Регуляція фібринолізу некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну

АННОТАЦИЯ

Гриненко Т.В. Регуляция фибринолиза некаталитическими участками молекул плазминогена/плазмина. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора билогических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2007.

Работа посвящена изучению механизмов регуляции фибринолитического процесса на уровне белок-белковых взаимодействий, обусловленных некаталитическими участками молекул плазминогена/ плазмина.

Исследование взаимодействия Глу- и Лиз-плазминогена с фибриногеном и его фрагментами, нативным и частично гидролизованным фибрином позволило определить доменную локализацию центров комплексообразования молекул плазминогена/плазмина с фибриногеном/ фибрином. Установлено, что в Е домене фибрин(оген)а экспонирован центр связывания плазминогена, комплементарный участку крингла 1-3. Во время полимеризации фибрина в его D-доменах экспонируются центры, комплементарные участку крингла 5 плазминогена. На начальных стадиях гидролиза, при расщеплении С-концевых областей -цепей молекул фибрина, появляются новые центры, соответствующие участку крингла 4 плазминогена.

Показано, что на частично гидролизованном фибрине, по сравнению с нативным, количество адсорбированного Лиз-плазминогена не изменяется, тогда как таковое Глу-плазминогена увеличивается на порядок, повышается его сродство к фибрину, увеличиваются скорость активации тканевым активатором и скорость гидролиза фибрина.

На основании полученных данных предложен механизм регуляции скорости гидролиза фибринового сгустка, согласно которому при взаимодействии плазминогена кринглом 4 с центрами, образующимися на начальных стадиях гидролиза, конформация профермента меняется таким образом, что участки кринглов 1-3 могут взаимодействовать с комплементарными им центрами, которые существуют в молекулах фибрина. Плазминоген, перемещаясь на эти центры, открывает доступ к взаимодействию с фибрином следующим молекулам профермента. Таким образом, в местах первичного связывания плазминогена на фибрине при образовании ограниченного количества новых плазминоген-связывающих центров происходит увеличение локальной концентрации профермента, что приводит к увеличению скорости его активации и быстрому разрушению фибринового сгустка.

Обосновано положение, что стадия образования Х-фрагмента является ключевой в регуляции скорости разрушения фибринового сгустка фибринолитической системой. На этой стадии происходит увеличение количества связанного с фибрином Глу-плазминогена, его сродства к фибрину, скорости активации и скорости гидролиза.

Исследование роли крингловых доменов в выполнении плазмином гидролитической функции показало, что на ранних стадиях при появлении Х-фрагментов скорость гидролиза фибриногена плазмином в большей мере зависит от участка связывания крингла 5, тогда как с началом разрушения Х-фрагментов она определяется участками кринглов 1-3 и 4. Показано, что кринглы 1-3 и 4 снижают скорость гидролиза фибрина плазмином. Ингибирующий эффект этих фрагментов усиливается при одновременном присутствии их в реакционной среде. Синергизм действия свидетельствует о важном значении кринглов 1-3 и 4 в разрушении фибринового сгустка плазмином.

На основании результатов исследований предложена гипотеза, согласно которой взаимодействие некаталитических участков молекул плазмина с соответствующими центрами молекул субстрата обеспечивает перемещение фермента по DDE-триадам протофибрилл и ориентацию активного центра на гидролиз неупорядоченных областей в суперспирализованной междоменной части молекул фибрина, вследствие чего расщепление протофибрилл является строго направленным процессом.

Установлено, что ₂-антиплазмин может быть регулятором фибринолитического процесса. Он контролирует скорость гидролиза фибрина, ингибируя активацию плазминогена тканевым активатором.

Показано существование неферментативного пути активации Глу- плазминогена в присутствии Е-фрагмента фибриногена. Е-фрагмент формирует в проферменте активный центр и индуцирует каталитическую активность. Комплекс плазминоген-Е-фрагмент проявляет небольшую, по сравнению с плазмином, фибринолитическую активность и активирует субстратный плазминоген. Е-фрагмент не защищает плазмин от ингибирования ₂-антиплазмином. Полученные результаты свидетельствуют, что Е-фрагмент может влиять на фибринолитический процесс по механизму отрицательной обратной связи, уменьшая концентрацию потенциально активного плазминогена в кровяном сгустке.

В результате проведенных исследований определена регуляторная роль лиганд-связывающих участков различных доменов молекулы плазминогена/ плазмина на всех этапах фибринолитического процесса.

Предложены способы количественного определения основных компонентов фибринолитической системы с использованием фибрина в качестве субстрата.

Ключевые слова: фибринолиз, плазминоген, плазмин, фибрин, б₂-антиплазмин, стрептокиназа, межмолекулярные взаимодействия, механизмы регуляции.

SUMMARY

Grinenko T.V. Regulation of fibrinolysis by noncatalytic sites of plasminogen/plasmin molecule. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of doctor of biological sciences by speciality 03.00.04 - Biochemistry. - Palladin Institute of Biochemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine. Kyiv, 2007.

The thesis describes the research of the mechanism of fibrinolysis regulation. It was investigated the plasminogen/plasmin interaction with fibrinogen/fibrin and the role of this interaction into regulation of fibrin hydrolysis rate.

It was determined the accordance of complex-formation centers from separate domains of plasminogen/plasmin and fibrinogen/fibrin molecules. It was declared, that the fibrin hydrolysis rate was determined by sequence of interactions between enzyme and substrate. It was postulated key stages initiated the process of fibrin hydrolysis and controls its rate.

The appearance of new plasminogen-binding sites on fibrino(geno)lytic stage of the X-fragment formation was showed. Plasminogen interacts with these sites and its conformation shall be changed at extended one. Mechanism of fibrin clot hydrolysis rate regulation was proposed. It based on data that plasminogen, after its conformation changing, can be transfered from one site to another within fibrin clot. This moving led to increasing of local concentration of proenzyme, its activation rate and rate of fibrin hydrolysis.

It was declared that б₂-antiplasmin served a regulation of fibrinolysis. It inhibited of plasminogen activation on fibrin by tissue activator and subsequent lysis of fibrin clot was inhibited as well.

It was concluded that all process of fibrinolysis - protein-protein interactions, activation, inhibition, fibrin hydrolysis - were regulated by noncatalytic sites of plasminogen/plasmin molecule. It was founded, that functional activity of plasminogen/plasmin was determined by structural differences of binding sites of kringles domains, multisites interactions, simultaneous act of several binding sites, conformational possibility of molecules and the possibility of molecules changes intra- on inter-molecular interactions.

Key words: fibrinolysis, plasminogen, plasmin, fibrin, б₂-antiplasmin, streptokinase, inter-molecular interactions, regulation mechanism.

Размещено на Allbest.ru