируса в CRISPR-кассету бактерии. И такая генно-модифицированная бактерия действительно оказалась устойчивой к вирусу. Эти результаты были опубликованы в журнале Science в 2007 году и были первым экспериментальным подтверждением защитного действия CRISPR/Cas-систем, опосредованного последовательностями спейсеров. Немногим позже в Science была опубликована статья группой Джона ван дер Ооста (prof. dr. John van der Oost) «CRISPR-Cas Systems: RNA-mediated Adaptive Immunity in Bacteria and Archaea», в которой показывалось, что система действительно работает через малые CRISPR РНК. Статья была выпущена в соавторстве с группой Кунина. [20]

Высокая эффективность системы CRISPR/Cas9 открыла новые возможности для контроля численности популяции насекомых-переносчиков заболеваний человека. Для этого было предложено внедрять в природные популяции насекомых-переносчиков, таких как малярийные комары, искусственные генетические элементы, инсерция которых приводит к нокауту определенных генов. Такие элементы (генные драйверы) способны конвертировать сопутствующий нормальный аллель и копировать себя, поэтому они быстро распространяются в популяции, даже если их наличие в геноме приводит к уменьшению приспособленности особи (Unckless et al., 2015). Идея использования искусственного автономного генетического элемента на основе программируемой нуклеазы была высказана более 10 лет назад (Burt, 2003), однако полноценная реализация данного подхода стала возможной только после создания простой и эффективной системы редактирования генома CRISPR/Cas9. Проверка принципа предложенной идеи была проведена на дрозофиле (Gantz, Bier, 2015). С помощью традиционного способа получения трансгенных мух - микроинъекции генетической конструкции в оплодотворенное яйцо - были получены мухи, у которых в геномный локус yellow (y) была введена генетическая конструкция, состоящая из трех основных элементов. Это, во-первых, кодирующая часть белка Cas9 под контролем промотора, обеспечивающего активность гена и в соматических, и в герминальных клетках; вовторых, sgРНК, комплементарная выбранному участку гена yellow. Наконец, фланкировали конструкцию плечи гомологии - протяженные последовательности, гомологичные участкам справа и слева от вносимого разрыва в гене y. Поскольку интеграция конструкции приводит к нокауту по гену у, наследование конструкции можно проследить по фенотипу мух. При скрещивании мух, гомозиготных по наличию трансгена (y-/y-), с мухами дикого типа (y+/y+) ожидается, что все потомки будут гетерозиготами по трансгену (y+/y-), однако в данном случае классические законы Менделя нарушаются, так что практически все (97 %) потомки имели фенотип y-/y- и были гомозиготами по трансгену. Особенность наследования этой конструкции объясняется тем, что на самых ранних стадиях развития за счет активности Cas9 и sgРНК, унаследованных в составе трансгенной конструкции от одного из родителей, вносится двухцепочечный разрыв в локус y+, унаследованный от второго родителя. Далее разрыв репарируется по механизму гомологичной рекомбинации, причем в качестве матрицы используется локус, несущий трансген, так как он фланкирован последовательностями, гомологичными району разрыва. При этом происходит копирование трансгенной конструкции в нормальный аллель. Следовательно, конструкции такого типа наследуются не только вертикально, от родителя к потомкам, но и горизонтально, в ядре клетки от трансгенного локуса в локус дикого типа (Gantz, Bier, 2015). Применение этой технологии было опробовано на двух видах комаров Anopheles stephensi (Gantz, Bier, 2015) и Anopheles gambiae (Hammond et al., 2015). [15]

В обеих работах была продемонстрирована высокая эффективность наследования трансгенной конструкции. Однако дизайн экспериментов несколько отличался. V.M. Gantz с коллегами (2015), помимо элементов, обеспечивающих интеграцию (Cas9, sgРНК и плечи гомологии), ввели в конструкцию два гена одноцепочечных антител против антигенов возбудителя малярии Plasmodium falciparum. Такая конструкция, будучи введенной в нейтральный локус генома, не будет сказываться на приспособленности комара, но сделает его неспособным к передаче малярийного плазмодия. Хотя такая стратегия кажется привлекательной, поскольку мало влияет на комаров как вид, она, возможно, окажется не столь эффективной в борьбе с распространением малярии, поскольку может вызвать быструю эволюцию антигенов плазмодия, в результате которой они станут нечувствительными к используемым антителам (Alphey, 2016).A. Hammond с коллегами (2015) тоже предлагают использовать Cas9-подход для уменьшения численности популяции малярийных комаров. Для этого трансгенную конструкцию вводят в гены, нокаут по которым в гомозиготном состоянии приводит к стерильности самок. Моделирование распространения этого элемента в популяции показало, что доля его носителей может увеличиться с 0,05 до 0,9 менее, чем за два года. При этом доля фертильных самок станет меньше 20% и далее продолжит уменьшаться вплоть до полного уничтожения популяции (Burt, 2003; Deredec et al., 2008). Вопросы безопасности применения таких крайне инвазивных конструкций, потенциально способных уничтожить биологический вид, безусловно, должны быть детально проанализированы до принятия решения об их использовании. [15]

...