Шостий розділ присвячено розробці та апробації на реальних промислових об'єктах нових методик кількісного визначення лецитину, кефаліну, N,N-диметил-N,N-діаліламоній хлориду та його полісульфону.

Дослідження взаємодії органічних катіонів нітрогеновмісних фосфоліпідів, n,n-диметил-n,n-діаліламоній хлориду і його полісульфону з молібдофосфат-аніоном

Методами УФ- та ІЧ-спектроскопії була досліджена реакція між органічними катіонами нітрогеновмісних фосфоліпідів, N,N-диметил-N,N-діаліламоній хлориду і його полісульфону та ГПА РМо₁₂О₄₀^3-. УФ-спектр поглинання етанольного розчину сполуки лецитину і Н₃РМо₁₂О₄₀ містить смуги поглинання, характерні для взаємодіючих речовин, що свідчить про незмінність хромофорної системи в ході реакції і підтверджує кулонівський характер взаємодії. Крім того, у спектрі спостерігається відхилення від адитивності світлопоглинання, що характеризує поведінку поверхнево-активних речовин у розчині, та особливості при взаємодії з ГПА і може свідчити про наявність додаткових гідрофобних взаємодій. Цей факт був врахований при подальшому використанні малорозчинної сполуки лецитину (Lec) з ГПА як ЕАР для мембрани іоноселективного електрода.

При вивченні властивостей кефаліну прийшлось зіткнутись із певними труднощами щодо стабільності його при розчиненні, а також підбору розчинника. Кефалін добре розчиняється в гексані, хлороформі та діетиловому етері, однак подальше електрохімічне дослідження цих розчинів дуже ускладнюється. До того ж досить проблематично отримати асоціати з ГПА в цих розчинниках. При розчиненні у водних розчинах кислот, яке проводиться складно і потребує багато часу, відбувається повний гідроліз кефаліну на складові частини. На відміну від кислотного гідролізу, м'яке лужне деацилювання проводиться простіше, до того ж утворюються два продукти гідролізу - гліцерофосфат етаноламіну в еквівалентній кількості і жирні кислоти, які легко відокремлюються від водної фази. Дослідження УФ-спектру водного розчину гліцерофосфату етаноламіну (Gfa) і порівняння його з УФ-спектром хлороформного розчину кефаліну показало наявність спільної смуги поглинання, яка обумовлена присутністю однакової ауксохромної групи молекули етаноламіну. Враховуючи це і більшу зручність роботи з водними розчинами, подальші дослідження кефаліну проводили після його лужного гідролізу і отримання водного розчину Gfa.

УФ-спектри водних розчинів асоціатів гліцерофосфату етаноламіну та N,N-диметил-N,N-діаліламоній хлориду з РМо12О40^3- вказують на адитивність поглинання реагентів і незмінність хромофорної системи в ході реакції, що підтверджує кулонівський характер зв'язку в цих сполуках.

Вивчення УФ-спектрів N,N-диметил-N,N-діаліламоній хлориду в широкому інтервалі рН виявило незмінність смуг поглинання, викликаних впливом полярної групи N(CH₃)₂, що свідчить про стабільність протонованої частинки. В УФ-спектрі полісульфону N,N-диметил-N,N-діаліламоній хлориду спостерігається лише “хвіст” смуги з л_max < 200 нм в широкому інтервалі рН. Дослідження залежності УФ-спектрів розчинів лецитину і гліцерофосфату етаноламіну від рН показало, що при рН=5,5-7,0 спостерігається інтенсивна смуга поглинання, зумовлена наявністю ауксохромної групи в цих молекулах, які існують у вигляді нейтрально заряджених частинок. При рН=1,0-5,0 відбувається протонування атома Нітрогену в молекулах Lec та Gfa, що супроводжується переходом смуги в плече меншої інтенсивності. При рН>7 молекули переходять в гідратовану форму, що підтверджується батохромним зсувом плеча і гіперхромним ефектом з підвищенням значення рН.

Порівняння ІЧ-спектрів кефаліну та продукту його лужного гідролізу - гліцерофосфату етаноламіну показало, що в ІЧ-спектрі Gfa відсутня смуга поглинання, відповідна до групи С=О, і з'являється смуга поглинання при 1175 см^-1, характерна для групи С-ОН, що підтверджує уявлення про деацилювання кефаліну з утворенням гліцерофосфату етаноламіну. В той же час, у спектрі продукту гідролізу кефаліну зберігаються смуги поглинання при 723, 771, 815, 824, 875 см ^-1, зумовлені деформаційними та валентними коливаннями зв'язків С-Н, смуга при частоті 1235 см^-1, що викликана групою Р=О, і при 1588 см^-1, що відповідає групі NH2.

При вивченні структури та хімічної поведінки фосфоліпідів слід враховувати, що вони, як біоактивні речовини природного походження, виявляють поверхнево-активні властивості. Це зумовлено їх дифільністю та впливом таких зовнішніх факторів, як температура, природа розчинника та концентрація розчину. Повідомляється, що фосфоліпіди в непротонованому середовищі з рН порядку 7 утворюють стійкі хелатні комплекси з іонами двовалентних металів. Структура та властивості фосфоліпідів дають змогу припустити, що в слабкокислому та нейтральному середовищі вони ведуть себе як неіоногенні поверхнево-активні речовини і в присутності двозарядних іонів металів існують у розчині у вигляді стійких катіонних комплексних частинок, здатних утворювати малорозчинні асоціати з гетерополіаніоном РМо12О40^3-. Тому важливим питанням було дослідження ІЧ-спектрів асоціатів органічних катіонів фосфоліпідів з ГПА в присутності Ва²⁺.

Так, в спектрі сполуки лецитину і продукту лужного гідролізу кефаліну (Gfa) з ГПА в присутності Ва²⁺ зберігаються смуги характеристичних коливань, які свідчать про незмінність структури ГПА та органічних катіонів. Однак, смуга поглинання у спектрах лецитину та Gfa, що відповідає групі Р-ОН, зникає у спектрі сполук з ГПА та Ва²⁺, а з'являється смуга невеликої інтенсивності при 1100 см^-1, викликана коливаннями групи Р-О^-, зв'язаної з катіонами металів. Крім того, коливання, характерні для групи Р=О, виявляються при 1230 см^-1 у спектрі лецитину і Gfa, а в спектрі їх сполук з ГПА в присутності Ва²⁺ ця смуга зміщується до 1190 см^-1. Все це може бути доказом припущення, що між органічними катіонами лецитину та Gfa з гетерополіаніоном в присутності Ва²⁺ утворюється іонно-асоціативний зв'язок.

Дослідження ІЧ-спектрів сполук мономеру N,N-диметил-N,N-діаліламоній хлориду та його полісульфону з ГПА показало збереження смуг характеристичних для ГПА та органічних катіонів коливань, що свідчить про незмінність їх структури. Смуга поглинання, відповідна зв'язку C-N в молекулі мономеру при 879 см^-1 зберігається з невеликим зсувом до 876 см^-1, а смуга при 993 см^-1 зміщується в низькочастотну ділянку і накладається на смугу, характерну для гетерополіаніона, що призводить до збільшення інтенсивності поглинання при 960 см^-1. Це може бути доказом локалізації взаємодії ГПА за атомом Нітрогену і утворення іонно-асоціативного зв'язку між органічним катіоном та гетерополіаніоном. У спектрі сполуки полісульфону з ГПА зберігаються смуги, викликані коливаннями кільця і групи SO2, а також смуги, характерні для коливань груп С-N - при 1200 и 1220 см^-1, а інтенсивність смуги при 1041 см^-1 зменшується. Все це свідчить про кулонівський характер взаємодії.

Віднесення смуг коливань в ІЧ-спектрах гетерополіаніону РМо₁₂О₄₀^3-, лецитину, кефаліну, гліцерофосфату етаноламіну, N,N-диметил-N,N-діаліламоній хлориду (ДМДААХ) і його полісульфону (ПДДАХ) та їх сполук з ГПА підтверджує, що досліджувані органічні катіони утворюють з гетерополіаніоном малорозчинні стійкі сполуки з кулонівською природою хімічного зв'язку.

Співвідношення реагуючих компонентів, встановлені спектрофотометричним методом, а також методом амперометричного титрування, склали для лецитину [Lec⁺]:[РМо12О40^3-] = 3:1, [Lec-Ba²⁺]:[РМо12О40^3-] = 3:2, для гліцерофосфату етаноламіну (продукту гідролізу кефаліну) [Gfa-Ba²⁺]:[РМо12О40^3-] = 3:2, для ДМДААХ і ПДДАХ - [ОК]:[РМо12О40^3-] = 3:1. За допомогою методу амперометричного титрування розраховані іонні добутки (ІД) отриманих сполук, які дорівнюють:

1* - 1·10^-6 - 1·10^-2 М розчин Lec 1** - 1·10^-6 - 1·10^-2 М розчин Gfa

2* - 1·10^-6 - 1·10^-2 М розчин Lec:ВаСl₂=(1:1) 2** - 1·10^-6 - 1·10^-2 М розчин Gfa:ВаСl₂=(1:1)

3* - 1·10^-6 - 1·10^-2 М розчин Lec на фоні 3** - 1·10^-6 - 1·10^-2 М розчин Gfa на фоні постійного вмісту ВаСl₂ (1·10^-2 М) постійного вмісту ВаСl₂ (1·10^-2 М)

В результаті досліджень виявилось, що іоноселективний електрод, в мембрані якого як ЕАР використовувався асоціат полісульфону з ГПА - (ПДДА)₃РМо₁₂О₄₀, має незадовільні характеристики, а саме, не спостерігається прямолінійна залежність потенціалу ІСЕ від концентрації визначуваної речовини. Це можна пояснити особливостями будови і поведінки полімеру у водних розчинах в залежності від різних факторів і відсутності відповідності природи потенціалвизначуваного іону в розчині і в фазі мембрани. Тому в подальших дослідженнях ця ЕАР не використовувалась.

Залежність електрорушійної сили (ЕРС) розроблених ІСЕ від негативного логарифма концентрації лецитину і кефаліну (рис.1) та мономеру ДМДААХ (рис.2) виражається рівнянням E = a + blgC. Статистична обробка даних методом найменших квадратів показала достатньо високу точність вимірювання і близькість досліджуваної залежності до функціональної (табл. 2).

Вивчення залежності електрохімічних властивостей ІСЕ, призначених для визначення лецитину і кефаліну, від рН розчину показало, що нахил градуювальних графіків зберігає постійне значення в інтервалі рН від 5,0 до 7,0. При зменшенні рН розчину спостерігається звуження діапазону лінійності та зменшення нахилу електродної функції, при збільшенні рН випадає осад. Тому оптимальним для роботи розроблених ІСЕ є використання розчинів Lec і Gfa з рН=5,0-7,0.

Рис. 1. Залежність ЕРС ІСЕ від концентрації визначуваної речовини на лецитин (1) і кефалін (2)

Рис.2. Залежність ЕРС ІСЕ концентрації визначуваної речовини від мономер

Таблиця 2. Результати регресійного аналізу градуювальних графіків ІСЕ для визначення лецитину, кефаліну та N,N-диметил-N,N-діалліламоній хлориду у відповідних інтервалах лінійності

Нахил градуювальних графіків ІСЕ на мономер зберігає постійне значення в інтервалі рН від 2,0 до 7,0. При збільшенні або зменшенні кислотності розчину спостерігається звуження діапазону лінійності та зменшення нахилу електродної функції, а також збільшення межі виявлення. Найкращі характеристики спостерігаються при рН = 5,0-6,0, тому цей діапазон є оптимальним для роботи ІСЕ, оборотного до органічного катіону мономеру. Електродні характеристики розроблених ІСЕ наведені в табл.3.

Методом змішаних розчинів була визначена селективність ІСЕ на лецитин відносно катіонів Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, а також продукту його гідролізу - холіну, і встановлено, що коефіцієнти селективності дорівнюють відповідно K_i/j = 0,003; 0,005; 0,010; 0,045; 0,017. Визначені для ІСЕ на кефалін коефіцієнти селективності K_i/j відносно катіонів Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺ склали 0,007; 0,005; 0,015; 0,035 відповідно. Виходячи з цих даних, можна зробити висновок, що перелічені катіони не чинять суттєвого заважаючого впливу на електродну функцію ІСЕ. Щодо сумісної присутності лецитину та кефаліну (або гліцерофосфату етаноламіну) в розчині, то слід зазначити, що вони розчиняються в різних розчинниках і не можуть заважати один одному. Коефіцієнти селективності ІСЕ на N,N-диметил-N,N-діаліламоній хлорид відносно катіонів Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺ дорівнюють відповідно K^pot_i/j = 0,004; 0,003; 0,012; 0,015; 0,016. Крім того, важливим було дослідження селективності електроду, оборотного до органічного катіону мономеру, відносно його полісульфону. Встановлено, що коефіцієнт селективності дорівнює 0,010, що свідчить про можливість визначати мономер в присутності його співполімеру.

Таблиця 3. Основні електродні характеристики розроблених ІСЕ для визначення лецитину, кефаліну та N,N-диметил-N,N-діаліламоній хлориду (мономеру)

Отримані результати були використані для розробки методик кількісного визначення лецитину, кефаліну і N,N-диметил-N,N-діаліламоній хлориду в промисловій продукції методом прямої потенціометрії з використанням ІСЕ.

Застосування результатів досліджень в аналізі природних та синтетичних нітрогеновмісних сполук

Розроблений та захищений патентом України спосіб кількісного визначення лецитину методом амперометричного титрування 12-молібдофосфатною гетерополікислотою, яка дозволяє експресно і з достатньою чутливістю визначати вміст лецитину в промисловій продукції.

Врахування особливостей взаємодії органічних катіонів лецитину, продукту гідролізу кефаліну та ДМДААХ з гетерополіаніоном 12-молібдофосфатної кислоти, а також вивчення електрохімічних характеристик розроблених ІСЕ, оборотних до цих катіонів, дозволили розробити методики прямого потенціометричного визначення їх вмісту в модельних розчинах та промисловій продукції (таблиці 4-8, 10, 12). Склад мембрани ІСЕ для визначення ДМДААХ захищений патентом України. Правильність результатів перевірена методом добавок і деякими класичними, більш тривалими і складними у виконанні, методиками (таблиці 4, 6, 7, 9, 11).

Таблиця 4. Визначення лецитину у фосфатидному концентраті методом амперометричного титрування і перевірка правильності (n = 7, Р = 0,95)