Применение потенциометрии в фарманализе

Потенциометрия является универсальным методом, его можно применять для потенциометрического определения концентрации вещества в растворе, исследования рН растворов, индикации конца титрования во всех типах титрования: кислотно-основном, окислительно-восстановительном, осадительном, комплексометрическом, при титровании в неводных средах.

Методом прямой потенциометрии можно проводить испытание на чистоту, определение рН и количественного содержания лекарственных средств: раствора натрия хлорида 0,9 % для инъекций, раствора магния сульфата 20 % или 25 % для инъекций, раствора кофеина-бензоата натрия 10 % или 20 % для инъекций.

Метод потенциометрического титрования применяется для анализа лекарственных веществ, например, кислоты аскорбиновой, сульфамидных препаратов, барбитуратов, алкалоидов и др. Метод обладает высокой точностью, хорошей чувствительностью и позволяет проводить титрование в мутных, окрашенных, неводных средах, раздельно определять компоненты смеси в одном анализируемом растворе, например, хлорид- и иодид - ионы при аргентометрическом титровании.

Прямая потенциометрия

Важную информацию о степени чистоты лекарственного препарата дает значение рН его раствора. По этому значению можно судить о наличии примесей кислых или щелочных продуктов. Принцип обнаружения примесей свободных кислот (неорганических и органических), свободных щелочей, т.е. кислотности и щелочности, заключается в нейтрализации этих веществ в растворе препарата или в водном экстракте. Реакция среды (рН) является характеристикой химических свойств вещества. Это важный параметр, который следует устанавливать при выполнении технологических и аналитических операций. Степень кислотности или основности растворов необходимо учитывать при выполнении испытаний чистоты лекарственных препаратов и количественного определения. От значений рН растворов зависят сроки хранения лекарственных веществ, а также особенности их применения.

Из многочисленных способов установления значения рН среды ГФ XII рекомендует потенциометрический способ. Потенциометрическое определение рН основано на измерении электродвижущей силы элемента, составленного из электрода сравнения (с известным значением потенциала, например, хлорсеребряного) и индикаторного электрода, потенциал которого зависит от рН испытуемого раствора (стандартного водородного или стеклянного). Для установления рН среды используют потенциометры или рН-метры различных марок. Их настройку осуществляют с помощью буферных растворов.

Потенциометрическое титрование

Титрование алкалоидов. При титровании оснований (алкалоидов, аминов) подбор электрода сравнения несколько затруднителен, поэтому проводят обратное титрование, т. е. оттитровывают избыток соляной кислоты 0,1 М раствором едкого натра.

Титрование катионов серебра. Потенциометрическое определение количества серебра в протарголе проводится без предварительного озоления и в колларголе.

Неводное потенциометрическое титрование. Немало работ посвящено потенциометрическим методам титрования препаратов, имеющих значение в фармацевтической практике, в неводных растворителях и др.

Титрование БАВ. Почти во всех случаях титрования растительных вытяжек раствором едкого натра пользуются 0,1 М раствором, либо проводят обратное титрование.

2. Кондуктометрический анализ

Метод не является фармакопейным в РФ, но его применяют за рубежом для оценки качества воды. Так, в Европейской Фармакопее существуют ФС:

1. (01/2008:0169. - Вода для инъекций // Европейская Фармакопея. - 6 изд. - Страсбург: Европейский департамент по качеству лекарств, 2007. - С. 3209-3212)

2. (01/2008:1927. - Вода высокоочищенная // Европейская Фармакопея. - 6 изд. - Страсбург: Европейский департамент по качеству лекарств, 2007. - С. 3212-3213) в части раздела "Термины и определения понятий" и приложений 2;

3. (01/2008:0008. - Вода очищенная // Европейская Фармакопея. - 6 изд. - Страсбург: Европейский департамент по качеству лекарств, 2007. - С. 3213-3215)

Вода для инъекций (water for injections)

Определение

Вода, используемая как растворитель при приготовлении лекарств для парентерального применения (вода для инъекций ангро) или для растворения либо разведения субстанций или препаратов для парентерального применения перед использованием (вода для инъекций стерилизованная).

Удельная электропроводность. Определяют удельную электропроводность автономно (off-line) или неавтономно (in-line) как описано ниже.

Прибор

Кондуктометр: разделяющая способность 0,1 мкСм/см для наименьшего значения рабочего диапазона.

Методика

Этап 1

1. Измеряют удельную электропроводность без температурной компенсации, одновременно регистрируя температуру. Измерение с температурной компенсацией может проводиться после соответствующей валидации.

2. Используя данные, приведенные в таблице, находят ближайшее значение температуры, которая не превышает значения измеренной температуры. Соответствующее значение удельной электропроводности является предельным для данной температуры.

3. Если измеренная удельная электропроводность не превышает значения, приведенного в таблице, испытуемая вода соответствует требованиям испытания на удельную электропроводность. Если значение удельной электропроводности превышает приведенное в таблице, продолжают испытание (этап 2).



Таблица

Предельные значения удельной электропроводности для определенных значений температуры

Температура (°С)	Удельная электропроводность (мкСм/см)
0	0,6
5	0,8
10	0,9
15	1,0
20	1,1
25	1,3
30	1,4
35	1,5
40	1,7
45	1,8
50	1,9
55	2,1
60	2,2
65	2,4
70	2,5
75	2,7
80	2,7
85	2,7
90	2,7
95	2,9
100	3,1

Этап 2

4. Достаточное количество испытуемой воды (100 мл или более) переносят в подходящий контейнер и перемешивают. Доводят температуру, если необходимо, до (251)°С и, поддерживая эту температуру, начинают тщательно встряхивать испытуемый образец, периодически регистрируя удельную электропроводность. Если изменения в значении удельной электропроводности, обусловленные поглощением углерода диоксида воздуха, не будут превышать 0.1 мкСм/см в течение 5 мин, записывают значение удельной электропроводности.

5. Вода выдерживает испытание на удельную электропроводность, если значение удельной электропроводности не превышает 2,1 мкСм/см. Если значение удельной электропроводности более 2,1 мкСм/см, продолжают испытание (этап 3).

Этап 3

6. Испытание проводят в течение около 5 мин после определения удельной электропроводности (пункт 5, этап 2), поддерживая температуру испытуемого образца (251) °С. В испытуемый образец прибавляют свежеприготовленный насыщенный раствор калия хлорида (0.3 мл в 100 мл испытуемого образца) и измеряют рН с точностью 0.1 ед.рН (по Общей статье Европейской фармакопеи: 2.2.3. Potentiometric Determination of pH (Потенциометрическое определение рН).

7. Используя таблицу, из значения рН, измеренного по пункту 6, определяют предельное значение удельной электропроводности. Если значение удельной электропроводности, определенное по пункту 4 этапа 2, не превышает требований к удельной электропроводности для определенного рН, субстанция выдерживает испытание на удельную электропроводность. Если значение удельной электропроводности, определенное по пункту 4 этапа 2, превышает это значение или значение рН выходит за пределы 5.0-7.0, вода не выдерживает испытания на удельную электропроводность.

Таблица

Значения удельной электропроводности для определенных значений рН

рН	Удельная электропроводность (мкСм/см)
5,0	4,7
5,1	4,1
5,2	3,6
5,3	3,3
5,4	3,0
5,5	2,8
5,6	2,6
5,7	2,5
5,8	2,4
5,9	2,4
6,0	2,4
6,1	2,4
6,2	2,5
6,3	2,4
6,4	2,3
6,5	2,2
6,6	2,1
6,7	2,6
6,8	3,1
6,9	3,8
7,0	4,6

Для обеспечения надлежащего качества воды следует использовать валидированные процедуры, а также мониторинг удельной электропроводности в процессе производства.

Кондуктометрическое титрование

Более широко применяется косвенная кондуктометрия - кондуктометрическое титрование (KT). КТ основано на заметном изменении характера зависимости электропроводности раствора от количества добавляемого титранта вблизи точки эквивалентности вследствие изменения ионного состава раствора. КТ применяют для установления конца кислотно-основного, окислительно-восстановительного, осадительного титрования мутных или окрашенных растворов, когда обычные химические цветопеременные индикаторы использовать нельзя. К достоинству метода относится возможность титрования очень разбавленных растворов (меньше 10-4 моль/л) с погрешностью, не превышающей 2%.

Кондуктометрическое титрование, в отличие от обычного, не требует применения индикаторов и может быть проведено в окрашенных, а также в очень разбавленных растворах. В процессе титрования за ходом реакции следят, измеряя электропроводность титруемого раствора после каждого нового прибавления титрующего реагента. Конец титрования совпадает с перегибом на кривой электропроводность - объем добавленного титранта. Изменение электропроводности при кондуктометрическом титровании связано с заменой в растворе по мере протекания реакции одних ионов на другие с иной проводимостью.

В научных исследованиях метод кондуктометрического титрования широко применяют для определения концентрации БАВ.



Газовая и жидкостная хроматография в фармацевтическом анализе

фармация химический лекарственный хроматография

Содержание

1. Газохроматографический анализ

2. Жидкостная хроматография

3. Эксклюзионная хроматография



1. Газохроматографический анализ (ГХ)

В последние годы в фармацевтическом анализе стали применяться газовая и газожидкостная хроматография (ГЖХ). Метод газовой хроматографии особенно эффективен при анализе летучих веществ, содержащихся в малых количествах, например в сложных природных смесях веществ.

Впервые официнальным хроматографический метод стал с 1961 г. со времени введения в ГФ IX двух его вариантов: ионообменной хроматографии и хроматографии на бумаге.

В 1968 г. в ГФ X дополнительно была введена хроматография в тонком слое, а с 1987 г. (ГФ XI) стали фармакопейными газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография, которые также включены в ГФ XII (2007г.).

Хроматография в различных ее вариантах преимущественно предназначена для разделения многокомпонентных смесей. Она незаменима при исследовании метаболизма, изучении и разделении комплекса действующих веществ ЛС и лекарственных растений, химико-токсикологических экспертизах.

ГХ и ГЖХ применяются для определения подлинности, чистоты и количественного содержания веществ.

Объектами анализа являются лекарственные препараты и лекарственные растения, объекты химико-токсикологических экспертиз, ингаляционные анальгетики в операционных, продукты метаболизма в биологических жидкостях, остаточные летучие растворители в препаратах.

Метод ГЖХ используется в фармацевтическом анализе для разделения, идентификации и количественного определения лекарственных веществ и их ей.

Этот метод особенно удобен в постадийном контроле качества промежуточных продуктов синтеза. Он применяется также при изучении устойчивости различных лекарственных форм в процессе их хранения. Особенно широко стала применяться газожидкостная хроматография в токсикологических исследованиях и биофармацевтическом анализе, так как этот метод позволяет определять с необходимой точностью концентрацию лекарственных веществ и продуктов их распада (метаболитов) в биологическом материале.

Метод ГЖХ может быть использован для испытаний подлинности лекарственных веществ. С этой целью применяют либо способ, основанный на использовании веществ-свидетелей, либо метод относительных удерживаний.

В первом случае после анализа исследуемого образца в идентичных условиях хроматографируют вещества-свидетели, которые могут содержаться в испытуемом объекте. Если времена удерживания свидетеля и какого-либо компонента в испытуемом образце совпадают, то это может служить доказательством идентичности данных веществ.

При испытании подлинности методом относительных удерживаний к пробе прибавляют определенное количество вещества-свидетеля. Затем анализируют по рекомендуемой методике и рассчитывают по формуле величину относительного удерживания, которая является постоянной для вещества в конкретных условиях выполнения анализа.

На различных сорбентах величины относительного удерживания установлены для лекарственных веществ из различных химических групп, в том числе альдегидов, кетонов, фенолов, терпеноидов, амидов и сложных эфиров карбоновых кислот, амино- производных, производных пиразола, имидазола, барбитуровой кислоты, некоторых алкалоидов, а также для ряда сильнодействующих лекарственных веществ из числа производных фенилалкиламинов, бензодиазепина, фенотиазина ( ГФ XII).

Количественный ГЖХ анализ лекарственных веществ выполняют в тех же условиях, что и качественный. Для расчетов количественного содержания используют такие параметры, как площадь или высота пиков веществ.

Для количественного ГЖХ анализа используют такие методы, как метод абсолютной градуировки, метод внутренней нормализации и метод внутреннего стандарта.

Газовую хроматографию сочетают с другими методами. Для анализа настоек, представляющих собой тройные системы, применяют рефрактохроматографический метод. Сущность его заключается в том, что соотношение концентрации спирта и воды устанавливают методом ГЖХ, а экстрактивные вещества - по показателю преломления.

Эффективным оказалось сочетание ГЖХ и масс-спектрометрии. Хромато-масс-спектрометрические характеристики позволили осуществить качественный и количественный анализ ряда препаратов.

Широкое распространение приобретает один из вариантов ГЖХ - капиллярная хроматография, основанная на использовании колонок небольшого диаметра 0,1-1,0 мм и длиной 50-100 м.

Примеры применения ГХ

Например, ацетон и метанол определяют в пирацетаме, этанол - в калгеле, изопропанол - в флуконазоле, примеси в камфоре, бромкамфоре, в препаратах витамина Е и т.д.

1. Определение подлинности:

? Валидол (ВФС 42-2356-94) - ГЖХ

Подлинность ментола и ментилового эфира кислоты изовалериановой.

? Облепиховое масло (ФС 42-1730-95) - ГЖХ

Подлинность метиловых эфиров жирных кислот облепихового масла.

? Корвалол (ФС 42-3277-94) - ГХ

Определение подлинности ментола.

2. Испытание на чистоту:

? Ампициллина натриевая соль (ФСП 42-1959-00) - ГЖХ

Содержание остаточных растворителей (хлористого метилена и триэтиламина).

? Спирт этиловый 95% (ФС 42-3072-00) - ГЖХ

Определение ментола и других летучих примесей.

3. Количественное определение:

? Парацетамола 2,4% сироп (ВФС 42-2277-94) - ГЖХ

Количественное определение спирта этилового.

? «Каметон» аэрозоль (ФС 42-1684-94) - ГХ

Количественное определение камфоры, ментола и хлорбутанолгидрата.

2. Жидкостная хроматография (ЖХ)

В последние годы в практику контрольно-аналитических лабораторий институтов, производственных фармацевтических объединений вводится метод ЖХ. Правильный подбор двух несмешивающихся жидких фаз - подвижной и неподвижной - может обеспечить высокое разделение при обычной температуре как летучих, так и нелетучих веществ.

Метод ЖХ уже применяется для разделения жирных кислот, аминокислот, хелатов, спиртов, аминов, углеводородов, стероидов, гормонов, алкалоидов, антибиотиков и др.

Вариантом колоночной ЖХ является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), которую называют также жидкостной хроматографией высокого давления. Характерной особенностью ВЭЖХ является то, что подвижная фаза проходит через колонку, наполненную сорбентом с большой скоростью за счет значительного давления.

Метод ВЭЖХ позволяет разделять на индивидуальные вещества многокомпонентные и нелетучих органических соединений сложной химической структуры с различной молекулярной массой. Метод очень широко используется для идентификации и количественного определения в аналитической химии и в фармацевтическом анализе. Чувствительность ВЭЖХ достигает 10^-6 г. На разделение смеси из 10-15 компонентов затрачивается 20-30 мин, причем выделяются вещества высокой степени чистоты.

Ионообменную ВЭЖХ применяют для разделения органических катионов и анионов, используя в качестве адсорбентов соединения, содержащие сульфогруппы, карбоксильные или аминогруппы разной основности. Элюентами служат водные буферные растворы с различным рН.

Вещества, способные образовывать комплексы с катионами металлов (например, оптические изомеры аминокислот), разделяют с помощью лигандообменной ВЭЖХ. Адсорбентами при этом служат соединения, способные образовывать комплексы с ионами металлов и разделяемым веществом.

Одной из разновидностей метода является микроколоночная жидкостная хроматография, представляющая собой универсальный ультрачувствительный и высокоэкономичный вариант ВЭЖХ. Принципиальное его отличие заключается в использовании микроколонок объемом около 200 мкл и спектрофотометра с объемом проточной кюветы 1 мкл в качестве детектора.

Метод ЖХ успешно применен для качественной и количественной оценки ряда наркотических, ядовитых и сильнодействующих лекарственных веществ. С этой целью перспективно использование таких параметров, как время удерживания, коэффициент емкости, интегральные спектральные отношения. В нашей стране метод ВЭЖХ рекомендован во всех ФС, разработанных на стандартные образцы антибиотиков. В Фармакопее США (XII издание) метод ВЭЖХ применен для анализа большинства антибиотиков противоопухолевого действия ицефалоспоринового ряда.

Примеры применения ВЭЖХ

Например, методом ВЭЖХ определяют подлинность и количественное содержаниие: парацетамола, кофеина, фенилэфрина гидрохлорида.

1. "Бронхолитин" сироп (производитель "Фармахим", Болгария) НД 42-371 -92

Подлинность: глауцина гидробромида и эфедрина гидрохлорида

2. "Колдрекс" таблетки (производитель "Стерлинг Винтроп", Великобритания) НД 42-I075-91

Подлинность и количественное содержание: парацетамола, кофеина, фенилэфрина гидрохлорида.

3. Эксклюзионная хроматография

Эксклюзионная хроматография (гель-фильтрация, молекулярно-ситовая фильтрация, гельпроникающая хроматография) - вид жидкостной распределительной хроматографии, в процессе которой разделение происходит по размерам молекул.

В гель-фильтрации элюентом служит вода, а в гельпроникающей хроматографии -- органический растворитель. Неподвижной фазой являются пористые материалы с определенным узким распределением пор по диаметру. Исследуемое вещество, диаметр которого превышает диаметр пор, не может диффундировать внутрь таких сорбентов. Поэтому оно проходит через колонку быстрее, чем молекулы с меньшим размером, которые проникают в поры. Таким образом обеспечивается разделение молекул в зависимости от их размера. Поры внутри геля заполнены жидкостью, которая занимает большую часть его объема.

Применяют гели на основе декстрана, агарозы, полиакриламида. Метод может быть использован для определения молекулярной массы, а также для исследования, очистки и разделения веществ с молекулярной массой 10²-10⁸.Осуществляют эксклюзионную хроматографию в жидкостных хроматографах.

Колонки заполняют различными сорбентами: мягкими (сефадексы), полужесткими (полиакриламидные гели), жесткими (пористые стекла). Детектором служит проточный рефрактометр или спектрофотометр. В отличие от других видов хроматографии на выполнение испытания требуются небольшие затраты времени.

Прибор для проведения эксклюзионной хроматографии.

Количественное содержание каждого компонента смеси можно установить, используя метод внутреннего стандарта или абсолютной калибровки. Время выхода каждого компонента из колонки в идентичных условиях разделения является постоянной величиной и может служить для идентификации вещества. Площадь пика пропорциональна количеству компонента и поэтому используется для определения его содержания в смеси.

Полибуферное распределение в фармацевтическом анализе применяют для разделения смесей веществ. Оно может быть использовано в анализе лекарственных форм, представляющих смеси оснований или кислот, для разделения смесей аминов, алкалоидов, органических кислот, фенолов, антибиотиков, а также для отделения веществ, диссоциирующих на ионы, отнедиссоциирующих.



Использование методов тонкослойной (ТСХ), бумажной (БХ) и ионообменной хроматографии в фармацевтическом анализе

Содержание

1. ТСХ и БХ

2. Электрофорез

3. Ионообменная хроматография



1. ТСХ и БХ

Наиболее широко в фармацевтическом анализе используют хроматографию на бумаге и хроматографию в тонком слое сорбента.

Хроматография в тонком слое сорбента (ГФ XI, вып. 1, с. 102) отличается от хроматографии на бумаге тем, что процесс, протекающий при перемещении подвижной фазы, происходит на носителе (сорбенте), нанесенном тонким слоем на инертную поверхность.

ТСХ нашла применение в фармакопейном, внутриаптечном контроле качества лекарств, токсикологическом анализе, при исследовании действующих веществ лекарственного сырья растительного и животного происхождения, в научных исследованиях, связанных с поиском, созданием и стандартизацией новых лекарственных средств.

Она используется при установлении подлинности лекарственных веществ, определения примесей в фармакопейных субстанциях и лекарственных формах, для определения ориентировочного количественного содержания, разделения сложных лекарственных смесей на отдельные компоненты и их идентификации.

В комбинации с другими методами ТСХ используется для установления количества и строения метаболитов лекарственных веществ в химико-токсикологическом анализе.

Одним из вариантов ТСХ является хроматография на полиамидных пленках. Преимущества этого варианта заключаются в высокой чувствительности, быстроте выполнения, универсальности, возможности использования различных систем растворителей в малых объемах.

Разработаны различные варианты, позволяющие совершенствовать методы хроматографирования на бумаге и в тонком слое сорбента. В ГФ XI описаны такие специальные приемы, какповторное и двумерное хроматографирование. Они позволяют достигнуть лучшего разделения анализируемых смесей веществ.

Суть повторного хроматографирования заключается в том, что полученную хроматограмму высушивают и повторно пропускают подвижную фазу в том же направлении.

Двумерное хроматографирование отличается тем, что повторное пропускание той же подвижной фазы осуществляется в перпендикулярном по отношению к первоначальному направлению.

В последние годы разработаны линейная, циркулярная и антициркулярная высокоэффективная тонкослойная хроматографии (ВЭТСХ).

Создание последней вызвано получением сорбентов с более узким распределением частиц и пор, а также пленок, почти идеально однородных по толщине. Другие параметры, как, например, среднее значение размеров частиц и ширина их распределения, позволяют сократить время анализа, так как возрастает скорость протекания растворителя между частицами и внутри пор. В качестве сорбентов используют силикагель с величиной пор 6 нм, целлюлозу и др.

Предложен метод ультрамикрохроматографии. Процесс протекает в микротонком слое специально приготовленного сорбента, что резко повышает скорость и чувствительность анализа.

Для идентификации ряда лекарственных веществ сочетают ТСХ с ИК-спектроскопией, УФ-спектрофотометрией, интерферометрией. Известны два варианта сочетания ТСХ с другими методами для количественного анализа:

1. определение вещества на самой хроматограмме,

2. в элюате (после снятия с хроматограммы).

Оба эти варианта очень часто применяют для анализа лекарственных форм.

Для качественного и количественного анализа фитохимических препаратов и лекарственного сырья используют такие комбинированные методы, как хроматофотометрия,хроматофлуориметрия, хромато-ИК-спектроскопия, хроматополярография, хроматопланиметрические методы, а также денситофлуориметрия и денситоспектрофотометрия.

Метод ТСХ используется преимущественно для идентификации ингредиентов многокомпонентных смесей.

Например, анализ лекарственной формы следующего состава:

Фенобарбитала 0,03

Кофеин-бензоата натрия 0,1

Фенацетина 0,3

Данную ЛФ хроматографируют в системе растворителей: эфир-этанол-25% раствор аммиака (10:5:1,5). Затем пластинку высушивают 30 минут, после чего детектируют облучением УФ-светом (254 нм) и парами иода. Рассчитывают значения R_f и определяют компоненты ЛФ.

В бумажной хроматографии (БХ) стационарной фазой служит поверхность специальной хроматографической бумаги, а механизм процесса будет относиться к распределительному.

В фармацевтическом анализе при выполнении испытаний методом бумажной хроматографии (БХ) руководствуются указаниями ГФ XI, вып. 1 (с. 98) и частных фармакопейных статей на соответствующие лекарственные вещества (лекарственные формы).

Метод используется в фармакопейном анализе для контроля качества лекарственных средств, для анализа смесей катионов в качественном анализе, смесей аминокислот и других органических соединений, при исследовании действующих веществ лекарственного сырья растительного и животного происхождения, в научных исследованиях.

Например, идентификация компонентов в гомеопатических ЛС: кверцетина, лютеолина, рутина, аминокислот: аспарагина, глицина, глутаминовой кислоты, аланина, фенилаланина и др.

При испытаниях подлинности хроматографируют на одном листе хроматографической бумаги одновременно испытуемое вещество и соответствующий стандартный образец. Если оба вещества идентичны, то соответствующие им пятна имеют на хроматограммах одинаковый вид и равные значения R_f.

Если хроматографировать смесь испытуемого вещества и стандартного образца, то при их идентичности на хроматограмме должно появляться только одно пятно. Чтобы исключить влияние условий хроматографирования на получаемые значения R_f, можно пользоваться более объективной величиной R_S, которая представляет собой отношение величин R_f испытуемого и стандартного образцов.

При испытании на чистоту о наличии примесей судят по количеству, величине и интенсивности окраски пятен на хроматограмме. Примесь и основное вещество должны иметь разные значения R_f. Для полуколичественного определения содержания примеси на одном листе бумаги одновременно в одинаковых условиях получают хроматограмму испытуемого вещества, взятого в определенном количестве, и несколько хроматограмм стандартного образца, взятых в точно отмеренных количествах. Затем сравнивают между собой хроматограммы испытуемого и стандартного образцов. Заключение о количестве примеси делают по величине пятен и их интенсивности.

Количественное содержание вещества методом хроматографии на бумаге можно установить непосредственно на хроматограмме, используя, например, планиметрический, денситометрический, люминесцентный или другие методы. Для количественной оценки используют также способы, основанные на элюировании испытуемого вещества из вырезанного и измельченного участка хроматограммы. В элюате или в сухом остатке (после отгонки экстрагента) содержание испытуемого вещества определяют фотометрическим или электрохимическим методом.

2. Электрофорез

Электрофорез на бумаге и в тонких слоях сорбента по технике выполнения и аналитическим возможностям сходен с ТСХ.

В ГФ XI включен электрофорез - метод анализа, основанный на способности заряженных частиц к перемещению в электрическом поле (рис.).

Подобно ТСХ, электрофорез позволяет разделять и идентифицировать компоненты различных смесей. Скорость перемещения ионов при электрофорезе зависит от напряженности электрического поля, величины заряда, размера частицы, вязкости, рН среды, температуры и других факторов.

Фронтальный электрофорез проводят в свободной незакрепленной фазе в кювете, представляющей собой разборный U-образный канал. В кювете исследуемую смесь и буферный раствор располагают так, чтобы между ними была четкая граница, которая затем в процессе электрофореза расходится на ряд границ, соответствующих числу компонентов.

Зональный электрофорез проводят в закрепленной среде, которая выполняет роль стабилизатора электрофоретических зон. Зональный электрофорез имеет много вариантов:

· электрофорез в свободной жидкости,

· на крупнопористых носителях (на бумаге, проточных установках, колонках, в блоке),

· на мелкопористых носителях (в тонком слое, крахмальном геле, в полиакриламидном геле).

Известны также комбинированные методы зонального электрофореаз:

· иммуноэлектрофорез,

· метод пептидных карт (сочетание бумажной и тонкослойной хроматографии с высоковольтным электрофорезом).

Приборы для всех видов электрофореза имеют единую схему. Они содержат камеру для электрофореза, источник тока, электроды, соединяющие камеру с источником тока, и устройства для сбора и идентификации разделяемых веществ.

Оценка полученных результатов электрофореза осуществляется различными способами: зарисовкой или фотографированием, определением величины абсолютной или относительной электрофоретической подвижности, определением физических, химических или биологических показателей каждой фракции, денситометрическим определением.

Для окраски электрофореграмм используют красители различного состава или их смеси. Использование в качестве носителя в тонкослойном электрофорезе силигателя марки КСК позволило разработать методики анализа различных лекарственных веществ в таблетках, мазях, эмульсиях, ампулированных растворах, суппозиториях.

3. Ионообменная хроматография

Ранее других методов разделения в фармацевтическом анализе начали применять ионообменную хроматографию для количественного определения препаратов: солей серной, лимонной и других кислот. При этом ионообменную хроматографию сочетают с кислотно-основным титрованием. Внешний вид катионитов (КУ-2), используемых в ионообменной хроматографии, представлен на фото.

Совершенствование метода позволило, используя хроматографию ионных пар с обращенной фазой, разделять некоторые гидрофильные органические соединения. Возможно сочетание комплексонометрии с использованием катионитов в Zn²⁺- фopмe для анализа аминопроизводных в смесях и алкалоидов в экстрактах и настойках. Таким образом, сочетание ионообменной хроматографии с другими методами расширяет область ее применения. Разработана двухколоночная и одноколоночная ионная хроматография.

Первая основана на ионообменном разделении ионов на одной колонке с последующим снижением фонового сигнала элюента на второй колонке и кондуктометрическим детектированием, а вторая (без подавления фонового сигнала элюента) сочетается с фотометрическим, атомно-абсорбционным и другими методами детектирования определяемых ионов.

Несмотря на ограниченное число работ по использованию ионной хроматографии в фармацевтическом анализе, очевидна перспективность этого метода для одновременного определения анионного состава многокомпонентных лекарственных форм и солевых растворов для инъекций (содержащих сульфат-, хлорид-, карбонат-, фосфат-ионы), для количественного определения солей алкалоидов и азотистых оснований, гетероэлементов в органических лекарственных веществах (содержащих галогены, серу, фосфор, мышьяк), для определения уровня загрязнения воды, используемой в фармацевтической промышленности, различными анионами, для определения некоторых органических ионов в лекарственных формах.

Достоинствами ионной хроматографии являются:

? высокая селективность определения ионов,

? возможность одновременного определения органических и неорганических ионов,

? низкий предел обнаружения (до 10^-3 и даже 10^-6 мкг/мл),

? малый объем проб и простота их подготовки,

? быстрота выполнения анализа (за 20 мин. возможно разделение до 10 ионов),

? простота аппаратурного обеспечения,

? возможность сочетания с другими аналитическими методами,

? применение хроматографии в отношении объектов, сходных по химической структуре и трудно разделяемых другими хроматографическими методами.

В качестве примера приведем несколько примеров.

1. Количественное определение солей минеральных и органических кислот. Точную навеску препарата (0,3-0,5 г) растворяют в мерной колбе вместимостью 50 мл и доводят водой до метки. 5 мл полученного раствора пропускают через колонку с катионитом со скоростью 20 капель в 1 мин, промывают водой (а при анализе солей органических кислот, например, бензоата и салицилата натрия - спиртом) до нейтральной реакции промывных вод и титруют выделившееся эквивалентное количество кислоты 0,1 М раствором едкого натра в присутствии соответствующего индикатора.

2. Количественное определение солей алкалоидов и азотистых оснований с помощью анионитов. Точную навеску исследуемой соли алкалоида (0,03-0,05 г) растворяют в 5 мл воды или спирта, подкисляют каплей разведенной хлороводородной кислоты, и раствор медленно пропускают через колонку с анионитом. При этом выделяется основание исследуемого алкалоида.

Так как большинство оснований алкалоидов трудно растворимы в воде, для достижения полноты вымывания таких оснований обрабатывают анионит 5-6 раз 5 мл 95% спирта, а затем 1-2 раза 5-10 мл воды до отрицательной реакции на основание анализируемой соли алкалоида: 3-4 мл последнего фильтрата упаривают до 2-3 капель и к остатку добавляют соответствующий реактив на исследуемое основание. Убедившись в полном вымывании основания исследуемой соли алкалоида, его определяют в фильтрате одним из аналитических методов.

Например, определение карбоксильных групп в препарате «Кальция пангамат» (ФС 42-2008-95).

Препарат представляет комплекс, содержащий кальциевую соль эфира D-кислоты глюконовой и диметилглицина, кальция глюконат и кальция хлорид.

Около 0,2 г препарата (точная навеска) растворяют в 50 мл воды. Затем раствор пропускают через колонку с в Н⁺- форме со скоростью 30 капель в минуту, колонку промывают водой. Из полученного раствора отбирают 20 мл и титруют 0,05 М раствором натрия гидроксида потенциометрическим методом.

Содержание карбоксильных групп в препарате в пересчете на сухое вещество должно быть не менее 11,0 и не более 15,0 %.

Метод ионообменной хроматографии применяется также во внутриаптечном контроле.

Например:

1. Определение натрия гидрокарбоната в растворе кислоты никотиновой 1% для инъекций.

Состав: Кислоты никотиновой 10,0

Натрия гидрокарбоната 7,0

Воды для инъекций до 1 л

2. Определение резорцина в лекарственных формах.

Состав: Новокаина 0,05

Резорцина 0,1

Кислоты борной 0,2

Воды для инъекций до 20 мл



Современные нефармакопейные инструментальные методы контроля качества лекарственных средств

Содержание

1. Термические методы анализа

2. Электрохимические методы

3. Рентгеноструктурный анализ (РСА)

4. Рентгенофазовый анализ (РФА)

5. Нефелометрия и турбидиметрия

6. Масс-спектрометрия



1. Термические методы анализа

Нагревание лекарственных веществ до температуры, не вызывающей термического разложения, приводит к ряду изменений в их физических свойствах. Происходят полиморфные превращения, растворение в кристаллизационной воде, удаление сорбционной и кристаллизационной воды, сублимация, плавление, кипение.

В зависимости от природы вещества, температуры и условий нагревания могут происходить химические превращения: структурирование, термическая, окислительная или гидролитическая деструкция.

Термическая деструкция веществ сопровождается поглощением или выделением теплоты, а также образованием газообразных продуктов. Поэтому наиболее информативными и экспрессными методами оценки термической стабильности являются термография и термогравиметрия.

Термический анализ основан на точной (до 0,1°С) регистрации равновесного состояния между кристаллической и жидкой фазами анализируемого вещества. Медленно нагревая или охлаждая сплав, устанавливают температуру, при которой появляются и исчезают кристаллы.

Термография позволяет оценить термическую стабильность по температурам термоэффекта, связанного с деструкцией исследуемого вещества. Термографический анализ лекарств весьма перспективен. Специфичность термограмм позволила использовать метод для идентификации целого ряда лекарственных веществ.

Термогравиметрия дает возможность определить термическую стабильность по температуре, при которой наблюдается уменьшение массы вещества.

Характерная особенность термометрического титрования - его универсальность. Один и тот же прибор можно использовать для различных видов определений, для анализа не требуются специфические индикаторы, селективные электроды. Область применения метода - реакции нейтрализации, ОВР и др.

Модификацией термического анализа является термомикроскопический метод, в котором используется поляризационная микроскопия для установления фазовых равновесий.

Основные недостатки этих методов: невозможность использования для исследования термолабильных веществ, значительные затраты времени на выполнение анализа, отсутствие должной воспроизводимости.

Значительно лучшей воспроизводимостью отличается дифференциальный термический анализ, основанный на регистрации изменения энергии в зависимости от температуры. Дифференциальный термический анализ позволяет определять наличие примесей в лекарственных веществах, прогнозировать сроки их годности, устанавливать однородность каждой партии и т.д.

Одной из модификаций дифференциального термического анализа, используемых для получения термических характеристик веществ, является дериватография. Сущностьдериватографии заключается в регистрации изменений температуры образца,вызванных дегидратацией, плавлением, термической деструкцией и другими процессами, происходящими при его непрерывном нагревании.

На фото показан современный дериватограф.

Метод сочетает экспрессность и информативность. С помощью дериватографов можно одновременно автоматически регистрировать простую и дифференциальную кривые нагревания, кривые и скорости изменения массы как функции времени. Используя указанные характеристики, можно:

? исследовать полиморфные структуры,

? идентифицировать лекарственные вещества,

? давать качественную оценку стандартным образцам,

? изучать кинетику сушки,

? определять содержание влаги в лекарственных веществах или промежуточных продуктах их получения.

Дериватография оказалась эффективным методом для определения содержания влаги и общей золы в лекарственном растительном сырье, а также определения сухого остатка в жидкихлекарственных формах, получаемых из этого сырья (настойки и экстракты).

Один из вариантов дифференциального термического анализа - дифференциальная сканирующая калориметрия, применение которой в комплексе с другими физико-химическими методами оказалось эффективным для оценки качества стандартных образцов, отличающихся высокой степенью чистоты.

Метод дифференциальной микрокалориметрии, основанный на определении энтальпии плавления, рекомендован для количественного определения термически неустойчивых веществ, установления степени чистоты, стабильности, наличия полиморфных форм.

Термофрактография - метод, основанный на нагревании сырья в определенном температурном интервале и улавливании образующихся продуктов по фракциям.



2. Электрохимические методы

Широкий спектр лекарственных препаратов, определяемых электрохимическими методами, составляют противомикробные, противовирусные, противопаразитарные средства; препараты, применяемые для лечения онкологическ заболеваний; средства, регулирующие метаболические процессы, действующие на нервную и сердечно-сосудистую систему, на периферические нейромедиаторные процессы и др.

Большое внимание уделяется определению антибиотиков левомицитинового, пенициллинового, тетракциклинового, аминогликозидного рядов, антибиотиков группы цефалоспоринов и др.

Разрабатываются новые варианты потенциометрии: инверсионная бестоковая хронопотенциометрия, прямая потенциометрия с помощью газового аммоний-селективного электрода и др. Расширяются исследования в области применения в фармацевтическом анализе таких методов, как кондуктометрия, основанная на исследовании электрической проводимости растворов анализируемых веществ; кулонометрия, заключающаяся в измерении количества электричества, затраченного на электрохимическое восстановление или окисление определяемых ионов.

Таблица

Методы электроанализа, применяемые в медицине и фармации

Способ определения	Определяемый компонент	Тип сенсора
Амперометрия(вольтамперометрия, полярография и ее модификации)	NO, антиоксиданты, аскорбиновая кислота, ферменты, ДНК,интеркаляторы (средства, ингибирующие репликацию ДНК в раковых клетках), антитела, возбудители болезней (вирусы), лекарственные соединения и др.	сенсоры с иммобилизированнымиреагентами, ДНК-сенсоры,иммуносенсоры, биосенсоры, амперометрические сенсоры сбислойными мембранами, реконструированными ферментами и др.
Амперометрия в сочетании с ВЭЖХ, ПХА,микродиализом и капиллярным электрофорезом (детекторы в потоке жидкости)	Нейропереносчики, катехоламины, компоненты плазмы крови, межклеточной жидкости и клеток в жидкости, лекарственные средства (вопросы фармакокинетики).	Ультрамикроэлектроды (металлические, угольно-волоконные), угольно-пастовыеэлектроды, металлические иметаллоксидные электроды и др.
Хроноамперометрия	Гормоны, антибиотики,интеркаляторы, лекарственные соединения.	Бислойные липидные мембраны и др.
Кулонометрия (кулонометрические детекторы)	Объекты фармации,нейропереносчики, антиоксиданты.	Активные металлические электроды, инертные электроды и источниккулонометрического титранта

Кулонометрия

Кулонометрия основана на измерении количества электричества и дает возможность непосредственно определять массу вещества, а не какое-либо свойство, пропорциональное концентрации. Вот почему кулонометрия исключает необходимость использования не только стандартных, но и титрованных растворов.

Что касается кулонометрического титрования, то оно расширяет область титриметрии за счет применения различных неустойчивых электрогенерированных титрантов. Одна и та же электрохимическая ячейка может быть использована для проведения титрования с использованием различных типов химических реакций. Так, методом нейтрализации можно определить кислоты и основания даже в миллимолярных растворах с погрешностью не более 0,5%.

Например, кулонометрический титратор по методу Карла Фишера специально разработан для определения содержания воды в исследуемых образцах. Определение количества воды происходит путем измерения количества электричества, затраченного на генерацию титранта, необходимого для проведения реакции от начала титрования до конечной точки.

На фото титратор фирмы GR Scientific (Великобритания).

Кулонометрический метод применяют при определении малых количеств анаболических стероидов, местно-анестезирующих и других лекарственных веществ.

Например, серия кулонометрических исследований Е.Н. Туровой была посвящена установлению антиоксидантного действия более 90 объектов растительного происхождения. Для количественной оценки антиоксидантной способности предложена характеристика - бромная антиоксидантная способность (АОС), выраженная в единицах количества электричества (кулонах), затраченного на титрование 100 г (или 100 мл) препарата электрогенерированным бромом. Была установлена взаимосвязь между АОС лекарственного растительного сырья и содержанием отдельных групп биологически активных соединений: суммы флавоноидов, токоферолов и веществ восстанавливающего характера.

Методом прямой кулонометрии определяют ионы меди, свинца, висмута, мышьяка, урана и других металлов. Этот метод нашел применение также анализа органических соединений, в том числе и лекарственных препаратов (аскорбиновой кислоты, новокаина, пикриновой кислоты, оксихинолина и пр.).

Пример применения кулонометрии. В прессе Великобритании поднята кампания против чая с молоком - утверждается, что добавление молока в чай уменьшает его антиоксидантнуюактивность (АОА). Российские ученые проверили данное утверждение. Результаты такой экспериментальной проверки показывают, что при внесении в чай молока не только не происходит уменьшения АОА, но она даже увеличивается на 10-15%. С другой стороны, происходит перераспределение антиоксидантов по стакану, так как слой молока может их концентрировать.

Классическая полярография

В практике фармацевтического анализа и в особенности в заводских условиях полярографический анализ встречает затруднения, так как требует соблюдения строгих условий техники безопасности при работе со ртутью. К недостаткам метода можно отнести его малую избирательность (из-за близких величин потенциалов полуволн) по отношению к исследуемым классам соединений, в связи с чем, требуется, как и при спектральных методах, предварительное разделение веществ. Поэтому полярография была исключена из ГФ XII (2007 г.). Однако еще существуют действующие ВФС, ФС на ЛС, включающие полярографию.

Полярографию широко используют в анализе неорганических веществ, а также алкалоидов, витаминов, гормонов, антибиотиков, сердечных гликозидов. Весьма перспективны вследствие высокой чувствительности современные методы: дифференциальная пульс-полярография, осциллографическая полярография и др.

...