2.3.4 Спектрофотометрический метод

Для измерения оптической плотности культур микроорганизмов проводили на фотометре Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США). Микроорганизмы культивировали в 96-луночном планшете объемом 1,5 мл.

В 6 колб со 100 мл стерильной питательной среды MRS вносили коллоидный раствор наноселена в концентрациях от 0,05 до 0,25 мг/л и 1,0 мл культуры микроорганизмов и тщательно перемешивали. Из каждой колбы дозатором отбирали по 400 мкл и вносили в 12 лунок планшета. Планшет заклеивали одноразовой пленкой. Все манипуляции проводили в бактерицидном боксе, с соблюдением правил асептики.

Планшеты культивировали в фотометре Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США) при температуре 36 °С в режиме постоянного встряхивания. Определение оптической плотности среды проводили при длине волны л = 620 нм с периодичностью 1 час в течение 70 ч.

2.3.5 Изучение антагонистической активности методом агаровых блоков с отсроченным антагонизмом, проводили глубинным способом. 1 мл 2-х суточной культуры лактобактерий вносили в стерильную чашку Петри и смешивали с охлажденной до 45°С средой МRS, тщательно размешивали и термостатировали при 37 єС 24 часа. Суточные культуры фитопатогенной бактерии X. campestris вносили в чашки Петри, заливали их питательной средой Кинг В охлажденной до 45°С, тщательно размешивали. После застывания среды вырезали 4-6 лунок, в которые вставляли блоки МRS с глубинно выращенным штаммом лактобактерии, вырезанным тем же пробочным сверлом. После внесения блоков в лунки, чашки Петри помещали на экспозицию при 5 °С на 5 часов для диффузии метаболитов лактобактерии в агаровую пластинку. Затем чашки Петри термостатировали при температуре 37 °С 18-24 часа. На следующие сутки измеряли диаметр зоны задержки роста фитопатогенного микроорганизма в мм.

2.3.6 Определение морфометрических показателей и биологической продуктивности растений

Измерения ростовых показателей 7-дневных растений (длины надземной части), выращенных в контрольных и опытных вариантах проводили с помощью металлической линейки с шагом 0,05 см. Ростовые показатели растений выражали в % к контролю.

Определение биологической продуктивности. Биологическую продуктивность (массу сухого вещества корней и надземной части) растений, выращенных на контрольных и опытных вариантах в водной культуре, измеряли весовым методом на электронных весах (GH-300). Массу сухого вещества определяли после высушивания в сушильном шкафу при температуре 105 ^оС до постоянного веса. Расчет массы сырого и сухого вещества корней и надземной части проводили на 1 растение и выражали в % к контролю.

2.3.7 Методы статистической обработки результатов

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием компьютерных программ Microsoft® Excel 2010 и Statistica v.6.0. Stat Soft Inc, рассчитывая среднюю арифметическую и стандартную ошибку средней арифметической. Достоверность различий между вариантами оценивали по t-критерию Стьюдента. Результаты считали достоверными в случае, если р?0,05.



РАЗДЕЛ 3. ОХРАНА ТРУДА

Правила работы с микроорганизмами.

1. Работа проводится только с производственными штаммами, которые имеют заключение органов здравоохранения о безопасности: сведения о наличии авторского свидетельства; справка о депонировании штамма; паспорт на штамм; официальное подтверждение. Госхимкомиссии о включении биопрепарата на основе штамма в список химических, биологических препаратов, разрешенных для применения в сельском хозяйстве. Производство микробиологических средств защиты растений в биолабораториях и на биофабриках возможно только при наличии утвержденных в установленном порядке ТУ и технологического регламента.

2. Для работы с микроорганизмами должны быть выделены специальные помещения: боксы для посева, помещение для подготовки сред, термостатная, автоклавная.

3. В боксах и других специальных помещениях, где проводится работа с микроорганизмами, нельзя употреблять пищу и использовать личные вещи. Работу с культуральной жидкостью, пастой, сухими препаратами следует проводить в респираторах, либо в ватно-марлевой повязке, резиновых перчатках, в головных уборах, глаза защищают герметическими очками, спецодежда должна быть застегнута.

4. В процессе работы по посеву микроорганизмов запрещается пипетирование ртом. Необходимо пользоваться шприцем непрерывного действия, грушами, баллонами.

5. После окончания работы рабочее место должно быть убрано и продезинфицировано 5 %-м раствором хлорамина, или 10 %-м раствором медного купороса, или 3 %-м раствором перекиси водорода не менее одного раза в день, а грязные пипетки обработаны в 5 %-м растворе перекиси водорода или фенола, затем простерлизованы в автоклаве при 1,5 атм в течение одного часа.

6. Халаты, шапочки, полотенца, используемые для работы с микроорганизмами, до передачи в стирку обезвреживаются автоклавированием при 1,5 атм в течение одного часа или кипячением в 2 %-м растворе соды один час. Ватно-марлевые маски, перчатки обрабатываются кипячением в 2 %-м растворе соды в течение одного часа.

7. Категорически запрещается слив продуктов жизнедеятельности микроорганизмов в канализацию, а также хранение чашек и пробирок с культурами микроорганизмов в открытом виде. Использованная культуральная жидкость перед сливом в канализацию должна стерилизоваться автоклавированием.

8. После окончания работы вымыть руки теплой водой с мылом, прополоскать рот.

9. Соблюдение стерильности при работе с микроорганизмами обеспечивает качество наработки биопрепаратов и безопасность работников.

10. Для очистки воздуха помещения и в процессе сушки препарата необходимо использовать установки фильтрации воздуха, состоящие из последовательно установленных фильтров грубой очистки и фильтров для ультравысокой эффективной очистки из ткани ФПП-15-30 [ГОСТ 12.4.113-82. Система стандартов безопасности труда. Работы учебные лабораторные…, 1983].



РАЗДЕЛ 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1 Влияние наноселена на накопление биомассы лактобактерий

Во многих странах применяют кисломолочные продукты и другие продукты питания, которые обогащенны селеном. Для этого лактобактерии культивируют на питательных средах с добавлением селена [Щедрин, Беляков, 2008]. По литературным данным, штаммы лактобактерий могут собирать селен или биотрансформировать соли селена в селенаминокислоты, наноселен или летучие соединения селена [Блинов, Буршина, 2008].

Лактобактерии могут расти при высоком содержании селенита натрия в питательной среде - до 198 мг/л [Селектор, 2008]. Согласно экспериментам, проведенным на L. bulgaricus, селен собирается в цитоплазме и во внеклеточном пространстве, при этом он не токсичен. Концентрирование питательных сред селеном, заставляет рост лактобацилл и увеличивает их способность подавлять условно-патогенную и патогенную микрофлору [Гуненко, 2014].

Внесение в питательную среду MRS коллоидного раствора наноселена в исследованных концентрациях оказало влияние, как на накопление биомассы культур штаммов L. casei IMB B-7343 и L. plantarum IMB B-7344, так и на сроки прохождения бактериями основных фаз развития.

В лаг-фазу (0-10 часов) между контрольным и опытным вариантами штамма L. casei IMB B-7343 начали проявляться отличия: у вариантов с 0,1-0,25 мг/л наноселена оптическая плотность превышала контроль на 8,3%, вариант с 0,05 мг/л наноселена - на 16% (рис. 4.1). Фазу ускорения контрольный вариант проходил на 2-4 часа позже чем, опытные.

Фаза экспоненциального роста в опытных вариантах составила 16-18 часов, в контроле - 24 часа. Оптическая плотность штамма L. casei IMB B-7343 с 1,0 мг/л наноселена до 31 часа культивирования превышала контрольный показатель, но к 70 часу культивирования была на 6,2% ниже контроля. Аналогичная тенденция отмечена и при культивировании штамма L. casei IMB B-734 в присутствии раствора 0,05 мг/л наноселена, но на 61 час культивирования.

Рис. 4.1. Накопление биомассы культуры штамма L. casei IMB B-7343 на питательной среде MRS с добавлением коллоидного раствора наноселена.

При культивировании штамма L. casei IMB B-734 с концентрациями 0,15-0,25 мг/л наноселена к окончанию экспоненциальной фазы оптическая плотность увеличилась на 8,0% по сравнению с контролем, а к окончанию культивирования - на 5,2 -11,3% соответственно.

Внесение в питательную среду MRS коллоидного раствора наноселена оказало стимулирующее влияние на накопление биомассы штамма L. plantarum IMB B-7344 (рис. 4.2). Лаг-фаза и II фаза развития культуры в контрольном и опытных вариантах происходила синхронно (первые 17 часов культивирования).

Рис. 4.2. Накопление биомассы культуры штамма L. plantarum IMB B-7344 на питательной среде MRS с добавлением коллоидного раствора наноселена.

В log-фазу в опытных вариантах культура развивалась быстрее контрольного варианта в среднем на 5 часов. По данным оптической плотности штамма IMB B-7344 между исследуемыми концентрациями наноселена достоверных отличий нет, но по сравнению с контрольным вариантом этот показатель увеличен на 63,6%. Фаза замедления роста в опытных вариантах, независимо от концентрации наноселена наступала раньше на 4 часа (с 39 по 45 час культивирования), чем в контрольном варианте (с 43 по 49 час).

В стационарную фазу, во всех исследованных концентрациях наноселена, оптическая плотность культуры на 45,4 - 54,6 % превосходила контрольный вариант.



4.2 Влияние наноселена на культурально-морфологические характеристики лактобактерий

При модификации питательной среды MRS коллоидным раствором наноселена в концентрациях 0,05-0,25 мг/л штаммов L. casei IMB B-7343 и L. plantarum IMB B-7344 изменений культурально-морфологических свойств и размеров клеток не отмечено.

Штамм L. casei IMB B-7343 на твердой питательной среде, как в контрольных, так и в опытных вариантах образовывал белые блестящие круглые колонии, с ровным краем, гладкой поверхностью и выпуклым профилем (рис. 4.3). Структура колоний однородная, при прикосновении бактериальной петлёй - колонии мягкие, снималась с поверхности питательной среды полностью. Диаметр колоний составил 1,5-1,7 мм (табл. 4.1).

Рис. 4.3. Колонии штамма L. casei IMB B-7343 на твердой питательной среде MRS с добавлением коллоидного раствора наноселена [фото автора].

Клетки L. casei IMB B-7343 во временном препарате, как контрольном, так и в опытном вариантах, представлены кривыми одиночными или образующими короткие цепочки палочками разной длины, от коротких до средних (рис.4.4). Размер клеток варьировал от 1,1-1,2 х 0,6-0,8 мкм (табл. 4.1).

Таблица 4.1

Влияние коллоидного раствора наноселена на размер колоний и клеток штамма L. casei IMB B-7343

Вариант опыта	Размер колоний	Размер клеток
MRS (контроль)	1,7±0,4	1,1±0,5 х 0,6±0,2
MRS + 0,05 мг/л Seo	1,6±0,3	1,2±0,4 х 0,8±0,3
MRS + 0,1 мг/л Seo	1,5±0,5	1,1±0,5 х 0,7±0,3
MRS + 0,15 мг/л Seo	1,6±0,4	1,0±0,5 х 0,6±0,4
MRS + 0,2 мг/л Seo	1,7±0,3	1,1±0,4 х 0,7±0,3
MRS + 0,25 мг/л Seo	1,7±0,4	1,1±0,4 х 0,6±0,2

Рис. 4.4. Клетки штамма L. casei IMB B-7343 на питательной среде MRS с добавлением коллоидного раствора наноселена [фото автора].

Штамм L. plantarum IMB B-7344, как в опытных, так и контрольном вариантах образовывал прозрачные, бесцветные круглые колонии с волнистым краем (рис.4.5). Структура точечных колоний струйчатая, профиль выпуклый, максимальный диаметр составлял до 1 мм (табл. 4.2). При прикосновении петлей - колонии сухие, хрупкие, рыхлые.

Рис. 4.5. Колонии штамма L. plantarum IMB B-7344 на твердой питательной среде MRS с добавлением коллоидного раствора наноселена [фото автора].

При микроскопировании культуры L. plantarum IMB B-7344 отмечено, что в вариантах с добавлением в питательную среду коллоидного раствора наноселена в концентрации 0,05-0,25 мг/л штамм образовывал цепочки по 5-6 клеток, в то время как в контрольном варианте наблюдали преимущественно одиночные и парные клетки (рис. 4.6). Достоверных отличий в размере клеток штамма IMB B-7344, в контрольном и опытных вариантах не отмечено. Размер клеток составлял 1,8-2,0 х 0,6-0,8 мкм (табл. 4.2).

Рис. 4.6. Клетки штамма L. plantarum IMB B-7344 на питательной среде MRS с добавлением коллоидного раствора наноселена [фото автора].



Таблица 4.2

Влияние коллоидного раствора наноселена на размер колоний и клеток штамма L. plantarum IMB B-7344

Вариант опыта	Размер колоний, мм	Размер клеток, мкм
MRS (контроль)	1,0±0,1	1,9±0,3 х 0,7±0,1
MRS + 0,05 мг/л Seo	1,0±0,1	1,8±0,2 х 0,6±0,1
MRS + 0,1 мг/л Seo	1,1±0,1	1,9±0,4 х 0,7±0,1
MRS + 0,15 мг/л Seo	1,0±0,1	1,9±0,3 х 0,7±0,1
MRS + 0,2 мг/л Seo	1,0±0,1	2,0±0,2 х 0,8±0,1
MRS + 0,25 мг/л Seo	1,0±0,1	1,9±0,2 х 0,6±0,1

Таким образом, полученные в результате культивирования лактобактерий на среде MRS с добавлением коллоидного раствора наноселена в изученных концентрациях 0,05-0,25 мг/л свидетельствуют, что исследуемая форма наноселена стимулирует накопление биомассы лактобактерий и не вызывает изменение культурально-морфологических свойств микроорганизмов.

4.3 Влияние лактобактерий, культивированных на средах с наноселеном, на фитопатогенные бактерии

Известно, что различные соединения селена, способны подавлять рост условно-патогенных и патогенных бактерий. Так, элементарный селен подваляет рост E. coli, а 0,2 % раствор наночастиц селена - рост P. aeruginosa и S. aureus. В литературе описано, что бактерий рода Lactobacillus, выращенные на питательных средах, содержащих селенометионин и селеноцистеин, эффективно подавляют рост патогенной E. coli. Отмечено, что штаммы L. plantarum и L. johnsonii, выращенные на питательных средах, содержащих наноселен, подавляют рост гриба Candida albicans. Штамм L. gasseri 55, выращенный на питательной среде с селенитом натрия подавляют условно-патогенные бактерии: S. enterica, K. pneumoniae, S. flexneri, P. vulgaris и S. epidermidis [Алдошин, 2008].

В результате проведенных исследований показано, что при добавлении в питательную среду MRS коллоидного раствора наноселена в концентрациях 0,05-0,25 мг/л, наблюдалось увеличение антагонистической активности штаммов лактобактерий L. casei IMB B-7343 и L. plantarum IMB B-7344 по отношению к фитопатогенной бактерии X. campestris В-4102, по сравнению с контрольным вариантом (табл. 4.3).

Зона подавления роста фитопатогенной бактерии штамма X. cаmpestris В-4102 при добавлении коллоидного раствора наноселена в питательную среду MRS для штамма L. casei IMB B-7343 в опытных вариантах увеличилась на 6-7 мм по сравнению с контролем. Для штамма L. plantarum IMB B-7344 этот показатель был выше - в опытных вариантах зоны подавления фитопатогена на 14,5-15 мм были больше чем в контроле. Достоверной разницы между концентрациями наноселена (0,05-0,25 мг/л) в питательной среде MRS и проявлением антагонистической активности штамма L. casei IMB B-7343 не отмечено.

Таблица 4.3

Антагонистическая активность штаммов L. casei IMB B-7343 и

L. plantarum IMB B-7344 относительно X. cаmpestris В-4102

Варианты опыта	Зоны подавления роста X. cаmpestris В-4102, мм
	L. casei IMB B-7343	L. plantarum IMB B-7344
MRS (контроль)	45,0±0,5	40,0±1,3
MRS + 0,05 мг/л Seо	51,0±1,0	54,5±0,5
MRS + 0,1 мг/л Seо	51,0±1,1	55,0±0,8
MRS + 0,15 мг/л Seо	52,0±0,8	55,0±0,7
MRS + 0,2 мг/л Seо	52,0±1,0	55,0±1,0
MRS + 0,25 мг/л Seо	52,0±1,2	55,0±1,1

Таким образом, антагонистическая активность по отношению к X. cаmpestris В-4102 у лактобактерий, культивированных на питательной среде MRS с коллоидным раствором наноселена выше, чем в контрольном варианте: у штамма L. casei IMB B-7343 на 13,3-15,5 %, а у штамма L. plantarum IMB B-7344 - на 36-37,5 % (рис. 4.7).

Рис. 4.7. Антагонистическая активность L. casei IMB B-7343 (а) и L. plantarum IMB B-7344 (б) относительно X. campestris В-4102 [фото автора].

Таким образом, культивирование лактобактерий на среде MRS с добавлением коллоидного раствора наноселена в концентрациях 0,05-0,25 мг/л повышает антагонистическую активность по отношению к X. campestris В-4102. Модификация питательных сред коллоидным раствором наноселена может увеличить способность лактобактерий подавлять фитопатогены растений.

4.4 Влияние лактобактерий, культивированных на среде с наноселеном, на ростовые процессы растений на ранних этапах развития

Большая часть исследований, направленных на практическое применение микроорганизмов, культивированных на средах, содержащих селен, направлена на получение наноселена, который в свою очередь используется в медицинской и пищевой промышленности.

Так, лактобактерии Lactobacillus brevis, содержащие внутриклеточные наночастиц селена, обладали иммуностимулирующим действием, продлевая срок жизни больных раком мышей при пероральном введении. В ряде исследований лактобактерии использовали для получения, обогащенного селеном йогурта. Исследований по влиянию на растения микроорганизмов, выращенных на средах, содержащих селен в каком-либо соединении, в том числе нанослен, ранее не проводилось.

В результате проведенных нами исследований показано, что лактобактерии, культивированные на среде с наноселеном стимулируют ростовые процессы на ранних этапах развития, как однодольных, так и двудольных культур (табл. 4.4 - 4.7).

При сравнении морфометрических показателей проростков пшеницы сорта Надор и гороха сорта Мадонна, выросших в воде (контроль 1), в растворе лактобактерий культивируемых на среде MRS (контроль 2) и в растворе лактобактерий, культивируемых на среде MRS с наноселеном отмечено, что лактобактерии, культивируемые на среде с ноноселеном стимулирует рост растений больше, чем лактобактерии на среде MRS.

Таблица 4.4

Влияние штамма L. casei IMB B-7343 на ростовые процессы гороха посевного сорта Мадонна

на ранних этапах развития

Варианты опыта	Длина корня	Длина надземной части	Сухая биомасса корня	Сухая биомасса надземной части
	средняя, см	к контролю, %	средняя, см	к контролю, %	средняя, г	к контролю, %	средняя, г	к контролю, %
Контроль 1 (вода)	9,30± 0,39	95,88	1,76±0,09	76,85	0,55	91,67	0,25	86,21
Контроль 2 (MRS)	9,70±0,31	100	2,29±0,1	100	0,60	100	0,29	100,00
MRS + 0,05 мг/л Seо	9,90±0,26	102,06	2,35±0,07	102,60	0,61	101,67	0,30	103,45
MRS + 0,1 мг/л Seо	9,91±0,27	102,17	2,39±0,16	104,37	0,63	105,00	0,31	106,89
MRS + 0,15 мг/л Seо	10,21±0,30	105,26	2,40±0,13	104,80	0,64	106,67	0,31	106,89
MRS + 0,2 мг/л Seо	10,73±0,32	110,62	2,39±0,15	104,37	0,65	108,33	0,31	106,89
MRS + 0,25 мг/л Seо	10,98±0,29	113,20	2,47±0,11	107,86	0,66	110,00	0,31	106,89

Таблица 4.5

Влияние L. casei IMB B-7343 на ростовые процессы пшеницы сорта Надор на ранних этапах развития

Варианты опыта	Длина корня	Длина надземной части	Сухая биомасса корня	Сухая биомасса надземной части
	средняя, см	к контролю, %	средняя, см	к контролю, %	средняя, г	к контролю, %	средняя, г	к контролю, %
Контроль 1 (вода)	5,29±0,50	79,67	9,09±0,43	89,29	0,12	92,00	0,18	78,26
Контроль 2 (MRS)	6,64±0,50	100,00	10,18±0,42	100	0,13	100,00	0,23	100,00
MRS + 0,05 мг/л Seо	6,99±0,73	105,30	10,50±0,52	103,14	0,15	115,38	0,24	104,35
MRS + 0,1 мг/л Seо	7,59±0,56	114,31	10,75±0,44	105,60	0,15	115,38	0,24	104,35
MRS + 0,15 мг/л Seо	7,74±0,41	116,57	10,82±0,45	106,29	0,16	123,08	0,25	108,70
MRS + 0,2 мг/л Seо	8,05±0,39	121,23	10,95±0,51	107,56	0,16	123,08	0,26	113,04
MRS + 0,25 мг/л Seо	8,09±0,51	121,84	11,11±0,45	109,13	0,17	130,77	0,27	117,39

Таблица 4.6

Влияние L. plantarum IMB B-7344 на ростовые процессы гороха посевного сорта Мадонна на ранних этапах развития

Варианты опыта	Длина корня	Длина надземной части	Сухая биомасса корня	Сухая биомасса надземной части
	средняя, см	к контролю, %	средняя, см	к контролю,%	средняя, г	к контролю, %	средняя, г	к контролю, %
вода (контроль 1)	7,95±0,32	81,2	2,49±0,07	65,70	0,377	89,13	0,275	78,57
MRS (контроль 2)	9,79±0,22	100,00	3,79±0,09	100,00	0,423	100,00	0, 35	100,00
MRS + 0,05 мг/л Seо	10,49±0,31	107,15	4,3±0,08	113,46	0,475	112,29	0, 367	104,85
MRS + 0,1 мг/л Seо	10,82±0,27	110,52	4,32±0,05	113,98	0,492	116,31	0,374	106,86
MRS + 0,15 мг/л Seо	10,78±0,25	110,13	4,34±0,08	114,51	0,498	117,73	0,381	108,86
MRS + 0,2 мг/л Seо	10,84±0,24	110,72	4,35±0,05	114,78	0,513	121,28	0,391	111,71
MRS + 0,25 мг/л Seо	10,9±0,30	111,34	4,37±0,06	115,30	0,540	127,66	0, 419	119,71



Таблица 4.7

Влияние L. plantarum IMB B-7344 на ростовые процессы пшеницы сорта Надор на ранних этапах развития

варианты опыта	длина корня	длина надземной части	сухая биомасса корня	сухая биомасса надземной части
	средняя, см	к контролю, %	средняя, см	к контролю, %	средняя, г	к контролю, %	средняя, г	к контролю, %
вода (контроль 1)	7,13±0,27	81,77	7,18±0,24	81,68	0,094	93,07	0,177	90,31
MRS (контроль 2)	8,72±0,21	100	8,79±0,26	100	0,101	100	0,196	100
MRS + 0,05 мг/л Seо	10,03±0,26	115,02	9,98±0,25	113,54	0,111	109,9	0,219	111,73
MRS + 0,1 мг/л Seо	10,25 ±0,23	117,55	10,22±0,22	116,27	0,116	114,8	0,228	116,33
MRS + 0,15 мг/л Seо	10,17±0,2	116,63	10,52±0,26	119,68	0,121	119,80	0,232	118,37
MRS + 0,2 мг/л Seо	10,40±0,27	119,27	10,63±0,29	120,93	0,120	118,81	0,234	119,39
MRS + 0,25 мг/л Seо	10,61±0,24	121,67	10,7±0,28	121,73	0,127	125,74	0,250	127,55

Показано, что штамм L. casei IMB B-7343, культивируемый на питательной среде с наноселеном в концентрациях 0,05-0,25 мг/л (табл. 3.4), стимулирует длину корня гороха посевного сорта Мадонна на 2,06-13,20 % и надземной части на 2,60-7,86% сравнению с контролем 2 (лактобактерии, культивируемые на классической среде MRS). На растениях пшеницы сорта Надор штамм L. casei IMB B-7343 оказал стимулирующий эффект по сравнению с контролем 2 - длина корня увеличилась на 5,30-21,84%, а надземная часть - на 3,14-9,13% соответственно (табл. 4.5).

Штамм L. plantarum IMB B-7344, культивируемый на среде MRS, стимулировал рост корней гороха на 18,8% и пшеницы на 18,3%, а рост побегов гороха на 34,3% и пшеницы - на 18,32 % по сравнению с контролем 1.

Штамм L. plantarum IMB B-7344 стимулирует длину корня гороха посевного сорта Мадонна в зависимости от концентрации наноселена на 7,15-11,34 %, а надземной части - на 13,46-15,33 % по сравнению с контролем 2 (табл. 4.6; рис. 4.8). На растениях пшеницы сорта Надор (рис. 4.9) также отмечен стимулирующий эффект: L. plantarum IMB B-7344, культивируемый на питательной среде с наноселеном, стимулировал длину корня пшеницы сорта Надор на 7,15-21,67 %, надземную часть - на 13,54-21,73% по сравнению с контролем 2 (табл. 4.7).

а б в г

Рис. 4.8. Растения гороха сорта Мадонна, выросший на 1,0% растворах лактобактерий с различными концентрациями наноселена: а - контроль (вода), б - L. plantarum IMB B-7344, в - L. plantarum IMB B-7344 + 0,05 мг/л Se^о, г - L. plantarum IMB B-7344 + 0,1 мг/л Se^о [фото автора].

а б в г

Рис. 4.9. Растения пшеницы сорта Надор, выросшие на 1,0% растворах лактобактерий с различными концентрациями наноселена: а - контроль (вода), б - L. plantarum IMB B-7344+ 0,1 мг/л Se^о, в - L. plantarum IMB B-7344 + 0,15 мг/л Se^о, г - L. plantarum IMB B-7344 + 0,2 мг/л Se^о [фото автора].

С увеличением концентрации наноселена в питательной среде увеличивались ростостимулирующие свойства лактобактерий. Данные по влиянию лактобактерий, культивируемых на среде MRS с наноселеном, полученные при изучении морфометрических показателей, подтверждены данными полученными при изучении сухой биомассы растений.

Сравнение ростостимулирующей активности двух штаммов лактобактерий показало, что штамм L. plantarum IMB B-7344, культивируемый на среде MRS обладает большей ростостимулирующей активностью, чем штамм L. casei IMB B-7343. Культивирование лактобактерий на среде с добавлением наноселена приводит к увеличению стимуляции роста лактобактерий. Для обоих штаммов лактобактерий наибольшая стимуляция роста, как однодольных, так и двудольных растений, отмечена при использовании 0,25 мг/л наноселена.



ВЫВОДЫ

1. Установлено, что при культивировании лактобактерий в питательной среде MRS с добавлением наноселена в концентрации 0,25 мг/л оптическая плотность штамма L. casei IMB B-7343 увеличилась на 11,3%, а L. plantarum IMB B-7344 - на 63,6% по сравнению с контролем.

2. Показано, что при внесении в питательную среду MRS наноселена у штамма L. casei IMB B-7343 не наблюдалось достоверных изменений культурально-морфологических свойств, а у штамма L. plantarum IMB B-7344 происходило образование цепочек по 5-6 клеток, в то время как в контроле наблюдали преимущественно одиночные и парные клетки.

3. При добавлении в питательную среду MRS наноселена в концентрациях 0,05-0,25 мг/л наблюдалось увеличение антагонистической активности изучаемых штаммов лактобактерий по отношению к фитопатогенной бактерии X. campestris В-4102. Наибольшая зона подавления фитопатогена отмечена у штамма L. plantarum IMB B-7344 и превысила значение контрольного варианта на 15 мм.

4. Показано, что лактобактерии, культивируемые на среде с наноселеном оказывают стимулирующее действие на морфометрические показатели проростков: штамм L. casei IMB B-7343 оказывает большее влияния на рост корней, по сравнению с надземной частью, а штамма L. plantarum IMB B-7344.

5. Полученные в результате исследований параметры культивирования лактобактерий на среде MRS с добавлением наноселена в концентрациях 0,05-0,25 мг/л свидетельствуют, что штаммы L. casei IMB B-7343 и L. plantarum IMB B-7344 являются технологичными и с учетом их антагонистической и ростстимулирующей активности могут быть рекомендованы для разработки комплексного биопрепарата.



СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Алдошин, А. В. Отчет о результатах применения микробиологического препарата удобрения «Байкал ЭМ 1» при возделывании сахарной свеклы в КФК «Алдошины» / А. В. Алдошин // Биологические препараты. Сельское хозяйство. Экология: Практика применения // ООО «ЭМ-кооперация». - М. - 2008. - С. 115-116.

2. Ареал вредоносности обыкновенной пятнистости фасоли [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://dacha5.ru/bolezni-i-vrediteli/obyiknovennaya-pyatnistost-fasoli-xanthomonas-campestris.html (дата обращения: 05.04.2021 г.).

3. Биологическая активность наноразмерного коллоидного селена / И. Н. Никонов, Ю. Г. Фолманис, Л. В. Коваленко [и др.] // Доклады академии наук. - 2012. - Т. 447. - № 6. - С. 675-677.

4. Блинкова, Л. П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления / Л. П. Блинкова // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 2003. - № 3. - С. 109-113.

5. Блинов, В. А, Буршина, С. Н. Особенности роста и развития семян столовой свеклы под влиянием биостимуляторов / В. А. Блинов, С. Н. Буршина // Биологические препараты. Сельское хозяйство. Экология: Практика применения. ООО «ЭМ-кооперация». - М. - 2008. - С.119-122.

6. Ботина, С. Г. Генетическая идентификация антагонистически активных штаммов лактобацилл, выделенных из полости рта здоровых людей / С. Г. Ботина, Ю. В. Червинец, К. М. Климина [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - № 11. - С. 43-46.

7. Ботина, С. Г. Генетическое разнообразие бактерий рода Lactobacillus из гастроинтестинальной микробиомы людей / Ботина, С. Г., Коробан, Н. В., Климина [и др.] // Генетика. - 2010. - Т. 46. - №12. - С. 1589-1599.

8. Вихрева, В. А., Блинохватов, А. А., Клейменова, Т. В. Селен в жизни растений: монография / В.А. Вихрева, А.А. Блинохватов, Т. В. Клейменова. - Пенза: РИО ПГСХА. - 2012. - 222 с.

9. Газиев, А. Т. Оценка действия солевого стресса и микробиологического удобрения «Байкал ЭМ1» на активность фотосистемы II и содержание хлорофилла в листьях пшеницы / А. Т. Газиев // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2015. - № 11. - С. 70-71.

10. Гладышева, Т. И. Выращивание огурца с применение «Байкал ЭМ 1» / Т. И. Гладышева // Биологические препараты. Сельское хозяйство. Экология: Практика применения. ООО «ЭМ-кооперация». - М. - 2008. - C. 67-69.

11. Глушанова, Н. А. Биологические свойства лактобацилл / Н. А. Глушанова // Бюллетень сибирской медицины. - 2003. - № 4. - С. 50-58.

12. Голубкина, Н. А. Аккумулирвоание селена зерновыми культурами России / Н. А. Голубкина // Доклады Российской Академии сельскохозяйственных наук. - 2007. - № 5. - С. 6-9.

13. ГОСТ 12038-84. Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести. - М. : Стандартинформ, 2011. - 64 с.

14. Гуненко, А. А. Влияние препарата Эмбико на энергию прорастания и всхожесть семян Cucumis sativus L. Сорта Феникс 640 / Гуненко А. А., Ржевская В. С, Теплицкая Л. М. // Материалы международной научно-практической конференции молодых учёных «Проблемы и перспективы исследований растительного мира», г. Ялта, 13-16 мая 2014. - Ялта, - 2014. - С. 218.

15. Егоров, Н. С. Баранова, И. П. Бактериоцины. Образование, свойства, применение / Н. С. Егоров, И. П. Баранова // Антибиотики и химиотерапия. - 1999. - № 6. - С. 33-40.

16. Ерзинкян, Л. А. Биологическая свойства лактобацилл / Ерзинкян, Л. А., Акопова, А. Б., Цибульская, [и др] // Биология. - 1987. - Т. 37. - С. 847-850].

17. Иванов, А. А. Совместное действие водного и солевого стрессов на фотосинтетическую активность листьев пшеницы разного возраста / А. А. Иванов // Физиология и биохимия культ. растений. - 2013. - Т. 45, № 2. - С. 155-163.

18. Игнатов, А. Н. Xanthomonas arboricola - бактериальный патоген сельскохозяйственных культур в России / А. Н. Игнатов, Н. В. Пунина, Е. В. Матвеева [и др.] // Защита и карантин растений. - 2010. - № 4. - С. 41-43.

19. Кашин, В. К. Биологическое действие и накопление селена в пшенице в условиях селенодефицитной биогеохимической провинции / В. К. Кашин, О. И. Шубина // Химия в интересах устойчивого развития. - 2011. - № 19. - С. 151-156.

20. Квасников, Е. И., Нестеренко, О. Л. Молочнокислые бактерии и пути их использования / Е. И. Квасников, О. Л. Нестеренко. - М. : Наука, -1975. - 389 с.

21. Климентова, Е. Г., Антимикробное действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis в отношении ряда фитопатогенных бактерий / Е. Г. Климентова. - М. : Высшая школа. - 2001. - №5. - С. 95-98.

22. Котляров, Д. В. Совершенствование способов защиты зерновых колосовых культур от бактериозов / автореф. дисс. … на соиск. учён. степени канд. биол. наук / Д. В. Котляров. - Краснодар. - 2010. - 26 с.

23. Кузнецов, В. В. Защитное действие селена при адаптации растений пшеницы к условиям засухи: автореф. дис. на соискан. учен. степ. канд. биол. наук / В. В. Кузнецов. - Москва. - 2004. - 21 с.

24. Кулагина, Ю. М. Влияние селенита натрия на рост и развитие растений пшеницы в зависимости от способа обработки / Ю. М. Кулагина, И. Ф. Головацкая // Вестник Томского государственного университета. Биология. - 2011. - № 2 (14). - С. 56-64.

25. Кумскова, Н. Д. Влияние препарата Кюсей ЭМ-5 на урожайность гречихи / Н. Д. Кумскова // Вестник дальневосточного государственного аграрного университета - 2007. - № 4. - С. 28-30.

26. Литвиненко, Р. А. Рентабельность применения биопрепаратов на зерновых / Р. А. Литвиненко // Новый аграрный журнал. - 2011. - № 3. - С. 14-17.

27. Пантелеева, А. А. Гены продукции микроцина Escherichia coli S5/98, их экспрессия и влияние на антагонистические свойства рекомбинантных штаммов : автореф. дис. ... канд. биол. наук / А. А. Пантелеева. - 2006. - 26 с.

28. Полонская, М. С. Антибиотические вещества ацидофильных бактерий / М. С. Полонская // Микробиология : вып. 3. - 1952. - Т. 21. - С. 303-310.

29. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: учебное пособие / Под ред. Е.С. Егорова. - 3-е изд. перераб. и доп. - М. : Изд-во МГУ, 1995. - 224 с.

30. Санин, С. С. Проблемы фитосанитарии России на современном этапе / С. С. Санин // Известия ТСХА. - 2016. - № 6. - С. 45-55.

31. Селектор, Г. Х. Мой опыт выращивания томатов по ЭМ-технологии / Г. Х. Селектор / Биологические препараты. Сельское хозяйство. Экология: Практика применения // ООО «ЭМ-кооперация». - М. - 2008. - С. 87-91.

32. Соловьёва, Ю. В. Клевера высокогорья РСО-Алания - Природный ресурс систематического разнообразия молочнокислых бактерий : автореф. дисс. … на соиск. учён. степени канд. биол. наук / Ю. В. Соловьёва. - Владикавказ : ФГБОУ ВО Горский ГАУ, 2018. - 9 с.

33. Стоянова, Л. Г. Выделение и идентификация молочнокислых бактерий Lactococus lactis subsp. Lactis с антимикробным действием / Л. Г. Стоянова // Статья «Ветеринарные науки». - Москва. - 2017 - 42 с.

34. Тихонович, И. А. Биопрепараты в сельском хозяйстве. Методология и практика применения микроорганизмов в растениеводстве и кормопроизводстве / И. А. Тихонович. - М. : ВНИИСХМ. - 2005. - 154 с.

35. Точилина, А. Г. Биохимическая и молекулярно-генетическая идентификация бактерий рода Lactobacillus : автореф. дисс. … на соиск. учён. степени канд. биол. наук / А. Г. Точилина. - Нижний Новгород : ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной», 2009. - 3 с.

36. Тюрин, М. В. К механизму антагонистической активности лактобацилл / М. В. Тюрин // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 1989. - № 2. - С. 3-8.

37. Устюгова, Е. А. Синтез антибиотического комплекса широкого спектра действия лактококком Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K : автореф. дис. … на соиск. учён. степени канд. биол. наук / Е. А. Устюгова. - Москва. - 2012. - 26 с.

38. Филиппов, В. А. Бактериоциногенотипирование лактобацилл / В. А. Филиппов // Журн. антибиотики. - 1982. - № 9. - С. 41-44.

39. Черная бактериальная пятнистость томата [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://dacha5.ru/bolezni-i-vrediteli/chernaya-bakterialnaya-pyatnistost-to.html (дата обращения: 22.03.2021).

40. Щедрин, В. А. Беляков, А. В. Об испытании микробиологического удобрения «Байкал ЭМ1» на посевах сахарной свеклы / В. А. Щедрин, А. В. Беляков // Биологические препараты. Сельское хозяйство. Экология: Практика применения // ООО «ЭМ-кооперация». - М. - 2008. - С.116-117

41. Юркова, И. Н., Омельченко, А. В., Панов, Д. А. Влияние наноселена на активность компонентов антиоксидантной системы пшеницы в условиях комбинированного действия засоления и засухи / Ученые записки Крымского федерального университета имени В. И. Вернадского Биология. Химия. Том 5 (71). - 2019. - № 3. - С. 216-225.

42. Biotransformation of Selenium by Lactic Acid Bacteria. / F. Martнnez, M. Gustavo // Formation of Seleno-Nanoparticles and Seleno-Amino Acids. - 2020. - 115 p.

43. Kleerebezem, M., Boerchorst, J., Kranenburg, R. Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1. / M. Kleerebezem, J. Boerchorst, R. Kranenburg [et al.] // PNAS. - 2003. - № 4. - P. 1990-1995.

44. Lactobacillus. Molecular biology From Genomics to Probiotics. / A. Ljungh, T. Wadstrom // Causter Academic Press, UK. - 2009. - 205 p.

45. Ruissen, A., Gagg, M., Toruno, L. Release of soil-borne Xanthomonas campestris pv. campestris in the phyllosphere of cabbage plants. / A. Ruissen, M. Gagg, L. Toruno [et. al.] // In. С. Klement Z, ed. Proceedings 7th International Conference on Plant Pathogenic Bacteria, Budapest, Hungary. - 1989. - P. 299-303.

46. Wang, W. B. Analysis of antioxidant enzyme activity during germination of alfalfa under salt and drought stresses / W. B. Wang, Y. H. Kim, H. S. Lee [et al.] // Plant Physiol Biochem. - 2009. - Vol. 4. - P. 570-577.

47. Williams, P. H. Black rot: a continuing threat to world crucifers / P. H. Williams // Plant disease. - 1980. V. 64. - № 8. - P. 736-742.

48. Zwielehner, J., Handschur, M., Michaelsen, A. DGGE and real-time PCR analysis of lactic acid bacteria in bacterial communities of the phyllosphere of lettuce. / J. Zwielehner, M. Handschur, A. Michaelsen [et al.] // Mol Nutr Food Res. - 2008. - № 52 (5). - Р. 614-623.

Размещено на Allbest.ru

...