Механизм работы CRISPR Cas. Применение в биотехнологии CRISPR Cas. Роль белков Cas в механизме CRISPR

Выводы

Описаны характеристики различных систем CRISPR, зависимости систем CRISPR от белков Cas, в том числе от Cas9.

Показано, что Cas9 выполняет проверку посредством раскручивания инородной ДНК и определения её комплементарности с двадцатью спаренными основаниями спейсера управляющей РНК. Если субстрат комплементарен управляющей РНК, Cas9 расщепляет чужую ДНК.

Выявлена роль CRISPR-систем в развитие адаптивного иммунитета. Описан механизм CRISPR по трем стадиям: приобретение спейсеров, экспрессия и образование crРНК, интерференция. Описано возникновение и эволюция этих систем.

А также охарактеризованы системы: CRISPR I, II и III типа.

Отдельно описан белок Cas 9 и его роль в приобретении адаптивного иммунитета в работе с системой CRISPR.

Также, в данной работе, показано противодействие фагов CRISPR-системам.

В работе приведены примеры использования данной методики редактирования генома в сельском хозяйстве, медицине, биотехнологии и эпидемиологии.

Заключение

Появление системы CRISPR/Cas9 в арсенале генной инженерии оказало огромное влияние на биологию. С 2013 г., когда были опубликованы первые свидетельства о «программируемости» Cas9 для редактирования генома, систему CRISPR/Cas9 начали использовать в тысячах лабораторий по всему миру. Области биологии, где система оказалась крайне важна: генная терапия, хромосомная инженерия и геномные скрининги, а также создание трансгенных животных.

Также CRISPR/Cas9 используют для активации и репрессии экспрессии генов, эпигенетической модификации состояния хроматина и флуоресцентного мечения специфических участков хромосом. С помощью этой системы уже произведено создание трансгенных животных-биопродуцентов и многое другое, включая и совсем отдаленные перспективы - воскрешение вымерших видов животных на основе геномов современных видов.

В ближайшем будущем можно ожидать идентификации новых уникальных ДНК и РНК-редактирующих нуклеаз среди тысяч белков из CRISPR/Cas-систем. В данный момент в области биотехнологии CRISPR/Cas-системы, включая CRISPR-Cas9, являются самыми инновационными и быстроразвивающимися в методах генной инженерии.

Список литературы

1. Marraffini L.A. CRISPR-Cas immunity in prokaryotes // Nature. - 2015. - Vol. 526, no. 7571. - P. 55-61.

2. Sontheimer E.J., Barrangou R. The Bacterial Origins of the CRISPR Genome-Editing Revolution // Human Gene Therapy. - 2015. - Vol. 26, no. 7. - P. 413-424.

3. Barrangou R. The roles of CRISPR-Cas systems in adaptive immunity and beyond // Current Opinion in Immunology. - 2015. - Vol. 32. - P. 36-41.

4. van Houte S., Ekroth A.K., Broniewski J.M., Chabas H., Ben Ashby, Bondy-Denomy J., Gandon S., Boots M., Paterson S., Buckling A., Westra E.R. The diversity-generating benefits of a prokaryotic adaptive immune system. (англ.) // Nature. - 2016.

5. Jiang Wenyan, Maniv I., Arain F., Wang Yaying, Levin B.R., Marraffini L.A. Dealing with the Evolutionary Downside of CRISPR Immunity: Bacteria and Beneficial Plasmids // PLoS Genetics. - 2013. - Vol. 9, no. 9. - P. e1003844.

6. Pawluk et al., 2016. Naturally Occurring Off-Switches for CRISPR-Cas9

7. Минина Е. Как превратить глию в нейроны в живом организме: [арх. 18 мая 2020] / Елизавета Минина // Нейроновости: [электр. ресурс]. - 2020. - 15 мая.

8. Zetsche B. et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system (англ.) // Cell. - Cell Press (англ.) русск., 2015. - Vol. 163, no. 3. - P. 759-771.

9. Makarova K.S., Wolf Y.I., Alkhnbashi O.S., Costa F., Shah S.A., Saunders S.J., Barrangou R., Brouns S.J., Charpentier E., Haft D.H., Horvath P., Moineau S., Mojica F.J., Terns R.M., Terns M.P., White M.F., Yakunin A.F., Garrett R.A., van der Oost J., Backofen R., Koonin E.V. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems // Nature reviews. Microbiology. - 2015. - Vol. 13, no. 11. - P. 722-736.

Термины и понятия

1. Адаптивный иммунитет (англ. adaptive immunity) - способность организма обезвреживать чужеродные и потенциально опасные микроорганизмы, которые уже попадали в организм ранее. Представляет собой результат работы системы высокоспециализированных клеток, расположенных по всему организму.

2. Мобильные генетические элементы / МГЭ(англ. mobile genetic elements) - последовательности ДНК, которые могут перемещаться внутри генома. Существует несколько классов мобильных элементов генома, отличающихся по строению и способу перемещения: Транспозоны (например, Tn5), Инсерционные элементы (например, IS1603), ДНК-транспозоны, Ретротранспозоны, Плазмиды (например, F-плазмида), Бактериофаги (например, Mu, интегрирующиеся случайно в участки генома), Интроны второй группы.

3. Спейсеры (англ. spacers)- участки некодирующей ДНК, расположенные между тандемно повторяющимися генами, например, между генами рибосомальной РНК у эукариот. Их функция, вероятнее всего, заключается в обеспечении высокого уровня точности транскрипции в связанных генах.

4. Горизонтальный перенос генов - процесс, в котором организм передаёт генетический материал организму-непотомку. В вертикальном переносе генов, напротив, организм получает генетический материал от предка. Генетика занимается в основном простым вертикальным переносом генов.

5. Конъюгативные плазмиды (англ. conjugative plasmids) - плазмиды, которые переносятся от бактерии к бактерии внутри вида или между представителями близкородственных видов в процессе конъюгации. Чаще всего конъюгативными плазмидами являются F - или R -плазмиды. Подобные плазмиды относительно крупные (25-150 млн Д) и часто выявляются у грамотрицательных палочек.

6. РНК-интерференция (англ. RNA interference, RNAi) - процесс подавления экспрессии гена на стадии транскрипции, трансляции, деаденилирования или деградации мРНК при помощи малых молекул РНК.

7. PAM (англ. protospacer adjacent motif) - мотив, смежный с протоспейсером.

8. Инвазивный (англ. invasive) - способный проникать и распространяться в организме.

9. Эндонуклеазы (англ. endonuclease) - белки из группы нуклеаз, расщепляющие фосфодиэфирные связи в середине полинуклеотидной цепи. Эндонуклеазы рестрикции, или рестриктазы, расщепляют ДНК в определенных местах, они подразделяются на три типа на основании механизма действия.

10. Нуклеаза (англ. nuclease) - большая группа ферментов, гидролизующих фосфодиэфирную связь между субъединицами нуклеиновых кислот. Различают несколько типов нуклеаз в зависимости от их специфичности: экзонуклеазы и эндонуклеазы, рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, рестриктазы и некоторые другие.

11. Вирулентность (англ. virulence)- степень способности данного инфекционного агента вызывать заболевание или гибель организма. Вирулентность является мерой патогенности. Показателями вирулентности являются условные величины - минимальная летальная, 50%-я летальная, 50%-я инфицирующая доза.

12. Транскрипт (англ. transcript)- молекула РНК, образующаяся в результате транскрипции (экспрессии соответствующего гена или участка ДНК).

13. Интеграза(integrase) - фермент, катализирующий интеграцию ДНК вируса в хромосому клетки-хозяина. Перед интеграцией линейные молекулы ДНК вируса сначала замыкаются в кольцо и затем уже встраиваются. Ретровирусные интегразы - ключевой компонент прединтеграционного комплекса.

14. Транспозоны (англ. transposons) - это участки ДНК организмов, способные к передвижению и размножению в пределах генома. Транспозоны также известны под названием «прыгающие гены» и являются примерами мобильных генетических элементов.

15. Сигнатурные гены (англ. Signature genes) - наличие определённых сигнатурных генов служит характеристическим признаком типов и подтипов систем CRISPR-Cas.

16. Синтения (англ. synteny) - по изначальному определению, расположение каких-либо локусов на одной и той же хромосоме. Сегодня, однако, синтенией обычно называют ситуацию, когда расположение каких-либо локусов на одной и той же хромосоме наблюдается в разных наборах хромосом. Это явление также называют общей синтенией.

17. Белковая субъединица (Protein subunit) - полипептид, который вместе с другими компонентами собирается в мультимерный или олигомерный белковый комплекс. Многие природные ферменты и другие белки состоят из нескольких белковых субъединиц.

18. Процессинг (англ. processing)- процесс формирования зрелых молекул РНК из их предшественников (пре-РНК). Иными словами, это совокупность реакций, ведущих к превращению первичных продуктов транскрипции.

19. Сверхспирализация ДНК (англ. DNA Supercoiling) - явление пере- или недоскручивания топологически замкнутых цепей ДНК, в результате которого ось двойной спирали ДНК сама закручивается в спираль более высокого порядка. Под «топологически замкнутыми» понимают молекулы, свободное вращение концов которых затруднено (кольцевые молекулы ДНК либо линейные молекулы, концы которых зафиксированы белковыми структурами). Образующаяся в результате сверхспирализации ДНК иногда называется суперскрученной.

20. Биогенез (англ. Biogenesis) - эмпирическое обобщение, утверждающее, что всё живое происходит только от живого. В основе представлений о биогенезе лежат противопоставление живого неживому и идея вечности жизни. В XIX веке биогенез противопоставляли представлениям о спонтанном самозарождении микроорганизмов (бактерий и простейших) из неорганического вещества. Как гипотеза о вечности жизни биогенез несостоятелен. Согласно современным научным представлениям, живое вещество на Земле возникло из неорганического вещества, но не в результате спонтанного самозарождения, а в результате химической (пребиотической) эволюции, длящейся миллионы лет.

21. ДНК-зонд (англ. DNA probe) - фрагмент ДНК, меченный тем или иным образом и использующийся для гибридизации со специфическим участком молекулы ДНК. Позволяет идентифицировать комплементарные ему нуклеотидные последовательности.

22. Аллостерический эффект (англ. Allosteric effect) - изменение конформации аллостерического фермента (и, соответственно, его каталитической активности) в результате взаимодействия его определенного участка, независимого от основного центра, с ингибитором или активатором.

23. Споруляция (англ. sporulation) - это процесс образования спор (одноклеточные репродуктивные единицы); встречается у споровых растений, а также у простейших. ... Размножение почкованием встречается у разных групп организмов: у кишечнополостных (гидра) и у одноклеточных грибов (дрожжи).

24. Гибридный белок (англ. fusion protein, также химерный, составной белок) - белок, полученный объединением двух или более генов, изначально кодировавших отдельные белки. Трансляция гибридного гена приводит к синтезу белка, который может сочетать некоторые функциональные свойства обоих исходных белков.

25. Эндосома (англ. Endosome) - мембранная внутриклеточная органелла, один из типов везикул, образующаяся при слиянии и созревании эндоцитозных пузырьков. Зрелые эндосомы представляют собой образования размером 300-400 нм.

26. Электропорация (англ. electroporation) - создание пор в бислойной липидной мембране под действием электрического поля. Это явление используется в биотехнологии для внедрения макромолекул (обычно ДНК или РНК) в клетки млекопитающих, бактерий или растений.

27. Репарация (англ. Reparation) - особая функция клеток, заключающаяся в способности исправлять химические повреждения и разрывы в молекулах ДНК, повреждённой при нормальном биосинтезе ДНК в клетке или в результате воздействия физических или химических агентов.

Размещено на allbest.ru