За даними залежності швидкості гідролізу нативного та частково деградованого фібрину плазміном за різних концентрацій субстрату були розраховані константи Міхаеліса, значення яких становить 7,0 та 3,3 10^-7 М відповідно. Збільшення спорідненості плазміну до частково гідролізованого фібрину дозволяє припустити участь у протеолізі додаткової ділянки зв'язування ферменту.

Таким чином, установлено, що на стадії розщеплення -ланцюгів молекул фібрину має місце збільшення швидкості активації Глу-плазміногену та швидкості гідролізу полімерного фібрину. Причиною збільшення є зміна конформації плазміногену та залучення до взаємодії додаткових ділянок зв'язування ферменту. Зроблено висновок, що стадія утворення Х-фрагментів є ключовою в регуляції швидкості руйнування фібринового згустка фібринолітичною системою.

Надалі з'ясовували роль кринглових доменів в регуляції швидкості гідролізу фібриногену/фібрину плазміном. Для характеристики ранніх етапів ¹²⁵І фібриноген гідролізували плазміном і вимірювали зміну в часі радіоактивності електрофоретичних зон, що відповідають сумарній фракції фібриногену та Х-фрагментів. Порівняння швидкості гідролізу плазміном, міні- та мікро-плазміном за різних концентрацій 6-АГК та аргініну дало можливість визначити участь ліганд-зв'язувальних ділянок окремих доменів ферменту на ранніх стадіях протеолізу (рис. 8, табл. 1).

Плазмін гідролізує фібриноген з найвищою швидкістю, її приймали за 100 %. У порівнянні з ним активність міні- та мікро-плазміну, у яких відсутні К 1-4 або всі кринглові домени відповідно, складає 30 та 20 %. 6-АГК в залежності від концентрації пригнічує швидкість гідролізу досліджуваної фракції плазміном та міні-плазміном до рівня мікро-плазміну і не впливає на активність останнього. В присутності 10 мМ аргініну активність плазміну знижується приблизно на 50 %. За такої концентрації аргініну, згідно з константами дисоціації для окремих кринглів, має місце насичення ділянок кринглів 1-3 та 5, тоді як ділянка крингла 4 залишається вільною. Отримані дані про те, що за блокування всіх ліганд-зв'язувальних ділянок активність плазміну знижується на 80 %, тоді як ділянок кринглів 1-3 та 5 - на 50 %, свідчать про важливе значення ділянки крингла 4 в регуляції швидкості початкових етапів гідролізу фібриногену плазміном.

Дослідження динаміки утворення та розщеплення Х-фрагментів, показало, що 10 мМ аргінін майже не впливає на швидкість розщеплення Х-фрагментів, тоді як в присутності 10 мМ 6-АГК вони накопичуються в реакційному середовищі і подальше їх руйнування потребує тривалого часу. Зроблено припущення, що найбільшого значення четвертий крингл набуває в процесі гідролізу фібриногену на стадії розщеплення Х-фрагментів.

Ефективність розчинення полімерного фібрину плазміном також значною мірою визначається крингловими доменами молекули ферменту. 6-АГК майже повністю пригнічує швидкість гідролізу фібринового згустка плазміном за концентрацій, які не впливають на активний центр, проте насичують його низькоафінні ліганд-зв'язувальні ділянки. Фрагменти плазміногену крингли 1-3 та 4, які можуть конкурувати за місця зв'язування плазміну на фібрині, ефективно впливають на процес гідролізу за спільної дії. Швидкість розчинення полімерного фібрину плазміном за 5-разового молярного надлишку кожного з фрагментів - кринглів 4 та 1-3 змінюється на 5 та 25 % відповідно, тоді як за одночасної присутності їх в інкубаційному середовищі швидкість реакції знижується більш ніж на 70 % (рис. 9).

Таким чином, доведено, що швидкість ранніх етапів гідролізу фібриногену, як і швидкість руйнування фібринового згустка плазміном контролюються крингловими доменами молекули ферменту. Отримані результати дозволяють припустити, що взаємодія некаталітичних ділянок молекули плазміну з відповідними центрами молекули субстрату орієнтує активний центр ферменту на гідроліз певних пептидних зв'язків, внаслідок чого розщеплення фібриногену/фібрину є строго спрямованим процесом.

Згідно сучасним уявленням, полімерний фібрин розщеплюється плазміном на великі надмолекулярні блоки, які складаються з фрагментів фібрил. Ефективність такого шляху визначається тим, що гідроліз відбувається лише в певних місцях фібрил у напрямку, перпендикулярному їх довжині. З погляду на отримані нами дані, можна висловити думку, що такими місцями є центри первинного зв'язування Глу-плазміногену на фібрині. На них відбувається активація проферменту, а на початкових етапах гідролізу - збільшення локальної концентрації плазміногену і швидкості його активації. Участь ділянок зв'язування різної спорідненості молекули плазміну у взаємодії з фібрином забезпечує його переміщення по DDE-трідам протофібрил, а орієнтація активного центра - гідроліз плазміном неупорядкованих ділянок в суперспіралізованій міждоменній частині молекул.

Активація плазміногену нативною та низькомолекулярною (36кДа) стрептокіназою. Ефекторні властивості фібрину. Участь плазміноген/ плазмінової системи у багатьох фізіологічних та патологічних процесах в організмі обумовлює інтерес до вивчення механізмів, які забезпечують та регулюють активацію плазміногену.

Наразі відомо ферментативний та неферментативний шляхи активації плазміногену. Фізіологічні активатори - тканинний та урокіназа каталізують гідроліз пептидного зв'язку Арг561-Вал562 в плазміногені, перетворюючи його на дволанцюговий плазмін. Неферментативна активація здійснюється стрептокіназою - екзогенним білком бактеріального походження. Стрептокіназа в комплексі з плазміногеном шляхом конформаційних перебудов індукує в проферменті утворення активного центра.

Вивчення стрептокінази як активатора плазміногену викликає особливий інтерес у зв'язку з широким застосуванням ії в тромболітичній терапії, унікальними властивостями та можливістю існування в організмі подібного механізму перетворення плазміногену на плазмін.

Отримані дані щодо кристалічної структури комплексу стрептокінази з мікро-плазміном (Wang, 1998) та результати клінічних досліджень, які показали, що за тромболітичною ефективністю стрептокіназа майже не поступається рекомбінантному тканинному активатору (GUSTO, 1993), надали нового імпульсу всебічному дослідженню цього білка. Проте, роль кринглових доменів плазміногену в механізмі активації стрептокіназою залишається до кінця не з'ясованою. Відомості щодо N- і С-кінцевих ділянок активатора у взаємодії з плазміногеном та формуванні активного центра є суперечливими. Отримано рекомбінантну стрептокіназу, у якої, на відміну від нативної, відсутні 59 N-кінцевих амінокислотних залишків. Активність її, яка набагато менша за таку стрептокінази, повністю відновлюється в присутності фібрину. В плазмі вона стимулює фібриноліз за мінімального фібриногенолізу (Reed, 1999), але причини такої дії стрептокінази залишються не з'ясованими.

Тому ми вивчали роль ліганд-зв'язувальних ділянок кринглових доменів молекули плазміногену та N- і С-кінцевих ділянок стрептокінази в процесі активації, а також ефекторні властивості фібрину щодо активації плазміногену стрептокіназою.

Молекулярний механізм активації плазміногену стрептокіназою може бути представлено загальною схемою:

На першій стадії реакції стрептокіназа утворює з плазміногеном еквімолярний комплекс, на другій - викликає конформаційні перебудови в серин-протеїназному домені проферменту з формуванням активного центра і появою ферментативної активності. На наступній стадії активаторний комплекс ферментативним шляхом розщеплює в плазміногені активаційний пептидний зв'язок з утворенням плазмін-стрептокіназного комплексу або за каталітичної кількості стрептокінази - вільного плазміну.

Активацію плазміногену стрептокіназою вивчали, використовуючи специфічний хромогенний субстрат плазміну S2251. Швидкість активації визначали за швидкістю вивільнення п-нітроаніліну, поглинання якого реєстрували на спектрофотометрі при 410 нм.

Дослідження кінетики активації Глу-, Ліз-, міні- та мікро-плазміногену каталітичною кількістю стрептокінази показало, що швидкість активації залежить від наявності в молекулі проферменту кринглових доменів. Про участь розташованих в них лізин-зв'язувальних ділянок свідчить пригнічення швидкості активації Глу-, Ліз- і міні-плазміногену 6-АГК у межах концентрацій 10^-5 - 10^-2 М, а також нативної форми плазміногену ізольованими кринглами 1-3 та 4.

Якщо комплекс активатора з Глу-плазміногеном утворювали в присутності 6-АГК, то його амідолітична активність зменшується в залежності від концентрації 6-АГК. В той же час 6-АГК практично не впливає на амідолітичну активність попередньо сформованих комплексів.

Комплекс стрептокінази з плазміногеном або плазміном, попередньо інкубований протягом декількох годин, взаємодіє з лізин-сефарозою. Наявність стрептокінази або її фрагментів в білкових фракціях, які елююювали 6-АГК, доведено вестерн-блотом з використанням відповідних антитіл. Отже, показано, що в комплексі плазмін(оген)-стрептокіназа після формування активного центра лізин-зв'язувальні ділянки кринглових доменів вивільняються. Комплементарні їм центри в молекулі стрептокінази можуть взаємодіяти з лізин-зв'язувальними ділянками субстратної молекули плазміногену. Підтвердженням цього є зменшення на 40 та 60 % відповідно активації Глу- та Ліз-плазміногену еквімолярним комплексом плазмін-стрептокіназа в присутності 6-АГК.

Отримані результати дозволили дійти висновку, що лізин-зв'язувальні ділянки проферменту регулюють всі стадії процесу активації стрептокіназою: утворення еквімолярного комплексу з активатором, індукцію каталітичної активності плазміногену та взаємодію активаторного комплексу з субстратним плазміногеном.

Для з'ясування ролі залишків лізину на С-кінці та в складі поліпептидного ланцюга молекули стрептокінази, що можуть приймати участь у взаємодії з плазміногеном, проводили хімічну модифікацію NH₂-груп стрептокінази тринітробензолсульфокислотою або обробляли її карбоксипептидазою. Відщеплення С-кінцевого лізину стрептокінази зменшує швидкість активації нею Глу-плазміногену в 3 рази, тоді як хімічна модифікація - більш ніж у 100 разів. Отримані дані свідчать про важливу роль залишків лізину і, можливо, N-кінцевого ізолейцину стрептокінази в процесі активації.

Існують різні точки зору відносно механізму формування активного центра в плазміногені у комплексі з стрептокіназою. Згідно одної з них, N-кінцевий ізолейцин стрептокінази утворює соляний місток з залишком Асп 740 плазміногену, що розташований поруч з Сер 741 каталітичної тріади (Wang,1999; Perry, 2000). Така взаємодія є пусковим механізмом формування активного центра та S₁ субцентра. Згідно другої, -домен стрептокінази зв'язується з серин-протеїназним доменом плазміногену поблизу консервативного залишку Ліз 698, що викликає конформаційні зміни цієї ділянки молекули, внаслідок яких утворюється необхідний іонний зв'язок між Ліз 698 та Асп740 (Wang, Lin, 1998).

Обмежений хімотрипсиновий гідроліз стрептокінази дозволяє одержати ряд фрагментів, які зберігають спорідненість до плазміногену. З метою визначення функціональної ролі окремих ділянок молекули стрептокінази досліджували активаторні властивості фрагменту з молекулярною масою 36 кДа, у якого відсутні 7 та 4 кДа N- та С-кінцеві пептиди відповідно. Індукція каталітичної активності Глу-плазміногену за еквімолярної кількості 36 кДа стрептокінази починається лише через годину від початку інкубації за високої 200 нМ концентрації кожного з білків. Швидкість реакції уповільнюється більш ніж на два порядки порівняно з нативною стрептокіназою. Наведені результати добре узгоджуються з даними літератури про низьку активаторну активність рекомбінантної стрептокінази, у якої відсутні 59 N-кінцевих амінокислотних залишків, і свідчать про важливу роль N-кінцевої ділянки стрептокінази в процесі активації плазміногену.

Вивчення кінетики активації Глу-, Ліз- та міні-плазміногену 36 кДа стрептокіназою за 50 нМ концентрації реагуючих білків виявило, що індукція каталітичної активності Глу-плазміногену була відсутня протягом всього часу спостережень, тоді як Ліз- і міні-плазміногену починалась відповідно через 30 і 10 хв від початку реакції (рис. 10). Швидкість активації міні-плазміногену на порядок перевищує таку Ліз-плазміногену (табл. 2). Отримані результати свідчать, що N-кінцева ділянка стрептокінази відповідає за кон-формаційні зміни проферменту, які контролюють доступність центрів зв'язування стрептокінази в протеїназному домені, що є необхідними для формування активного центра. Дослідження впливу фібрину на активацію різних форм плазміногену 36 кДа фрагментом стрептокінази показало, що за присутності desAABB фібрину активація Глу-плазміногену починається після 20-30 хв лаг-періоду і відбувається з високою швидкістю (рис. 10).

Фібрин на порядок прискорює швидкість активації Ліз-плазміногену і практично не впливає на активацію міні-плазміногену низькомолекулярною стрептокіназою (табл. 2). Ці дані дозволяють дійти висновку, що певна ділянка молекули фібрину виконує функцію N-кінцевого пептиду стрептокінази, індукуючи в проферменті конформаційні зміни, які необхідні для швидкого утворення активаторного комплексу плазміногену з 36 кДа фрагментом стрептокінази.

На відміну від нативної, низькомолекулярна стрептокіназа не впливає на швидкість реакції плазміну з ₂-антиплазміном - амідолітична активність ферменту повністю інгібується ₂-антиплазміном в присутності еквімолярної кількості 36 кДа фрагмента стрептокінази.

Таким чином, показано, що низькомолекулярна стрептокіназа є ефективним активатором плазміногену, асоційованого з фібрином. Низька швидкість активації нею плазміногену у розчині та відсутність протекторної дії за інгібування плазміну ₂-антиплазіном дозволяють пояснити вибірковість руйнування фібрину та відсутність фібриногенолізу за активації плазміногену плазми низькомолекулярною стрептокіназою.

Порівняльна характеристика активації Глу-плазміногену Е-фрагментом фібриногену, стрептокіназою та моноклональним антитілом IV-1c. До непрямих активаторів плазміногену, крім стрептокінази, належить антиплазміногенове моноклональне антитіло IV-1c, властивості і механізм дії якого досить детально вивчені (Макогоненко, 2000). При вивченні взаємодії Глу-плазміногену з Е-фрагментом фібриногену нами виявлено, що в комплексі з ним профермент змінює конформацію і з часом перетворюється на Ліз-плазміноген, що вказує на потенційні активаторні властивості Е-фрагмента.

Представляло інтерес більш детально дослідити активацію плазміногену Е-фрагментом і порівняти її з характерними особливостями механізму активації плазміногену стрептокіназою та моноклональним антитілом IV-1c, що є важливим для визначення існування в організмі неферментативної активації плазміногену та вивчення механізмів регуляції фібринолітичного процесу продуктами гідролізу фібриногену/фібрину.

Характерними ознаками неферментативної активації плазміногену є:

- утворення стійкого комплексу між проферментом та активатором;

- двоцентрова взаємодія;

- зміна конформації проферменту;

- індукція каталітичної активності;

- перетворення плазміногену на плазмін в складі комплексу;

- активація комплексом субстратного плазміногену;

- залежність активаторної активності комплексу від часу його існування.

Ймовірність домішок будь-якої протеолітичної або активаторної активності в препаратах Глу-плазміногену та Е-фрагмента виключали системою контролей з гідролізу фібрину або S 2251 та попередньою обробкою інгібіторами п-НФГБ та ДФФ.

Дослідження комплексоутворення Глу-плазміногену з Е-фрагментом показало, що за надлишку проферменту з 1 молем фрагмента можливе зв'язування 2 молей плазміногену. Взаємодія забезпечується високо- та низькоафінними ділянками зв'язування проферменту, розташованими в кринглах 1-3 та 5. Значення констант дисоціації комплексу Глу-плазміногену з Е-фрагментом співпадає з такими для Ліз-плазміногену, що свідчить про зміну конформації нативної форми проферменту.

Здатність Е-фрагмента формувати активний центр та індукувати каталітичну активність в Глу-плазміногені доведено вивільненням п-нітроаніліну з субстрату S-2251 під час його інкубації з еквімолярною сумішшю Глу-плазміногену та Е-фрагмента. За присутності ДФФ вивільнення п-нітроаніліну не спостерігається.

Електрофоретичні дослідження суміші, яку попередньо інкубували при 37 ^оС, виявили перетворення з часом нативної форми проферменту в частково гідролізовану, а за умов відновлення дисульфідних зв'язків в білках - утворення плазміну. З використанням методу фібринових пластин показано, що комплекс проявляє фібринолітичну активність, величина якої становить приблизно 30 % відповідної кількості плазміну. Збільшення зон лізису фібринових пластин за надлишку плазміногену свідчить про активаторну активність комплексу. Дослідження динаміки вивільнення п-нітроаніліну від часу попередньої інкубації комплексу виявило, що його активаторна активність досягає максимальної величини через 30 хв після утворення і з часом поступово зменшується, можливо, внаслідок протеолізу Е-фрагмента плазміном або автолізу останнього.

Таким чином, установлено, що Е-фрагмент спричинює в Глу-плазміногені структурні зміни, внаслідок яких в протеїназному домені проферменту формується активний центр. Проведені дослідження дозволяють віднести Е-фрагмент до активаторів плазміногену непрямої дії та

припустити фізіологічне значення неферментативної активації плазміногену в присутності Е-фрагмента. Враховуючи кількість Глу-плазміногену, що зв'язується з фрагментом, та інгібування плазміну, який утворюється в складі комплексу, б-2-антиплазміном, представляється ймовірним, що Е-фрагмент буде впливати на фібринолітичний процес за механізмом від'ємного зворотнього зв'язку, зменшуючи локальну концентрацію потенційно активного плазміногену в кров'яному згустку. Зважаючи на можливість Е-фрагмента активувати протромбін (Платонова, 2002; 2006) та перетворювати Глу-плазміноген на Ліз-форму, яка має підсилюючий вплив на полімеризацію фібрину, можна припустити, що накопичення Е-фрагмента пов'язано з ризиком повторного тромбоутворення.

Некаталітичні ділянки молекули плазміну в інгібуванні б₂-антиплазміном. Роль б₂-антиплазміну у фібринолітичному процесі. На завершальному етапі фібринолітичного процесу плазмін, що вивільняється в кровоток, швидко і необоротно інгібується ₂-антиплазміном. Механізм реакції досить добре вивчений, але участь в ньому окремих кринглових доменів плазміну остаточно не з'ясована, що залишає відкритим питання про здатність ₂-антиплазміну ефективно інгібувати низькомолекулярні похідні плазміну, які можуть утворюватись в організмі (Lijnen, 2001; Narasaki, 2005).

Проведене нами дослідження кінетики інгібування б₂-антиплазміном амідолітичної активності плазміну, міні- та мікро-плазміну показало, що низькомолекулярні похідні плазміну також інгібуються б₂-антиплазміном, але повільніше. Значення константи швидкості комплексоутворення з інгібітором зменшується на порядок в послідовності: плазмін, міні- та мікро-плазмін. За умов насичення лізин-зв'язувальних ділянок плазміну та міні-плазміну 6-АГК швидкість інгібування їх б₂-антиплазміном зменшується до рівня мікро-плазміну (табл. 3).

З використанням міченого біотином інгібітора установлено, що він взаємодіє з фрагментами плазміногену: мікро-, міні-плазміногеном, кринглом 4 та з найвищою спорідненістю з кринглом 1-3. Величина зв'язування б₂-антиплазміну з міні-плазміногеном та плазміном, який попередньо інгібували ДФФ, в присутності 6-АГК знижується до рівня мікро-плазміногену.

Крингли 1-3, 4 та міні-плазміноген за 30-разового молярного надлишку практично не впливають на інгібування плазміну еквімолярною кількістю інгібітора.

Проведені дослідження показали, що: а) швидкість реакції плазміну з б₂-антиплазміном контролюється крингловими доменами; б) в протеїназному домені плазміногену/плазміну міститься відмінна від активного центра ділянка зв'язування інгібітора. Зроблено висновок, що ефективність дії б₂-антиплазміну забезпечується багатоцентровою взаємодією інгібітора з ферментом.

Основною функцією б₂-антиплазміну вважається нейтралізація вільного плазміну та захист білків плазми від неспецифічного протеолізу.

З метою визначення ролі інгібітора в фібринолітичному процесі були розроблені модельні системи гідролізу фібринових згустків, утворених в присутності різних компонентів фібринолітичної системи. Дослідження проводили в термостатованій кюветі спектрофотометру, реєструючи зміну оптичної густини середовища при 350 нм. Для запобігання змішування білків до початку реакції їх вносили в різні кутки кювети в мікролітрових кількостях. Полімеризацію des ААВВ фібрин-мономеру ініціювали додаванням буферу з нейтральним значенням рН. Виявлено, що фібрин швидко гідролізується за наявності в системі як плазміну, так і Глу-плазміногену та стрептокінази або тканинного активатора (рис. 11). За одночасної присутності ₂-антиплазміну та плазміну фібриновий згусток не гідролізується. Інгібітор не впливає на швидкість гідролізу фібрину Глу-плазміногеном, активованим каталітичною кількістю стрептокінази, що пояснюється його низькою спорідненістю до проферменту. Плазміноген в присутності інгібітора зв'язується з фібрином і активується до плазміну. Разом з тим, в системі, що містить Глу-плазміноген і тканинний активатор, ₂-антиплазмін майже повністю пригнічує гідроліз фібрину. Зважаючи на залежність активації проферменту тканинним активатором від фібрину і те, що плазмін, зв'язаний з фібрином, захищений від дії інгібітора, отриманий результат виявився несподіваним.

Подальші дослідження показали, що ₂-антиплазмін практично не впливає на величину зв'язування тканинного активатора та плазміногену з фібрином, також як і амідолітичну активність активатора.

Разом з тим, в залежності від концентрації він пригнічує швидкість активації плазміногену тканинним активатором (рис. 12). Майже повне інгібування спостерігається за фізіологічної концентрації інгібітора при всіх досліджуваних концентраціях тканинного активатора.

Виявлено, що мічений біотином ₂-антиплазмін зв'язується з тканинним активатором з Кd 78 нМ. Інгібітор сорбується на фібринових плівках, утворених з дезААВВ фібрину, та іммобілізованих фрагментах D та D-D і не взаємодіє з Е-фрагментом, тобто ділянки зв'язування інгібітора на фібрині розташовані в місцях локалізації активаторного комплексу. Це дозволяє зробити припущення, що інгібування ₂-антиплазміном процесу активації може бути результатом стеричних перешкод для взаємодії плазміногену з тканинним активатором або зміни конформації активатора.

Таким чином, установлено, що ₂-антиплазмін регулює швидкість гідролізу фібрину на стадії активації плазміногену тканинним активатором.

Механізм зміни активності плазміну в комплексі зі стрептокіназою.

Плазмін, крім фібринолітичної, виконує в організмі різноманітні регуляторні функції. Вибірково гідролізуючи в білках певні пептидні зв'язки, він активує металопротеїнази, фактори росту, клітинні рецептори. В зв'язку з багатофункціональністю та участю плазміну в широкому спектрі біологічних процесів, особливого значення набуває вивчення механізмів регуляції активності плазміну на рівні білок-білкових взаємодій.

Одним з відомих білків, які змінюють активність плазміну, є стрептокіназа. В комплексі з нею плазмін не інгібується ₂-антиплазміном, майже втрачає здатність гідролізувати фібрин і стає ефективним активатором плазміногену.

Ми поставили на меті з'ясувати механізм регуляції активності плазміну по відношенню до високомолекулярних субстратів та інгібіторів в комплексі з стрептокіназою.

Оскільки взаємодія ₂-антиплазміну і стрептокінази з плазмін(оген)ом є багатоцентровою і відбувається за участі як кринглових, так і протеїназного доменів ферменту, порівнювали зв'язування цих білків, що попередньо мітили біотином, з іммобілізованими фрагментами плазміногену.

Обидва білка в однаковій кількості і з однаковою спорідненістю (С₅₀ дорівнює 60-80 нМ) зв'язуються з кринглом 1-3. Тоді як стрептокіназа проявляє більш високу спорідненість до міні-плазміногену (С₅₀ - 26 нМ), з яким зв'язується в основному в області протеїназного домену, оскільки на величину зв'язування слабо впливає 20 мМ аргінін, який блокує ділянку п'ятого крингла.

Стрептокіназа, в залежності від концентрації, інгібує зв'язування ₂-антиплазміну з плазміном. Повне інгібування спостерігається за одночасної присутності стрептокінази та 6-АГК (рис. 13). За аналогічних умов ₂- антиплазмін та 6-АГК слабо впливають на зв'язування стрептокінази з

плазміном. Зроблено висновок, що взаємодія ₂-антиплазміну саме з протеїназним доменом блокується стрептокіназою. Послаблення впливу стрептокінази на взаємодію ₂-антиплазміну з плазміном за інгібування ферменту ДФФ, вказує, що ділянки зв'язування стрептокінази розташовані поблизу або в контактній зоні активного центра.

Отримані результати добре узгоджуються з даними рентгеноструктурного аналізу комплексу мікро-плазмін-стрептокіназа, які показали, що область активного центра ферменту оточена розташованими на поверхні кластерами позитивно заряджених амінокислот, що беруть участь у взаємодії з стрептокіназою (Parry, 2000).

Дослідження просторової структури мікро-плазміну та активаторів плазміногену виявили, що поблизу активного центра плазміну розташована виступаюча назовні петля, яка має делецію з 6 амінокислотних залишків і є більш пологою порівняно з аналогічною структурою тканинного активатора та урокінази. Внаслідок цього плазмін гідролізує пептидні зв'язки, розташовані на витягнутих в просторі ділянках поліпептидного ланцюга, тоді як активатори - на ділянках, що мають “шпилькоподібну” структуру.

Результати експериментальних досліджень та аналіз літературних даних дозволили запропоновувати механізм регуляції активності плазміну в комплексі з стрептокіназою. Він полягає в тому, що частина молекули стрептокінази, що приєднується до протеїназного домену, виконує структурну роль відрізка поліпептидного ланцюга, де має місце делеція амінокислотних залишків. В такий спосіб стрептокіназа обмежує доступ в контактну зону активного центра плазміну просторово витягнутим субстратам та інгібіторам і залишає її відкритою для субстратів, які мають ділянки, структурно подібні до активаційної петлі плазміногену.

Кількісне визначення основних компонентів фібринолітичної системи в плазмі крові. Фібринолітична система, що регулює утворення та лізис фібринових згустків, відіграє важливу роль в підтримці гемостатичного балансу в організмі. Тому визначення рівня та активності окремих її компонентів як факторів, що сприяють та супроводжують розвиток патологічних процесів, є надзвичайно важливим для розуміння механізмів, які порушують динамічну рівновагу між зсідаючою та фібринолітичною системами крові.

Відомо, що патологічні процеси в організмі супроводжуються порушеннями зсідаючої та фібринолітичної систем крові. В зв'язку з цим визначення основних компонентів обох систем буде сприяти попередженню розвитку патологічних станів, що ведуть до тромбоутворення або геморагій, а в разі їх розвитку - визначенню схем ефективного лікування.

Широке впровадження в клінічну практику тромболітичної терапії порушує питання про необхідність контролю за зміною концентрації та активності основних компонентів, що приймають участь в процесі розчинення тромбів.

Для визначення вмісту плазміногену в плазмі найчастіше використовують імуноферментний та амідолітичний методи. Перший дозволяє визначати кількість плазміногену та його фрагментів, але не дає уявлення про рівень функціонально активного білка. Амідолітичний метод з використанням синтетичного хромогенного субстрату дає завищення рівня функціонально активного плазміногену. За різних запальних процесів поява в плазмі нейтрофільної еластази та інших протеолітичних ферментів, приводить до розщеплення циркулюючого плазміногену на декілька проміжних форм та фрагментів. Відповідні форми плазміну зберігають гідролітичну активність до хромогенних пептидних субстратів, але різко зменшують здатність розпізнавати та гідролізувати фізіологічний субстрат фібрин. До того ж в амідолітичному методі для запобігання інактивації плазміну, що утворюється, б₂-антиплазміном активацію плазміногену проводять надлишковою кількістю стрептокінази. Тому весь плазмін буде находитись в комплексі з стрептокіназою, яка значно підвищує його амідолітичну активність.

За надмірної активації плазміногену рівень б₂-антиплазміну крові критично знижується, що передбачає можливість неконтрольованого протеолізу і ставить питання про необхідність визначення крнцентрації б₂-антиплазміну за різних патологій та при тромболітичній терапії стрептокіназою або тканинним активатором.

Концентрація тканинного активатора в крові є значно нижчою, порівняно з іншими протеазами, тому точне визначення її є методично складною задачею. Використання імуноферментних методів виявило збільшення концентрації активатора за ряду тромботичних ускладнень, що пояснюється накопиченням неактивного комплексу активатора з його специфічним інгібітором. В зв'язку з цим поряд з імуноферментними необхідно використання методів визначення функціонально активного тканинного активатора, який міг би з високою ефективністю перетворювати плазміноген до плазміну на поверхні фібринового згустка. Широкого застосування набув метод з використанням хромогенного субстрату плазміну та бромціанового фрагмента фібрину - FCB-2 в якості стимулятора. Ефекторні властивості цього фрагменту, порівняно з фібрином, є досить низькими, тому метод потребує використання високих концентрацій плазміногену. Отже, потреба у розробці способів визначення основних компонентів фібринолітичної системи з використанням специфічного фізіологічного субстрату - фібрину є нагальною практичною проблемою.

Для визначення концентрації плазміногену в плазмі крові нами розроблено спосіб, який базується на активації проферменту, адсорбованого на фібрині, каталітичною кількістю стрептокінази і гідролізі фібрину плазміном, що утворюється.

При розробці способу враховували отримані нами дані про кількість Глу-плазміногену, що зв'язується з фібрином; більш високу спорідненість нативної форми проферменту до фібрину, порівняно з стрептокіназою та б₂-антиплазміном; високу швидкість активації асоційованого з фібрином Глу-плазміногену стрептокіназою та відомий факт про недоступність плазміну, що утворюється на фібрині, дії б₂-антиплазміну.

Реакцію проводили в термостатованій кюветі спектрофотометра, в яку вносили зразки досліджуваної плазми, буферний розчин та стрептокіназу. Полімеризацію фібрину ініціювали додаванням аліквоти des ААВВ фібрин-мономеру, після чого зміну світлопропускання реєстрували при 350 нм. За часом, необхідним для зменшення максимальної величини мутності розчину на 50 %, визначали швидкість гідролізу фібрину і виражали як 1/tЅ. Вміст плазміногену визначали за калібрувальним графіком, побудованим з використанням стандартної плазми. Кількість плазміногену виражали в мкг/мл.

До переваг даного способу можна віднести: 1) використання desААВВ фібрину замість фібриногену, що дозволяє позбутися впливу фібриногену плазми та інгібіторів тромбіну на процес полімеризації фібрину; 2) визначення концентрації плазміногену безпосередньо в плазмі, що дозволяє скоротити час на отримання еуглобулінової фракції; 3) використання малої кількості плазми (10-30 мкл) та короткий час (3-10 хв), які витрачаються на одне випробування.

Для визначення б₂-антиплазміну плазми розроблено спосіб, який базується на гідролізі фібрину екзогенним плазміном, що залишається вільним після взаємодії з інгібіторами плазми. В кювету спектрофотометра вносили плазмін, зразки досліджуваної плазми та буферний розчин. Полімеризацію фібрину проводили як описано вище. За часом, необхідним для зменшення максимальної величини мутності розчину на 50 %, визначали швидкість гідролізу фібрину і виражали як tЅ. Вміст б₂-антиплазміну визначали за калібрувальним графіком, побудованим з використанням стандартної плазми з визначеним вмістом інгібітора. Кількість б₂-антиплазміну виражали в мкг/мл.

Спосіб визначення тканинного активатора представляє модифікацію стандартної процедури методу COASET t-PA (Chromogenix). Сутність її полягає у використанні desААВВ фібрину в якості стимулятора, що дозволяє вдвічі знизити кількість плазміногену та вдвічі скоротити час інкубації, а також визначати активність тканинного активатора безпосередньо у фібриновому згустку, що є необхідним в разі використання в клінічній практиці фібринового клею.

Застосування стрептокінази в тромболітичній терапіі потребує попереднього визначення рівня антистрептокіназних антитіл в плазмі крові, наявність яких знижує терапевтичну ефективність стрептокінази, а за повторного використання викликає алергійні реакції різної етіології. Нами розроблено простий у використнні спосіб визначення концентрації IgG проти стрептокінази у сироватці крові людини, що базується на інгібуванні ними активації плазміногену стрептокіназою і визначенні швидкості гідролізу фібрину плазміном.

Запропоновані способи можуть бути використані в медичній практиці для характеристики загального фібринолітичного потенціалу, контролю за ефективністю тромболітичної терапії, визначення концентрації функціонально активних білків та виявлення низькомолекулярних похідних плазміногену/плазміну.



ВИСНОВКИ

1. Функціонування фібринолітичної системи базується на високоспецифічних білок-білкових взаємодіях, вивчення яких важливе для з'ясування молекулярних механізмів регуляції фібринолізу та загальних принципів функціонування регуляторних протеїназ. Проведені дослідження визначили функціональну роль некаталітичних ділянок певних доменів молекули плазміногену/плазміну на всіх етапах процесу фібринолізу. Установлено, що вони забезпечують взаємодію плазміногену/плазміну з фібриногеном/фібрином, визначають швидкість процесів активації плазміногену, руйнування фібринового згустка плазміном, інгібування плазміну та зміну його активності.

2. Виявлено, що молекула фібриногену містить центри зв'язування плазміногену, які локалізовані в центральному домені Е та периферичних доменах D. Доведено, що в останніх плазміноген-зв'язувальні центри експонуються в процесі гідролізу молекули фібриногену. Показано, що Глу-плазміноген не взаємодіє з фібриногеном, що обумовлено його закритою конформацією, тоді як Ліз-плазміноген зв'язується з доменом Е фібриногену високоафінними ділянками кринглів 1-3.

3. Вперше вивчено взаємодію Glu-плазміногену з фрагментами фібриногену, що утворюються на всіх етапах його гідролізу, та розраховано константи дисоціації комплексів проферменту з Е- та D-фрагментами фібриногену.

4. Установлено, що під час полімеризації фібрину в D-доменах його молекул експонуються первинні центри зв'язування Глу-плазміногену, комплементарні низькоафінній ділянці крингла 5. Показано, що Ліз-плазміноген взаємодіє з фібрином як високо-, так і низькоафінними ділянками зв'язування в кількості, що на порядок перевищує таку Глу-плазміногену.

5. Показано, що на початкових стадіях гідролізу фібрину при розщепленні С-доменів в окремих молекулах фібрин-мономеру утворюються нові центри зв'язування плазміногену, комплементарні кринглу 4. Взаємодія з ними викликає конформаційні зміни в молекулі Глу-плазміногену, внаслідок чого ділянки кринглів 1-3 отримують можливість взаємодіяти з фібрином, що приводить до збільшення кількості сорбованого на фібриновому згустку проферменту.

6. Продемонстровано, що на стадії розщеплення С-доменів молекул фібрину швидкість активації Глу-плазміногену тканинним активатором та гідролізу полімерного фібрину збільшується. Таким чином, стадія утворення Х-фрагментів є ключовою в регуляції швидкості руйнування фібринового згустка фібринолітичною системою.

7. Вперше показано існування неферментативного шляху активації Глу-плазміногену за присутності Е фрагмента фібриногену. Останній викликає в проферменті структурні зміни, внаслідок яких в його протеїназному домені формується активний центр. Проведені дослідження дозволяють віднести Е-фрагмент до активаторів плазміногену непрямої дії.

8. Установлено, що кринглові домени контролюють швидкість процесу активації плазміногену стрептокіназою. Вперше показано, що лізин-зв'язувальні ділянки кринглових доменів беруть участь у всіх етапах процесу активації: утворення еквімолярного комплексу, формування активного центра, взаємодії активаторного комплексу з субстратним плазміногеном.

9. Запропоновано механізм регуляції активності плазміну в комплексі з стрептокіназою. Він полягає в тому, що частина молекули активатора, який приєднується до протеїназного домену, виконує структурну роль відрізка поліпептидного ланцюга, де має місце делеція амінокислотних залишків. В такий спосіб стрептокіназа обмежує доступ в контактну зону активного центра плазміну просторово витягнутим ділянкам субстратів та інгібіторів і залишає її відкритою для ділянок, структурно подібних до активаційної петлі плазміногену.

10. Вперше установлено, що б₂-антиплазмін є регулятором фібринолітичного процесу. Він контролює швидкість гідролізу полімерного фібрину на стадії активації плазміногену тканинним активатором.

11. Запропоновано способи кількісного визначення плазміногену, тканинного активатора плазміногену, б₂-антиплазміну та антистрептокіназних антитіл в плазмі крові людини.



СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г. Иммобилизация стрептокиназы на нерастворимых носителях и свойства иммобилизованного белка // Укр. биохим. журн. - 1983. - Т. 55, № 3. - С. 307-310.

2. Кудинов С.А., Гриненко Т.В., Новохатний В.К., Макогоненко Е.М., Кастрикина Т.Ф. Некоторые структурные и функциональные аспекты молекулярного механизма фибринолиза // Вестник АН УССР. - 1984. - № 6. - С. 27-34.

3. Веревка С.В., Кудинов С.А., Гриненко Т.В. Аргинил-связывающие участки плазминогена человека // Докл. АН УССР. - 1985. - Сер. Б, № 1. - С. 53-56.

4. Кудинов С.А., Веревка С.В., Гриненко Т.В. Лигандная специфичность участков белок-белкового взаимодействия молекулы плазминогена человека // Стрептокиназа в регуляции свертывающей и противосвертывающей систем крови: Сб. науч. работ. - Минск, 1985. - С. 116-121.

5. Кудинов С.А., Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г., Медведь Л.В. Локализация плазминоген-связывающих участков на молекуле фибриногена и его фрагментах // Докл. АН УССР. - 1986. - Сер. Б, № 4. - С. 70-73.

6. Verevka S.V., Kudinov S.A., Grinenko T.V. Arginil-binding sites of human plasminogen // Thrombosis Research. - 1986. - Vol. 41, № 5. - Р. 689-698.

7. Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г., Кудинов С.А., Медведь Л.В. Плазминоген-связывающие центры молекулы фибриногена, фибрина и продуктов их протеолиза // Биохимия. - 1987. - Т. 52, № 10. - С. 1732-1738.

8. Третьяченко В.Г., Гриненко Т.В., Кудинов С.А. Связывание К 1-3 и К 4 фрагментов плазминогена, содержащих лизин-связывающие участки, с фибриногеном и его фрагментами // Укр. биохим. журн. - 1988. - Т. 60, № 2.- С. 3-6.

9. Скоморовская Е.В., Гриненко Т.В., Кудинов С.А., Третьяченко В.Г. Протеолитическая активность Глу-плазминогена при его взаимодействии с Е-фрагментом фибриногена // Докл. АН УССР. - 1988. - Сер. Б, № 10. - С. 75-78.

10. Кудинов С.А., Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г. Изучение взаимодействия Глу- и Лиз-форм плазминогена с фибриногеном // Механизмы регуляции гемостаза на уровне молекулярных взаимодействий: Сб. науч. работ. - Свердловск. - 1988. - С. 6-13.

11. Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г., Скоморовская Е.В., Кудинов С.А. Связывание Глу-плазминогена с фибриногеном и продуктами его протеолиза // Биохимия. - 1989. - Т. 54, № 2. - С. 213-220.

12. Гриненко Т.В., Кудинов С.А. Межбелковые взаимодействия плазминогена и фибриногена/фибрина в процессе фибринолиза // Биохимия животных и человека. - Киев, Наукова думка. - 1989. - Т. 13. - С. 46-55.

13. Скоморовская Е.В., Гриненко Т.В., Кудинов С.А., Золотарева Э.Н. Исследование протеолитической активности комплекса Глу-плазминогена с фрагментом Е фибриногена // Биохимия. - 1991. - Т. 56, № 3. - С. 458-466.

14. Гриненко Т.В., Кудинов С.А. Характеристика центров комплексообразования между Глу- и Лиз-формами плазминогена и фибриногеном/фибрином // Биохимия животных и человека. - Киев, Наукова думка.- 1991. - Т. 15. - С. 66-76.

15. Золотарева Э.Н., Гриненко Т.В., Скоморовская Е.В., Кудинов С.А. Влияние аргинина на гидролиз фибриногена плазмином и мини-плазмином // Укр. биохим. журн. - 1992. - Т. 64, № 1. - С. 3-9.

16. Гриненко Т.В., Скоморовская Е.В., Кудинов С.А., Золотарева Э.Н. Особенности взаимодействия Glu- и Lys-форм плзминогена с нативным и частично гидролизованным фибрином // Биохимия. - 1992. - Т. 57, № 5.- С. 728-737.

17. Золотарева Э.Н., Гриненко Т.В., Скоморовская Е.В., Кудинов С.А. Влияние химической модификации остатков аргинина фибриногена и его Dн-фрагмента на скорость гидролиза этих белков плазмином // Укр. биохим. журн. - 1994. - Т. 66, № 2. - С. 79-84.

18. Метелицына И.П., Левицкая Г.В., Гриненко Т.В., Метелицына Т.И. Методы исследования системы фибринолиза и ее компонентов // Укр. биохим. журн. - 1997. - Т. 69, № 5. - С. 33-40.

19. Макогоненко Є.М., Яковлев С.О., Сломінський О.Ю., Корольчук В.І., Гриненко Т.В., Соколовська Л.І., Дружина Н.М., Колесникова І.М., Чернишов В.І., Седерхольм-Вильямс С.А. Активація плазміногену антиплазміногеновим моноклональним антитілом IV-1с. Властивості та механізм реакції // Укр. біохім. журн. - 2000. - Т. 72, № 4-5. - С. 99-108.

20. Гриненко Т.В., Макогоненко Є.М., Юсова О.І., Седерхольм-Вільямс С.А. Деградація стрептокінази та каталітичні властивості плазмін-стрептокіназного комплексу // Укр. біохім. журн. - 2002. - Т. 74, № 3. - С. 50-57.

21. Гриненко Т.В., Макогоненко Е.М., Юсова Е.И., Скоморовская-Прокволит Е.В., Седерхольм-Вильямс С.А., Колесникова И.Н. Модифицирующее действие антиплазминогенового антитела IV-1с на каталитические свойства плазмина человека // Укр. биохим. журн. - 2002. - Т. 74, № 4. - С. 61-70.

22. Гриненко Т.В., Юсова О.І., Задорожна М.Б., Макогоненко Є.М. Особливості взаємодії б-2-антиплазміну з плазміногеном/плазміном // Укр. біохім. журн. - 2002. - Т. 74, № 6. - С. 83-90.

23. Соколовська А.С., Платонова Т.М., Гриненко Т.В., Чернишенко Т.М. Порівняльна характеристика методів визначення вмісту фібриногену в плазмі крові // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2002. - № 3 - С. 82-86.

24. Юсова Е.И., Гриненко Т.В., Волков Г.Л. Способ определения количества антистрептокиназных антител // Гематологія і переливання крові: Міжвід.зб. - Київ, 2002 - Т. 31 - С. 345-349.

25. Соколовская Л.И., Макогоненко Е.М., Гриненко Т.В., Седерхольм-Вильямс С.А. Роль лизин-связывающих участков в активации плазминогена стрептокиназой // Укр. биохим. журн. - 2003. - Т. 75, № 2. - С. 25-32.

26. Гриненко Т.В. Альфа-2-антиплазмін інгібує процес активації плазміногена тканинним активатором на фібрині // Кровообіг та гемостаз - 2004 - № 3. - С. 49-50.

27. Юсова Е.И., Гриненко Т.В., Волков Г.Л. Влияние стрептокиназы на взаимодействие б-2-антиплазмина с различными участками молекулы плазмина // Укр. биохим. журн. - 2004. - Т. 76, № 2. - С. 98-106.

28. Задорожна М.Б., Гриненко Т.В., Юсова О.І., Волков Г.Л. Зв'язування б-2-антиплазміну з фібриногеном/фібрином та їх фрагментами без участі фактора ХІІІ // Укр. біохім. журн. - 2004 - Т. 76, № 5. - С. 42-48.

29. Гриненко Т.В., Задорожна М.Б., Платонова Т.М., Волков Г.Л. Інгібуванняб-2-антиплазміном процесу активації Glu-плазміногену тканинним активатором на фібрині DDЕ-комплексі та DD-димері // Укр. біохім. журн. - 2005. - Т. 77, № 5. - С. 45-51.

30. Гриненко Т.В., Задорожна М.Б., Юсова О.І. Регуляція б-2-антиплазміном процесу активації Glu-плазміногену тканинним активатором на фібрині // Укр. біохім. журн. - 2006. - Т. 78, № 3 - С. 106-112.

31. Гриненко Т.В., Юсова Е.И., Волков Г.Л. Вплив антистрептокіназних антитіл на активацію плазміногену стрептокіназою та комплексом плазмін-стрептокіназа // Лаб. діагностика. - 2007. - Т. 2, № 40. - С. 60-63.

32. Пат. UA 53146 C2. Спосіб виділення високоочищеного A₂-антиплазміну з плазми крові людини: Пат. UA 53146 C2 Гриненко Т.В., Макогоненко Є.М., Юсова О.І., Задорожна М.Б., Волков Г.Л.; Заявл. 22.03.2002; Опубл. 15.01.2003, Бюл. № 1.

33. Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г., Веревка С.В. Влияние аминокапроновой кислоты и аргинина на взаимодействие плазминогена с фибрином и его фрагментами // IV Всесоюзный симпозиум „Инженерная энзимология”. - Киев, 1983. - С. 85.

34. Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г., Кудинов С.А. Локализация плазминоген-связывающих участков на молекуле фибриногена и его фрагментах // IV симпозиум СССР-Италия „Макромолекулы в функционирующей клетке”. - Киев, 1984. - С. 43.

35. Гриненко Т.В., Лежен Т.І. Структурно-функціональні аспекти міжбілкових взаїмодій плазміногену та фібриногену в системі фібринолізу // Тези V Українського біохімічного з'ізду - Івано-Франківськ, 1987. - С. 40.

36. Гриненко Т.В., Скоморовська О.В., Золотарьова Е.М. Вплив появи Х-фрагменту на фібрин-зв'язуючі властивості Глу-плазміногену // Тези VІ Українського біохімічного з'ізду. - Київ, 1992. - С. 90.

37. Гриненко Т.В., Скоморовская Е.В., Золотарева Э.Н., Кудинов С.А. Изучение комплексообразования различных форм плазминогена с фибрином // III симпозиум „Химия протеолитических ферментов”.- Москва, 1993. - С. 80.

38. Skomorovskaya E.V., Grinenko T.V., Platonova T.N. Interaction between Glu-plasminogen and Lys-plasminogen with Dн-dimer // Abstracts of XVth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, June 11-16, 1995, Jerusalem (Israel) / Thrombosis and Haemostasis. - 1995. - Vol. 73, № 6. - P. 1136.

39. Grinenko T., Slominski A., Makogonenko E., Skomorovskaya- Prokvolit E., Yusova E., Cederholm-Williams S. Catalytic properties of plasmin in complex with antiplasminogen monoclonal antibody IV-1c // Abstracts of XVth International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis, June 25-29, 2000, Hamamatsu (Japan) / Fibrinolysis and Proteolysis - 2000. - Vol. 14, № 1. - P. 70.

40. Гриненко Т.В., Семьошкіна Т.В. Швидкість гідролізу фібрину різними формами плазміногену, активованого стрептокіназою за присутності б-2-антиплазміну // Тези VIII Українського біохімічного з'їзду, 1-3 жовтня 2002, Чернівці / Укр.біохім.журн. - 2002. - Т.74, № 4Б (додаток 2) - С. 25-26.

41. Grinenko T., Volkov G., Gavriliuk O., Yusova O., Zadorozhnaya M. Triple affinity columns package for step high purificvation of the alpha-2-plasmin inhibitor and histidine-rich glycoprotein directly from human plasma // Abstracts of the second Product biotechnology meeting. - Curasao (Netherlands Antilles), 2003. - Р. 66.

42. Гриненко Т.В., Юсова О.І. Порівняння активаторних та протекторних властивостей нативної стрептокінази та її 36 кДа фрагмента // Матеріали науково-практичної конференції „Сучасні проблеми медичної та клінічної біохімії”, 18-20 2005, Чернівці / Буковинський медичний вісник - 2005. - Т. 9, № 2. - C. 75-76.

43. Grinenko T., Yusova O. Activation of Glu-, Lys- and mini-plasminogen by equimolar quantities of streptokinase 36 kDa fragment and effect of fibrin on this process. // Abstracts of 18th International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis, August 21-31, 2006, San Diego (USA) / J. Intern. Soc. Thrombosis and Haemostasis - 2006. - Vol. 4. - P. 191.

44. Гриненко Т.В. Міжбілкові взаємодії плазміногену/плазміну в регуляції фібринолізу // Матеріали ІХ Українського біохімічного з'їзду. - Харків, 2006. - С.16.

45. Grinenko T.V., Volkov G.L., Yusova E.I. Influence of the streptokinase 36 kDa fragment on the plasmin activity. // Abstracts of XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, July 6-12, 2007, Geneva (Switzerland) / J. Thromb. and Haemost. - 2007. - Vol 5, Suppl. 2. - P-T-394.



АНОТАЦІЯ

Гриненко Т.В. Регуляція фібринолізу некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора білогічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2007.

Робота присвячена вивченню механізмів регуляції фібринолітичного процесу. Досліджено взаємодію плазміногену/плазміну з фібриногеном/ фібрином, її роль в регуляції швидкості гідролізу фібрину.

Визначено відповідність центрів комплексоутворення окремих доменів молекул плазміногену/плазміну та фібриногену/фібрину. Установлено послідовність взаємодій молекул ферменту та субстрату за участі комплементарних центрів, яка визначає швидкість гідролізу фібрину. Визначено ключові стадії, які ініціюють процес гідролізу фібрину та регулюють його швидкість.

Показано появу нових плазміноген-зв'язувальних центрів на стадії фібрин(оген)олізу - утворення Х-фрагменту. Взаємодія з ними плазміногену змінює його конформацію на просторово витягнуту форму. Запропоновано механізм регуляції швидкості гідролізу фібринового згустка. Згідно з ним зміна конформації Глу-плазміногену забезпечує переміщення проферменту на центри, що існують в молекулах фібрину. В такий спосіб відбувається підвищення локальної концентрації плазміногену, збільшення швидкості його активації та швидкості гідролізу фібрину плазміном, що утворюється.

Установлено, що ₂-антиплазмін контролює швидкість гідролізу фібрину, пригнічуючи активацію плазміногену тканинним активатором.

Установлено, що всі етапи процесу фібринолізу: білок-білкові взаємодії, активація, інгібування, гідроліз фібрину регулюються некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну. Обгрунтовано, що функціональна активність плазміногену/плазміну визначається структурними відмінностями центрів зв'язування кринглових доменів, злагодженою одночасною дією декількох центрів зв'язування, конформаційною мінливістю молекули та можливістю переключенням внутрішньомолекулярних взаємодій на міжмолекулярні.

Ключові слова: фібриноліз, плазміноген, плазмін, фібрин, б₂-антиплазмін, стрептокіназа, міжмолекулярні взаємодії, механізми регуляції.

...