Исследования минерализатов

После прибавления одного объема свежеприготовленного раствора сульфида аммония (NH 4) 2 S или других восстановителей (дитионит натрия Na 2 S 2 O 4 ·2H 2 O и др.) к четырем объемам водного раствора исследуемой крови оксигемоглобин (OHb) превращается в дезоксигемоглобин Hb, в спектре которого имеется одна широкая полоса поглощения при 543--596 нм. Карбоксигемоглобин не восстанавливается сульфидом аммония и другими восстановителями. Поэтому после прибавления восстановителей полосы поглощения карбоксигемоглобина не исчезают.

Таким образом, после прибавления раствора сульфида аммония к крови, содержащей окси- и карбоксигемоглобин, сохраняются две полосы поглощения карбоксигемоглобина, но исчезают полосы поглощения оксигемоглобина, а вместо них появляется широкая полоса поглощения дезоксигемоглобина. По наличию соответствующих полос поглощения в спектре крови делают вывод об отравлении оксидом углерода (II).

Спектральный метод оправдывает себя при исследовании крови, содержащей 10--30 % карбоксигемоглобина.

2. Химические методы обнаружения

Реакция с раствором гидроксида натрия (проба Гоппе--Зейлера). К определенному объему крови прибавляют равный или двойной объем 30 %-го раствора гидроксида натрия. Кровь, содержащая карбоксигемоглобин, остается ярко-красной, а кровь, не содержащая карбоксигемоглобина, буреет.

Реакция с сульфидом аммония (проба Сальковского--Катаяма). К Ю мл дистиллированной воды прибавляют 5 капель крови и 5 капель свежеприготовленного раствора сульфида аммония. Смесь осторожно взбалтывают, прибавляют 30 %-й раствор уксусной кислоты до слабокислой реакции и слегка взбалтывают. Кровь, содержащая карбоксигемоглобин, имеет малиново-красную окраску, а кровь, не содержащая карбоксигемоглобина, становится серо-зеленой.

Реакция с хинином и сульфидом аммония (проба Хорошке-вича -- Маркса). К 2 мл крови прибавляют 4 мл 8 %-го раствора гидрохлорида хинина и смесь кипятят непродолжительное время. После охлаждения смеси прибавляют 2--3 капли свежеприготовленного раствора сульфида аммония и сильно взбалтывают.

Рис. 3. Спектр поглощения карбоксигемоглобина (I) и дезоксигемоглобина (II)

Реакция с гексацианоферратом (III) калия (проба Бюр-кера). К 5 мл крови прибавляют воду до 500 мл и взбалтывают. К 5--10 мл полученного раствора крови прибавляют 5 капель 1 %-го раствора гексацианоферрата (III) калия К 3 [Fe(CN) 6]. Кровь, в которой содержится карбоксигемоглобин, остается красной, а кровь, не содержащая карбоксигемоглобина, становится желтоватой.

Реакция с гексацианоферратом (III) калия и дихроматом калия (проба Сидорова). 1 мл крови разбавляют водой до 10 мл. К 2 мл полученного раствора крови прибавляют 3--5 капель 20 %-го раствора гексацианоферрата (III) калия и такой же объем 0,01 %-го раствора дихромата калия. Смесь крови и реактивов слегка взбалтывают. Кровь, содержащая карбоксигемоглобин, становится карминово-красной, а кровь, не содержащая карбоксигемоглобина, приобретает коричневато-зеленую окраску.

Реакция с гексацианоферратом (III) калия и уксусной кислотой (проба Ветцеля). К 10 мл крови прибавляют 90 мл воды. К 10 мл полученного раствора прибавляют 5 мл 20 %-го раствора гексацианоферрата (III) калия и 1 мл ледяной уксусной кислоты. Из крови, содержащей карбоксигемоглобин, выпадает вишнево-красный осадок, а из крови, не содержащей карбоксигемоглобина,-- серовато-коричневый осадок.

Реакция с танином (проба Кункеля--Ветцеля). Кровь разбавляют пятикратным объемом дистиллированной воды. В пробирку вносят 5 мл этого раствора крови, прибавляют 15 мл 3 %-го водного раствора танина, а затем содержимое пробирки хорошо взбалтывают. Из крови, содержащей карбоксигемоглобин, выпадает светлый карминово-красный осадок, а из крови, не содержащей карбоксигемоглобина, выпадает серовато-коричневый осадок.

Реакция с формальдегидом (проба Либмана). К 5 мл неразбавленной крови прибавляют 5 мл формалина (40 %-й раствор формальдегида) и сильно взбалтывают. Кровь, содержащая карбоксигемоглобин, сохраняет красную окраску, а кровь, не содержащая карбоксигемоглобина, через несколько минут становится коричневато-черной.

Реакция с ацетатом свинца (проба Рубнера). К 5 мл неразбавленной крови прибавляют 20 мл 5 %-го раствора основного ацетата свинца и в течение 1 мин сильно взбалтывают. Кровь, содержащая карбоксигемоглобин, сохраняет красную окраску,

Реакция с сульфатом меди (проба Залесского). К 1 мл крови прибавляют воду до 100 мл и хорошо взбалтывают. К 5 мл полученного раствора крови прибавляют 5 капель 10 %-го раствора сульфата меди. Смесь хорошо взбалтывают. Кровь, содержащая карбоксигемоглобин, становится пурпурно-красной, а кровь, не содержащая карбоксигемоглобина, приобретает зеленоватую окраску.

Количественное определение

Для количественного спектрофотометрического определения оксида углерода (II) по карбоксигемоглобину приготовляют ряд растворов: раствор А -- раствор исследуемой крови; раствор Б -- раствор крови, содержащей смесь карбоксигемоглобина и дезоксигемоглобина; раствор В -- раствор крови, в которой все формы гемоглобина (дезоксигемоглобин, оксигемоглобин и метгемоглобин) полностью переведены в карбоксигемоглобин.

При количественном определении оксида углерода (II) необходимо измерять оптическую плотность раствора крови, содержащего смесь карбоксигемоглобина и дезоксигемоглобина, а затем измерять оптическую плотность раствора крови, насыщенного оксидом углерода (II). Этот раствор не должен содержать дезоксигемоглобина, оксигемоглобина и метгемоглобина.

Дезоксигемоглобин имеет максимум светопоглощения при длине волны, равной 557 нм, а карбоксигемоглобин имеет 2 максимума светопоглощения при длинах волн 541 и 571 нм. При наложении спектральных кривых карбоксигемоглобина и дезоксигемоглобина на одном графике отмечается появление трех изобестических точек (а, б, в) при длинах волн 550, 565 и 580 нм. В этих точках пересечения спектральных кривых оптические плотности растворов карбоксигемоглобина и дезоксигемоглобина одинаковы.

47. Производные барбитуровой кислоты

Барбитураты -- сильные снотворные и седативные средства.

Имеют кето-енольную и лактим-лактамную таутомерию

Пробоподготовка.

Изолирование из органов трупа.

Общие методы

Изолирование нейтральным ацетоном

Метод Васильевой

Метод Стаса-Отто

Частные методы

Метод Валова

100 г измельченного биологического материала + 180 мл воды и 20 мл 10 %-го раствора гидроксида натрия 30 мин при частом перемешивании центрифугируют 30 мин надосадочная жидкость + 120 мл 10 %-го раствора вольфрамата натрия и 1 н. раствор серной кислоты (до рН=2) нагревают на кипящей водяной бане 20 мин центрифугирование центрифугат процеживают через ватный тампон собирают в делительную воронку + диэтиловый эфир эфирный слой + 50 мл 10%-го гидроксида натрия водный слой отделяют + 25 %-ным раствор серной кислоты до рН=2 + диэтиловый эфир эфирная вытяжка.

Метод Швайковой

100 г измельченных органов трупов + 200 мл воды + раствор щавелевой кислоты до рН=2 2 ч при перемешивании центрифугируют 30 мин центрифугат процеживают через ватный тампон + хлороформ в течение 5 мин (3 раза) вытяжки соединяют + 25 мл 0,1 н. раствора гидроксида натрия хлороформная вытяжка + вода + соляная кислота до рН=2 + две порции хлороформа (по 20 мл) 5 мин хлороформная вытяжка.

Метод Попова

100 г измельченного биологического материала + 80 мл р-ра серной кислоты до рН=2...3 настаивают 2 ч при перемешивании биологический материал еще 2 раза настаивают с новыми порциями раствора серной кислоты 1 ч. водные вытяжки процеживают через марлю и центрифугируют центрифугат сливают с осадка и очищают от примесей методом гель-хроматографии барбитураты + хлороформ в течение 7 мин хлороформные вытяжки на водяной бане при 70 °С отгоняют и выпаривают досуха.

Очистка полученного извлечения.

Метод экстракции.

Основан на способности фенобарбитала практически не растворяться в органических растворителях в лактимной форме. В лактамной форме он легко переходит в органический слой. Метод заключается в многократной реэкстракции препарата при различных значениях pH из водного в органический слой и наоборот.

Колоночная хроматография.

Очистка вытяжки из биологического материала проводится с использованием колоночной хроматографии. В методе применяются колонки с окисью алюминия. Колонка - мерная пипетка на 10 мл, обрезанная с конца слива. Сорбент смачивают 1-2 мл растворителя - смесь хлороформа и 25% аммиака. Органический экстракт выпаривают в чашечке. Остаток растворяют в минимальном количестве растворителя - хлороформа - переносят в колонку. Затем колонку промывают для удаления соэкстрактивных веществ 8-10 мл хлороформа с добавлением аммиака. Фенобарбитал вымывают из колонки 4-5 мл 0,1 н щелочи (NaOH). Вытекающий из колонки раствор щелочи собирают, доводят до pH=1-2 раствором соляной кислоты и экстрагируют барбитурат хлороформом.

Предварительный этап (ТСХ-скрининг)

Исследование в общих системах растворителей

НФ - силикагель

ПФ - ацетон : хлороформ (1:9)

Длина пробега растворителя - 10 см

Время насыщения камеры парами растворителя - 15-20 мин

Д:

* дифенилкарбазоном (ДФК) - 0,1% раствор в хлороформе и раствором сульфата ртути - 5% раствор в концентрированной серной кислоте. Исследуемое соединение оказывается во второй хроматографической зоне (барбитураты): Rf=0,31 - 0,41

Непроявленный слой сорбента с анализируемым веществом элюируют ацетоном.

исследование в частных системах растворителей

НФ - силикагель КСК, забуференный 0,1н раствором борной кислоты.

ПФ - хлороформ : н-бутанол : 25% раствор аммиака (70 : 40 : 5)

Время насыщения камеры парами растворителя - 10 мин

Высота поднятия фронта растворителя - 10 см

Д:

* дифенилкарбазоном (ДФК) - 0,1% раствор в хлороформе и раствором сульфата ртути - 5% раствор в концентрированной серной кислоте. Исследуемое соединение оказывается во второй хроматографической зоне (барбитураты): R_f фенобарбитала = 0,4

Характеристикой каждого вещества при (ТСХ) служит значение R_f :

Длина пробега растворителя от старта

Сравниваются значения R_f соединения, находящегося в образце, со значением R_f вещества сравнения.

Проведение гомогенного ИФА мочи.

Используют следующий набор диагностикума: Реагенты:

Реакционная виала, содержащая:

антитело на фенобарбитал

кофермент НАД

конъюгат (фенобарбитал, меченный глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой)

хромогенное вещество

буфер

консервант

Негативный контроль (холостой образец - моча человека, в которой заведомо нет фенобарбитала, с консервантом - азидом натрия)

Позитивный контроль. Контрольный образец, содержащий 1 мкг/мл фенобарбитала, лиофилизированную мочу человека и азид натрия

Калибратор. Контрольный образец, содержащий фенобарбитал в концентрации 0,5 мкг/мл.

Проведение анализа.

1. Отбор и хранение биообразцов. Образцы мочи отбирают в пластиковые или стеклянные контейнеры.

2. Анализ.

приготовление калибратора и контролей

контроль температуры - 22-25 °С

включение спектрофотометра

мочу помещают в виалу, виалу - в держатель и проводят СФ.

3. Интерпретация результатов

Цветные реакции

+ изопропиламин и соли Co (р-в Пари) -> фиолетовое

+ соли Co и щелочь -> розовое

+ мурексидная проба -> розовое

+ родамин -> оранжевое (слой в хлороформе)

+ пиридин и соли Cu -> аморфный осадок

УФ - спектроскопия

Вытяжка из биоматериала -> упаривание -> сухой остаток + вода

+ NH4OH -> спектр при 240нм (фенобарбитал, барбитал)

+ H2SO4 -> спектр не должно быть максимума

290нм - для тиобарбитуратов

+ NaOH -> спектр при 240нм (фенобарбитал, барбитал)

305нм - для тиобарбитуратов

Количественное определение

ГЖХ-анализ

Условия газохроматографического анализа Газовый хроматограф с термоаэрозольным детектором (ТАД) или с беспламенным азотно-фосфорным детектором (NPD). Колонка стеклянная, силанизированная, длиной 1 м, внутренний диаметр 2-3 мм. Сорбент - 3%-ный SE-30 на хромосорбе W (HP)- 80 - 100 меш. Скорость газа-носителя - 45 мл/ мин азота для ТАД и 40 мл/мин гелия для NPD.

Температура детектора 300єС. Температура испарителя 250 єС. Температура термостата колонки изменяется по линейной программе от 130 до 290 єС со скоростью 20 єС в минуту. Выдерживание при конечной температуре занимает до 15 минут общего анализа. Объем вводимой пробы - 2,5 мкл.

Подготовка пробы:

0,2 мл плазмы/мочи + 1,3 мл воды и ацетатного буфера + смесь этилацетат/диэтиловый эфир встряхивание 5 минут центрифугирование отделение органики упаривание + ТМАГ метилирование барбитуратов

ВЭЖХ-анализ

Условия хроматографирования:

хроматограф жидкостный

хроматографическая колонка (6282 мм), заполненная обращено-фазным сорбентом Сепарон

подвижная фаза - элюент - смесь 0,05М водного раствора двузамещенного фосфата аммония и метанола (60:40)

скорость потока элюирования - 100 мкл/мин

детектирование - при длине волны 240 нм.

Подготовка пробы: кровь/моча + стандарт + вода + ацетатный буфер перемешивание центрифугирование упаривание органики анализ

Приготовление стандартных образцов.

Для приготовления эталонных растворов используется чистые субстанции барбитала, фенофарфитала, циклобарбитала, барбамила и этаминала натрия. Эти растворы служат для идентификации указанных веществ, определения их хроматографических параметров, а также для приготовления контрольных растворов при проведении количественных анализов.

Градуировка хроматографа проводится по фенобарбиталу, барбамилу и этаминалу натрия.

Качественный анализ.

Идентификация проводится следующим образом:

сопоставляют время удерживания и коэффициент емкости определяемого компонента и образца сравнения - фенобарбитала;

сравнивают УФ-спектры предполагаемого компонента и образца сравнения;

оценивают совпадение значений времени удерживания определяемого
компонента и образца сравнения при добавлении контрольного раствора в
раствор экстракта из биопробы (причем концентрация образца сравнения
должна быть близка к концентрации определяемого компонента);

сопоставляют УФ-спектры определяемого компонента и образца сравнения при двух длинах волн, и оценивается их спектральное отношение.

Концентрация определяемого вещества (Ci) в растворе экстракта из биопробы определяется по формуле

где

C_k - концентрация "добавки" в растворе подвижной фазы;

V_k - объем добавленного контрольного раствора;

Vi- объем раствора экстракта с определяемым веществом;

hi - высота сигнала определяемого вещества в растворе экстракта из биопробы;

hi+k - высота сиrnала определяемого вещества после добавки в раствор экстракта контрольного раствора.

Метод внешнего стандарта

В соответствии с методом внешнего стандарта и с учетом линейности зависимости выходного сигнала от массы вещества последовательно, с анализом раствора экстракта биопробы, проводят анализ контрольного раствора идентифицированного вещества, концентрация контрольного раствора (Ck) должна быть близка к концентрации определяемого вещества в растворе экстракта. Анализы контрольного раствора и экстракта биопробы должны проводитьсяв одном масштабе регистрации. Концентрация определяемого вещества в растворе экстракта (Ci) рассчитывается по формуле

Ci = Ck*hi/Hk,

где Ck - концентрация контрольного раствора;

hi- высота сигнала определяемого наркотического вещества в

растворе экстракта биопробы; hk - высота пика вещества контрольного раствора.

Метод внутреннего стандарта

В соответствии с методом внутреннего стандарта в биообьект до операции пробоподготовки добавляется известное количество вещества, принятого за стандарт. В анализе барбитуратов в количестве внутренних стандартов рекомендуется использовать одно изследующих веществ: апробарбитал, метилфенобарбитал, фенилubдантоин и другне вещества, которые в данных условиях xpoмaтoграфического разделения должны полностью отделяться от других компонентов образца, должны элюироваться близко к пику анализируемого соединения, не реагировать с другими компонентами, т.е. удовлетворять требованиям, предъявляемым к внутреннему стандарту. Можно использовать одновременно два и более внутренних стандарта. Концентрация определяемогo вещесгва (CI) рассчитывается по формуле

Ci = Cbc * Hi /Hbc *1/Fi/bc,

где Свс - концентрация внутреннего стандарта;

hi - высота пика (или площадь) определяемого вещества; h_вс - высота пика (или площадь) стандарта; Fi/вc - относительный калибровочный фактор.

Относительный калибровочный фактор компонента Fi/вc вычисляется по формуле

Fi/bc = Hi * Cbc/Ci * Hbc,

где hl - высота пика (или площадь) компонента известной концентрации (калибровочный раствор); CI - концентрация калибровочного раствора определяемого компонента; h_вс - высота пика (или площадь) внутреннего стандарта; Сbc - концентрация внутреннего стандарта

УФ-спектрофотометрия.

Спектрофотометрическое определение основано на способности фенобарбитала к лактим-лактамной (амидоимидольной) таутомерии. При pH=2,0 барбитурат находится в растворе в лактамной форме, не обладающей специфической абсорбцией в пределах 200-300 нм. При pH=10,0 образуется монолактимная форма, в гетероциклическом ядре возникает двойная связь, наблюдается поглощение при 240 нм. При pH=13 и выше в растворе присутствует дилактимная форма с двумя двойными связями в кольце. Абсорбция наблюдается при 255-260 нм.

Для определения рекомендованы методы прямого и дифференциального спектрофотометрирования.

Прямая СФМ: проводится при pH=10 и 240 нм.

Дифференциальные методы:

при pH=2,0-10,0 и 239 нм - если исследуются внутренние органы трупа;

при pH=10,0-13,0 и 260 нм - если исследуется кровь и моча. Дифференциальные методы дают более надежные результаты, т.к. исключают влияние посторонних веществ, экстрагируемых хлороформом из кислого раствора вместе с фенобарбиталом.

УФ-спектральные характеристики фенобарбитала: при pH = 9,2 наблюдается поглощение при 239 нм (е_а = 452); при pH = 13,0 поглощение при 254 нм (е_а = 342).

Для расчета содержания барбитурата пользуются калибровочным графиком или значениями показателя удельного поглощения.

В сочетании с хроматографией метод УФ-спектрофотометрии является достаточно специфичным, быстрым и чувствительным. Определяются микрограммовые количества фенобарбитала.

48. Фенобарбитал

Депрессант центральной нервной системы. Кристаллическое вещество с температурой плавления 245°. Вещество кислого характера, pK_a=7,3. Плохо растворимо в воде, хорошо растворимо в этаноле и в водных растворах щелочей. УФ-спектр имеет два максимума поглощения при щелочных значениях pH (при pH=9,2 л_нм=239; при pH=13,0 л_нм=254). ИК-спектр имеет следующие характеристические частоты: 1684, 1712, 1770, 1310.

Соединение быстро всасывается после орального введения, экскретируется в неизменном виде до 30%. Препарат пролонгированного действия (10-18 часов), период полувыведения 3 дня. Фенобарбитал используется как снотворное и противосудорожное средство. Фенобарбитал дает длительный сон, мало изменяется в организме и выводится в значительной степени почками в неизменном состоянии.

В относительно больших дозах фенобарбитал способен вызывать смертельное отравление. (0,6-1 г.). ВРД 0,2, ВСД 0,5.

В организме человека фенобарбитал подвергается, в основном, в печени ряду превращений:

Окислению одного из радикалов

Окислению до кислот и кетонов

Десульфированию

Демитилированию

Гидролизу

Метод Валова

100 г измельченного биологического материала + 180 мл воды и 20 мл 10 %-го раствора гидроксида натрия 30 мин при частом перемешивании центрифугируют 30 мин надосадочная жидкость + 120 мл 10 %-го раствора вольфрамата натрия и 1 н. раствор серной кислоты (до рН=2) нагревают на кипящей водяной бане 20 мин центрифугирование центрифугат процеживают через ватный тампон собирают в делительную воронку + диэтиловый эфир эфирный слой + 50 мл 10%-го гидроксида натрия водный слой отделяют + 25 %-ным раствор серной кислоты до рН=2 + диэтиловый эфир эфирная вытяжка

Подтверждающие исследования

Цветные реакции:

* с аммиачным раствором нитрата или ацетата кобальта. При наличии барбитуратов появляется розово-фиолетовое окрашивание.

* мурексидная проба. Через некоторое время по краям сухого остатка появляется розовое и красное окрашивание, которое становится интенсивней при смачивании остатка 25% раствором гидрата окиси аммония.

Микрокристаллоскопические реакции:

перекристаллизация: на предметное стекло помещают сухой остаток. Через 24 часа наблюдают форму осадка - сферолиты, в виде «ежиков».

с железоиодидным комплексом. Раствор хлорида окисного железа + концентрированная соляная кислота + калия иодид. Через 10 минут наблюдают образование сростков кристаллов.

49. Бензонал

Кристаллическое вещество с температурой плавления 137°. Вещество кислого характера, pK_a=7,3. Бензонал трудно растворяется в воде и этиловом спирте, легче -- в диэтиловом эфире, хлороформе и диметилформамиде. Экстрагируется органическими растворителями из кислых водных растворов.

Бензонал в основном применяется для лечения судорожных форм эпилепсии. Иногда он применяется для лечения больных, страдающих припадками, не сопровождающимися судорогами. ВРД 0,3, ВСД 0,6.

Метаболитами бензонала являются бензойная кислота и фенобарбитал, который, в свою очередь, подвергается метаболизму. Бензонал и его метаболиты в основном выделяются с мочой.

Выделение бензонала из биологического материала.

100 г измельченного биологического материала + 10 мл р-ра соляной кислоты + 50 г сульфата аммония перемешивают + 200 мл смеси равных объемов этилового спирта и хлороформа настаивают 2 ч при перемешивании вытяжку сливают и фильтруют через плотный бумажный фильтр промывают смесью этилового спирта и хлороформа (1 : 1) водную фазу, насыщенную сульфатом аммония, отделяют и не исследуют. Слой органических растворителей выпаривают досуха + 200 мл горячей воды перемешивают и фильтруют + три порции хлороформа хлороформные вытяжки + фосфатный раствор (рН = 7,4) хлороформный слой фильтруют через бумажный фильтр хлороформную вытяжку используют для идентификации и количественного определения бензонала. Поскольку бензонал частично разлагается в организме на фенобарбитал и бензойную кислоту, наличие последней определяют в водной фазе. С этой целью водную фазу подкисляют раствором соляной кислоты (1 : 1) до рН = 2 и взбалтывают с 10 мл хлороформа. От водной фазы отделяют хлороформную вытяжку, которую исследуют на наличие бензойной кислоты.

Подтверждающие исследования

Бензонал с изопропиламином и солями кобальта дает фиолетовую окраску

С солями кобальта и щелочами бензонал дает сине-фиолетовую окраску

Бензонал можно обнаружить по форме кристаллов, которые образуются после прибавления к нему метилового спирта и концентрированной соляной кислоты. Через несколько минут в поле зрения под микроскопом появляются ромбической формы кристаллы или сростки из них.

Обнаружение методом хроматографии.

НФ: силикагель

ПФ: хлороформ: н-бутанол: 25% раствор аммиака

Д: 0,02 %-м хлороформным раствором дифенилкарбазида, затем раствором сульфата ртути.

Пятна бензонала на пластинке имеют Rf =* 0,40...0,45. 10. При наличии барбамила пятна на хроматограмме приобретают сине-фиолетовую или красно-фиолетовую окраску.

50. Гексенал

Хорошо растворяется в воде, этиловом спирте и хлороформе, слабо -- в диэтиловом эфире. Гексенал экстрагируется органическими растворителями из кислых водных растворов.

Гексенал проявляет снотворное действие, а в больших дозах он имеет наркотические свойства. Его применяют для наркоза в сочетании с оксидом азота (I), фторотаиом и с некоторыми другими веществами. Гексенал и сам может применяться для кратковременного наркоза (продолжительностью 15--20 мин).

Гексенал относится к барбитуратам короткого периода действия. В организме он подвергается метаболизму несколькими путями:

Гидроксилирование циклогексильной группы окисление с образованием 3'-кетогексабарбитала N-деметилирование.

N-деметилирования при атоме азота в третьем положении норгексабарбитал.

Определенное количество гексенала, поступившего в организм, метаболизируется путем разрыва цикла барбитуровой кислоты.

Подтверждающие исследования

От прибавления солей кобальта и изопропиламина к гексеналу появляется фиолетовая окраска.

Гексенал с солями кобальта и щелочью дает розовую или красную окраску.

От прибавления концентрированной серной кислоты к гексеналу образуется осадок, состоящий из сростков игольчатых кристаллов.

Гексенал с подкисленным спиртовым раствором иодида калия образует кристаллический осадок.

Обнаружение гексенала по УФ-спектрам. Гексенал в ходе
химико-токсикологического анализа выделяется из биологического материала в виде гексобарбитала, который можно обнаружить по спектрам поглощения

В ИК-области спектра гексенал (диск с бромидом калия) имеет основные пики при 1712, 1660, 1390, 1358 см^-1,

51. Тиопентал-натрий

Легко растворим в воде, практически нерастворим в бензоле и эфире. Средство для внутривенного наркоза.

52. Производные 1,4-бензодиазепина

Общие свойства веществ.

Распределение производных 1,4-бенздиазепина по органам происходит в три стадии:

1-ая характеризуется падением концентрации в крови и накоплением в паренхиматозных органах;

на 2-ой стадии идет накопление соединений во всех органах. Предел накопления соединений в тканях определяется кажущимся объемом распределения (Vр);

3-я стадия, самая продолжительная по времени - характеризуется накоплением соединений в органах выделения (печени, почках), с одновременным уменьшением в остальных тканях органов.

Наибольшее содержание 1,4-бенздиазепинов в ЖКТ, тканях печени, почек.

Ультрафиолетовые спектры

В электронных спектрах производных 1,4-бенздиазепина имеется 3 полосы поглощения с л_max в областях:

200-215 нм

220-240 нм

290-330 нм

Две первые полосы соответствуют возбуждению ароматических хромофоров. Третью длинноволновую полосу относят к азометиновой связи, сопряженной с бензогруппой.

По характеру поглощения в УФ-области 1,4-бенздиазепины относятся к соединениям, абсорбция которых изменяется от величины значений рН:

в кислой среде - за счет протонирования атома азота 1 (у хлордиазепоксида) и 4 (1,2-дигидропроизводных 1,4-бенздиазепина - нитразепам, оксазепам, диазепам);

в щелочной среде в молекуле 1,2-дигидропроизводных 1,4-бенздиазепина наблюдается изменение хромофорной системы (увеличение сопряжения за счет лактим-лактамной таутомерии азометиновой связи в положения 1,2 - нитразепам, оксазепам).

Кислотный гидролиз хлордиазепоксида (I), протекающий в мягких условиях, приводит к образованию 4-окси-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-онов (II). В более жестких условиях эти соединения гидролизуются до 2-аминобензофенонов (III), альфа-аминокислот (IV) и аминов (V).

Метаболизм

Окисление

N-деметилирование

В молекуле диазепама у атома азота в 1 положении

В метиламинной группе хлордиазепоксида

Пробоподготовка.

Изолирование из тканей и органов трупа.

Анализ производных 1.4-бензодиазепина по нативным соединениям.

Возможно использование любых общих методов пробоподготовки.

М-д изолирования нейтральным ацетоном

Биоматериал + н-ацетон ацетоновое извлечение + 0,5н HCL + н-гексан очищенная ацетоно-водная вытяжка ацетоно-водная фаза + NaOH + эфир эфирное извлечение ТСХ, элюирование исследование не бензодиазепины.

М-д Васильевой

Биоматериал + вода, подкисленная органической кислотой водная вытяжка водная фаза + NH4OH + хлороформ органическая фаза выпаривание исследование на бензодиазепины

М-д Стаса-Отто

Биоматериал + 96% этанол + органическая кислота спиртовой экстракт упаривание + 100% спирт отделение осадка очищенный экстракт упаривание остаток + горячая вода фильтрование водная фаза + NaOH + хлороформ органическая фаза исследование на бензодиазепины

ТСХ-скрининг

Общая система

НФ: силуфол

ПФ: хлороформ: этилацетат

Д:

Р-в Драгендорфа

Р-р FeCl3 + HCl + HNO3

Частная система

НФ: силуфол

ПФ: хлороформ: этилацетат:метанол

Д:

Р-в Драгендорфа

Р-р FeCl3 + HCl + HNO3

Обнаружение:

а) реактив Драгендорфа в разбавленной уксусной кислоте образует оранжевые и желто-оранжевые комплексные соли;

б) реактив FPN (хлорид железа (III) в смеси хлорной и азотной кислот) окисляет бензодиазепины с образованием окрашенных продуктов желтого цвета;

в) реактив Марки образует окрашенные продукты желтого цвета;

г) подкисленный йодплатинат образует темноокрашенные пятна.

Количественное определение

Для ГЖХ обнаружения производных 1,4-бензодиазепина и их метаболитов используется общая система: стеклянная колонка 2 м х 4мм с 2,5% SE-30 на хромосорбе Q.

Газ-носитель - аргон/метан

Температура колонки от 150 до 300 °С

Температура инжектора - 230

Температура детектора - 300

Подготовка пробы: кровь/моча + вода + р-р NaHCO3 центрифугирование центрифугат ТФЭ + вода промывают картридж хлороформом остаток растворяют в метаноле.

ГХ/МС анализ

Газовый хроматограф/ масс-спектрометр

Стандарты: смесь бензодиазепинов

Экстракция: пробирка + биожидкость + стандарт встряхивают + NaCl + NH4Cl + н-бутилхлорид экстракция центрифугирование органический слой + ацетонитрил + гексан выпаривание + этиловый эфир + KOH центрифугирование анализ

ВЭЖХ-анализ

Условия хроматографирования:

хроматограф жидкостный

ПФ: ацетонитрил: ацетатный буфер

скорость потока элюирования - 100 мкл/мин

детектирование - при длине волны 240 нм.

Подготовка пробы: моча + ацетат Na + b-глюкуронидаза настаивание 2 часа + ацетатный буфер.

Приготовление стандартных образцов.

Для приготовления эталонных растворов используется чистые субстанции. Эти растворы служат для идентификации указанных веществ, определения их хроматографических параметров, а также для приготовления контрольных растворов при проведении количественных анализов.

Качественный анализ.

Идентификация проводится следующим образом:

сопоставляют время удерживания и коэффициент емкости определяемого компонента и образца сравнения;

сравнивают УФ-спектры предполагаемого компонента и образца сравнения;

оценивают совпадение значений времени удерживания определяемого
компонента и образца сравнения при добавлении контрольного раствора в
раствор экстракта из биопробы (причем концентрация образца сравнения
должна быть близка к концентрации определяемого компонента);

сопоставляют УФ-спектры определяемого компонента и образца сравнения при двух длинах волн, и оценивается их спектральное отношение.

Концентрация определяемого вещества (Ci) в растворе экстракта из биопробы определяется по формуле



где

C_k - концентрация "добавки" в растворе подвижной фазы;

V_k - объем добавленного контрольного раствора;

Vi- объем раствора экстракта с определяемым веществом;

hi - высота сигнала определяемого вещества в растворе экстракта из биопробы;

hi+k - высота сиrnала определяемого вещества после добавки в раствор экстракта

контрольного раствора.

Метод внешнего стандарта

В соответствии с методом внешнего стандарта и с учетом линейности зависимости выходного сигнала от массы вещества последовательно, с анализом раствора экстракта биопробы, проводят анализ контрольного раствора идентифицированного вещества. концентрация контрольного раствора (Ck) должна быть близка к концентрации определяемого вещества в растворе экстракта. Анализы контрольного раствора и экстракта биопробы должны проводитьсяв одном масштабе регистрации. Концентрация определяемого вещества в растворе экстракта (Ci) рассчитывается по формуле

Ci = Ck*hi/Hk,

где Ck - концентрация контрольного раствора;

hi- высота сигнала определяемого наркотического вещества в растворе экстракта биопробы; hk - высота пика вещества контрольного раствора.

Метод внутреннего стандарта

В соответствии с методом внутреннего стандарта в биообьект до операции пробоподготовки добавляется известное количество вещества, принятого за стандарт. Это вещество должно полностью отделяться от других компонентов образца, элюироваться близко к пику анализируемого соединения, не реагировать с другими компонентами, т.е. удовлетворять требованиям, предъявляемым к внутреннему стандарту. Можно использовать одновременно два и более внутренних стандарта. Концентрация определяемогo вещесгва (CI) рассчитывается по формуле

Ci = Cbc * Hi /Hbc *1/Fi/bc,

где Свс - концентрация внутреннего стандарта;

hi - высота пика (или площадь) определяемого вещества; h_вс - высота пика (или площадь) стандарта; Fi/вc - относительный калибровочный фактор.

Относительный калибровочный фактор компонента Fi/вc вычисляется по формуле

Fi/bc = Hi * Cbc/Ci * Hbc,

где hl - высота пика (или площадь) компонента известной концентрации (калибровочный раствор); CI - концентрация калибровочного раствора определяемого компонента; h_вс - высота пика (или площадь) внутреннего стандарта;

Сbc - концентрация внутреннего стандарта



Изучив отечественные и зарубежные литературные источники, описывающие различные инструментальные методы анализа группы производных бензодиазепина, а также опираясь на результаты наших исследований мы пришли к выводу, что оптимальной комбинацией в анализе производных бензодиазепина является применение в качестве:

предварительного метода анализа - метод ПФИА с использованием пороговой концентрации 100 нг/мл,

подтверждающего метода анализа - метод газовой хроматографиии с масс селективным детектором или газовой хроматографии с электронно-захватным детектором,

метода количественного определения - высоко-эффективная жидкостная хроматография с диодно-матричным детектором.

53. Хлордиазепоксид (элениум, хлозепид)

Практически нерастворим в воде, растворим в воде соли 1,4-бенздиазепинов. В органических растворителях растворимость зависит от структуры. Наиболее высокая растворимость наблюдается в апротонных растворителях (диметилформамиде, диметилсульфоксиде). Слабое основание. pKa = 2.93

Выводятся производные 1,4-бенздиазепина, в основном, почками в виде основных соединений и метаболитов. Наличие в органах активных метаболитов производных 1,4-бенздиазепина снижает скорость элиминации. Время полувыведения (Т Ѕ) 8-28 часов.

Хлордиазепоксид относится к транквилизаторам. Он оказывает успокаивающее действие на центральную нервную систему, обладает противосудорожной активностью, потенцирует действие снотворных веществ и анальгетиков, проявляет умеренный снотворный эффект.

Хлордиазепоксид (7-хлор-2-метиламино-5-фенил-ЗН-1,4-бензодиазепин-4-оксид) быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта. Метаболитами хлордиазепоксида является N-деметилхлордиазепоксид и лактам (7-хлор-1,3-дигидро-5-фенил-2Н-1,4-бензодиазепин-2-он-4-оксид). Часть неизмененного хлордиазепоксида и его метаболитов выделяется с мочой, а часть -- образует конъюгаты, которые тоже выделяются с мочой.

Пробоподготовка.

25 г измельченного биологического материала + вода + HCl до рН = 1 3 раза по одному часу вытяжки центрифугируют центрифугат подщелачивают до рН = 10 + хлороформ 3 раза взбалтывают хлороформные вытяжки соединяют обнаружение и количественное определение хлордиазепоксида.

5-10 мл плазмы крови или мочи + аммиак дважды взбалтывают с хлороформом хлороформные вытяжки + вода взбалтывают хлороформный слой + 5 мл р-ра соляной кислоты взбалтывают 5 мин солянокислые вытяжки отделяют нагревают на водяной бане затем нагревают при 125 °С на парафиновой бане 30 мин (при этом образуется 2-амино-5-хлорбензофенон) + 0,5 мл 10 %-го р-ра нитрита натрия + 0,5 мл 0,5 %-го раствора сульфамината аммония + 0,5 мл 0,1 %-го раствора N-1-нафтилэтилендиамина дигидрохлорида вишнево-красная окраска.

Цветные реакции.

Реакция с нингидрином, хлордиазепоксид дает коричневую окраску.

Реакция с реактивом Марки, хлордиазепоксид дает желтую окраску.

Реакция с реактивом Фреде, хлордиазепоксид дает оранжевую окраску.

Реакция Витали -- Морена, хлордиазепоксид дает желтую окраску.

ТСХ-обнаружение

Обнаружение хлордиазепоксида методом хроматографии в тонком слое сорбента.

НФ: силикагель КСК или пластинки «силуфол»

ПФ: этилацетат : 25 %-го р-р аммиака : метиловый спирт

хлороформ : ацетон

Д: р-в Драгендорфа

Использование спектров.

Обнаружение хлордиазепоксида по УФ- и ИК-спектрам. Хлордиазепоксид в 0,1 н. растворе гидроксида натрия имеет максимумы поглощения при 243 и 260 нм; в 0,1 н. растворе серной кислоты хлордиазепоксид имеет максимумы поглощения при 245 и 306 нм.

Хлордиазепоксид в 0,1 н. растворе соляной кислоты имеет максимумы поглощения при 246 и 308 нм.

54. Диазепам (седуксен)

Диазепам (седуксен, эридан,реланиум и др.) представляет собой белый или белый с желтоватым оттенком кристаллический порошок, не растворяется в воде, трудно растворяется в этиловом спирте, растворяется в хлороформе.

Т1/2 = 20-55 часов.

По действию на организм диазепам относится к транквилизаторам. Он способствует нормализации сна, применяется для лечения невротических состояний, уменьшает чувство страха и т. д.

Диазепам быстро всасывается в пищевом канале.

Метаболизм:

образуются продукты N-деметилирования оксазепам глюкуронид гидроксилирование диазепама глюкуронид

Выделение из крови и мочи.

10 мл мочи/5 мл крови + равный объем фосфатного буферного раствора (рН = 7,0) 2 раза по 5 мин взбалтывают с диэтиловым эфиром эфирные вытяжки + NaOH дважды взбалтывают + вода эфирная вытяжка + HCl встряхивание 10 мин отделение солянокислой вытяжки ФЭК

Параллельно измеряют оптическую плотность диазепама, обработанного указанным выше способом. Наличие максимумов поглощения при 242 и 287 нм указывает на наличие диазепама в крови или моче.

Качественные реакции.

Реакция с нингидрином. Р-р диазепама в этиловом спирте + 10 мг нингидрина водяная баня + 5 мл этилового спирта синяя окраска + 1 %-го раствора сульфата меди красная.

ТСХ-обнаружение.

НФ: силикагель КСК/силуфол

ПФ: этилацетат : р-р аммиака : метиловый спирт

хлороформ : ацетон

Д: реактив Драгендорфа.

Спектральный анализ.

Диазепам в 2 н. растворе соляной кислоты имеет максимумы поглощения при 242 и 287 нм, в 0,1 н. растворе серной кислоты имеет максимумы поглощения при 241, 284 и 359 нм; в ИК-области спектра диазепам имеет основные пики при 1681, 1484 и 1313 см -1.

55. Оксазепам

Т1/2 = 5-15 часов.

Он представляет собой кристаллический порошок, почти не растворимый в воде, растворимый в этиловом спирте и хлороформе.

По фармакологическим свойствам оксазепам близкий к хлордиазепоксиду и диазепаму. Он менее токсичен, чем диазепам, обладает слабым противосудорожным действием и миорелаксантным эффектом.

Метаболизм. Оксазепам явдяется одним из метаболитов диазепама. После приема оксазепама максимальный уровень его в плазме достигается через 4 ч, а через 48 ч он исчезает из плазмы. Оксазепам находится в плазме в виде глюкуронида. В виде глюкуронида он выделяется с мочой, а с калом он выделяется в неизмененном виде.

Выделение из биологического материала

25 г исследуемого объекта + 3 мл насыщенного р-ра гидрофосфата натрия uомогенизирование гомогенат + 100 мл диэтилового эфира взбалтывают эфирные вытяжки соединяют фильтруют через бумажный фильтр профильтрованные эфирные вытяжки обнаружение и количественное определение оксазепама.

Выделение из крови и мочи.

10 мл крови/мочи + 100 мл диэтилового эфира взбалтывают 10 мин, 2 раза отделяют эфирную вытяжку фильтруют через бумажный фильтр профильтрованные эфирные вытяжки обнаружение и количественное определение оксазепама.

Качественные реакции.

Цветная реакция

25--50 мл объединенной эфирной вытяжки выпаривают досуха сухой остаток растворяют в 5 мл 6 н. раствора соляной кислоты и фильтруют 1 мл фильтрата кипятят 5--10 мин помещают в холодильник на 15 мин + 1 мл смеси (0,3 г бромида калия, 0,3 г нитрита натрия в 6 мл воды) взбалтывают и помещают в холодильник на 30 мин + 0,5 мл 10%-го раствора мочевины + 1 мл 1 %-го спиртового раствора б-нафтола и 1 мл 40 %-го водного раствора гидроксида натрия красная окраска

ТСХ-обнаружение.

НФ: силуфол

ПФ: хлороформ : пропиловый спирт : ацетон

Д: тиосульфат натрия.

При налички оксазепама на пластинке появляются оранжевые или желтоватые пятна.

Обнаружение по УФ- и ИК-спектрам.

Растворы оксазепама в этиловом спирте имеют максимумы полос поглощения при 230 и 315 нм. В ИК-области спектра оксазепам (диск с бромидом калия) имеет основные пики при 1687, 1706, 693 и 830 см -1.

56. Нитразепам

T1|2 = 18-38 часов.

Нитразепам -- светло-желтый или светло-желтый с зеленым оттенком кристаллический порошок. Практически нерастворим в этиловом спирте и хлороформе.

Нитразепам оказывает транквилизирующее, мышечно-расслабляющее, снотворное действие и т. д. Он усиливает снотворное действие других снотворных средств и анальгетиков. Применяется при нарушении сна, неврозах, психопатиях.

Метаболизм. Метаболитами нитразепама являются 7-амино-метаболит, 7-ацетиламино-метаболит. В течение 48 ч из организма выделяется около 23 % принятой дозы нитразепама. В неизмененном виде с мочой выделяется около 5 % этого препарата. Свыше 8 % нитразепама выделяется с мочой в виде 7-амино-метаболита и около 10%--в виде 7-ацетиламино-метаболита. Часть неизмененного нитразепама может быть обнаружена в кале.

Выделение из биологического материала.

Биологический материал трижды настаивают с насыщенным раствором щавелевой кислоты (рН=1) Через 1 ч после каждого настаивания вытяжки отделяют от биологического материала центрифугированием кислый центрифугат трижды взбалтывают со смесью хлороформа и этилацетата кислый центрифугат подщелачивают до рН = 10 трижды взбалтывают с новыми порциями смеси хлороформа и этилацетата исследование на наличие нитразепама.

Предварительные пробы на наличие в моче.

5 мл мочи + аммиак до рН=10 + 250 г дитионита натрия (Na2S2O4) взбалтывают 10 мин нагревают при 50 °С в течение часа и охлаждают жидкость 10 мин взбалтывают с 10 мл смеси (метиленхлорида и этилацетата) от водной фазы отделяют слой смеси органических растворителей взбалтывают с 10 мл 5 %-го раствора буры фаза органических растворителей + 5 мл 0,2 н. раствора соляной кислоты взбалтывают органические растворители.

4 мл кислой водной фазы охлаждают в ледяной воде + 0,2 мл 0,4 н. раствора нитрита натрия + 0,2 мл 2%-го раствора сульфамината аммония перемешивают + 0,2 мл 0,4 %-го раствора N-1-нафтилэтилендиамина дигидрохлорида вишнево-красная окраска.

Выделение метаболитов нитразепама из мочи.

5 мл мочи + аммиак до рН=10 взбалтывают 10 мин нагревают при 50 °С в течение часа и охлаждают жидкость 10 мин взбалтывают с 10 мл смеси (метиленхлорида и этилацетата) от водной фазы отделяют слой смеси органических растворителей взбалтывают с 10 мл 5 %-го раствора буры фаза органических растворителей + 5 мл 0,2 н. раствора соляной кислоты взбалтывают органические растворители.

4 мл кислой водной фазы охлаждают в ледяной воде + 0,2 мл 0,4 н. раствора нитрита натрия + 0,2 мл 2%-го раствора сульфамината аммония перемешивают + 0,2 мл 0,4 %-го раствора N-1-нафтилэтилендиамина дигидрохлорида вишнево-красная окраска.

Обнаружение нитразепама и его метаболитов методом хроматографии.

ПФ: силикагель/силуфол

НФ: этилацетат : метилен : аммиак

Д: р-в Драгендорфа

Обнаружение по УФ- и ИК-спектрам.

Раствор нитразепама в этиловом спирте имеет максимумы поглощения при 218 и 260 нм, в 0,1 и. растворе серной кислоты имеет максимум поглощения при 277 нм и изгиб около 340 нм; нитразепам в ИК-области спектра (диск с бромидом калия) имеет основные пики при 1692, 1615, 1352 и 702 см -1.

57. Производные фенилалкиламина

Изолирование

М-д Васильевой.

Биоматериал + вода + органическая кислота водная вытяжка + NH4OH + хлороформ органическая фаза выпаривание анализ

М-д Стаса-Отто

Биоматериал + 96% этанол + органическая кислота спиртовой экстракт упаривание + 100% этанол осаждение белков отделение осадка очищенный экстракт упаривание сухой остаток + горячая вода фильтрование + NH4OH + хлороформ органическая фаза анализ

М-д Крамаренко

Биоматериал + вода + серная кислота водная вытяжка + электролит осаждение белка отделение осадка очищенная водная вытяжка + эфир (доп. очистка) + NaOH до рН = 8-9 + хлороформ органическая фаза анализ

Изолирование н-ацетоном

Биоматериал + ацетон ацетоновое извлечение + н-гексан + Hcl очищенная фаза + NH4OH + эфир эфирное извлечение ТСХ, элюирование анализ

Обнаружение амфетаминов.

ТСХ

НФ: силикагель

ПФ: хлороформ : ацетон : этанол : аммиак

Д: р-в Марки окраска

Дериватизация: сухой остаток + толуол + дериватизирующий реактив темп. 60 С 30 мин. + NaH2CO3 центрифугирование

Количественное определение.

Выбор условий разделения

Для разделения фенилалкиламинов методом ВЭЖХ рекомендуются следующие условия:

хроматографическая колонка (62 х 2 мм), заполненная обращенно-фазным сорбентом "Сепарон" Cie (5мкм) (колонка поставляется с хроматографом);

в качестве подвижной фазы (элюента) для разделения фенилалкиламинов используется смесь водного раствора ортофосфорной кислоты (0,2 М), метанола и диэтиламина (75:20:1). Добавление диэтидамина улучшает форму пиков и позволяет сократить время анализа;

детектирование фенилалкиламинов проводится при 210 нм;

скорость элюирования -- 50 мкл/мин.

Приготовление эталонных растворов

а) В мерной посуде готовится раствор ортофосфорной кислоты в дистиллированной воде (0,2 М). Для этого:

на аналитических весах берется навеска ортофосфорной кислоты;

навеска переносится в колбу на 100 мл, объем доводится дистиллированной водой до метки, и смесь встряхивается до полного растворения (раствор № 1).

б) В мерный цилиндр на 100 мл переносится 75 мл раствора № 1, 20 мл метанола и 1 мл свежеперегаанного при 5б°С диэтиламина. Смесь хорошо перемешивается.

в) Для приготовления эталонных растворов анализируемых фенилалкиламинов используются чистые субстанции норэфедрина, эфедрона, эфедрина, амфетамина и метамфетамина, и проводят следующие операции:

на лабораторных весах взвешивается по 25 ± 1 мг указанных веществ;

навеска каждого вещества переносится в соответствующую маркированную отдельную колбу на 50 см и заполняется элюентом до метки;

содержимое колбы встряхивается до полного растворения осадка.

Эталонные растворы служат для идентификации указанных веществ, определения их хроматографических параметров, а также для приготовления контрольных растворов при проведении количественных анализов.

Элюеыт и эталонные растворы сравнения перед использованием необходимо очистить от механических примесей (пыль из атмосферы, частицы вещества), которые могут забивать фильтры колонки и нарушать нормальную работу насоса и хроматографической колонки. Для удаления этих примесей используется владипоровская мембрана с размером пор 0,15 -- 0,25 мкм или мелкопористый стеклянный фильтр. Элюент перед работой необходимо продегазировать в течение 10 минут. Для этого используется ток газообразного гелия при расходе 40 -- 50 мл/мин, обработка на ультразвуковой бане или вакуумный насос.

58. Анализ модельной смеси фенилалкиламинов и определение их параметров удерживания

Тестовая модельная смесь норэфедрина, эфедрона, эфедрина, амфетамина, метамфетамина готовится в растворе подвижной фазы. Для этого:

а) берется навеска норэфедрина, эфедрина, эфедрона, амфетамина, метамфетамина;

б) навески переносятся в колбу 50см , объем доводится до метки, смесь встряхивается до полного растворения и фильтруется.

Хроматографирование модельной смеси проводится при следующих условиях:

расход элюента -- 100 мкг/мл;

объем вводимой пробы -- 7 мкл;

масштаб чувствительности -- 0,4 е.о.п.;

время измерения -- 0,3 с;

длина волны -- 210 нм.

59. Определение пределов обнаружения анализируемых веществ

Предел обнаружения анализируемого вещества устанавливается по величине такого количества вещества, которое вызывает сигнал, превышающий в 5 раз уровень флкжтуационных шумов, который на шкале чувствительности составляет 2 мм.

Значение пределов обнаружения (Gmin, мг) рассчитывается по формуле

60. Анализ биопроб на содержание фенилалкиламинов

Качественный анализ

Идентификация фенилалкиламинов, содержащихся в биопробах, производится следующим образом:

а) сопоставляются время (объемы) удерживания и коэффициенты емкости определяемого компонента и образца сравнения (эталонный раствор) индивидуальных фенилалкиламинов;

б) сравниваются УФ-спектры предполагаемого компонента и об
разца сравнения;

в) оценивается совпадение значений времени удерживания определяемого компонента и образца сравнения при добавлении эталонного раствора в раствор экстракта из биопробы (концентрация
образца сравнения должна быть близка к концентрации определяемого компонента);

г) сопоставляются УФ-спектры определяемого компонента и образца сравнения при двух длинах волн, и оценивается их спектральное отношение.

Количественный анализ

Для количественного анализа фенилалкиламинов в биощюбах можно использовать различные методы, в том числе метод добавки, метод внешнего стандарта, метод внутреннего стандарта и т.д.

а) Метод добавки. В соответствии с методом добавки проводят анализ раствора экстракта биопробы из этого же раствора, но с добавкой в него раствора известной концентрации предполагаемого фенилалкиламина (эталонного раствора). Анализы растворов "без добавки" и "с добавкой" должны проводиться в одном масштабе регистрации.

Концентрация определяемого вещества (О) в растворе экстракта из биопробы определяется но формуле

где

Ск -- концентрация "добавки" в растворе подвижной фазы; Vk -- объем добавленного эталонного раствора; Vi -- объем раствора экстракта с определяемым веществом; hi -- высота сигнала определяемого вещества в растворе экстракта из биопробы; hi+k-- высота сигнала определяемого вещества после добавки в раствор экстракта эталонного раствора.

б) Метод внешнего стандарта. В соответствии с методом внешнего стандарта и с учетом линейной зависимости выходного сигнала от массы вещества последовательно, сразу же после анализа раствора экстракта биопробы проводят анализ эталонного раствора идентифицированного вещества. Концентрация эталонного раствора (Ск) должна быть близка к концентрации определяемого вещества в растворе экстракта. Анализы эталонного раствора и экстракта биопробы должны проводиться в одном масштабе регистрации.



где

hi -- высота сигнала определяемого наркотического вещества в растворе экстракта биопробы; hk -- высота пика вещества эталонного раствора.

в) Метод внутреннего стандарта. В соответствии с методом внутреннего стандарта к биообъекту до операции пробоподготовки добавляется известное количество вещества, принятого за стандарт.

Концентрация определяемого вещества (СО рассчитывается по формуле

где

Свс -- концентрация внутреннего стандарта;

hi -- высота пика (или площадь) определяемого вещества;

h_Bc -- высота пика (или площадь) стандарта;

Fi/bc-- относительный калибровочный фактор.

Относительный калибровочный фактор компонента Fi/с вычисляется по формуле

где

hi -- высота пика (или площадь) компонента известной концентрации (калибровочный раствор);

Q -- концентрация калибровочного раствора определяемого компонента;

hue -- высота пика (или площадь) внутреннего стандарта;

Свс -- концентрация внутреннего стандарта.

61. Селективный анализ эфедрона

Используя значительное различие в коэффициентах молярного поглощения эфедрона и других соединений этой группы при 250 нм, можно провести селективный анализ эфедрона в смеси с другими компонентами этой группы -- норэфедрином, эфедрином, амфетамином, метамфетамином. При этом анализ проводится путем детектирования при двух длинах волн: 210 нм для регистрации всех определяемых фенилал-киламинов и 250 нм для селективно определяемого эфедрона с последующим сопоставлением полученных хроматограмм для количественного определения эфедрона в биопробах.

...