Использование лактобактерий и наноселена для подавления фитопатогенов и стимуляции ростовых процессов культурных растений

Размещено на http://allbest.ru

Размещено на http://allbest.ru

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования

«КРЫМСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. В.И. Вернадского»

Таврическая академия (структурное подразделение)

Факультет биологии и химии

Кафедра ботаники и физиологии растений и биотехнологий

Эмиралиева Мавиле Исметовна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛАКТОБАКТЕРИЙ И НАНОСЕЛЕНА ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ ФИТОПАТОГЕНОВ И СТИМУЛЯЦИИ РОСТОВЫХ ПРОЦЕССОВ КУЛЬТУРНЫХ РАСТЕНИЙ

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА

Обучающейся 4 курса

Направления 06.03.01 Биология

Форма обучения очная

Научный руководитель,

доцент кафедры ботаники и

физиологии растений и биотехнологий,

к.б.н. А.В. Омельченко

Симферополь, 2021



СВЕДЕНИЯ О ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЕ

Выпускная квалификационная работа на тему: «Использование лактобактерий и наноселена для подавления фитопатогенов и стимуляции ростовых процессов культурных растений» изложена на 57 страницах машинописного текста; иллюстрирована 7 таблицами и 11 рисунками. Список литературных источников, упоминаемых в тексте, включает 48 работ, из них 7 ? на иностранном языке.

Экспериментальная часть работы выполнена на базе кафедры ботаники и физиологии растений и биотехнологий Таврической академии (СП) КФУ имени В.И. Вернадского (ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского).

В результате проведенных исследований впервые установлено, что при культивировании лактобактерий в питательной среде MRS с добавлением наноселена в концентрации 0,25 мг/л оптическая плотность штамма L. casei IMB B-7343 увеличилась на 11,3%, а L. plantarum IMB B-7344 - на 63,6% по сравнению с контролем. При внесении в питательную среду MRS наноселена у штамма L. casei IMB B-7343 не наблюдалось достоверных изменений культурально-морфологических свойств, а у штамма L. plantarum IMB B-7344 происходило образование цепочек по 5-6 клеток, в то время как в контроле наблюдали преимущественно одиночные и парные клетки. При добавлении в питательную среду MRS наноселена в концентрациях 0,05-0,25 мг/л наблюдалось увеличение антагонистической активности изучаемых штаммов лактобактерий по отношению к фитопатогенной бактерии X. campestris В-4102. Наибольшая зона подавления фитопатогена отмечена у штамма L. plantarum IMB B-7344 и превысила значение контрольного варианта на 15 мм.

Показано, что лактобактерии, культивируемые на среде с наноселеном оказывают стимулирующее действие на морфометрические показатели проростков: штамм L. casei IMB B-7343 оказывает большее влияния на рост корней, по сравнению с надземной частью, а штамма L. plantarum IMB B-7344. Полученные в результате исследований параметры культивирования лактобактерий на среде MRS с добавлением наноселена в концентрациях 0,05-0,25 мг/л свидетельствуют, что штаммы L. casei IMB B-7343 и L. plantarum IMB B-7344 являются технологичными и с учетом их антагонистической и ростстимулирующей активности могут быть рекомендованы для разработки комплексного биопрепарата.



СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

РАЗДЕЛ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ

1.1 Общая характеристика лактобактерий

1.2 Антагонистическая активность лактобактерий

1.3 Экология и этиология заболеваний, вызываемых фитопатогенами рода Xanthomonas

1.3.1 Биологическая характеристика рода Xanthomonas

1.3.2 Патогенез бактерий рода Xanthomonas

1.3.3 Вредоносность и способы заражения бактериями рода Xanthomonas

1.4.4 Распространенность фитопатогенов рода Xanthomonas на территории РФ

1.3.5 Методы защиты от возбудителей бактериозов вызванных Xanthomonas spp. на злаковых культурах

1.4 Биологическая роль селена

1.4.1 Влияние селена на биологические свойства лактобактерий

1.4.2 Влияние селена на ростовые процессы культурных растений

РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

2.2 Условия и схема проведения эксперимента

2.3 Методы исследования

2.3.1 Микроскопирование

2.3.2 Определение размеров клеток микроорганизмов

2.3.3 Получение наночастиц селена

2.3.4 Спектрофотометрический метод

2.3.5 Изучение антагонистической активности методом агаровых блоков с отсроченным антагонизмом

2.3.6 Определение морфометрических показателей и биологической продуктивности растений

2.3.7 Методы статистической обработки результатов

РАЗДЕЛ 3. ОХРАНА ТРУДА

РАЗДЕЛ 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1 Влияние наноселена на накопление биомассы лактобактерий

4.2 Влияние наноселена на культурально-морфологические характеристики лактобактерий

4.3 Влияние лактобактерий, культивированных на средах с наноселеном, на фитопатогенные бактерии

4.4 Влияние лактобактерий, культивированных на среде с наноселеном, на ростовые процессы растений на ранних этапах развития

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

фитопатогены защита бактериоз лактобактерии селен



ВВЕДЕНИЕ

На сегодняшний день большое значение приобретает разработка биологических препаратов, которые используются в сельском хозяйстве. Эти препараты рассматривают как альтернативу химическим. Если сравнивать с химическими средствами биопрепараты отличаются избирательностью своего действия и экологической безопасностью. Применение этих методов не нарушает взаимодействие между элементами агроэкосистемы и не вызывают нагрузку на возделываемые почвы таких загрязнителей, как пестициды. Кроме защиты растений от фитопатогенов биопрепараты повышают урожайность сельскохозяйственных культур и тем самым ведут к получению экологически чистой продукции [Климентова, 2001; Голубкина, 2007].

Серьезный экономический ущерб сельскохозяйственным и декоративным растениям наносят бактериальные болезни. Среднегодовая потеря урожая от бактериальных болезней составляет от 25% до 80 %. Самым распространённым среди фитопатогенных бактерий являются облигатные аэробные бесспоровые бактерии рода Xanthomonas [Кашин, 2011].

Для того чтобы восстанавливать и сохранять разнообразия биоценозов на уровне, который гарантирует стабильность окружающей среды, лежит в основе. Стратегических направлением биологического земледелия являются биотехнологические исследования по разработке технологий получения и практического применения новых экологически безопасных микробных биопрепаратов [Тихонович, 2005].

Особенностью микробиологических биопрепаратов перед химическими является их высокая биологическая эффективность по отношению к восприимчивым видам вредителей и болезней; избирательность действия, а также щадящее влияние на насекомых-опылителей; применение препаратов в любую фазу вегетации растений; являются безвредными для теплокровных животных и человека; отсутствует опасность накопления токсических веществ в окружающей среде [Климентова, 2001].

В последнее время внимание уделяется биологическим методам защиты растений, в данном методе используют микроорганизмы - антагонисты фитопатогенов и продукты их метаболизма. Угнетение фитопатогенных бактерий тоже происходит под влиянием активных веществ, которые выделяют микроорганизмы, обладающие высоким бактерицидным действием в тканях растений [Ljungh, Wadstrom, 2009].

Молочнокислые бактерии, а именно лактобактерии, представляют собой распространённую группу микроорганизмов. Плюсы лактобактерий в борьбе с болезнетворными микроорганизмами говорят о их способности выделять антибактериальные вещества, которые подавляют рост и размножение фитопатогенных микроорганизмов. Лактобактерии колонизируют поверхность корней и надземных органов растений, в свою очередь это препятствует распространению фитопатогенов к поверхности растений [Zwielehner, Handschur et al., 2008].

Актуальным является внедрение нанотехнологий в сельском хозяйстве для защиты растений от фитопатогенов. Важным биологически активным микроэлементом является селен. Он входит в состав более 200 гормонов и ферментов организма, регулируя работу всех органов и систем. Селен является одним из главных компонентов антиоксидантной системы растений. Также известно, что селен в форме наночастиц обладает антибактериальными свойствами по отношению к фитопатогенным бактериям. Биологический эффект наночастиц селена по отношению к фитопатогенным бактериям заключается в том, что, нарушается мембранный потенциал бактериальной клетки, который вызывает ее гибель. Наночастицы селена, стимулируют рост и развитие растений, снижая численность фитопатогенных микроорганизмов. Применяя наночастицы селена в сельском хозяйстве может быть перспективным для стимуляции роста растений и агрономически полезной микрофлоры [Голубкина, 2007].

В связи с этим, целью нашей работы явилось изучение влияния наноселена на основные параметры культивирования бактерий рода Lactobacillus и их свойства подавлять фитопатогены и стимулировать ростовые процессы культурных растений.

В задачи исследования входило:

1. изучить влияние наноселена на накопление биомассы лактобактерий штаммов L. casei IMB B-7343 и L. plantarum IMB B-7344;

2. выявить влияние наноселена на культурально-морфологические характеристики штаммов L. casei IMB B-7343 и L. plantarum IMB B-7344;

3. определить влияние культивированных на питательной среде MRS с наноселеном штаммов L. casei IMB B-7343 и L. plantarum IMB B-7344 на антагонистическую активность по отношению к X. campestris В-4102;

4. изучить влияние культивированных на среде MRS с наноселеном штаммов L. casei IMB B-7343 и L. plantarum IMB B-7344 на ростовые процессы культурных растений гороха сорта Мадонна и пшеницы сорта Надор на ранних этапах развития.

Место проведения исследования - лаборатория кафедры ботаники и физиологии растений и биотехнологий Таврической академии (СП) Крымского федерального университета им. В.И. Вернадского.

Объект исследования - свойства лактобактерий, культивируемых на питательной среде с комплексом наноселена.

Предмет исследований - влияние лактобактерий, культивируемых на питательной среде с комплексом наноселена на подавление фитопатогенов и стимуляцию ростовых процессов культурных растений.

В процессе выполнения работы были использованы следующие методы: микроскопический; спектрофотометрический; метод агаровых блоков; морфометрический; метод статистической обработки результатов.



РАЗДЕЛ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ

1.1. Общая характеристика лактобактерий

Лактобациллы можно встретить в различных экологических нишах, которые отвечают их потребностям:

- нехватка кислорода, большая концентрация питательных веществ, ростовых факторов;

- в различных биотопах организма человека и животных как представители нормальной микрофлоры, почве, эпифитной микрофлоре, на разлагающихся растительных остатках [Ljungh, Wadstrom, 2009].

По последним исследованиям, бактерии рода Lactobacillus составляют 0,01-1% от общего числа микроорганизмов эпифитной микрофлоры растений, это составляет 10⁴-10⁵ КОЕ/мл [Zwielehner, Handschur et al., 2008]. Условия обитания на растениях связаны с таким действием как экзогенные факторы, ультрафиолетовое излучение, различные механические повреждения растений, что является неблагоприятно для микроорганизмов. Главными видами - представителями эпифитной микрофлоры, т. е. это микрофлора поверхности листьев растений, являются L. plantarum, L. paracasei, L. fermentum, L. brevis и L. buchneri. Другие виды лактобацилл, такие как L. plantarum, L. brevis и L. fermentum, входят в состав микрофлоры ризоидов [Квасников, Нестеренко, 1975]. Роль лактобацилл в филосфере и ризосфере растений состоит в антагонистическом воздействии на фитопатогенной бактерии. Закисление среды лактобациллами предотвращает развитию инфекций при механической травме растения.

Лактобациллы входят в состав резидентной микрофлоры желудочно-кишечного и урогенитального тракта человека, в желудочно-кишечном тракте эти микроорганизмы представлены наиболее широко. Их количественное содержание в полости рта здоровых людей составляет 10³-10⁴ КОЕ/мл [Ботина и др., 2010]. В желудке лактобациллы обнаруживаются в количестве 10³ КОЕ/мл, в тощей и подвздошной кишке их количество находится в пределах 10²-10⁵ КОЕ/мл. Бактерии рода Lactobacillus являются неотъемлемым компонентом микробиоценоза влагалища и составляют 95-98% от общего числа микроорганизмов [Глушанова, 2003]. Бактерии рода Lactobacillus являются неотъемлемым компонентом микробиоценоза влагалища и составляют 95-98% от общего числа микроорганизмов [Ботина и др., 2010].

Лактобациллы - это грамположительные неспорообразующие палочки правильной формы, размером 0,5-1,2 Ч1,0-10,0 мкм. Палочки длинные, иногда имеют вид кокков, в коротких цепочках, в редко бывают подвижны за счет перитрихиальных жгутиков. От условий роста, состава питательной среды, температурного режима и возраста культуры зависит морфология микроорганизмов. Факультативные анаэробы, микроаэрофилы, растут слабо на воздухе, лучше при пониженном содержании кислорода, некоторые виды растут только в анаэробных условиях. Добавлением 5% СО₂ стимулируется рост. На агаризованной среде колонии представлены, диаметром 2-5 мм, выпуклые, с цельным краем, непрозрачные, они непигментированные, в самой толще среды, имеют вид кусочков ваты, белые или желтовато-бурые. Хемоорганотрофам, им нужна богатая сложная среда. Метаболизм у них бродильного типа, сахаролитический; по меньшей мере, половина углерода конечных продуктов брожения приходится на лактат. Нитраты они не восстанавливают, желатину не разжижают, каталазоотрицательные, цитохромов не имеют. Оптимальной температурой для роста является 30-40°С [Ljungh, Wadstrom, 2009].

Молочнокислые бактерии используют в качестве источника энергии углеводы и расщепляют их с образованием молочной кислоты. Также они способны только к брожению, и не содержат гемопротеинов (цитохромы и каталаза) [Kleerebezem, Boerchorst et al., 2003]. Гомоферментативные молочнокислые бактерии (группа А) при сбраживании глюкозы образуют практически только одну молочную кислоту. Данные бактерии обладают всеми нужными ферментами. Гомоферментативные молочнокислые бактерии не могут сбраживать пентозы. Факультативные гетероферментативные молочнокислые бактерии (группа В) могут сбраживать глюкозу по фруктозобисфосфатному пути, а при отсутствии глюкозы - пентозы по пентозофосфатному пути с образованием уксусной, молочной кислоты, муравьиной кислоты и этанола. Облигатно гетероферментативные лактобациллы (группа С), у них нет главных ферментов фруктозобисфосфатного пути - альдолазы и триозофосфат-изомеразы и сбраживают глюкозу по пентозофосфатному пути с образованием молочной, уксусной кислот и СО₂ и пентозы с образованием молочной и уксусной кислот [Ljungh, Wadstrom, 2009].

Кислотоустойчивость лактобактерий, можно рассматривать в качестве эволюционно сложившегося механизма приспособления к выживанию в сложных условиях и конкуренции. Это говорит широкое распространение лактобацилл и успешное освоение ими различных сред обитания [Ljungh, Wadstrom, 2009].

Лактобациллы синтезируют витамины. Молочнокислый продукт рибофлавином на 50-61%, фолиевой кислотой на 67-85,5%, биотином на 5-20% обогащают не слизистые формы молочнокислых бактерий йогурта [Ерзинкян и др., 1987].

Молочнокислые микроорганизмы родов Lactobacillus, Lactis, и термофильный Streptococcus ингибируют порчу продуктов, подавляют патогенные бактерии, но при этом сохраняя питательные свойства продукта в течение долгого срока хранения [Соловьёва, 2018].

Молочнокислые микроорганизмы играют важную роль при силосовании кормов для животных. Низкий рН, связанный с накоплением органических кислот, делает липиды растворимыми, что позволяет им легко диффундировать через клеточную мембрану в цитоплазму [Соловьёва, 2018].

Лактобациллы долгое время завлекают внимание ученых - по причине потенциального значения для поддержания гомеостаза системы «человек-находящаяся вокруг среда», сохранения здоровья населения, профилактики и лечения многих болезней разной этиологии. В последние десятилетия сфера применения лактобацилл очень сильно расширилась - начали появляться препараты на базе лактобацилл для растениеводства. Открыты новые характеристики данной группы микроорганизмов - стимуляция роста растений, исследование антагонистической активности лактобактерий показало способность данных бактерий подавлять не только лишь кишечные патогенны, но и фитопатогенные бактерии и грибы [Точилина, 2009].

1.2 Антагонистическая активность лактобактерий

Антагонистические взаимоотношения заключаются в том, что при общем развитии бактерии одного вида угнетают жизнедеятельность иного вида. Антагонистические характеристики молочнокислых бактерий являются одной из соответствующих необыкновенностей этих микроорганизмов [Полонская, 1952]. Мечников первый заинтересовал исследователей к использованию антагонистических параметров молочнокислых бактерий в борьбе с гнилостной микрофлорой кишечного [Квасников, Нестеренко, 1975].

Антагонистическая характеристика молочнокислых бактерий обоснована продукцией органических кислот таких как молочная, уксусная, фенилмолочная, пропионовая, капроновая, пероксида водорода, а также образованием веществ белковой природы, которыми являются бактериоцины.

Образование обозначенных органических кислот из углеводов приводит к уменьшению рН среды и пред утверждает развитие других микроорганизмов [Тюрин и др., 1989]. Ингибирование роста микроорганизмов органическими кислотами связано с их способностью проходить через клеточные мембраны, диссоциировать в более щелочной среде внутренних клеток в заряженные протоны и анионы, которые не могут потом возвратиться в наружную среду и подкисляют цитоплазму. Закисление цитоплазмы в итоге скопления протонов ингибирует некие метаболические процессы такие, к примеру, синтез АТФ, что приводит к смерти микроорганизма.

Пероксид водорода, в ходе роста каталазоотрицательных микроорганизмов аккумулируется в среде, оказывает ингибирующее действие на рост каталазоположительных бактерий посредством сильного окислительного действия на их молекулярные структуры [Филиппов, 1982].

Бактериоцины (бактерии + лат. caedo «убиваю») -- это антимикробные вещества белковой природы, различающиеся по спектру, способу действия и биохимическим свойствам. Могут иметь узкий, или большой спектр активности, в особенности это характерно для бактериоцинов грамположительных бактерий [Блинкова, 2003].

В первый раз бактериоцины были идентифицированы почти 100 лет назад, как термолабильный продукт, присутствующий в культурах Escherichia coli. Больше изученным, а также разрешенным для использования в качестве биологического консерванта (код Е234), является бактериоцин низин, он один является из антибиотиков с 1997 года имеющий «GRAS» (Generally Recognized As Safe) статус, т.е. признанный Европейским парламентом безопасным [Стоянова, 2017].

Биосинтез бактериоцинов. У бактериальных клеток способность продуцировать определенный тип бактериоцина является стабильным свойством. Синтез бактериоцинов является наследственной особенностью организмов, проявляется в виде того что, каждый штамм способен создавать один или несколько определенных, строго специфичных ему антибиотических веществ.

Синтез большинства бактериоцинов детерминируется особенными плазмидами, называющимися бактериоциногенными факторами. Передаются при конъюгации некоторые из данных плазмид, что является характерным для молочнокислых бактерий, но многие из этих плазмид относятся к уровню неконъюгативных. Cинтез кое-каких бактериоцинов детерминируется генами находящимися в бактериальной хромосоме. Характерно это лишь для некоторых грамотрицательных бактерий, к примеру, Pseudomonas aeruginosa, Erwinia chrysanthemi и другие [Егоров, Баранова, 1999].

Парадокс бактериоциногении характеризуется последующей необыкновенной особенностью: синтез бактериоцина является процессом, смертельным для продуцирующей его клетки. Постоянно идущим процессом, синтез бактериоцинов не является. При обычных условиях культивирования синтез бактериоцина осуществляется только в отдельных клеточках популяции бактериоциногенного штамма - в среднем 1:1000 бактерий, их количество при необходимости может резко увеличиваться. В большом количестве клеток популяции бактериоциногенного штамма продукция бактериоцина снижена или подавлена. Это обосновано повреждением структуры ДНК и возникновением продуктов, инактивирующих функции бактериоциногенного фактора. Штаммы, продуцирующие бактериоцин тоже синтезируют белок иммунитета к своему бактериоцину, который в свою очередь защищает клетку от своих бактериоцинов. Но при этом клетки всей популяции сохраняют способность к его продукции в течение бесконечного ряда поколений [Пантелеева, 2006].

К действию бактериоцинов чувствительность либо устойчивость бактериальных клеток определяется, наличием или неимением на их поверхности рецепторных структур, которые сорбируют тот или иной бактериоцин. Из популяций клеток-мишеней могут быть выделены особи, в рецепторных структурах которых произошли мутации, приводящие к возникновению стойкости бактерий к бактериоцинам. Эти устойчивые мутанты достаточно часто сохраняют чувствительность к другим типам бактериоцинов того же вида. Таким образом, бактериоцины одного и таково же вида могут быть разными по специфичности адсорбции на рецепторных структурах бактериальных клеток [Пантелеева, 2006].

Механизм действия бактериоцинов. На грамположительные и грамотрицательные патогенные бактерии бактериоцины оказывают антибактериальное и бактериостатическое действие, нарушая синтез бактериальной мембраны и владеют порообразующим действием, а микроцины ингибируют ферменты, участвующие в процессах синтеза функциональных бактериальных протеинов.

Бактериоцины лактобактерий ингибируют синтез пептидогликана, связываясь с липидом II, основным транспортером субъединиц пептидогликана из цитоплазмы в клеточную стенку и, следовательно, предотвращают правильный синтез клеточной стенки, что приводит к образованию поры и гибели клеток.

Бактериоцины класса II, такие как лактококцин А, связываются с порообразующей рецепторной маннозо-фосфотрансферазной системой (Man-PTS) [Устюгова, 2012].

Один бактериоцин согласно литературным данным Lactobacillus casei синтезирует - казеицин, а Lactobacillus plantarum - три: плантарицин А и С и плантацин 154.

1.3 Экология и этиология заболеваний, вызываемых фитопатогенами рода Xanthomonas

В последнее время в России происходит нарастание зараженности посевного материала главных сельхоз культур возбудителями бактериальных заболеваний растений. Причиной такого явления является - нарушение технологии выращивания, уборки и хранения собранных семян, в изменениях климатических условий, также недостатке своевременной и достоверной диагностики фитопатогенов в поле и в посевном материале. Чаще всего посев зараженными зёрнами приводит к развитию болезней растений в поле, особенно если неправильно подобран протравитель. Наиболее распространёнными среди фитопатогенных бактерий и значимыми являются бактерии рода Ксантомонас (Xanthomonas) [Кумскова, 2007].

1.3.1 Биологическая характеристика рода Xanthomonas

Бактерии рода Xanthomonas обширно распространены - их можно найти в воде, почве, ризосфере, в насекомых, в филлоплане растений, на поверхности водорослей, грибов и простейших животных.

Бактерии рода Xanthomonas - они грамотрицательные, неспороносные палочки 0.4-0.7 x 0.7-1.8 мкм; у них есть один полярный жгутик. Клетки у них одиночные грамотрицательные подвижные палочки, концы закруглённые. Их культура разжижает желатин, молоко пептонизирует, нитраты не восстанавливает, крахмал гидролизует. Продуцирует кислоту из глюкозы, галактозы, мальтозы, сахарозы, раффинозы. Является аэробом. Подходящая, а именно, оптимальной температурой роста есть 28°C. Оптимальное значение рН среды 6,0 [Газиев, 2015].

1.3.2 Патогенез бактерий рода Xanthomonas

Ксантан выступает за формирование биопленок X. campestris, он оказывает защитное действие сообществ, созданных в этой структуре, когда происходят резкие изменения температуры, pH, ультрафиолетового излучения, заметные осмотические изменения или снижение влажности.

У данного рода бактерий есть некоторые механизмы, для того чтобы избежать защитных реакций растений, которые он заражает. Первый барьер растения к бактериальной инфекции - это клеточная стенка и поверхностные вещества с антимикробной активностью. Заразить растение X. campestris может через его листовые устьица (поры), и гидраты (тип стомы, через которые идёт выделение избытка воды) или имеющиеся раны [Гладышева, 2008].

1.3.3 Вредоносность и способы заражения бактериями рода Xanthomonas

Род Xanthomonas вредоносной бактерии знаменита повсеместно, поскольку они являются фитопатогенами важных сельскохозяйственных, дикорастущих растений и декоративных культур. Заболевания, вызываемые Xanthomonas, они понижают количество и в то же время качество урожая сельхоз культур и вызывают смерть растений [Williams, 1980].

Бактерии рода Xanthomonas вызывают заболевания больше чем у 124 однодольных и 268 двудольных растений, которые принадлежат к 68 семействам и 240 родам, включая такие семейства как пасленовые, крестоцветные, сложноцветные, злаковые. Некоторые другие виды бактерий рода Xanthomonas являются более опасными патогенами растений, большое их распространение приводит к экономическим серьезным потерям.

Бактерии распространяются с растительным материалом и семенами во всем мире, и вызывая значимые экономические убытки. По этим данным FAO, потерями урожая в сельском хозяйстве насчитывают 75 миллиардов долларов каждый год, из них от бактериальных болезней - 25 миллиардов долларов, что составляет приблизительно 30% от потерь урожая во всём мире (FAO, 2006).

В хорошем качестве источника инфекции почва не представляет большой опасности. Быстро погибают фитопатогенные бактерии, когда попадают в почву под воздействием микробов-антагонистов. Бактерии Xanthomonas spp. они могут выживать даже в нестерильной почве до 43 дней зимой и 14 дней летом. И чем ниже температура почвы и выше влажность, тем выживаемость бактерий больше [Санин, 2016].

Бактерии данного рода могут сохранять свою жизнь в воде. Сосредоточение фитопатогенных бактерий в нестерильной воде со временем уменьшается, в стерильной воде они способны хранить свою жизненность до 15 лет. Атмосфера - среда, куда бактерии постепенно попадают совместно с дождем, мелкокапельными туманами, пылью с почвы, с растительности и из водоемов.

Семена представлены одним из главнейших ключей заражения. Как правило, бактерии находят на поверхности семян и когда прорастают могут заражать всходы через гидатоды и устьица семядольных листочков или повреждения первичного корня, а затем перемещаться в растения по проводящим сосудам и заражать в период вегетации взрослые растения.

Инфицированные семена переносят бактериальную инфекцию в места, где ее раньше не было [Ruissen, Gagg, Toruno, 1989].

1.3.4 Распространенность фитопатогенов рода Xanthomonas на территории Российской Федерации

В последние годы у нас в стране происходит нарастание зараженности посевного материала основных сельхоз культур бактериями рода Xanthomonas (рис. 1.1 и 1.2). Причины этого процесса -- нарушение технологии выращивания, уборки и хранения собранных семян, в изменении климатических условий, в недостатке своевременной, достоверной диагностики фитопатогенов в поле и в посевном материале. Если производить посев зараженными семенами, то он приводит к развитию болезней растений в поле, особенно если неправильно подобран протравитель [Блинов, Буршина, 2008].

Рис. 1.1. Черная бактериальная пятнистость томата - это заболевание, которое вызывает бактерия Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria [https://dacha5.ru/bolezni-i-vrediteli/chernaya-bakterialnaya-pyatnistost-to.html].

Крупное действие на распространённость бактерий рода Xanthomonas на территории нашей страны оказывает наличие возбудителей бактериозов, которые поступают с посадочным материалом из-за рубежа. В России ввоз посадочного материала постоянно увеличивается, связано это с установлением рыночной экономики государства, появлением новых сортов зарубежной селекции. В Россию ввезённый посадочный материал приходит из больше 26 стран мира, 58% из которых составляют страны-члены Евросоюза. Ввоз импортного растительного материала может стать причиной обширного распространения Xanthomonas, а также интродукцию новых вредных организмов, включая возбудителей болезней, которые ранее не было на территории страны.

Рис. 1.2. Ареал вредоносности обыкновенной пятнистости фасоли (Xanthomonas campestris pv. phaseoli (Smith) Dye) [https://dacha5.ru/bolezni-i-vrediteli/obyiknovennaya-pyatnistost-fasoli-xanthomonas-campestris.html].

В России потери урожая только зерновых культур от вредителей, болезней и сорняков достигают 25-30% валового сбора зерна. Главной задачей учреждений, которые осуществляют фитосанитарный надзор диагностировать и останавливать распространение опасных объектов на этапе досмотра импортной продукции.

1.3.5 Методы защиты от возбудителей бактериозов вызванных Xanthomonas spp. на злаковых культурах

В России используются три разрешенных препарата чтобы защищать от вредоносных бактериальных заболеваний пшеницу и ячмень, которые вызывают бактерияии рода Xanthomonas: два химических препарата для протравливания семян - Витарос и ТМТД (на основе тирама), а также антибиотик Фитолавин 300. Некоторые ученые считают, что, Фитолавин 300 (фитобактериомицин - комплекс стрептотрициновых антибиотиков) - один единственный эффективный препарат для защиты ряда культур от возбудителей бактериозов [Котляров, 2010]. Антибиотик Фитолавин-300 разрешен к применению на озимой пшенице и озимом ячмене. Большая эффективность препарата достигается, при опрыскивании растения, когда начинается выход колоса в трубку. Обрабатывание семян препарат снижает инфицированность растений, он повышает урожайность и улучшает качество зерна.

По данным Пасичник Л. А. биологический фунгицид Микосан В, а также препараты Пенкоцеб, Татту, Ридомил Голд, Ацидан и Чемпион проявляют антибактериальную активность в отношении Xanthomоnas в рекомендованной дозе и могут быть рекомендованы для того чтобы использовать против возбудителей бактериальных болезней на зерновых культурах.

В борьбе с возбудителями бактериальных заболеваний зерновых культур, принципиальное значение имеют агротехнические мероприятия. Для того чтобы усилить защитные реакции растений нужно сделать оптимальные условия для их роста (главное связанные с их перезимовкой) и неблагоприятные для жизнедеятельности возбудителей бактериозов. А именно, проводить предпосевные мероприятия, обработку растений во время вегетационного периода, соблюдать условия хранения урожая. Поскольку фитопатогенные бактерии передаются через посевной материал, необходимо заранее проверять семена на предмет наличия возбудителей заболевания и для посева использовать только здоровое настоящее зерно [Литвиненко, 2011].

Способствует ограничению развития бактериозов в посевах: биологизация земледелия включающая мероприятия по повышению биологической активности почвы, внесение органических удобрений, а также обработка пожнивных остатков микробными препаратами с функцией подавления патогенов.



1.4 Биологическая роль селена

Селен (Se) - это металлоид, он считается актуально принципиальным микроэлементом с уникальными биофункциями и большим диапазоном биодеяния его соединений на живые организмы.

Эссенциальность селена характеризуется его вхождением в состав активных центров ряда ферментов, из которых более изученными являются несколько глутатионпероксидаз, тиоредуктаза. На сегодняшний день сформировалось представление о том, что главной биохимической функцией селена является его участие в построении глутатионпероксидазы - одного из ключевых антиоксидантных ферментов, который останавливает накопление в тканях свободных радикалов, инициирующих перекисное окисление липидов, белков, нуклеиновых кислот и других соединений.

Не полностью охарактеризованы по структуре и функциям выделены, еще около 30 селенопротеинов. Общим для этих белков является то, что микроэлемент входит в их состав в виде селеноцистеина. Установлен и специфический кодон, ответственный за включение селеносодержащей аминокислоты в белки.

Селен участвует в поддержании структурной стабильности и функциональной активности как самой мембраны, но и комплекса мембраносвязанных ферментов, обеспечивающих нормальную интенсивность обменных процессов. Регулируя перекисное окисление липидов и поддерживая тем самым концентрационный оптимум свободнорадикальных частиц, селен влияет не только на целостность клеточных мембран, но и также участвует в регуляции обмена: белкового, углеводного и жирового.

Включать Se в организм можно через пищу; морская еда которой является рыба, овощи будут являться главными источниками Se. Количество потребления селена во всем мире зависит от его количества в почве каждой страны и способности овощей накапливать Se, типа выращиваемой и потребляемой культуры т.д. Хоть Se считался токсичным элементом до 1973 г., есть немаленькая разница в концентрации между эссенциальностью и токсичностью Se, которая зависит от его соединения [Вихрева, Блинохватов, Клейменова, 2012].

В природе селен встречается в виде селенида (Se^2?), как элементарный Se (Se⁰) и как растворимые соли селенита (SeO₂^-3 SeO₃^2-) и селенат (SeO₂^-4SeO₄^2-), которые являются наиболее токсичными формами.

По данным некоторых авторов, селен может участвовать в синтезе коэнзимов Q и А, включается в цитохром С.

Для животных функции селена отчетливо проявляются в обеспечении нормальной деятельности трех защитных систем: иммунной антиоксидантной и детоксицирующей.

Анализ биологической роли селена в животных организмах говорит о том, что этот микроэлемент является, эссенциальным для животного мира, участвуя в многочисленных биохимических процессах как непосредственно, так и косвенно (влияя на деятельность ферментов и других биомолекул, не содержащих селена) [Вихрева, Блинохватов, Клейменова, 2012].

1.4.1 Влияние селена на биологические свойства лактобактерий

Немногие лактобактерии могут накапливать и трансформировать соли Se в селенаминокислоты и SeNP; но метаболические пути, с помощью которых лактобактерии собсвенно биопреобразовали селенит, остаются неясными и неизвестными. Установлено, что селенит может реагировать с глутатионом, образуя при этом селенотрисульфидные производные, которые в свою очередь являются промежуточными продуктами превращения неорганического Se в биоактивные селеносоединения.

Лактобактерии могут произрастать в присутствии Se, но в зависимости от анализируемых штаммов было замечено, что разные характеристики роста [Martнnez, Gustavo, 2020].

1.4.2 Влияние селена на ростовые процессы культурных растений

Биологическая роль селена в растениях изучена мало.

Можно лишь предположить, что данный селен может участвовать в усилении адаптивного потенциала растений. В теории это может быть реализовано за счет следующих факторов:

? способности Se делать меньше уровень плохих последствий окислительных стрессов, спровоцированные неблагоприятными внешними воздействиями на растения;

? способности селена фигурировать в разработке ответной реакции растений на стрессовое воздействие - быстром снижении уровня обмена веществ и переходе в положение глубокого покоя;

? способности микроэлемента способствовать благополучному выходу из обстоятельства с резко сниженным обменом веществ в состояние с нормальным и поднятым уровнем последнего [Игнатов и др., 2010].

Изучения роли селена в функционировании растений достаточно важно, в первую очередь, в аспекте уровня достатка их этим элементом и способности концентрировании им с целью лечения и профилактики заболеваний человека и животных, создаваемых селенодефицитом. Это формируется тем, что в растениях элементы находятся усвояемой форме. Органически связанный селен доходиться организмом человека и животных в 5-10 раз лучше, чем минеральный. Зерновые культуры, в особенности пшеница, являются одними из главных источников прихода селена в организм человека [Игнатов и др., 2010].

Биологическая активность селена зависит от его формы. Множество исследований влияния селена на различные процессы, протекающие в растениях, проводятся с ионными формами селена (селенитами и селенатами), которые владеют большой токсичностью. Меньше всего токсичными и биологически доступными являются наночастицы селена, имеющие пролонгированное действие. Биологическая деятельность наночастиц селена, как и других биогенных элементов, не только от размера, формы и устойчивости наночастиц, но и от свойств стабилизирующей матрицы [Юркова, Омельченко, Панов, 2019].

Работы по исследованию и воздействию разных форм селена на рост и процессы развития растений начали активно проводиться в конце XX- начале XXI веков. Множество существующих научных исследований предназначенные изучению стимуляции селеном урожайности или обогащению им культурных растений. Также известны работы по влиянию ионных форм селена на устойчивость растений к засухе [Кузнецов, 2004]. Отмечено положительный процесс маленьких концентраций селена при обработке семян земледельческих культур на их эффективность и адаптацию к стрессам. [Wang, 2009]. В ряде работ изучалось и исследовалось влияние селена на рост и развитие проростков озимой пшеницы и возможность повышения устойчивости растений к критическим факторам среды [Иванов, 2013]. В литературе, в общем, селен используется в вредной форме (селенит-, селенат-ионы), он добавляется в почву или применяется для замачивания семян [Кулагина, 2011]. В противовес от ионных форм высокодисперсный элементарный селен не столь токсичен и владеет пролонгированным действием [Никонов, Фолманис, Ковленко, 2012].



РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследований

Объектами для проведения исследований служили два штамма бактерий рода Lactobacillus - L. casei IMB B-7343 и L. plantarum IMB B-7344, а также водорастворимая композиция наночастиц селена, которую получали по оригинальной технологии, разработанной в Крымском федеральном университете им. В. И. Вернадского.

Штамм L. casei IMB B-7343 - факультативная анаэробная мезофильная гомоферментативная палочкообразная бактерия, выделена из самоквасных домашних кисломолочных продуктов.

Штамм L. plantarum IMB B-7344 - мезофильная гомоферментативная анаэробная бактерия, выделена из силосного зернажа.

Домен: Bacteria

Фила: Firmicutes

Класс: Bacilli

Порядок: Lactobacillales

Семейство: Lactobacillaceae

Род: Lactobacillus

Вид I: Lactobacillus casei

Вид I I: Lactobacillus plantarum

В качестве тест-объекта для изучения антагонистической активности использовали штамм фитопатогенной бактерии Xanthomonas campestris В-4102, полученной из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов.

Бактерии рода Xanthomonas:

Тип: Bacteria;

Группа: Proteobacteria;

Класс: Gammaproteobacteria;

Порядок: Xanthomonadales;

Семейство: Xanthomonadaceae.

Типовым представителем рода Xanthomonas является вид X. campestris. Синонимы: Bacterium campestre, Bacillus campestris, Phytomonas campestris, Pseudomonas campestris [Гладышева, 2008].

В качестве тест-объектов для изучения ростостимулирующей активности лактобацилл использовали представителя Однодольных - растения семейства Poaceae (Злаковые) - (Triticum aestivum L.) сорта Надор:

Отдел: Цветковые - Magnoliophyta

Класс: Однодольные - Liliopsida

Порядок: Злакоцветные - Poales

Семейство: Злаки - Poaceae

Род: Пшеница - Triticum

Вид: Пшеница мягкая - Triticum aestivum L.

В качестве тест-объектов для изучения ростостимулирующей активности лактобацилл использовали представителя Двудольных - из семейства Fabaceae (Бобовые) - (Pisum sativum L.) сорта Мадонна.

Отдел: Цветковые - Magnoliophyta

Класс: Двудольные - Dicotyledonae

Порядок: Бобовоцветные - Fabales

Семейство: Бобовые - Fabaceae

Род: Горох - Pisum

Вид: Горох посевной - Pisum sativum L.

Горох посевной (Pisum sativum L.) - однолетний очень полиморфный вид. Стебель от тонкого до значительно утолщенного и плоско-фасциированного в верхнем ярусе, полый в основном полегающий, иногда прямостоячий. Междоузлия от укороченных до длинных. Высота растения от 20 до 300 см. Встречаются формы имеющее все формы листьев. Прилистники крупнее листочков. Цветоносы пазушные одно- и многоцветковые. Бобы от мелких (3-4 см) до очень крупных (12-15 см), с пергаментным слоем (лущильные) или без него, разнообразные по форме. Семена округлые, в основном гладкие, разной крупности. Горох распространен в умеренной зоне Европы и Азии, а также в Африке (в основном Северной), Северной, Центральной и Южной Америке. Может возделываться на высоте около 4500 м над уровнем моря. Вид включает шесть подвидов, многие из них являются очень ценными хозяйственными культурами.

Пшеница мягкая (Triticum aestivum L.) - однолетнее травянистое растение семейства. Корни пшеницы могут уходить на глубину до 1 м. Стебель высотой 45-200 см высотой, полый, голый. Листья линейные, плоские. Колос рыхлый, двухрядный, четырехгранный, с гибким стержнем. Зерновки овальные с ясно выраженным, 1-1,5 см длиной, 0,3-0,5 см шириной [ГОСТ 12038-84. Семена сельскохозяйственных культур, 2011].

Урожайность лучших сортов пшеницы достигает 100 т/га. Посевы пшеницы сегодня покрывают около одной восьмидесятой части всей суши нашей планеты или пятую часть всей обрабатываемой земли, что составляет более 220 млн. гектаров. Ежегодно в мире собирают более 500 млн. тонн пшеницы. Основную её часть выращивают на территории Евразии.

2.2 Условия и схема проведения эксперимента

Все исследования проводили на базе кафедры ботаники и физиологии растений и биотехнологий КФУ им. В.И. Вернадского.

Культивирование бактерий рода Xanthomonas проводили на питательной среде следующего состава (г/л): сахароза - 20,0; дрожжевой экстракт - 10,0; пептон - 10,0; вода дистиллированная - 1,0 л.

Культивирование лактобактерий проводили на питательной среде MRS следующего состава (г/л): пептон ферментативный - 10,0; экстракт пекарных дрожжей 5,0; твин-80 - 1,0 мл; мясной экстракт 10,0; глюкоза - 20,0; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,0; натрий уксуснокислый 3-водный 5,0; аммоний лимоннокислый однозамещенный - 2,0; магний сернокислый 7-водный - 0,1; марганец хлористый 4-водный - 0,05; рН среды - 6,3; режим стерилизации: 0,75 атм., 20 мин.

В стерильную остывшую до 40 °С среду вносили наноселен в концентрациях 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 и 0,25 мг/л (по селену). В качестве контроля использовали среду MRS, куда вместо растворов селена добавляли эквивалентное количество дистиллированной воды. Для инокуляции питательной среды использовали 24-часовую культуру лактобактерий с титром 1,2?10⁸.

Действие лактобактерий на растения пшеницы и гороха изучали в вегетационных лабораторных опытах, в которых, растения выращивали в водной культуре. Для определения влияния лактобактерий, растения пшеницы и гороха, выращивали в водной среде. Для этого семена стерилизовали в 1 % растворе KMnO₄, а затем в количестве 30 штук раскладывали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную в дистиллированной воде (контроль 1), 1% растворе лактобактерий выращенных на среде MRS (контроль 2) и 1% растворах лактобактерий, культивированных на средах MRS с разными концентрациями наноселена (опытные варианты). В опыте использовали Чашки Петри помещали в термостат при температуре 25±1^oС.

2.3 Методы исследования

2.3.1 Микроскопирование

Изучение морфологии и измерение размеров клеток проводили в светлом поле с помощью оптического микроскопа Микромед. Фотосъемку бактериальных клеток проводили на микроскопе Биолар ПИ (Польша) камер оснащённого камерой SL-CMOS/CCD.

Описание колоний микроорганизмов проводили с помощью микроскопа МБС 9. Измерение размеров колоний проводили с помощью металлической линейки с шагом 0,05 см. Для достоверности результатов измеряли диаметр у 20 колоний.

2.3.2 Определение размеров клеток микроорганизмов

Размеры клеток микроорганизмов определяют под микроскопом с помощью окулярной линейки (микрометра) [Егорова, 1995]. Окуляр-микрометр вставляли в окуляр на диафрагму между собирательной и глазной линзами. Цену деления его линейки устанавливали с помощью объект-микрометра. Для этого объект-микрометр устанавливали на столик микроскопа и фокусировали при увеличении х8. Изображение линейки перемещали в центр поля зрения и меняли объектив х40. Устанавливали линейки обоих микрометров параллельно и совмещают их первые черты (метки «0»). По принципу нониуса находили следующее совмещение черт и определяли, скольким делениям объект-микрометра соответствует одно деление окуляр-микрометра.

Заменяли объект-микрометр препаратом и при том же увеличении измеряли исследуемые препараты лактобактерий. Для достоверности результатов выполняли измерения длины и ширины проводили у 20 клеток.

Для измерения размеров клеток использовали живые препараты, приготовленные из 24-часовой культуры, выращенной в жидкой среде. Результаты измерений выражали в микрометрах (мкм).

2.3.3 Получение наночастиц селена

Водорастворимую композицию наночастиц селена получали по оригинальной методике, разработанной в Крымском федеральном университете им. В.И. Вернадского. Для этого селенистокислый натрий (х.ч.) восстанавливали L-цистеином (Synex Pharma, Китай) в присутствии природного полисахарида альгината натрия (BioPolymer, Норвегия). Реакцию восстановления ионного селена проводили при рН= 6,5-7,0, при температуре 293 К. Концентрация селена в водном растворе составляла 0,050 г/л, альгината натрия - 1,00 г/л, массовое соотношение концентраций нуль-валентного селена: альгината натрия было равно 0,050. В результате окислительно-восстановительной реакции образовывался красновато-оранжевый коллоидный раствор наноселена с максимумом оптического поглощения при длине волны л = 253 нм, что свидетельствовало об образовании наночастиц селена. Электронные спектры поглощения регистрировали с помощью псевдо-двухлучевого сканирующего спектрофотометра Shimadzu UV-1280 (Япония) в рабочем диапазоне длин волн 200-500 нм. Определение размера образующихся селеносодержащих наноструктур и изучение поверхности тонких пленок, полученных из водных растворов альгината и наноселена, проводили на сканирующем мультимикроскопе (СММ-2000, Россия). При изучении структур поверхности тонких пленок наблюдали наличие изолированных наноструктур, имеющих сферическую форму со средним диаметром частиц - 34 нм.

...