Транспорт са2+ в мітохондріях гладеньком`язових клітин

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ. О.В.ПАЛЛАДІНА

ДИСЕРТАЦІЯ

ТРАНСПОРТ СА²⁺ В МІТОХОНДРІЯХ ГЛАДЕНЬКОМ`ЯЗОВИХ КЛІТИН

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор КОСТЕРІН Сергій Олексійович, завідувач відділу біохімії м`язів, заступник директора з наукової роботи Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник ЛІТОШЕНКО Олександр Якович, керівник лабораторії молекулярної генетики Інституту геронтології АМН України; кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник КОЛЧИНСЬКА Людмила Іллівна, старший науковий співробітник відділу нейрохімії Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

Провідна установа - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат дисертації розісланий “27“ лютого 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Іони Са відіграють важливу роль в регуляції багатьох біохімічних та біофізичних процесів, виступаючи як цитоплазматичний сигнальний посередник, який передає інформацію від плазматичної мембрани до внутрішньоклітинних структур [Berchtold M.W. et al., 2000; Somlyo A.P., Somlyo A.V., 2000; Костюк П.Г., 2001; Pu Y., 2001]. Втім, незважаючи на значну кількість експериментальних робіт, присвячених вивченню внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів, механізми підтримання фізіологічно значимої концентрації іонів кальцію в клітині ([Ca²⁺]_i <1 мкМ) все ще з`ясовані недостатньо.

Гладенькі м'язи, разом із скелетовими м'язами та міокардом, відіграють важливу роль у забезпеченні життєдіяльності організму. Серед гла-деньком`язових органів матка займає виключне положення не тільки внаслідок особливої функції, яку вона виконує в організмі при виношуванні плоду та пологах, але й з огляду на реагування на різноманітні фактори середовища, що регулюють скоротливу активність (полові гормони, гормони гіпофіза, медіатори, іони, механічне розтягання та інше) [Wray S. et al., 2001; Kim J. et al., 2002; Curley M. et al., 2002; Kayisli U. et al., 2002]. З метою розробки ефективних методів корекції процесу скорочення - розслаблення міометрія важливим є вивчення мембранних та молекулярних механізмів контролю скоротливої функції матки. Численні порушення цієї функції, які, як правило, є основою різноманітних патологій (слабкість пологової діяльності, спонтанні аборти, передчасні пологи, викидні, атонія, гіпо- і гіпертонус матки тощо), пов`язані значною мірою саме з порушенням внутрішньоклітинного гомеостазу іонів Са, яким, як відомо, належить важлива роль у контролі скорочення - розслаблення гладеньких м'язів [Шуба М.Ф., 2002; Kupittayanant S. et al., 2002; Wray S. et al., 2002]. Регуляція концентрації Са²⁺ у клітинах міометрія, як і інших гладеньких м'язів, забезпечується функціонуванням мембраннозв`язаних Са²⁺-транспортуючих систем [Костерин С.А., 1990; Kosterin S.A. et al., 1994; Sanborn B.M., 2000; Burdyga T., Wray S., 2002]. Отже особливого значення набуває ідентифікація, вивчення властивостей та особливостей регуляції транспортної активності цих систем у гладеньком'язових клітинах.

Суттєва роль у забезпеченні кальцієвого гомеостазу у клітинах збудливих тканин, зокрема, м`язів, у тому числі гладеньких, належить Mg²⁺,ATP-залежним Са²⁺-транспортуючим системам [Duchen M.R., 1999; Sanborn B.M. et al., 2000; Camello-Almaraz C., 2000]. Серед них все більшу увагу привертає до себе електрофоретична Са²⁺-акумулююча система мітохондрій [Kosterin S.A. et al., 1994; Bernardi P., 1999; Duchen M.R., 2000; Kostyuk P.G., 2000; Pozzan T. et al., 2000; Rizzuto R. et al., 2000; Magalhaes P.J., 2001].

Ця система задіяна у процесі передачі сигналу із цитоплазми в мітохондріальний матрикс для стимуляції дихання та окислювального фосфорилювання [Kavanagh N.I. et al., 2000; Евтодиенко Ю.В., 2000; Дерябина Ю.И., 2000]. Значна увага цій транспортній системі приділяється в зв`зку з центральною роллю мітохондрій в механізмах, що пов`язані із клітинним апоптозом [Brustovetsky N., Dubinsky J., 2000; Duchen M.R., 2000; Smaili S.S., 2000; Галитовский В.Е. Гогвадзе В.Г., 2001; Beutner G., 2001].

Іони Са акумулюються у мітохондріях за рахунок електрохімічного трансмембранного потенціалу протонів _H+, який генерується на внутрішній мембрані дихальним ланцюгом чи АТР-синтазою (протонною чи Н⁺-АТРазою, F₀F₁-АТРазою, V комплексом окислювального фосфорилювання) [Литошенко А.Я., 2001; Бойер П.Д., 2001; Blum D.J., 2001]. Розроблені уявлення щодо молекулярно-функціональної організації АТР-синтази як турбіноподібного мотора, що обертається [Литошенко А.Я., 2001].

Втім, дані щодо властивостей системи транспорту Са²⁺ в мітохондріях гладеньких м'язів вельми обмежені. Мова йде, наприклад, за її катіонну та субстратну специфічність, спорідненість до реагентів (Mg²⁺, ATP, субстрат окиснення, фосфат, Са²⁺), чутливість до дії інгібіторів та фізико-хімічних факторів (рН, іонне оточення).

В ряді робіт були наведені переконливі докази того, що деякі метаболіти, зокрема поліамін спермін, у концентраціях, що відповідають такій у цитоплазмі, проявляють істотний активуючий вплив на Са²⁺-транспортуючу систему мітохондрій різних тканин [Дерябина Ю.И., 2000]. Вважають, що зміни концентрації сперміну в клітині можуть призводити до помітного підвищення здатності мітохондрій накопичувати і утримувати іони Са [Евтодиенко Ю.В., 2000]. При вагітності збільшується вміст поліамінів в тканинах матки жінок [Бердинских Н.К., Залеток С.П., 1987]. Проте сучасні уявлення щодо закономірностей впливу сперміну на енергозалежний трансмембранний обмін Са²⁺ у мітохондріях гладеньком'язових клітин матки вельми обмежені. матка реагент мітохондрія

Привабливою експериментальною моделлю для вивчення енерго-залежного транспорту Са²⁺ у внутрішньоклітинних депо гладеньких м`язів є суспензія міоцитів, попередньо оброблених розчином неіонного детергенту дигітоніну з метою підвищення неспецифічної проникності плазматичної мембрани [Horowitz A., 1996; Sutko I.L., 1996; Fiskum G. et al., 2000; Yang Z., 2000]. Як виявилось, використання дигітоніну у невеликих концентраціях (~0,1 мг/мл) не призводить до руйнування ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрій і забезпечує доступ компонентів середовища інкубації (реагенти, інгібітори, іонофори, іони тощо) до внутрішньоклітинних Са²⁺-транспортуючих систем [Kargacin M.E., 1995; Шлыков С.Г. и др., 1997; Дерябина Ю.И., 2000]. При цьому акумуляцію Са²⁺ у мітохондріях у дослідах, виконаних із використанням ізотопної техніки (⁴⁵Са²⁺), можна тестувати як таку, що не є чутливою до дії тапсигаргіну чи циклопіазонієвої кислоти, а накопичення Са²⁺ у ретикулумі - як таке, що гальмується цими інгібіторами [Бабіч Л.Г., 1999; Camello-Almaraz C. et al., 2000; Borisova L.A., 2002; Kupittayanant S. et al., 2002].

Отже, актуальною є надійна біохімічна ідентифікація системи Mg²⁺,ATP-залежного транспорту Са²⁺ у мітохондріях клітин міометрія, вивчення її властивостей та чутливості до дії сперміну.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу біохімії м`язів Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (проблема “Біохімія тварин та людини”): тема 2.10.5 № 0194И013509 “Вивчення біохімічних механізмів регуляції концентрації Са<sup>2+</sup> у гладеньком`язових клітинах та ролі систем енергозалежного транспорту цього катіона у контролі скорочення - розслаблення гладеньких м`язів” (І кв. 1994 - IV кв. 1998 р.); тема 2.10.5, № 0199И000270 “Вивчення біохімічних механізмів електро- та фарма-комеханічного спряження у гладеньких м`язах та ролі систем енергозалежного транспорту Са²⁺ у забезпеченні цього процесу” (І кв. 1999 - IV кв. 2003 р.).

Мета та задачі дослідження. Мета роботи: у дослідах, виконаних на обробленій розчином дигітоніну суспензії гладеньком`язових клітин матки щурів, вивчити з використанням ізотопного методу (⁴⁵Са²⁺) властивості системи Mg²⁺,ATP-залежного транспорту іонів Са у мітохондріях міометрія.

Для досягнення зазначеної мети було сформульовано такі основні задачі:

1. У дослідженнях, проведених із використанням селективних інгібіторів мембранозв`язаних енергозалежних Са²⁺-транспортуючих систем (рутенієвий червоний, азид натрію, тапсигаргін, циклопіазонієва кислота) та Са²⁺-іонофора А-23187, тестувати Mg²⁺,ATP-залежну акумуляцію Са²⁺ у мітохондріях.

2. Вивчити властивості Са²⁺-акумулюючої системи мітохондрій: катіонну та субстратну специфічність, концентраційні залежності впливу реагентів на транспорт Са²⁺, чутливість до дії інгібіторів та фізико-хімічних факторів - рН, одновалентних іонів.

3. Дослідити вплив сперміну на енергозалежне накопичення іонів Са у мітохондріях.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше у дослідах, виконаних на суспензії міоцитів, оброблених розчином дигітоніну (0,1 мг/мл), проведено систематичне дослідження властивостей Са²⁺-акумулюючої системи мітохондрій гладенького м'язу матки.

Доведено, що нечутлива до дії тапсигаргіну і циклопіазонієвої кислоти акумуляція Са²⁺ у міоцитах, оброблених розчином дигітоніну, повністю гальмується рутенієвим червоним та азидом натрія і відбувається у мітохондріях. Значення початкової швидкості транспортного процесу становить 1260+130 пмоль Са²⁺/10⁶ клітин за 1 хв. Транспортна система мітохондрій є специфічною стосовно АТР та іонів Mg.

Двовалентні катіони неспецифічно пригнічують Mg²⁺,ATP-залежний транспорт Са²⁺ у мітохондріях відповідно до послідовності: Cu²⁺ > Ni²⁺ > Co²⁺.

Досліджені та кінетично охарактеризовані залежності швидкості акумуляції Са²⁺ у мітохондріях від концентрацій Mg²⁺, ATP (у присутності сукцинату), сукцинату (у присутності АТР), неорганічного фосфату та Са²⁺.

Вивчена чутливість Са²⁺-акумулюючої системи мітохондрій до апро-бованих інгібіторів Mg²⁺,ATP-залежних мембранозв`язаних кальцієвих помп. Пригнічувальний ефект цих речовин на накопичення Са²⁺ у мітохондріях відповідає послідовності: рутенієвий червоний > еозин Y ~ n-хлормеркурібен-зоат >> о-ванадат ~ азид натрію.

Трансмембранний обмін Са²⁺ у мітохондріях є чутливим до зміни рН середовища інкубації, але не залежить від концентрації іонів Na в ньому.

Поліамін спермін активує Mg²⁺,ATP-залежне накопичення Са²⁺ в мітохондріях (значення уявної константи активації К_а становило 0,43+0,04 мМ).

Одержані результати розширюють сучасні уявлення щодо біохімічних механізмів контролю кальцієвого обміну в гладеньком'язових клітинах, властивостей Са²⁺-транспортуючої системи у мітохондріях цих м'язів.

Практичне значення одержаних результатів. Продемонстровано, що суспензія міоцитів, попередньо оброблених розчином дигітоніну, є перспективною експериментальною моделлю для дослідження властивостей Са²⁺-транспортуючої системи мітохондрій міометрія, вивчення впливу внутрішньоклітинних метаболітів на неї (на прикладі сперміну).

Результати, що були одержані, мають значення для розробки методів спрямованої корекції активності Са²⁺-транспортуючої системи мітохондрій міоцитів матки.

Особистий внесок здобувача. Дисертантка особисто одержувала суспензію гладеньком'язових клітин матки щурів, проводила досліди по вивченню акумуляції іонів Са в мітохондріях клітин міометрія із використанням ізотопної методики (⁴⁵Са²⁺) (деякі з таких експериментів було виконано разом із к.б.н. Шинловою О.П.), а також безпосередньо проводила кінетичний та статистичний аналіз фактичних результатів.

Дисертанткою самостійно здійснено аналіз та узагальнення відповідних літературних даних. Головна ідея та задачі досліджень були сформульовані науковим керівником - доктором біологічних наук, професором Костеріним С.О. Аналіз експериментальних результатів, їх узагальнення, інтерпретацію та формування основних положень і висновків роботи проведено спільно із науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що викладено в дисертації, були апробовані на таких наукових конференціях: конкурс молодих вчених Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України у 2001 р. (ІІ місце); конференція “Биология - наука 21^го века“, Пущино, Росія, 2001 р.; конференція, що була присвячена відкриттю Українського молекулярно-біологічного товариства, 2001 р., Київ, Україна; міжнародна конференція з інформотерапії: теоретичні аспекти і практичне застосування, 2001 р., Київ, Україна; 6-та Пущинська школа-конференція молодих вчених, 2002 р., Пущино, Росія; ІІ Львівсько-Люблінська конференція з експериментальної та клінічної біохімії, 2002 р., Люблін, Польща; VII Український біохімічний з`їзд, 1997 р., Київ, Україна. Результати експериментів доповідались на наукових семінарах відділу біохімії м'язів, загальноінститутському семінарі та засіданнях Вченої Ради Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 4 статті у фахових наукових журналах та 6 тез доповідей у матеріалах міжнародних та українських наукових конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 167 сторінках машинописного тексту і складається з таких розділів: “Вступ”, “Огляд літератури”, “Методи досліджень”, “Результати досліджень та їх обговорення”, “Заключний розділ”, “Висновки” та “Список використаних джерел”, який містить 260 посилань. Робота ілюстрована - 37 рисунками та 4 таблицями.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з одного розділу. Він присвячений загальним уявленням щодо транспорту Са²⁺ у мітохондріях, автоколивань концентрації іонів Са у матриксі мітохондрій і цитозолі клітин, функціональній ролі системи транспорту Са²⁺ в цих субклітинних структурах, а також деяким особливостям транспорту іонів Са в мітохондріях гладеньких м'язів.

MEТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Суспензію гладеньком`язових клітин матки невагітних щурів, естрогенізованих за 16 годин до забору тканини [Rao P. et al., 1986] (внутрішньом`язово вводили 50 мкл 0,1% розчину естрадіолу), одержували із використанням колагенази і соєвого інгібітору трипсину за допомогою методу [Mollard Р. et al., 1986] з деякими модифікаціями.

Функціональну активність електрофоретичної Mg²⁺,АТР-залежної Са²⁺-транспортуючої системи мітохондрій (МХ) тестували в експериментах, що були виконані на суспензії міоцитів матки, оброблених розчином дигітоніну. Концентрація дигітоніну у стандартному середовищі інкубації (склад наведено у розділі “Результати досліджень та їх обговорення”) становила 0,1 мг/мл. Доведено, що додавання дигітоніну у цій концентрації беспосередньо в середовище інкубації надійно забезпечує підвищення неспецифічної проникності плазматичної мембрани клітин міометрія і, відповідно, доступність ефекторів (реагенти, інгібітори тощо) до енергозалежних Са²⁺-транспортуючих систем, локалізованих у внутрішньоклітинних структурах, та не впливає на структурно-функціональні властивості цих структур [Fiscum G. et al., 1985; Шлыков C.Г. и др., 1997]. Енергозалежну акумуляцію Са²⁺ в ендо-плазматичному ретикулумі гальмували тапсигаргіном (100 нМ). Для пригнічення енергозалежного накопичення Са²⁺ у МХ використовували рутенієвий червоний (10 мкМ) або азид натрію (10 мМ).

Транспорт Са²⁺ у МХ клітин міометрія щурів, за умов обробки останніх розчином дигітоніну, вивчали за допомогою ізотопної методики з вико-ристанням ⁴⁵Са²⁺ (див. розділ “Результати досліджень та їх обговорення”). Як правило, акумуляцію Са²⁺ ініціювали внесенням аліквоти (50 мкл) суспензії міоцитів (кінцева кількість клітин в пробі - 200-500 тисяч) в стандартне або модифіковане по своєму складу середовище інкубації (об`єм - 0,5 мл). Кількість Са²⁺, акумульованого МХ міоцитів в енергозалежному процесі (пмоль/10⁶ клітин), розраховували по різниці між загальним накопиченням цього катіону із стандартного (чи модифікованого по концентраціям реагентів) середовища інкубації та його адсорбцією на поверхні субклітинних структур у випадку використання інкубаційних середовищ, що не містять АТР (або MgCl₂). При вивченні пасивного транспорту Са²⁺ в МХ клітини матки попередньо навантажували ⁴⁵Са²⁺ в стандартному середовищі інкубації із наступним гальмуванням подальшої акумуляції Са²⁺ в МХ рутенієвим червоним (10 мкМ). В усіх дослідах транспортні процеси зупиняли шляхом швидкого фільтрування інкубаційної суміші через мембранні фільтри ("Хіміфіл", Естонія або "Millipor", США) (діаметр пор 0,45 мкм). Радіо-активність фільтрів вимірювали за допомогою сцинтиляційного лічильника.

Необхідний діапазон концентрацій іонізованого Са задавали із використанням ЕГТА-вмісного середовища інкубації, до складу якого входили АТР, MgCl₂, CaCl₂, сукцинат та фосфат [Костерин С.А., 1990].

Експериментальні дані були оброблені із застосуванням загальноприйнятих методів кінетичного аналізу та варіаційної статистики із використанням персонального комп`ютера типу IBM PC/AT за спеціально складеними програмами [Варфоломеев С.Д., 1999]. Графіки побудовано за допомогою програми Excel. Уявні квазірівноважні константи, що характеризують спорідненість Са²⁺-транспортуючої системи до реагентів (К_m по АТР та сукцинату, К_Mg²⁺ по Mg²⁺, К_Ca²⁺ по Са²⁺) та ефекторів (І_0,5 - для інгібіторів та іонів металів, К_а - по сперміну) розраховували, виходячи із лінеаризованих рівнянь Хілла, Ейзенталя-Корніш-Боуден, Едді-Хофсті. Зна-чення коефіцієнтів кореляції r лінеаризованих графіків становили 0,96 - 0,99.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Тестування Mg²⁺,ATP-залежної акумуляції Са²⁺ у мітохондріях клітин міометрія, оброблених розчином дигітоніну, було проведене з використанням селективних інгібіторів мембранозв`язаних енергозалежних Са²⁺-транспортуючих систем (рутенієвий червоний, азид натрію, тапсигаргін, циклопіазонієва кислота) та Са²⁺-іонофора А-23187.

Отже, на першому етапі дослідження ми вивчили загальні закономірності енергозалежного транспорту Са²⁺ в суспензії клітин міометрія, що були оброблені розчином дигітоніну.

Гладеньком`язові клітини матки мали здатність акумулювати 1660+56 пмоль Са²⁺/10⁶ міоцитів за 5 хв (n=8) при 37^оС із стандартного середовища інку-бації, що містило дигітонін (0,1 мг/мл) і мало наступний склад (мМ): HEPES (pH=7,4) - 25, 125 - KCl, NaCl - 25, ATP - 3, сукцинат Na - 3, MgCl₂ - 3, P_i (в вигляді К-фосфатного буферу) - 2, (⁴⁰CaCl₂+ ⁴⁵CaCl₂) - 0,01 (контроль) (рис. 1, стовпчик 1). У відсутності іонів Mg транспорт Са²⁺ взагалі не спостерігався.

В присутності в середовищі інкубації 50 нМ тапсигаргіну - селективного інгібітора Са²⁺-помпи ендо(сарко)плазматичного ретикулуму [Wictome M. et al., 1992; Hoth M. et al., 1997; Camello-Almaraz C. et al., 2000; Рубцов А.М., 2001], міоцити накопичували 1480+43 пмоль Са²⁺/10⁶ міоцитів за 5 хв (n=8) (рис. 1, стовпчик 2), тобто на 10% менше, ніж у першому випадку (рис. 1, стовпчик 1).

Для накопичення Са²⁺ за вказаних експериментальних умов вкрай необхідна наявність у середовищі інкубації АТР, але не субстрату окиснення (сукцинату), бо у відсутності АТР у цьому середовищі (за наявності сукцинату) (рис. 1, стовпчик 4) накопичення Са²⁺ складало лише 105+15 пмоль Са²⁺/10⁶ міоцитів за 5 хв, і, таким чином, зменшувалось на 94-95% відносно контролю. У відсутності ж сукцинату у середовищі інкубації (але за наявності АТР) транспорт Са²⁺ гальмується лише на 45% відносно контролю. Цікаво відзначити, що стимулююча дія сукцинату на накопичення Са²⁺ спостерігалась лише за наявності АТР у середовищі інкубації: у відсутності нуклеозидтрифосфату, але у присутності сукцинату накопичення Са²⁺ було дуже низьким. В останьому випадку рівень акумуляції Са²⁺ практично відповідав такому, що спостерігався за умов одночасної відсутності АТР та сукцинату у середовищі інкубації.

Інгібітори енергозалежного транспорту Са²⁺ в МХ - рутенієвий червоний (10 мкМ) і азид натрію (10 мМ) - пригнічували включення Са²⁺ в гладень-ком`язові клітини до рівня 309+19 і 472+21 пмоль Са<sup>2+</sup>/10<sup>6</sup> міоцитів за 5 хв, тоб-то на 80-82% і 70-72%. Пригнічувальний вплив рутенієвого червоного на нечутли-ву до дії тапсигаргіну (100 нМ) енергозалежну акумуляцію Са<sup>2+</sup> в гладенько-м`язових клітинах матки був значно ефективнішим, ніж азиду натрію: значення уявної константи інгібування І_0,5 становило 0,6+0,2 мкМ та 0,9+0,1 мМ відповідно (n=8). Тому у подальших експериментах для пригнічення акумуляції Са²⁺ в МХ, як правило, використовували саме рутенієвий червоний.

Із наведених вище даних випливає, що в клітинах міометрія нами ідентифікована система нечутливої до дії тапсигаргіну Mg²⁺,АТР-залежної акумуляції Са²⁺, яка пригнічується рутенієвим червоним і азидом натрію та, відповідно, локалізована саме у МХ. Що ж стосується чутливої до інгібіторної дії тапсигаргіну та резистентної до впливу рутенієвого червоного та азиду натрію складової акумуляції Са²⁺ у міоцитах, то вона, згідно із літературними даними [Borisova L.A., 2002], відзеркалює функціонування Mg²⁺,АТР-залежної кальцієвої помпи ендоплазматичного ретикулуму.

В подальших експериментах ми дослідили кінетику акумуляції Са²⁺ в МХ міоцитів, оброблених розчином дигітоніну. Нечутливу до дії тапсигаргіну (100 нМ) Mg²⁺,АТР-залежну акумуляцію іонів Са у гладеньком`язових клітинах визначали по різниці між загальною акумуляцією Са²⁺ і нако-пиченням катіона за відсутності АТР (рис. 3, графік 2) у стандартному середовищі інкубації. Накопичення Са²⁺ зростало в часі протягом 1-5 хв, на 3-5-ій хвилинах спостерігався стаціонарний рівень акумуляції катіону (в середньому 1460+54 пмоль Са²⁺/10⁶ міоцитів) (n=7). Подальше збільшення часу інкубації приводило до незначного зменшення кількості іонів Са, які акумулювались в МХ. Початкова швидкість акумуляції Са²⁺ (V₀) складала 1260+130 пмоль Са²⁺/10⁶ міоцитів за 1 хв (n=7).

Стаціонарний рівень акумуляції Са²⁺ у МХ зумовлений суперпозицією двох процесів: активного накопичення його у матриксі та пасивного вивільнення іонів Са із нього. За фізіолігічних умов пасивна проникність внутрішньої мембрани МХ для іонів Са дуже низька [Костерин С.А., 1990]. В дослідах, проведених на клітинах міометрія, що були оброблені розчином дигітоніну, ми вивчили пасивне вивільнення Са²⁺ із МХ (рис. 4).

МХ попередньо навантажували Са²⁺ в ході енергозалежної акумуляції цього катіону (час інкубіції - 5 хв) із стандартного середовища інкубації, після чого транспортний процес зупиняли шляхом додавання в середовище аліквоти розчину рутенієвого червоного (кінцева концентрація - 10 мкМ) (рис. 4, графік 1, точка на осі ординат) з наступним розведенням (на 5 хв) клітинної суспензії в два рази ізотонічним розчином, який містив 0,01 мМ рутенієвий червоний, але не містив АТР і сукцинат Na. Як видно (рис. 4, графік 1, інтервал часу 0-5 хв), за 5 хв, які пройшли після зупинки транспортного процесу рутенієвим червоним, із клітин міометрія пасивно звільняється не більше 10% від кількості попередньо акумульованого Са²⁺. Це вказує на той факт, що на рівні використання такої експериментальної моделі, як суспензія міоцитів, оброблених розчином дигітоніну, для МХ міометрія властива надійна (відносно Са²⁺) бар`єрна функція внутрішньої мембрани. Внесення в середовище інкубації ЕГТА (кінцева концентрація - 1 мМ) на 5-й хв, яка пройшла після зупинки процесу акумуляції Са²⁺ рутенієвим червоним, призводило до збільшення швидкості виходу іонів Са, попередньо накопичених у МХ. Втім, при цьому встановлювалась нова рівновага для іонів Са у системі “мітохондрії - середовище розведення”, яка характеризувалась відносною стабільністю його вмісту на рівні 6-10 хв інкубації (рис. 4, графік 1, момент внесення аліквоти розчину ЕГТА вказаний стрілкою, інтервал часу 5 - 10 хв). Кальцієвий ж іонофор А-23187 (кінцева концентрація - 1 мкМ), внесений в стандартне середовище інкубації разом з ЕГТА (кінцева концентрація - 1 мМ) через 5 хв після зупинки процесу енергозалежного включення Са²⁺ в пермеабілізовані міоцити рутенієвим червоним, індукував практично повне оборотне швидке звільнення попередньо акумульованого катіону в середовище інкубації (рис. 4, графік 2, час добавки аліквоти розчину А-23187 і ЕГТА вказаний стрілкою, інтервал часу 5 - 10 хв).

Внесення ж аліквоти розчину ЕГТА (кінцева концентрація - 1 мМ) в стандартне середовище інкубації в умовах початкової присутності в ньому рутенієвого червоного (10 мкМ) практично не впливало на вміст Са²⁺ в клітинах міометрія, що були оброблені розчином дигітоніну.

Наведені дані, що були отримані у дослідах на суспензії міоцитів матки, оброблених розчином дигітоніну (0,1 мг/мл), свідчать про наступне: нечутливе до дії тапсигаргіну оборотне накопичення Са²⁺ у міоцитах матки, оброблених розчином дигітоніну, яке пригнічується рутенієвим червоним (І_0,5 = 0,6+0,2 мкМ) та азидом натрію (І_0,5 = 0,9+0,3 мМ) - то є прояв функціонування саме системи Mg²⁺,ATP-залежного транспорту Са²⁺ у МХ. У той же час дигітонін як такий у концентрації 0,1 мг/мл практично не впливає на бар`єрну (відносно іонів Са) функцію внутрішньої мембрани МХ.

Вивчення властивостей Са²⁺-акумулюючої системи мітохондрій міоцитів матки.

На другому етапі дослідження ми, використовуючи модель суспензії міо-цитів, оброблених розчином дигітоніну, дослідили деякі властивості нечутливо-го до дії тапсигаргіну Mg²⁺,ATP-залежного транспорту Са²⁺ в МХ міометрія.

Катіонна специфічність. Ми знайшли, що катіонна специфічність стосовно забезпечення акумуляції іонів Са у МХ за умов заміни іонів Mg на інші двовалентні катіони задовільняє слідуючій послідовності: Mg²⁺ >> Co²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺. Таким чином, для здійснення акумуляції Са²⁺ у МХ міоцитів матки іони Mg практично не можуть бути замінені на іони Co, Ni чи Cu.

Вплив іонів двовалентних металів (Ме²⁺). Cu²⁺, Ni²⁺ та Co²⁺, що були внесені до Mg²⁺,ATP-вмісного стандартного середовища інкубації, з різним ступенем ефективності пригнічували енергозалежну акумуляцію іонів Са в МХ клітин міометрія. При цьому іони Сu найбільш ефективно гальмували акумуляцію Са²⁺, повний ефект пригнічення спостерігався при концентрації іонів Сu, рівній 10^-4 М. Уявна константа інгібування І_0,5 для Сu²⁺ складала 4,2+0,2 мкМ (n=7). В малих концентраціях (10^-6 - 10^-5 М) Co²⁺ і Ni²⁺ практично не впливають на енергозалежний транспорт Ca²⁺ в МХ. Проте, починаючи з концентрації Me²⁺ 10^-4 М, інгібуючий ефект зростає, досягаючи максимуму при величині концентрації іонів Co і Ni, що становить 10^-2-10^-3 M. У випадку дії іонів Ni величина уявної константи інгібування І_0,5 складала 51+7 мкМ (n=7). Гальмівний ефект іонів Со був значно слабшим, значення уявної константи інгібування І_0,5 складало 290+30 мкМ (n=7). Безперечно, в основі пригнічувального ефекту Ме²⁺ на акумуляцію Са²⁺ у МХ є комплексні події - конкуренція між Ме²⁺ та Ca²⁺ за Ca²⁺-уніпортер, розведення радіоактивної мітки у матриксі як наслідок можливої акумуляції Ме²⁺ у МХ, прямий ефект Ме²⁺ на проникність внутрішньої мембрани МХ для іонів Са тощо (див., зокрема, [Дубицький Л.О., Вовканич Л.С., 1996, 2000]).

Отже, згідно із значеннями І_0,5, катіони двовалентних металів Ме²⁺ неспецифічно гальмують Mg²⁺,ATP-залежний транспорт Са²⁺ у МХ клітин міометрія відповідно послідовності: Сu²⁺ > Ni²⁺ > Со²⁺.

Специфічність до нуклеозидтрифосфатів. Нами було показано, що МХ міоцитів матки здатні акумулювати Са²⁺ в енергозалежному процесі із середовища, яке містить АТР і сукцинат, і практично не здатні накопичувати іони Са у присутності сукцинату, але при відсутності АТР. Ці результати відповідають даним, одержаними іншими дослідниками [Bernardi P., 1999]. Втім, при заміні АТР на інші нуклеозидтрифосфати (GTP, СТР, UTP) Mg²⁺-залежне накопичення катіону в МХ клітин міометрія було дуже низьке: лише в присутності GTP накопичення складало 10% від контрольної величини; при використані СТР і UТР акумуляція іонів Са не перевищувала 1% від контрольного рівня (час інкубації - 10 хв.). Отже, субстратна специфічність системи енергозалежного накопичення Са²⁺ у МХ гладеньком`язових клітин відповідає послідовності АТР >> GTP > CTP > UTP. Таким чином, для системи транспорту Са²⁺ у МХ міоцитів матки характерна висока субстратна специфічність відносно АТР.

Вплив різних концентрацій Mg²⁺. Ми знайшли, що іони Mg абсолютно необхідні для забезпечення чутливої до дії азиду натрію та рутенієвого червоного і резистентної до дії тапсигаргіну АТР-залежної акумуляції Са²⁺ у клітинах міометрія. Активність Mg²⁺,АТР-залежної Са²⁺-акумулюючої системи МХ зростає по мірі збільшення концентрації іонів Mg від 10^-3 до 10^-2 М за умов фіксованих концентрацій АТР (3 мМ) та сукцинату натрія (3мМ) в інкубаційному середовищі. Значення оптимальної для акумуляції Са²⁺ концентрації Mg²⁺ складає 10 мМ. Значення величини уявної константи активації по Mg²⁺ (K_Mg²⁺) складає 4,27+0,04 мМ (n=5). Отже, ця величина є фізіологічно значимою, бо відповідає концентрації Mg²⁺ у міоцитах [Lamb G.D., 2002; Chakraborti S. et al., 2002]. При подальшому зростанні концентрації Mg²⁺ до 410^-2 М цей катіон істотно гальмує акумуляцію Са²⁺ (на 65% від макси-мального значення, що спостерігається при концентрації Mg²⁺ 10 мМ). Гальмівний ефект пов`язаний, мабуть, з тим, що за умов використання Mg<sup>2+</sup> у концентрації >10 мМ останній може блокувати накопичення Са<sup>2+</sup> у МХ шляхом зв`язування безпосередньо біля транспортного центру або опосередковано - через так званий “заряд-екрануючий ефект” [Рубцов А.М., 2001].

Вплив різних концентрацій АТР. Приймаючи до уваги високий рівень субстратної специфічності системи акумуляції іонів Са у МХ клітин міометрія щодо АТР, ми дослідили концентраційну залежність впливу цього нуклеозидтрифосфату на транспортний процес.

Графік залежності накопичення Са²⁺ в МХ клітин міометрія від концентрації АТР в інкубаційному середовищі, яке містить 3 мМ сукцинату і 3 мМ MgCl₂, має куполоподібний вигляд. Підвищення концентрації АТР в сере-довищі інкубації в діапазоні від 0,1 до 3 мМ призводило до активації транспорту Са²⁺, при подальшому зростанні концентрації АТР до 10 мМ спостерігається пригнічення процесу акумуляції Са²⁺. Значення оптимальної для акумуляції Са²⁺ концентрації АТР складає 1-3 мМ. Величина уявної константи Міхаеліса (К_m) по нуклеозидтрифосфату дорівнює 0,10+0,01 мМ (n=6) і є фізіологічно значимою [Gommans I.M. et al., 2002; Lamb G.D., 2002].

В цілому важлива роль АТР у забезпеченні Mg²⁺,АТР-залежної акумуляції іонів Са у МХ міометрія відзеркалює дію АТР-синтази як оборотного спряжуючого пристрою: цей турбіноподібний мотор може використовувати енергію гідролізу АТР для генерації _H+, забезпечуючи транспорт протонів через мембрану проти градієнту їхньої концентрації [Литошенко А.Я., 2001].

Вплив різних концентрацій сукцинату. При відсутності сукцинату в середовищі інкубації накопичення іонів Са у МХ складає - 58 - 60% від конт-рольного значення. Підвищення концентрації сукцинату в цьому середовищі в діапазоні від 1 до 10 мМ стимулювало Mg²⁺,АТР-залежну акумуляцію Са²⁺ у МХ клітин міометрія. Максимальне накопичення Са²⁺ в присутності 3 мМ АТР і 3 мМ MgCl₂ спостерігається при концентрації сукцинату натрія > 3 мМ. Значення уявної константи Міхаеліса К_m по цьому субстрату складає 0,30+0,05 мМ (n=6). Отже, за присутності нуклеозидтрифосфату Са²⁺-акумулююча система МХ гладенького м`язу матки має, судячи по значенню К_m для сукцинату, фізіологічно значиму чутливість до субстрату окиснення [Bernardi P., 1999; Duchen M.R., 2000].

Вплив різних концентрацій неорганічного фосфату. Фосфат калію, внесений у середовище інкубації, яке містило АТР (3мМ) і Mg²⁺ (3 мМ), потенціює нечутливе до дії тапсигаргіну Mg²⁺,АТР-залежне включення іонів Ca в клітини міометрія. Накопичення іонів Са в МХ зростало із збільшенням концентрації Са²⁺-преципітуючого аніона в інтервалі від 0,1 до 10 мМ. При відсутності фосфату калію в середовищі інкубації суспензії міоцитів, що були оброблені розчином дигітоніну, акумуляція Са²⁺ у МХ складає 83-85% від контрольного значення (тобто за умов присутності у середовищі інкубації 2 мМ фосфату).

Вплив різних концентрацій Са²⁺. Важливою “паспортною” характеристикою кальцієвого уніпортера МХ є його спорідненість до субстрату переносу, що тестується по величині уявної константи активації по іонізованому Са (К_Са²⁺).

Ми знайшли, що підвищення концентрації вільного кальцію в середовищі інкубації в діапазоні 10^-7 - 10^-5 М призводило до активації енергозалежного транспорту даного катіону у МХ (щодо розрахунку концентрації вільного кальцію в системі, що містить CaCl₂, MgCl₂, ATP і ЕГТА, див. розділ “Методи дослідження”). Залежність рівня накопичення субстрату переносу від концентрації Са²⁺ має тенденцію до насичення. Значення концентрації катіону, при якій спостерігається максимальне накопичення Са²⁺, становить 510^-6 М, величина К_Са²⁺ по Са²⁺ становить 1,0+0,1 мкМ (n=5).

Ці дані підтверджують результати, що були одержані раніше у випадку використання таких експериментальних моделей, як фракції ізольованих субклітинних мембранних структур: у випадку міометрія спорідненість Са²⁺-транспортуючої системи МХ до іонів Са значно менша, ніж спорідненість Mg²⁺,АТР-залежної кальцієвої помпи плазматичної мембрани (К_Са²⁺ = 0,3 - 0,6 мкМ) [Kosterin S.A. et al., 1994; Бабіч Л.Г., 1999; Слінченко Н.М., 2000].

Вплив деяких інгібіторів кальцієвих помп. Як відомо, у біохімічних дослідженнях, що присвячені вивченню мембранних механізмів контролю внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу, активно використовуються різноманітні інгібітори енергозалежних Са²⁺-помп та Са²⁺-обмінників [Gatto C., 1995]. Так, наприклад, використання речовин, дія яких приводить до гальмування акумуляції Са²⁺ в МХ (азид натрію NaN₃, рутенієвий червоний, 2,4-динітрофенол, олігоміцин), ендоплазматичному ретикулумі (тапсигаргін, циклопіазонієва кислота), а також активного транспорту Са²⁺ через плазматичну мембрану (еозин Y), дозволяє “виключити” ту чи іншу мембранозв`язану енергозалежну Са<sup>2+</sup>-транспортуючу систему [Inesi G., 1994]; це відкриває перспективи для оцінки її парціального внеску в контроль внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу і скоротливої відповіді м`яза.

Раніше було продемонстровано, що рутенієвий червоний та азид натрію NaN₃ ефективно інгібують Mg²⁺,ATP-залежний транспорт іонів Са в МХ клітин міометрія (І_0,5 = 0,6+0,2 мкМ і І_0,5 = 0,9+0,3 мМ відповідно). Ми дослідили концентраційний вплив деяких інших інгібіторів активного трансмембранного переносу Са²⁺, що мають різну хімічну природу (тапсигаргін, циклопіазонієва кислота, о-ванадат натрія, n-хлормеркурібензоат, еозин Y), на Са²⁺-транспортуючу систему МХ клітин міометрія.

Високоефективні інгібітори Mg²⁺,ATP-залежної кальцієвої помпи ендо(сарко)плазматичного ретикулуму тапсигаргін та циклопіазонієва кислота (ЦПК), що були використані у концентрації 10^-9 - 10^-7 та 10^-9 - 10^-5 М відповідно, практично не впливали на акумуляцію Са²⁺ в МХ біометрія.

В діапазоні концентрацій 10^-6-10^-4 М ортованадат Na пригнічує Mg²⁺,ATP-залежний транспорт Са²⁺ в МХ гладеньком`язових клітин матки лише на 10% в порівнянні з контрольним рівнем, подальше збільшення концентрації ортованадату до 10^-3 М призводить до інгібування кальцієвого уніпортера МХ клітин міометрія на 70% в порівнянні з контрольною величиною. Величина уявної константи інгібування І_0,5 дорівнює 0,6+0,2 мМ (n=6).

При підвищенні концентрації n-хлормеркурібензоату (n-ХМБ) до 10^-6 М енергозалежний транспорт Са²⁺ в МХ міоцитів матки інгібується незначно - не більше, ніж на 20% від контрольної величини, проте при збільшенні концентрації n-хлормеркурібензоату до 10^-5 - 10^-4 М акумуляція іонів кальцію в МХ гальмується майже повністю - на 90-95% відносно контрольного значення. При цьому величина І_0,5 складає 3,1+0,3 мкМ (n=6).

При концентрації еозину Y 10^-4 М також повністю інгібується Mg²⁺,ATP-залежний транспорт Са²⁺ в МХ. Значення уявної константи інгібування І_0,5 при цьому складає 2,1+0,4 мкМ (n=6).

Таким чином, у відповідності до значень І_0,5, гальмівний ефект інгібіторів енергозалежних Са²⁺-транспортуючих систем на Mg²⁺,ATP-залежну Са²⁺-транспортуючу систему МХ клітин міометрія задовільняє послідовності: рутенієвий червоний > еозин Y ~ n-хлормеркурібензоат >> о-ванадат ~ азид натрію.

Вплив рН та іонів Na. Закислення середовища інкубації (рН=8,0-6,0) призводить як до пригнічення нечутливого до дії тапсигаргіну та чутливого до дії рутенієвого червоного енергозалежного накопичення Са²⁺ у клітинах міометрія, оброблених розчином дигітоніну, так і до стимуляції пасивного звільнення катіону із міоцитів після зупинки попередньої акумуляції Са²⁺ в них рутенієвим червоним.

У той же час було знайдено, що ізотонічна заміна K⁺ на Na⁺ у середовищі абсолютно не впливає на вказані транспортні процеси.

Ці дані підтверджують результати, що були одержані при використанні іншої експериментальної моделі - фракції ізольованих МХ міометрія [Костерин С.А., 1990], стосовно наявності у цих субклітинних структурах системи Н⁺-Са²⁺ обміну, але відсутності в них системи Na⁺-Ca²⁺-обміну. Можлива функціональна роль системи Н⁺-Са²⁺ обміну у забезпеченні вивільнення іонів Са із МХ міометрія за умов in vivo підлягає ретельному подальшому вивченню.

3. Дослідження впливу сперміну на енергозалежне накопичення іонів Са у мітохондріях гладеньком'язових клітин матки.

Полікатіону сперміну належить важлива роль в регулюванні різних біохімічних процесів, які протікають в живій клітині [Bernardi P., 1999; Дерябина Ю.И., Звягильская Р.А., 2000]. У 1988 р. Kroner H. висловив припущення, що спермін є алостеричним регулятором Са²⁺-уніпортера МХ збудливих тканин. Дія сперміну імовірно обумовлена його зв`язуванням з самим переносником [Вотякова Т.В., 1992]. Зміни концентрації сперміну в клітині можуть істотно підвищити здатність МХ накопичувати і утримувати Са²⁺ [Bernardi P. et al., 1999]. Встановлено, що вміст сперміну збільшується в тканинах матки жінок при вагітності [Бердинских Н.К., Залеток С.П., 1987].

Тому на третьому етапі свого дослідження ми вивчили вплив сперміну (0,5 мМ) на кінетику Mg²⁺,АТР-залежного накопичення іонів Са у МХ клітин міометрія. Було знайдено, що цей поліамін підвищує початкову швидкість транспортного процесу. Стимулюючий ефект сперміну залежав від його кон-центрації. В діапазоні концентрацій від 0,01 до 5 мМ поліамін стимулює нако-пичення іонів Са на 230 - 240% відносно контролю (рис. 8). При цьому зна-чення уявної константи активації К_а по сперміну складало 0,43+0,04 мМ (n=7).

Таким чином, спермін є природним активатором Са²⁺-транспортуючої системи МХ клітин міометрія. Дійсно, встановлена нами величина К_а по сперміну (К_а=0,4 мМ) наближено відповідає фізіологічним значенням концентрації цього поліаміну у міоплазмі [Дерябина Ю.И., 1996].

Отже у своїх дослідах, які були виконані на суспензії міоцитів матки, оброблених розчином дигітоніну (0,1 мг/мл), ми тестували систему Mg²⁺,АТР-залежного накопичення іонів Са у МХ як таку, що є чутливою до гальмівної дії рутенієвого червоного (І_0,5=0,6+0,2 мкМ) і азиду натрію (І_0,5=0,9+0,3 мМ), але резистентна до дії тапсигаргіну і циклопіазонієвої кислоти. За умов використання вказаної експериментальної моделі дигітонін, як такий, не впливає на бар`єрну (відносно Са²⁺) функцію внутрішньої мембрани МХ. Накопичення Са²⁺ у МХ характеризується фазою стаціонарності (на 3^ій - 5^ій хвилинах) і є оборотним, бо кальцієвий іонофор А-23187 індукує практично повне вивільнення іонів Са, які попередньо були накопичені у цих субклітинних структурах. Процесу акумуляції Са²⁺ властива абсолютна катіонна (щодо Mg²⁺) та висока субстратна (щодо АТР) специфічність, чутливість до гальмівної неспецифічної дії іонів двовалентних металів (Cu²⁺, Ni²⁺, Co²⁺), насиченість за концентраціями Mg²⁺ (~1 мМ), АТР (1-3 мМ) та сукцинату (>3мМ). Неорганічний фосфат (0,1-10 мМ) потенціює накопичення Са²⁺ у МХ. Транспортна система МХ характеризується меншою спорідненістю до іонів Са, ніж Mg²⁺,АТР-залежна кальцієва помпа плазматичної мембрани. Еозин Y та n-хлормеркурібензоат вельми ефективно блокують накопичення Са²⁺ у МХ (значення І_0,5 становить 2,1+0,4 мкМ та 3,1+0,3 мкМ відповідно), інгібувальна дія о-ванадату є менш ефективною (І_0,5=0,6+0,2 мМ). Трансмембраний обмін Са²⁺ у МХ є рН-чутливим, але не Na⁺-чутливим. Поліамін спермін активує накопичення Са²⁺ у цих субклітинних структурах (К_а=0,43+0,04 мМ).

Висновки

1. Оскільки дані щодо властивостей системи транспорту іонів Са у мітохондріях вельми обмежені, у дисертації із використанням ізотопної методики (⁴⁵Са²⁺) на суспензії клітин міометрія, оброблених розчином дигітоніну, ідентифікована система Mg²⁺,ATP-залежної акумуляції іонів Са у мітохондріях та вивчені її властивості.

2. Нечутливе до дії тапсигаргіну накопичення Са²⁺ у суспензії міоцитів матки повністю пригнічується рутенієвим червоним (10 мкМ) та азидом натрія (10 мМ) і, таким чином, є проявом функціональної активності Mg²⁺,АТР-залежного кальцієвого уніпортера мітохондрій гладеньком`язових клітин. Стаціонарний рівень накопичення Са²⁺ у мітохондріях (на 5^-й хвилині інкубації) становив 1460+54 пмоль Са²⁺/10⁶ міоцитів, значення початкової швидкості транспортного процесу V_o - 1260+130 пмоль Са²⁺/10⁶ клітин за 1 хв.

3. Накопичення іонів Са у мітохондріях гладенького м`язу є оборотним. Кальцієвий іонофор А-23187 індукує вивільнення Ca²⁺ після його попередньої акумуляції в цих субклітинних структурах.

4. Системі транспорту Са²⁺ у мітохондріях гладеньком`язових клітин властива абсолютна катіонна (відносно іонів Mg) та висока субстратна (відносно АТР) специфічність.

5. Катіони двовалентних металів неспецифічно пригнічували Mg²⁺,ATP-залежний транспорт Ca²⁺ в мітохондріях клітин гладенького м`язу у відповідності із рядом: Cu²⁺ > Ni²⁺ > Co²⁺ (уявна константа інгібування І_0,5 становить 4,2+0,2, 51+4 та 290+30 мкМ відповідно).

6. Значення константи Міхаеліса К_m по АТР, сукцинату, а також уявної константи активації К_Mg²⁺ по Mg²⁺, що характеризують концентраційний режим функціонування Са²⁺-транспортуючої системи мітохондрій становлять: 0,10+0,01 мМ, 0,30+0,05 мМ та 4,27+0,04 мМ відповідно. Величина константи активації по Ca²⁺ К_Са²⁺ становить 1,0+0,1 мкМ.

7. Інгібітори енергозалежного накопичення Са²⁺ з різним ступенем ефективності пригнічували Mg²⁺,АТР-залежну Са²⁺-акумулюючу систему мітохондрій клітин гладенького м`язу. У відповідності із величинами коефіцієнту інгібування І_0,5 пригнічувальний ефект відповідає послідовності: рутенієвий червоний (І_0,5 = 0,6+0,2 мкМ) > еозин Y (І_0,5 = 2,1+0,4 мкМ) ~ n-хлормеркурібензоат (І_0,5 = 3,1+0,3 мкМ) >> о-ванадат (І_0,5 = 0,6+0,2 мМ) ~ азид натрію (І_0,5 = 0,9+0,3 мМ). Ця транспортна система нечутлива до дії тапсигаргіну і циклопіазонієвої кислоти.

8. Закислення середовища інкубації пригнічує чутливе до дії рутенієвого червоного накопичення Са²⁺ у мітохондріях суспензії гладеньком`язових клітин, але стимулює вивільнення цих іонів із субклітинних структур. Ізотонічна заміна іонів К на іони Na не впливає на вказані транспортні процеси.

9. Поліамін спермін активує акумуляцію Са²⁺ у мітохондріях міоцитів матки, підвищуючи як початкову швидкість транспортного процесу, так і кількість іонів Са, що накопичуються. Уявна константа активації К_а становить 0,43+0,04 мМ.

Список робіт за темою дисертації

1. Векліч Т.О., Костерін С.О., Шинлова О.П. Катіонна специфічність системи акумуляції Са²⁺ в мітохондріях клітин міометрія // Укр. біохім. журн. -2002. - Т. 74, № 1. - С. 42-48.

2. Шинлова О.П., Костерин С.А., Веклич Т.А. Подавляемый рутениевым красным энергозависимый и пассивный транспорт Са²⁺ в пермеабилизиро-ванных гладкомышечных клетках//Биохимия. - 1996 - Т. 61, №8.-стр.1440-1447.

3. Костерин С.А., Браткова Н.Ф., Бабич Л.Г., Шинлова О.П., Слинченко Н.Н., Шлыков С.Г., Зимина В.П., Ровенец Н.А., Веклич Т.А. Влияние инги-биторов энергозависимых Са²⁺-транспортирующих систем на кальциевые насо-сы гладкомышечной клетки // Укр.біохім.журн. - 1996. - Т. 68, №6. - С. 50-61.

4. Veclich Tetyana. The effect of inhibitors of energy-dependent Са²⁺-transporting systems on accumulation of Са²⁺ in mitochondria smooth muscle cells // Annales universitatis Mariae Curie-Sclodowska. - Lublin, Polonia. - 2002. - Vol. XV, №39. - P. 427-431.

5. Векліч Т.О. Властивості кальцієвого уніпортера мітохондрій гла-деньком`язових клітин міометрія //Міжгалузева конференція молодих науковців: Тези доп. - Укр.біохім.журн. -2002. - Т. 74, № 1. - С. 138.

6. Веклич Т.А. Нечувствительная к действию тапсигаргина и подавляемая рутениевым красным и азидом натрия аккумуляция Са²⁺ в гладкомышечных клетках // Биология - наука 21-го века: Сборник тезисов, Т. 1. - Пущино. - 2002. - С. 224.

7. Веклич Т.А. Система акумуляции кальция в митохондриях гладкомышечных клеток и ее свойства // Биология - наука 21-го века: Сборник тезисов. - Пущино. - 2001. - С. 12-13.

8. Veklich T.O. Accumulation of Ca²⁺ in the smooth muscle cells mitochondria and spermine effect on this process // Milecular biology and genetics: Abstracts book. - Kyiv, Ukraine. - 2001. - P. 74.

9. Векліч T.О. Вплив сперміну на Са²⁺-уніпортер мітохондрій гла-деньком`язових клітин//VII Міжнародна конференція - інформотерапія: теоретичні аспекти та практичне застосування: Збірник тезисів. - Київ. - 2001. - С. 24-25.

10. Шинлова О.П., Векліч Т.О. Властивості Са²⁺-акумулюючої системи мітохондрій гладеньком`язових клітин матки, що були хімічно скіновані // VII Укр. біохім. з`їзд: Тези доп. Ч. 1. - К. - 1997 - С. 54-55.

Анотація

Векліч Т.О. Транспорт Са²⁺ в мітохондріях гладеньком`язових клітин. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ, 2002.