Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

1. Применение методов химической метрологии в фармации

2. Нормативная база для проведения валидации

3. Валидационные параметры

4. Аналитические характеристики, применяемые в отдельных случаях



1. Применение методов химической метрологии в фармации

Лекарственные средства (ЛС) представляют собой сложные химические вещества как неорганической, так и органической природы, и для контроля их качества используют весь комплекс аналитических методов анализа.

Сборником обязательных общегосударственных стандартов и положений, нормирующих качество лекарственных средств, является Государственная Фармакопея (ГФ). Последнее издание Государственной Фармакопеи (ГФ XII, вып.1, 2007г.) включает не только классические химические методы определения подлинности препаратов, чистоты и их количественного содержания (гравиметрия, титриметрия), но в ней также широко представлены современные инструментальные методы анализа.

Аналитический контроль лекарственных средств или определенных ингредиентов в препарате необходим, чтобы гарантировать их безопасность и эффективность на протяжении всего срока годности, включая хранение, распределение и использование.

Аналитические методы начинают применяться на стадии разработки и испытания препаратов, технологий производства и продолжают использоваться при серийном выпускелекарственных средств. В идеале такой контроль должен проводиться в соответствии со спецификациями, разработанными и валидированными во время разработки препарата. Это гарантирует, что спецификации качества применимы как к фармацевтической продукции, использованной для установления биологических характеристик действующих веществ, так и для дозированных лекарственных форм, предназначенных для продажи. После завершения биомедицинской экспертизы продукта качество всех последующих серий будет оцениваться только на основании этих спецификаций.

Для того чтобы аналитическая методика заняла достойное место в системе обеспечения качества, соответствовала своему назначению, то есть гарантировала достоверные и точные результаты анализа, предусмотрена процедура валидации аналитических методик.

Валидация (validation) - это процесс экспериментального подтверждения того, что аналитическая методика обеспечивает получение необходимой и достоверной информации об объекте анализа и пригодна для практического использования.

Необходимость валидации всех аналитических методик не вызывает сомнений - это один из элементов валидации всего процесса производства лекарств. Кроме этого, с практической точки зрения, валидация аналитических методик дает ряд существенных «вторичных» полезных эффектов.

Во-первых, при проведении валидации в процессе разработки новых методик можно своевременно выявить их недостатки и на ранних стадиях существенно улучшить методику.

Во-вторых, при грамотно и качественно выполненной работе появляется уверенность и в методике, и в качестве анализируемого препарата.

В третьих, в процессе валидации обязательно принимают практическое участие различные аналитические лаборатории. Практика валидационных экспериментов дает понимание сути методики и осознание необходимости строгого соблюдения ее параметров. В результате, при последующей эксплуатации валидированной методики значительно снижается вероятность ошибок.

2. Нормативная база для проведения валидации

Решением правительства РФ отечественные производители лекарственных средств должны полностью перейти на международный стандарт GMP (Good Manufacturing Practice, т.е. надлежащая производственная практика). Стандарт GMP - это набор норм, правил и указаний в отношении производства, хранения и испытания фармацевтических ингредиентов, пищи и медицинских устройств.

Переход на стандарт GMP не только обеспечит население России качественными лекарствами, но и позволит отечественным инновационным препаратам выйти на международный рынок и конкурировать с лучшей зарубежной продукцией.

Впервые требования GMP были сформулированы в США в 1963 году. В 1968 году свои правила GMP были созданы в Италии и Канаде, в 1969 году - в Сингапуре и Швеции, в 1971 году - в Австралии, Великобритании, Норвегии, Польше, в 1974 году - на Филиппинах. Следует отметить, что этому в значительной степени содействовала ВОЗ, которая уже в 1967 году сформулировала, а в 1969 году рекомендовала всем странам принять и применять международные правила организации производства и контроля качества ЛС. В дальнейшем эти правила были включены в дополнение ко II изданию Международной фармакопеи.

В настоящее время около 140 государств присоединились к системе удостоверения (сертификации) качества медикаментов в международной торговле, основанной на стандартах GMP.

Итак, мировая история GMP насчитывает уже более 40 лет, поэтому международная документальная база по одному из ее разделов - валидации методик хорошо развита. В первую очередь это нормативные документы: статья фармакопеи США «Validation of Compendial Methods» и документы Международной Конференции по Гармонизации (ICH). Они содержат, во-первых, четкое определение цели валидации методик, объект применения процедуры: «…методы испытаний, используемые для оценки соответствия фармацевтических продуктов определенным техническим требованиям (спецификациям)…».

Определяется круг методик, которые необходимо валидировать (новые, или измененные, представляемые на утверждение), и какая дополнительная информация должна представляться совместно с методикой при ее утверждении.

Документы ICH, кроме вышеперечисленного, содержат подходы к методологии процесса валидации методик. Для практики валидации аналитических методик все же недостаточно только описания параметров, методологии их определений, способов выражения (то, что дают фармакопейные документы). Необходима также информация о том, как организовать процесс, оптимизировать исследования и выбирать числовые критерии, на каком этапе разработки методики проводить валидацию.

3. Валидационные параметры

Во всех нормативных документах по валидации методологическая часть начинается с определения параметров валидации. При этом применяется специальная терминология, причем в различных документах зачастую одни и те же термины используются в разных значениях. Для того чтобы избежать этого мы будем опираться на рекомендации ICH и USP.

Для валидации методик используются следующие параметры:

? Правильность (accuracy). Правильность методики - это близость получаемых с использованием данной методики результатов к истинному значению. Правильность методики может быть определена посредством выполнения анализа образцов материала, приготовленных с количественной точностью. При возможности такие образцы должны содержать все компоненты материала, включая анализируемые. Также должны быть приготовлены образцы, содержащие анализируемое вещество в количестве примерно на 10 % выше и ниже ожидаемого содержания. Правильность может быть также определена путем сравнения результатов с таковыми, полученными при использовании альтернативной методики, которая была провалидирована ранее. Специальные приемы проверки и повышения правильности

Помимо общего подхода к проверке правильности результатов анализа, основанного на их сравнении с независимыми данными при помощи статистических тестов, существует ряд специальных приемов, которые позволяют выявить, а во многих случаях и существенно снизить систематическую погрешность. Рассмотрим некоторые из них.

1. Варьирование размера пробы.

Этот прием основан на том, что для анализа используют серию проб различного размера (например, несколько аликвот разного объема) и исследуют зависимость найденного содержания от размера пробы.

Предположим, что методика анализа содержит систематическую погрешность, которая постоянна и не зависит от размера пробы. Погрешность такого типа называют аддитивной. Ее влияние состоит в том, что она увеличивает или уменьшает измеряемое значение аналитического сигнала на одну и ту же постоянную величину, т.е. вызывает параллельное смещениеградуировочной зависимости.

2. Релятивизация.

Релятивизация - проведение отдельных аналитических операций в как можно более идентичных и строго контролируемых условиях с тем, чтобы возможные систематические погрешности взаимно скомпенсировать.

Например, если показания весов содержат систематическую погрешность, то следует на одних и тех же весах в течение как можно более короткого промежутка времени взвесить сначала стаканчик с навеской, затем пустой стаканчик и найти массу навески по разности.

По той же причине для отбора аликвот растворов следует пользоваться одной и той же мерной посудой.

3. Рандомизация.

В отличие от релятивизации здесь, наоборот, необходимо варьировать условия анализа случайным образом в достаточно широких пределах.

Например, если каждая пипетка содержит свою систематическую погрешность объема, то для выполнения серии параллельных анализов образца можно отобрать каждую аликвоту новой пипеткой.

При этом погрешность объема, применительно к каждой отдельной пипетке являющаяся систематической, по отношению ко всему множеству пипеток становится случайной, а среднее значение объема оказывается ближе к истинному, чем полученное при использовании только одной пипетки.

Таким образом, рандомизация - это способ превращения систематической погрешности в случайную. Рандомизацию обязательно используют, например, в ходе аттестации вновь разработанных стандартных образцов: порции СО рассылают по разным лабораториям и анализируют различными методами на протяжении достаточно длительного времени.

· Точность (precision). Точность методики - это степень согласованности между отдельными результатами испытаний. Она измеряется отклонением отдельных результатов от среднего значения и обычно выражается как стандартное отклонение или как коэффициент вариации (относительное стандартное отклонение), при условии использования полной методики для повторного анализа отдельных идентичных образцов, отобранных из одной и той же однородной серии материала.

· Сходимость (repeatability) (внутрилабораторная вариация). Это точность методики при ее выполнении одним и тем же аналитиком при одних и тех же условиях (те же реактивы, оборудование, задание каких-либо параметров и лаборатория) и в течение короткого промежутка времени. Сходимость методики оценивается проведением полных определений на отдельных идентичных образцах, отобранных из одной и той же однородной серии материала, и таким образом обеспечивает измерение точности методики в нормальных рабочих условиях.

· Воспроизводимость (reproducibility). Это точность методики, когда она проводится в различных условиях (обычно в разных лабораториях) на отдельных, предположительно идентичных образцах, отобранных из одной и той же однородной серии материала. Сравнение результатов, полученных разными аналитиками, при использовании разного оборудования или при проведении анализа в разное время, также может предоставить ценную информацию.

Решающую роль в улучшении воспроизводимости результатов анализа играет строгий контроль условий эксперимента.

Очевидно, что при выполнении серии анализов одного и того же образца в одной и той же лаборатории и на одном и том же приборе воспроизводимость будет выше, чем при работе с тем же образцом в разных лабораториях, на разных приборах. Поэтому любые численные характеристики воспроизводимости имеют смысл только тогда, когда указано, к каким условиям анализа они относятся.

Принято различать три основных типа таких условий, отличающихся по степени строгости их контроля.

1. Работа в максимально строго контролируемых условиях. Это означает выполнение серии анализов в одной и той же лаборатории, на одной и той же аппаратуре, одним и тем же человеком и, что немаловажно, в течение как можно более короткого промежутка времени (максимум в течение одного дня). Воспроизводимость, рассчитанная применительно к таким условиям, носит специальное название сходимость.

2. Выполнение серии анализов в одной лаборатории, на одном оборудовании, но, возможно, разными операторами и в разные дни. В этом случае воспроизводимость называетсявнутрилабораторной (по современной терминологии - промежуточной прецизионностью). Внутрилабораторная воспроизводимость ниже, чем сходимость (соответствующее значение s_r выше).

3. Выполнение серии анализов в разных лабораториях, на разном оборудовании, разными людьми и в разное время, т.е. варьирование условий выполнения методики в максимально широких пределах. Соответствующая воспроизводимость называется межлабораторной (по современной терминологии - просто воспроизводимостью). Для всех официально рекомендуемых методик обязательно проводится межлабораторное исследование - испытание методики в различных лабораториях и оценка ее межлабораторной воспроизводимости.

· Надежность (robustness или ruggedness). Надежность - это способность методики давать результаты анализа с приемлемой правильностью и точностью при изменении условий. Она является мерой степени влияния изменений условий работы или окружающей среды (которые, тем не менее, совместимы со спецификациями, описывающими методику) на получаемые результаты анализа отдельных, предположительно идентичных образцов из одной и той же однородной серии материала.

· Линейность и диапазон (linearity и range). Линейность аналитической методики - это ее способность давать результаты, которые прямо пропорциональны концентрации анализируемого вещества в образцах. Диапазон методики выражается как высшая и низшая концентрации, в пределах которых продемонстрировано, что анализируемое вещество определяется с приемлемой точностью, правильностью и линейностью. Эти характеристики определяются посредством применения данной методики для выполнения анализа серии образцов, имеющих концентрации анализируемого вещества, перекрывающие требуемый диапазон. Когда соотношение между результатом и концентрацией нелинейно, стандартизация может быть обеспечена с помощью калибровочной кривой.

· Избирательность (selectivity). Избирательность или специфичность методики - это ее способность измерять анализируемое вещество так, чтобы быть свободной от влияния других компонентов анализируемого образца (например, примесей, являющихся технологическими примесями или продуктами разложения, или других ингредиентов, отличных от анализируемого вещества, независимо оттого фармакологически активны они или инертны). Избирательность (или ее отсутствие) может быть выражена как отклонение результатов, полученных при применении методики для определения анализируемого вещества в присутствии ожидаемого количества других компонентов, по сравнению с результатами, полученными для этого же анализируемого вещества без добавления других веществ. Когда другие компоненты известны и доступны, избирательность может быть определена путем сравнения результатов испытания определяемого вещества в образце с добавлением и без добавления потенциально мешающих веществ. Когда такие компоненты неидентифицированыили недоступны, измерение избирательности часто может быть выполнено путем определения извлечения стандартной добавки чистого определяемого вещества в образце, содержащем постоянный уровень других компонентов.

· Чувствительность (sensitivity). Чувствительность - это способность методики испытания регистрировать небольшие изменения концентрации. Чувствительность есть наклон калибровочной кривой.

· Предел обнаружения (limit of detection). Предел обнаружения - это наименьшее содержание, при котором анализируемое вещество может быть обнаружено, но не обязательно определено количественно при использовании данной методики при требуемых экспериментальных условиях. Такой предел обычно выражается в значениях концентрации анализируемого вещества (например, в мкг/л) в образце. Если окончательное измерение основывается на показаниях приборов необходимо принять в расчет величину фонового сигнала.

· Предел количественного определения (limit of quantitation). Предел количественного определения - это наименьшая концентрация анализируемого вещества в образце, которая может быть определена с подходящей правильностью и точностью при применении требуемой методики. Он измеряется путем анализа образцов, содержащих уменьшающиеся количества анализируемого вещества и определением наименьшего уровня содержания, при котором может быть достигнута приемлемая степень правильности и точности. Во многих случаях предел количественного определения приблизительно в два раза выше предела обнаружения.

4. Аналитические характеристики, применяемые в отдельных случаях

Не все описанные характеристики необходимо применять в каждом конкретном случае. При валидации проводится оценка аналитической методики по характеристикам, выбираемым с учетом рекомендаций (табл.):

Таблица

Характеристики методики, определяемые при валидации

Наименование характеристики	Основные типы методик
	Испытание на подлинность	Посторонние примеси	Количественные определения
		Количественные методики	Предел содержания	Основного действующего вещества, нормируемых компонентов	Действующего вещества в тесте «Растворение»
Предел обнаружения	Нет	Нет	Да	Нет	Нет
Предел количественного определения	Нет	Да	Нет	Нет	Нет
Диапазон	Нет	Да	Нет	Да	Да
Линейность	Нет	Да	Нет	Да	Да
Правильность	Нет	Да	*	Да	Да
Прецизионность: ? сходимость ? промежуточнаяпрецизионность	Нет Нет	Да Да	Нет Нет	Да Да	Да Нет

^*) может определяться при необходимости

Ревалидацию (повторную валидацию) методик проводят при:

? изменении технологии получения объекта анализа;

? изменении состава лекарственного средства (объекта анализа);

? изменении ранее утвержденной методики анализа.

Материалы валидации отдельных аналитических методик, включаемых в проект нормативного документа, целесообразно представлять в виде объединенного отчета о валидации.Итоговый протокол валидации аналитической методики должен содержать:

- ее полное описание, достаточное для воспроизведения и отражающее все условия, необходимые для выполнения анализа;

- результаты статистической обработки данных, полученных экспериментально при разработке или проверке валидируемой методики;

- иллюстративные материалы, такие как копии хроматограмм, полученных методами ВЭЖХ или ГХ; копии электронных и ИК-спектров; фотографии или рисунки хроматограмм, полученных методами тонкослойной или бумажной хроматографии; рисунки кривых титрования;

- заключение о пригодности валидируемой методики для включения в нормативный документ (ФСП, ФС и т. п.).



ЯМР- и ПМР- спектроскопия

Содержание

1. Применение ЯМР

2. Теоретическое обоснование методов: ПМР и ЯМР

3. Приборное оснащение

4. Использование ЯМР-спектроскопии в фарманализе



1. Применение ЯМР

Одним из основных методов радиоспектроскопии является метод ЯМР. Исследуемый образец помещают в магнитное поле и облучают радиочастотным электромагнитным излучением.

* Изучение строения и свойств органических и неорганических соединений.

* Изучение динамических свойств молекул (таутомерия, изомерия).

* Исследование процессов (кинетика, термодинамика, титрование).

* Определение структуры биомакромолекул

o Изучение белок-лигандных взаимодействий (ЯМР-скрининг биологически активных соединений)

o Мониторинг состава биологических жидкостей (метабономика)

* Визуализация объектов живой и неживой природы (ЯМР-томография)

o Мониторинг процессов, происходящих в живом организме (in-vivo спектроскопия)

o Исследование функциональной активности мозга (f-MRI)

Явление ЯМР открыли в 1946 г. американские физики Ф. Блох и Е. Пёрсел. Однако еще ЗАВОЙСКИЙ Евгений Константинович в 1941 г. - впервые зарегистрировал сигнал ядерного магнитного резонанса, а в 1944 г. - открытие электронного парамагнитного резонанса.

2. Теоретическое обоснование методов: ПМР и ЯМР

Магнитные моменты имеют изотопы ядер элементов с нечетным атомным весом (¹H, ¹³C, ¹⁵N, ³¹P, ¹⁹F). Не имеют магнитных моментов ядра атомов с четным зарядом и четным атомным весом (¹²C, ¹⁶O).

Протомнный магнимтный резонамнс (ПМР) -- аналитический метод в органической химии, использующийся для определения структуры молекул. Является подвидом ядерного магнитогорезонанса на ядрах ¹Н.

Ядро атома водорода состоит из 1 протона, который вращается вокруг своей оси. При этом возникает магнитное поле, направленное по оси вращения, т.е. ядро ведет себя как маленький магнит. Т.О., кроме заряда и массы, протон обладает угловым моментом или спином (ядерный спин, равный ±1/2). В отсутствие внешнего магнитного поля спины протонов ориентированы беспорядочно, но в магнитном поле возможны лишь 2 ориентации спина: в направлении поля или против него.

г - гиромагнитное отношение (свойство ядра) - постоянная величина

На рис. представлены направления движения по правилу правой руки: на 1 рис. по час. стрелке (ядерный спин равен +1/2), на 2 рис. - против час. стрелки(ядерный спин равен -1/2).

3. Влияние магнитного поля на ядерные спины

Ядерные спины в отсутствии магнитного поля. Ядерные спины в магнитном поле.

P - угловой момент количества движения

м - магнитный момент ядра

B₀ - магнитное поле

ЛАРМОРА ПРЕЦЕССИЯ - движение оси вращения электронов в атоме или атомного ядра, возникающее под действием постоянного однородного магнитного поля, направление которого и служит осью вращения, при этом получается круговая коническая поверхность. Открыта (1895) Дж. Лармором.

Спиновое состояние, при котором магнитный момент ориентирован по полю, имеет меньшую энергию, чем состояние против поля. Энергетическая разница двух спиновых состояний соответствует энергии фотона радиочастотного излучения. Поэтому переход из одного состояния в другое требует дополнительной энергии: ДE=hн, где н - частота поглощаемого излучения.

ЛАРМОРОВА ЧАСТОТА - угловая частота прецессии магнитного момента, помещённого в магнитное поле.

щ = г · В₀ частота в рад/с ?E = г·h/2р ·B₀

н = г · В₀ /2р частота в Гц ДE=hн

Частота н₀ = щ₀ /2р, при которой выполняется условие резонанса щ₀ = г · В₀ называется резонансной частотой.

Когда атом находится в молекуле, электронные облака других атомов создают вблизи него дополнительное магнитное поле, которое смещает ларморовскую частоту. Это смещение получило название химического сдвига.

Метод ядерного магнитного резонанса основан на измерении химических смещений ядер с полуцелым спином. При помощи метода ядерного магнитного резонанса можно получить данные о химическом строении молекул, их пространственной структуре и молекулярной динамике.

Спектр ЯМР может быть получен двумя способами: или при непрерывном облучении образца слабым электромагнитным полем с изменяющейся частотой, в результате чего получается непосредственно спектр ЯМР (спектроскопия с непрерывным облучением), или при воздействии на образец короткого радиочастотного импульса с последующим Фурье-преобразованием отклика, представляющего собой сигнал свободной индукции, в спектр (импульсная спектроскопия).

При прочих равных условиях частота поглощения зависит от состояния электронной оболочки атома ¹Н.

Ядра химически идентичных атомов водорода поглощают излучение одной и той же частоты.

Ядра химически различающихся атомов водорода поглощают излучение разной частоты.

Пример: циклогексан и бромэтан.

В бромэтане из-за смещения электронной плотности к атому брома химические сдвиги двух типов протонов разные по величине и соотносятся следующим образом: д(СН₂) > д(CH₃).

Для того, чтобы можно было сравнивать результаты разных экспериментов, в ЯМР-спектроскопии используется следующая стандартизация:

а) спектр снимают в присутствии вещества-эталона.

В качестве эталона чаще всего используют Si(CH₃)₄ (тетраметилсилан, TMS), дающий интенсивный одиночный сигнал в стороне от большинства иных сигналов, кроме того, он химически инертен, и поглощение его сигнала мало зависит от растворителя.

б) положение остальных сигналов прибор рассчитывает относительно сигнала TMS по формуле:

д - химический сдвиг. Величина безразмерная, выражается в ppm или миллионных долях - м.д.

Величина химического сдвига каждого типа атомов водорода лежит во вполне определенном интервале. Например: величина д зависит от ближайшего окружения атомов.

Величина д тем больше, чем сильнее смещена электронная плотность с атома водорода.

Правая часть спектра называется сильнопольной областью, а левая - слабопольной.

В спектрах ЯМР низкого разрешения, о которых шла речь до сих пор, каждой группе идентичных атомов¹Н соответствует один сигнал. В спектрах ЯМР высокого разрешения обнаруживаются более тонкие эффекты. В спектре низкого разрешения наблюдается одиночный пик (синглет), в спектре высокого разрешения может находиться мультиплет - группа пиков, расположенных очень близко друг возле друга.

Мультиплет появляется от того, что на энергетическое состояние данного протона влияют магнитные моменты иных близко расположенных протонов - происходит расщепление энергетических уровней. Расщепление энергетических уровней ядра в магнитном поле называется эффектом Зеемана.

В системе излучающих атомов (газе), помещенной в магнитное поле, появятся атомы с различными энергиями исходного уровня. Эту ситуацию удобнее описать, рассмотрев расщепление энергетического уровня атома на подуровня.

Следствием этого является расщепление спектральных линий излучения газа атомов, помещенного в магнитное поле, которое впервые наблюдал П.Зееман в 1896 г. при исследовании свечения паров натрия в магнитном поле. Поэтому такой эффект расщепления спектральных линий в магнитном поле получил название эффекта Зеемана. На рис. приведен случай расщепления спектральной линии на триплет и называется простым или нормальным эффектом Зеемана.

Поскольку энергия таких взаимодействий очень мала, этот эффект можно обнаружить только в спектре высокого разрешения.

Химически одинаковые протоны не расщепляют энергетические уровни друг у друга.

Пример: Циклогексан. Все атомы Н в молекуле циклогексана химически идентичны. В спектре низкого разрешения наблюдается один пик. В спектре высокого разрешения тоже наблюдается только один пик - расщепление отсутствует.

Расщепление уровней и появление мультиплета вызывается протонами, химически отличающимися от данного и расположенными, главным образом, по соседству.

Следует отметить, что:

Число пиков в мультиплете = (число соседних химически иных протонов) + 1.

Пример. Бромэтан Два типа протонов: A и B

В спектре высокого разрешения имеется два мультиплета:

сигнал протонов группы А под действием протонов группы В расщепляется на квартет (3+1=4);

сигнал протонов группы В под действием протонов группы А расщепляется на триплет (2+1=3);

Рис. - спектры низкого разрешения (слева) и высокого разрешения (справа) для бромэтана:

Ядерный магнитный резонанс на атомах углерода ¹³С (¹³С-NMR, Carbon-13 NMR)

Ядра углерода С¹² имеют нулевой спин и поэтому неактивны в ЯМР-эксперименте.

Природный углерод содержит около 1 % изотопа ¹³С, который в соответствующих условиях можно обнаружить в веществе методом ЯМР-спектроскопии.

Исследование магнитного резонанса ядер ¹³С проводят в таких условиях, в которых не проявляется расщепление сигналов, поэтому в спектрах ¹³С-ЯМР каждой группе химически эквивалентных атомов углерода соответствует один пик.

Примеры.

а) бромэтан: два неэквивалентных атома углерода, два пика.

б) 1-бромпропан Br--CH₂--CH₂--CH₃: три неэквивалентных атома углерода, три пика.

в) 2-бромпропан CH₃--CH₂Br--CН₃: две группы неэквивалентных атомов углерода, два пика.



4. Приборное оснащение

ЯМР-спектрометр для спектроскопии с непрерывным облучением состоит из магнита, генератора изменяющейся частоты, датчика, генератора радиочастоты и приемника, а также электронного интегратора и самопишущего потенциометра. Импульсные спектрометры, кроме того, имеют генератор импульсов и компьютер для преобразования интерферограммы отклика в спектр.

Рабочая частота спектрометра не должна быть меньше 60 МГц.

При ЯМР-исследовании ампулу с растворенным исследуемым веществом помещают в сильное магнитное поле и облучают мощным узкочастотным импульсом, основная частота которого характерна для данного ЯМР-спектрометра (например, 100 МГц). Атомы Н резонируют при некоторых частотах. Прибор обнаруживает поглощение энергии при этих частотах и выводит результаты (в табличной форме, в виде спектра). Основные узлы прибора представлены на фото (магнит и датчик).

Если при анализе ЛС в частной фармакопейной статье не оговорен процесс проведения ЯМР, то необходимо соблюдать следующие условия:

1) Разрешение должно быть 0,5 Гц или менее.

2) Амплитуда боковых сигналов, появляющихся при вращении образца, не должна превышать 2% от основного сигнала.

3) При количественных измерениях с использованием интегралов сигналов ни одно из пяти измерений не должно превосходить 2,5% от среднего значения.

4) Разрешение и отношение сигнал/шум следует измерять, используя соответствующие команды в пакете стандартных программ.

В качестве растворителей используют легкоподвижные жидкости, в которых для уменьшения интенсивности сигналов растворителей атомы водорода заменены атомами дейтерия. При описании спектров необходимо указывать растворитель, в котором растворено вещество, и его концентрацию.

Химические сдвиги (м.д.) сигналов остаточных протонов растворителей имеют следующие значения: хлороформ - 7,26; бензол - 7,16; вода - 4,7; метанол - 3,35 и 4,8; диметилсульфоксид - 2,50; ацетон - 2,05; положение сигнала воды и протонов гидроксильных групп спиртов зависит от pH среды и температуры.

4. Использование ЯМР-спектроскопии в фарманализе

Многообразие структурной и аналитической информации, содержащейся в спектрах ЯМР, позволяет использовать метод ЯМР для установления подлинности, чистоты и количественных определений.

1. Установление подлинности вещества. В спектрах ЯМР практически исключается совпадение даже нескольких сигналов от разных веществ. При заявлении спектра на подлинность желательно ограничиваться по возможности меньшим количеством сигналов. При описании спектров необходимо приводить значения химических сдвигов и мультиплетность сигналов, заявленных на подлинность. Следует указывать рабочую частоту спектрометра, т.к. от нее зависит вид спектра. По этой же причине не использовать формулировку "...такой же вид, как и на приведенном (в НД) спектре". Для установления подлинности смеси веществ (экстрактов) эффективна двумерная ЯМР-спектроскопия.

2. Определение количества посторонних примесей. При получении спектров ЯМР, как правило, легко достигается значение отношения сигнал/шум более 100, что позволяет использовать этот метод для определения в субстанции примеси в количествах, измеряемых процентами и долями процента.

3. Определение количества остаточных растворителей. Все растворители, содержащие атомы водорода и углерода, дают характерные сигналы в спектрах ¹H и ¹³C ЯМР.

4. Количественное определение относительного или абсолютного содержания лекарственного вещества (примеси). Содержание вещества (X%) определяется методом внутреннего стандарта, в качестве которого выбирается вещество, сигналы которого находятся вблизи сигналов анализируемого вещества, не перекрываясь с ними. Интенсивности сигналов анализируемого вещества и стандарта не должны существенно различаться. При выборе вещества-стандарта следует отдавать предпочтение не гигроскопичному, не образующему кристаллосольватов веществу.

В качестве веществ-стандартов можно использовать следующие вещества: малеиновая кислота (2H; 6,60 м.д., M = 116,07), бензилбензоат (2H; 5,30 м.д., M = 212,25), малоновая кислота (2H; 3,30 м.д., M = 104,03), сукцинимид (4H; 2,77 м.д., M = 99,09), ацетанилид (3H; 2,12 м.д., M = 135,16), трет-бутанол (9H; 1,30 м.д., M = 74,12).

Например, ЯМР - спектр субстанции ИБУПРОФЕНА.



ИК - спектроскопия

Содержание

1. Теоретические основы метода

2. ИК-спектр

3. Аппаратура ИК-спектроскопии

4. Применение в фармации



1. Теоретические основы метода

Явление взаимодействия веществ с ИК-излучением было открыто У.Эбни и И.Фестингом в 1861 г. В настоящие время ИК-спектроскопия стала одним из основных методов исследования веществ различной химической природы, в том число и лекарственных соединений.

В России впервые ИК спектры адсорбированных молекул были получены в 1938 г. А.Н. Терениным и его аспирантом К.Я. Каспаровым.

Уже в 1948 г., за шесть лет до появления первой подобной публикации за рубежом, Н.Г.Ярославским были обобщены результаты первых исследований поверхности пористого стекла с помощью ИК-спектроскопии. В дальнейшем этот метод, весьма чувствительный к межмолекулярным взаимодействиям, оказался незаменимым средством изучения веществ и их превращений в адсорбированном состоянии.

Впервые метод стал фармакопейным с 1968 г (ГФ X), где он рекомендовался для контроля качества трех лекарственных веществ: фторотана, оксациллина и метициллина натриевых солей, а в разделе "Общие методы физико-химического, химического и биологического исследования" фармакопеи помещен материал, касающийся некоторых практических вопросов ИК-спектроскопии. Со времени выхода 10-го издания фармакопеи число препаратов, при исследовании которых рекомендуется метод, значительно выросло, что можно проследить на примере дополнений к фармакопее, издаваемых ежегодно, и отдельно выпускаемых фармакопейных статьях. Наряду с ультрафиолетовой ИК-спектроскопия включена во все современные фармакопеи.

ИК-спектроскопия - метод исследования веществ, основанный на поглощении ИК-излучения, в результате чего происходит усиление колебательных и вращательных движений молекул. Большее проявление имеют колебательные движения, поэтому ИК-спектры, называются колебательными (или молекулярными).

Атомы в молекулах никогда не находятся в состоянии покоя, а колеблются относительно каких-то средних положений, отчего расположение их относительно друг друга периодически изменяется. ИК-излучение усиливает эти колебания, при этом часть энергии излучения теряется. Фиксируется ослабление прошедшего ИК-излучения.

Энергия, необходимая для возбуждения колебаний атомов в молекуле, соответствует энергии квантов света с длиной волны 1-15 мкм или волновым числом 400-4000 см-¹, т.е. электромагнитному излучению средней инфракрасной области. Области, примыкающие к ней, называются ближней инфракрасной от 10000-4000 см^-1 и дальней инфракрасной от 625-50 см-¹. Слова ближний и дальний характеризуют близость к области видимого света.

В свою очередь средняя область подразделяется на область «отпечатков пальцев» (600-1500 см-¹) и область характеристических полос (1500-4000 см-¹). В области отпечатков пальцев лежат полосы поглощения скелета органической молекулы, содержащей связи С-С, С-О, С-N (для этой области не характерны колебания, принадлежащие отдельным связям). По ИК спектрам в области «отпечатков пальцев» можно идентифицировать изомерные алканы, определение которых другими путями вызывает большие затруднения.

Поглощая квант света, молекула может переходить на более высокий колебательный уровень, обычно из основного колебательного состояния в возбужденное.

Поглощение инфракрасного излучения вызывают колебания связанные с изменением либо длин связи, либо углов между связями. Это означает, что в зависимости от частоты поглощенного излучения начинает периодически растягиваться определенная связь или искажаться определенный угол между связями. Таким образом, основными типами колебаний являются так называемые валентные и деформационные колебания.

Колебания, заключающиеся в изменении длины связи между связанными атомами и не сопровождающиеся отклонением от межъядерной оси, называются валентными. Валентные колебания располагаются в области больших частот 4000-1400 см-¹, деформационные - в области низких. В зависимости от природы колебания подразделяются на скелетные (600-1500 см-¹) иколебания групп (>1500 см-¹).

Наряду с указанными основными в спектре наблюдаются обертоны, полосы резонансного взаимодействия, составные полосы, возникающие в результате взаимодействия полос поглощения отдельных атомов.

Колебательными спектрами обладают не все молекулы, а только те, у которых при колебании происходит изменение ее дипольного момента, т.е. вещества с полярной ковалентной связью.

Приближенной механической моделью валентных колебаний может служить система из двух шаров, связанных пружиной (шары изображают атомы, а пружина - химическую связь). При растяжении или сжатии пружины шары начнут колебаться вокруг положения равновесия, т.е. будет осуществляться гармоническое колебание.

Валентные колебания могут быть симметричными, если обе связи одновременно удлиняются или укорачиваются и пары атомов одновременно приближаются и отдаляются, аантисимметричными.

Следующим типом колебаний являются деформационные, которые связаны с изменением валентного угла, образованного связями у общего атома. Они тоже бывают симметричными и антисимметричными.

Для возбуждения деформационных колебаний требуется меньшая энергия, чем в случае валентных колебаний и, следовательно, они имеют меньшую частоту.

ИК-спектроскопия является:

? молекулярно - специфичной, что позволяет получать информацию о функциональных группах в молекуле - их типе, взаимодействиях и ориентациях;

? селективной по отношению к изомерам, благодаря области «отпечатков пальцев»;

? методом количественного и недеструктивного анализа, даже по отношению к неустойчивым соединениям;

? методом, работающим в области концентраций от 0,1% до 100%, но также пригодным и для определения микроколичеств после соответствующего концентрирования;

2. ИК-спектр

Инфракрасный спектр получают путем регистрации интенсивности прошедшего излучения в зависимости от волновых чисел.

Спектральные данные записываются как зависимость коэффициента поглощения от длины волны или частоты в обратных сантиметрах (см^-1) или в микрометрах (мкм).

Фактор интенсивности для ИК-области спектра может быть выражен как пропускание в %:

где I₀ - интенсивность падающего монохроматического излучения;

I - интенсивность прошедшего монохроматического излучения, или поглощение в %.

На рис. приведен общий вид ИК-спектра.

Основные факторы, влияющие на частоту и интенсивность характеристических полос поглощения

Экспериментальные данные показывают, что некоторые группы атомов (например, СН₃, С=О, Р=О, С=С) поглощают почти при постоянных длинах волн независимо от молекулы, в которой они находятся. Эти частоты, называемые характеристическими, позволяют быстро и однозначно подтвердить наличие или отсутствие данного фрагмента. Однако положение характеристической частоты не является строго постоянным, а изменяется внутри некоторого интервала, который определяется как внешними, так и внутренними факторами:

1. Внутренние факторы, влияющие на характеристические частоты

А) Геометрия молекулы оказывает заметное влияние на частоту и интенсивность колебательного спектра поглощения. Колебание активно в ИК-области, если оно приводит к изменению дипольного момента, а интенсивность полосы поглощения зависит от изменения дипольного момента. Таким образом, отсутствие характеристического поглощения в определенном месте спектра не должно обязательно указывать на отсутствие данной группы. Характеристические частоты могут смещаться также под действием механических факторов.

2. Влияние внешних воздействий

А) Агрегатное состояние. В газовой фазе молекулы оказывают незначительное взаимное влияние на колебание и вращение друг друга. В растворах каждая молекула ограничена «клеткой» из других молекул, с которыми они непрерывно сталкиваются и не могут совершать квантованного вращательного движения. В результате тонкая вращательная структура спектров, которая наблюдалась в газообразном состоянии, исчезает. Величина смещения полос поглощения при переходе от газа к жидкости обычно меньше 25 см'¹, иногда достигает 100 см"¹.

Б) Растворитель. Положение и интенсивность полос поглощения, обусловленных характеристическими частотами, изменяются при переходе от одного растворителя к другому.

В) Концентрация вещества. Большое влияние на ИК-спектр оказывает концентрация вещества, поэтому для таких образцов рекомендуют принимать стандартные условия (растворитель, концентрацию и толщину поглощающего слоя).

Г) Температура.

3. Снятие ИК-спектров

Объекты исследования ИК-спектроскопии могут быть жидкими, твердыми, газообразными, могут быть как органическими, так и неорганическими.

1. Спектры газов или низкокипящих жидкостей получают введением образца в вакуумированные кюветы.

2. Жидкости можно исследовать чистыми или в растворах. Чистые помещают между двумя солевыми пластинками, получают пленку толщиной 0,01 мм и меньше. Пластинки удерживаются вместе капиллярными силами. Необходимо от 1 до 10 мг пробы. Летучие жидкости исследуют в герметических кюветах с очень тонкими стенками. Растворы помещают в кюветы толщиной 0,1 -1 мм.

3. Твердые вещества применяют в виде паст, прессованных дисков (таблеток) или в виде осажденных стекловидных пленок.

4. Аппаратура ИК - спектроскопии

Для снятия ИК-спектров, как правило, используют двухлучевые спектрометры с оптическим нулем следующего типа: «Specord 75 IR», «Specord М-80», «Unicam SP-200», «Beckman IR-11», «Perkin-Elmer», «Bruker», «Shimadzu FTIR-8900», «MTIFS 01» и др.

В качестве источника инфракрасного излучения используют нагретые тела, дающие сплошное излучение в ИК-области: например, штифты Нернста и Глобара, нагреваемые электрическим током до 1000 - 1800 °С.

Принципиальная схема прибора для исследования оптических спектров:

· источник излучения;

· кювета с образцом;

· монохроматор;

· входная и выходная щели монохроматора;

· фокусирующая оптика;

· призма или дифракционная решетка;

· приемник излучения;

· регистрирующее устройство

Приемник - устройство, которое измеряет энергию излучения по его тепловому эффекту. Приемники подразделяются на: термические, фотонные и пироэлектрические.

Термические детекторы, действие которых основано на измерении тепловых эффектов, применимы в широком интервале длин волн, не требуют охлаждения, но они инерционны и относительно малочувствительны.

Фотонные детекторы - полупроводниковые устройства, в которых электрон может поглотить квант инфракрасного излучения и перейти в зону проводимости, внося свой вклад в электропроводность. Фотонные детекторы обладают быстрой реакцией и более чувствительны.

Пироэлектрические детекторы реагируют не на саму температуру, а на изменение ее во времени и не нуждаются в дублирующей системе, защищающей от излучения.

Применение в фармации

ИК-спектроскопия используется:

? при установлении структуры новых БАВ получаемых путем химического синтеза или выделяемых из природных объектов (животное или растительное сырье, продукты жизнедеятельности микроорганизмов); изучении строения метаболитов;

? при испытании на подлинность лекарственных веществ;

? определении доброкачественности лекарственных соединений;

? количественном анализе;

? контроле технологического процесса в промышленном производстве фармпрепаратов (полнота протекания);

? для доказательства отличия лекарственных веществ близкого химического строения (одного ряда).

ИК-спектроскопия является обязательным методом контроля веществ - стандартных образцов, кроме того, она в настоящее время включается в ФС на многие лекарственные вещества.

ИК-спектроскопия широко используется для анализа: гормонов, антибиотиков (пенициллины), азотсодержащих гетероциклических лекарственных средств и т.д.

Современная НД рекомендует проводить испытания 2-мя способами:

? по характеристическим полосам поглощения,

? по сравнению с ИК-спектром стандарта.

Например, ИК-спектр субстанции ЦИСТЕИН (CYSTEINE)



Использование методов потенциометрического и кондуктометрического анализа для контроля качества лекарственных средств

Содержание

1. Потенциометрический анализ

2. Кондуктометрический анализ



Электрохимические методы анализа были созданы в конце XIX - начале XX века на основе достижений физики и физической химии.

Электрохимические методы довольно селективны, поэтому с их помощью количественно определяют одни элементы в присутствии других, раздельно определяют разные формы одного элемента, делят сложные смеси и идентифицируют их компоненты, а также концентрируют некоторые микропримеси. Электрохимические методы широко применяют для контроля состава воды, пищевых продуктов, технологических растворов и биологических жидкостей. Соответствующие методики не требуют сложного оборудования, в них не используются высокие температуры и давления.

1. Потенциометрический анализ

Принцип метода. Аналитическим сигналом в потенциометрии является электродный потенциал. Зависимость потенциала электрода от состава раствора была установлена на основании термодинамических функций немецким химиком Вальтером Нернстом (в будущем - лауреатом Нобелевской премии) в 1889 г. Позднее теоретические выкладки Нернста были подтверждены опытным путем.

...