Размещено на http://www.allbest.ru/

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

"Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова"

На правах рукописи

Специальность: 02.00.06 ? высокомолекулярные соединения

02.00.11 - коллоидная химия

Диссертация

на соискание ученой степени

кандидата химических наук

СОЗДАНИЕ ПОЛИМЕРНЫХ МИКРОСФЕР ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИИ С ФУНКЦИОНАЛЬНО-МОДИФИЦИРОВАННОЙ ПОВЕРХНОСТЬЮ В ШИРОКОМ ИНТЕРВАЛЕ ДИАМЕТРОВ

Лукашевич Андрей Дмитриевич

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор И.А. Грицкова.

доктор химических наук С.М. Левачёв

Москва - 2015Содержание

• Список сокращений
• Введение
• Глава 1. Литературный обзор
• 1.1 Полимерные микросферы в биотехнологии. Основные подходы к синтезу
• 1.1.1 Полимерные суспензии с альдегидными группами на поверхности частиц
• 1.1.2 Полимерные суспензии с хлорметильными группами на поверхности частиц
• 1.1.3 Синтез полимерных суспензий с эпоксидными группами на поверхности частиц
• 1.1.4 Полимерные суспензии с карбоксильными группами на поверхности частиц
• 1.1.5 Синтез полимерных суспензий с амидными группами на поверхности частиц
• 1.1.6 Синтез полимерных суспензии с аминогруппами на поверхности частиц
• 1.2 Активация функциональных групп на поверхности частиц полимерной суспензии
• 1.2.1 Требования к методам активации функциональных групп на поверхности частиц полимерные суспензии
• 1.2.2 Карбоксильные группы
• 1.2.3 Гидроксильные группы
• 1.2.4 Амидные группы
• 1.3 Принципы модификации полимерных микросфер полупроводниковыми флуоресцентными нанокристаллами
• Глава 2. Экспериментальная часть
• 2.1 Исходные реагенты
• 2.2 Методы исследования
• 2.2.1 Измерение межфазного натяжения на границе раздела фаз методом Вильгельми
• 2.2.2 Дилатометрический метод исследования кинетики полимеризации
• 2.2.3 Определение размеров частиц полимерных суспензий методом электронной сканирующей микроскопии
• 2.2.4 Определение размеров частиц и дзета-потенциала методом фотонной корреляционной спектроскопии
• 2.2.5 Определение молекулярных масс полимеров методом вискозиметрии
• 2.2.6 Определение сухого остатка полимерных суспензий
• 2.2.7 Определение концентрации аминогрупп на поверхности полимерных частиц
• 2.2.8 Определение концентрации карбоксильных групп на поверхности полимерных частиц
• 2.2.9 Определение концентрации эпоксидных групп на поверхности полимерных частиц
• 2.2.10 Определение агрегативной устойчивости полимерных частиц
• 2.2.11 Определение краевого угла смачивания
• 2.2.12 Постановка реакции пассивной геммагглютинации (РПГА) и реакции пассивной латексной агглютинации (РПЛА)
• Глава 3. Результаты и их обсуждение
• 3.1 Полимеризация стирола в присутствии функциональных КО ПАВ
• 3.2 Дисперсионная полимеризация мономеров
• 3.2.1 Дисперсионная полимеризация стирола
• 3.2.1.1 Влияние объёмного соотношения мономер/растворитель на конечный диаметр полистирольных частиц
• 3.2.1.2 Влияние температурного профиля на процесс полимеризации и свойства конечной дисперсии
• 3.2.2 Дисперсионная полимеризация глицидилметакрилата
• 3.3 Затравочная полимеризация
• 3.3.1 Затравочная полимеризация глицидилметакрилата
• 3.3.2 Анализ наличия функциональных групп
• 3.4 Затравочная полимеризация стирола
• 3.5 Модификация поверхности полимерных микросфер флуоресцентными нанокристаллами (КТ)
• 3.6 Выбор полистирольных микросфер для разработки диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации
• 3.7 Работка нового типа частиц - носителей с развитой поверхностью
• Выводы
• Список литературы

Список сокращений

АА - акриламид

БЭТ - метод Брунауэра-Эмметта-Теллера

ВРК - водорастворимый карбодиимид

ГМА - глицидилметакрилат

ДСН - додецилсульфат натрия

ККМ - критическая концентрация мицеллообразования

КО ПАВ - кремнийорганическое поверхностно-активное вещество

МАС - межфазный адсорбционный слой

ПАВ - поверхностно-активное вещество

ПВП - поли-N-винилпирролидон

ПВС - поливиниловый спирт

ПК - персульфат калия

ПМ - полимерные микросферы (а)

ПМЧ - полимерно-мономерная частица

РЛА - реакция латекс-аглютинации

РСМА - рентгеноспектральный микроанализ

РЧР - распределение частиц по размерам

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия

ЦС - цетиловый спирт

Введение

Полимерные суспензии с большими размерами частиц (от 5 мкм и выше) получают методами дисперсионной и затравочной полимеризации. Несмотря на то, что эти методы синтеза известны давно и широко применяются для производства полимерных суспензий различного назначения, до сих пор актуальным остается вопрос регулирования диаметра полимерных микросфер, распределения их по размерам и свойств приповерхностного слоя. Существование этой острой проблемы обусловлено тем, что при гетерофазной полимеризации мономеров одновременно протекают несколько процессов. Это инициирование полимеризации, формирование полимер-мономерных частиц и образование межфазного адсорбционного слоя, которые определяют агрегативную устойчивость реакционной системы, диаметр полимер-мономерных частиц и их распределение по размерам.

Методом дисперсионной полимеризации получают полимерные частицы с размерами от 1 до 10 мкм. Для дисперсионной полимеризации обычно используют полярные растворители такие как этанол, изопропанол и метанол. В качестве стабилизаторов частиц используют поли-N-винилпирролидон (ПВП), диоктилсульфосукцинат натрия(AOT).

Контроль размера частиц и их распределение по размерам - одна из самых важных проблем дисперсионной полимеризации.

На эти параметры влияют природа и концентрация мономера, стабилизатора, инициатора и температура. Влияние этих параметров изучено в недостаточной степени и требуются дополнительные исследования, чтобы оценить их роль при проведении дисперсионной полимеризации мономеров в растворителях разной полярности.

При затравочной полимеризации мономеров необходимо предварительно получить полимерные суспензии малого диаметра с узким РЧР, что также является непростой задачей, а затем использовать их как затравочные для набухания мономером и проведения в них полимеризации. В этом случае необходимо тщательно соблюдать режим полимеризации для того, чтобы в водной фазе не оказался мономер и не образовались ПМЧ по другому механизму.

Одним из путей решения этой проблемы является полимеризация мономеров в присутствии нерастворимых в воде ПАВ. В этом случае образование полимер-мономерных частиц происходит по одному механизму из микрокапель мономера, а прочный межфазный адсорбционный слой формируется на поверхности ПМЧ на ранних стадиях полимеризации и определяет узкое распределение по размерам.

Не менее важной и актуальной проблемой является получение функциональных полимерных микросфер со свойствами, позволяющими заменить эритроциты в реакциях латекс - агглютинации. В этом случае они должны соответствовать определенным критериям, наличие которых обеспечивает сохранение чувствительности и специфичности реакциилатекс - агглютинации такой же как в эротрицитарных диагностикумах. Такие частицы прямым синтезом получить невозможно и в этом случае перспективна полимеризации на затравочных частицах в присутствии функциональных ПАВ.

Получить полимерные микросферы, удовлетворяющие высоким требованиям, предъявляемым к носителям биолигандов, возможно и путем модификации предварительно полученных полимерных дисперсий. Это позволяет в широких пределах варьировать свойства поверхности ПМС, что невозможно обеспечить прямыми методами.

Цель настоящей работы. Создание полимерных микросфер с функционально - модифицированной поверхностью в широком интервале диаметров и узким распределением по размерам различными методами гетерофазной полимеризации.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- Использовать различные методы проведения гетерофазной полимеризации с целью получения полимерных дисперсий, обладающих необходимым комплексом свойств: диаметром, РЧР, устойчивостью, наличием функциональных групп на поверхности частиц, способностью к иммоблилизации полупроводниковых нанокристаллов (КТ).

- На основе данных анализа кинетических закономерностей полимеризации мономеров создать рецептуры синтеза полимерных микросфер (в том числе и композитных) с диаметрами в интервале от 0,4 до 5мкм для применения в качестве носителей биолигандов.

- Обеспечить устойчивость полимерных микросфер на всех стадиях синтеза и модификации их поверхности.

Научная новизна работы:

- Впервые проведены систематические исследования по изучению влияния изменения температуры реакционной смеси на начальную стадию дисперсионной полимеризации. Показано его определяющее влияние на число частиц, скорость их роста и конечный диаметр дисперсий.

- Установлено влияние природы растворителя на дисперсный состав полимерных микросфер (в ряду метанол - трет-бутанол) при проведении дисперсионной полимеризации.

- Методом микросуспензионной полимеризации стирола и метилметакрилата в присутствии нерастворимых в воде ПАВ синтезированы полимерные суспензии с узким РЧР и диаметрами 0,4-0,9 мкм, содержащие на поверхности карбоксильные и эпоксидные группы.

- Впервые методом затравочной полимеризации стирола, содержащего нерастворимые в воде КО ПАВ, на сшитых полистирольных частицах с диаметром ? 5мкм, синтезированы полимерные микросферы со структурой ядро-оболочка, содержащие в межфазном адсорбционном слое функциональные карбокси и эпокси группы.

- Предложены различные химические и физико-химические способы модификации, позволяющие широко варьировать концентрацию функциональных групп на поверхности ПМС.

- Впервые найдены условия синтеза устойчивых полистирольных микросфер с узким РЧР, содержащих на поверхности высокую концентрацию функциональных групп, путём последовательной модификации частиц процессами хлорметилирования и аминирования.

- Разработана методология получения полимерных дисперсий, частицы которых представляют собой композит из флуоресцентной функциональной оболочки и полимерного ядра.

Практическая значимость работы:

- Создана диагностическая тест-система с использованием полимерных микросфер в качестве носителей биолигандов для определения уровня антител к столбнячному анатоксину в сыворотках крови человека методом реакции пассивной латексной агглютинации, чувствительность которой сопоставима с чувствительностью существующего гемагглютинационного иммунного диагностикума.

- Получены новые композиционные полимерные частицы с высокой удельной поверхностью, применение которых в качестве носителей биолигандов позволяет на порядок повысить чувствительность диагностических тест-систем, по сравнению с наблюдаемой при использовании эритроцитов или индивидуальных полимерных микросфер.

- Полученные результаты могут стать основой при разработке тест системы для диагностики различных заболеваний методом реакции пассивной латексной агглютинации.

- Проведено исследование различных методов формирования флуоресцентных микросфер, спектрально кодированных квантовыми точками, что позволило научно обоснованно сформулировать требования к конструкции флуоресцентных микросфер, применяемых в качестве диагностикумов.

Автор защищает:

1. Влияние изменения температуры на начальной стадии дисперсионной полимеризации стирола на диаметр частиц и их распределение по размерам.

2. Влияние природы растворителя и концентрации мономера на дисперсный состав полимерных дисперсий.

3. Кинетические закономерности полимеризации стирола и метилметакрилата в присутствии функциональных нерастворимых в воде ПАВ и рецептуры синтеза полимерных дисперсий с диаметрами 0,4-1,1мкм.

4. Синтез и свойства функциональных полимерных дисперсий с диаметром порядка 5мкм, полученных методом затравочной полимеризации.

5. Химическую и физико-химическую модификацию поверхности полимерных частиц.

6. Методологию получения полимерных микросфер с иммобилизованными на поверхности КТ-точками.

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации докладывались и обсуждались на международной конференции "Коллоиды и нанотехнологии в индустрии", Алматы, 2014г.

Глава 1. Литературный обзор

1.1 Полимерные микросферы в биотехнологии. Основные подходы к синтезу

В биотехнологии обычно применяют полимерные суспензии, содержащие на поверхности частиц функциональные группы, способные непосредственно реагировать с амино, карбоксильными или сульфгидрильными группами биомолекул. К числу функциональных полимерных суспензии первого типа относятся полимерные суспензии, частицы которых содержат на поверхности хлорметильные, хлорсульфоновые, альдегидные, эпоксидные и сульфгидридные группы[1-18]. Такие группы реагируют с биомолекулами в водной среде при умеренной температуре. Схема таких реакций приведена ниже:

Ко второму типу относятся полимерные суспензии с карбоксильными, гидроксильными, аминными, амидными, гликолевыми и другими группами на поверхности частиц, неспособные к прямому взаимодействию с функциональными группами белка и требующие их химической активации[22-25].

Основные методы синтеза полимерных суспензий с функциональными группами различной природы на поверхности частиц это: эмульсионная[20,21,28-30],суспензионная[18], дисперсионная 55,56, осадительная, безэмульгаторная 13,54, затравочная полимеризации. При этом выбор метода синтеза определяется необходимостью получения суспензий с определенным диаметром частиц, узким распределение частиц по размерам, стабильностью в физиологических растворах и при хранении.

1.1.1 Полимерные суспензии с альдегидными группами на поверхности частиц

Наиболее подробно изучены и широко используются полимерные суспензии с альдегидными группами на поверхности частиц. Их получают гомополимеризацией ненасыщенных альдегидов (акролеин, формилстирол) и их сополимеризацией с мономерами различной природы [63,64].

Полиакролеиновые микросферы с узким РЧР получают анионной осадительной полимеризацией в щелочных условиях, радикальной эмульсионной полимеризацией, а также радиационно-инициированной эмульсионной полимеризацией [64]. В качестве окислительно-восстановительной системы используют персульфат калия - нитрат серебра. Полимеризацию проводят в водном растворе в темноте при комнатной температуре обычно при концентрации акролеина 10%об. В качестве стабилизатора частиц применяют полиэтиленоксид. Этим способом были получены полиакролеиновые микросферы с диаметрами от 0,01 до 0,2 мкм и коэффициентом вариации менее 10 %. [63]

При г - инициированой радикальной полимеризация акролеина процесс проводили в водном растворе смеси ионогенного (лаурилсульфата натрия) и неионогенного (полиэтиленоксид) ПАВ при дозе обучение 0,4 Мрад и комнатной температуре в течение 4 часов. Были получены полиакролеиновые микросферы широкого спектра размеров: от 0,01-0,02 до 5 мкм. Однако стабильные и монодисперсные микросферы удалось получить лишь при концентрации мономера не выше 15% масс[64].

Полиакролеиновые суспензии с размерами частиц от 0,04 до 8 микрон и коэффициентом вариации менее 10% авторам [56] удалось получить осадительной гомополимеризацией акролеина в щелочной среде (pH>11) при постепенном введении раствора щелочи в водный раствор акролеина только в присутствии специально синтезированного эмульгатора - продукта взаимодействия олигомеров полиглутарового альдегида с бисульфитом натрия.

Было установлено что размер, РЧР, концентрация альдегидных групп на поверхности и т.д. существенно зависят от условий полимеризации, вследствие чего процесс является плохо воспроизводимым. О плохой воспроизводимости процессов осадительной полимеризация акролеина также сообщается в работах. Кроме того, отмечается, что в частицах полиакролеиновых суспензий всегда содержится некоторое количество олигомерного продукта, наличие которого обусловлено особенностями механизма осадительной полимеризации. Вследствие этого, с течением времени такие олигомерные продукты могут диффундировать из объема частиц на их поверхность, что приводит к заметному изменению свойств микросфер в процессе хранения. Эти недостатки были устранены при синтезе полиакролеиновых суспензии в щелочной среде в присутствии радикальных инициаторов[65-69] в результате дополнительного сшивания олигомеров акролеина радикальным инициатором.

Более высокой стабильностью чем полиакролеиновые суспензии, обладали полистирол-акролеиновые и полиметилметакрилат-акролеиновыесуспензии, полученные безэмульгаторной сополимеризацией акролеина с этими мономерами, инициированной персульфатом калия при температуре 55оС в атмосфереазота. Устойчивые полистирольные и полиметилметакрилатметакриловые частицы одинакового размера были синтезированы методом пострадиационной привитой полимеризации акролеина из газовой фазы [64].

В качестве ПАВ применяли оксиэтилированный полипропиленгликоль (F-68), растворимый в воде и ди-п-толил-о-карбалкоксифенилкарбинол (ДТК), растворимый в мономерной фазе. Инициирование процесса полимеризации во всех случаях осуществляли персульфатом калия (ПК). Полимеризацию мономеров проводили до полной конверсии, время полимеризации составляло 24 часа. Частицы полимерных суспензий были устойчивы при хранении и физиологическом растворе, имели узкое распределение по размерам и диаметры 0,2 и 0,45 мкм соответственно [64].

Анализ ИК-спектров показал, что Количество свободных и связанных -CHO групп в полиакролеине определяется условиями его синтеза. Так, для микросфер полученных ионной полимеризацией акролеина, содержание альдегидных групп в полимере составляет 2,9 ммоль альдегида/г микросфер, в то время как для микросфер, полученных радикальной полимеризацией акролеина, например, под действием радикальный окислительно-восстановительной системы, содержание альдегидных групп равно 12,0ммоль/гмикросфер.

Полимерные суспензии с альдегидными группами на поверхности получают методом дисперсионной полимеризации глутарового альдегида [38,61,62] и формилстирола в водно-этанольной среде с использованием в качестве инициатора ДАК [71,73] и стабилизатора - поливинилбензойной кислоты. Полимеризацию проводят в течение 24 часов при температуре 70^оС. Полученные частицы, в зависимости от концентрации мономера имели диаметр 0,5 - 2,0 мкм, коэффициент вариации 8-10% и концентрацию альдегидных групп на поверхности частиц 0,1-0,2 мкмоль/г.

1.1.2 Полимерные суспензии с хлорметильными группами на поверхности частиц

Получают такие полимерные суспензии осадительной и затравочной полимеризацией хлорметилстирола и хлорметилакрилата. Общим серьезным недостатком этих мономеров является их высокая токсичность. Наиболее удобным способом синтеза полимерных суспензий с хлорметильными группами на поверхности оказалась затравочная сополимеризация хлорметилстирола со стиролом. Затравочные полистирольные частицы с диаметром около 2мкм обычно получают дисперсионной полимеризацией стирола инициированной ДАК (1моль/л) в водно-этанольной среде при объемном соотношении равном 1:4 соответственно, в присутствии полиакриловой кислоты в качестве стабилизатора. Затем набухали частицы затравочной суспензии мономерами и проводили полимеризацию в течение 24 часов при 70^оС. В процессе хранения полихлорметильных суспензий имел место частичный гидролиз реакционноспособныххлорметильных групп, что приводило к изменению свойств полимерной суспензии. В работе [55]приведены данные по использованию стирол-хлорметильных сополимерных суспензий в иммуноанализе.

1.1.3 Синтез полимерных суспензий с эпоксидными группами на поверхности частиц

Полимерные суспензии, частицы которых содержат на поверхности эпоксидные группы, получают, в основном, безэмульгаторной сополимеризацией стирола с глицидилметакрилатом [44-48]. В процессе синтеза стирол-глицидилметакрилатных сополимерных суспензий часть эпоксидных групп на поверхности частиц теряется вследствие гидролиза. Однако, несмотря на это, их концентрация на поверхности частиц остается достаточнойдля ковалентного связывания с биолигандами и обеспечения их необходимой концентрации. Эпоксидныегруппы часто подвергают дальнейшей модификации как с целью получения более стабильных групп на поверхности частиц, так и для введения дополнительной спейсерной группировки.

Вследствие высокой реакционоспособности эпоксидных групп они способны принимать участие в различных реакциях полимераналогичных превращений ⁴⁰.

Так, подвергая гидролизу эпоксидные группы на поверхности частиц суспензии при рН=2 и температура 50°С, получают частицы с гликолевыми группами, которые затем легко превращаются в альдегидные под действием йодной кислоты:

Следует отметить, что в результате гидролиза удается получить до 60% гликолевых групп от теоретически возможного (исходя из концентрации эпоксидных групп на поверхности частиц суспензии), причем диаметр и РЧР исходных и модифицированных частиц практически не изменяется: 440 нм и КВ=3.9% для исходных и 475 нм и КВ=5.8% для модифицированных частиц.

Еще легче протекает реакция эпоксигрупп с гидроокисью аммония (реакция аммонолиза), проходящая при 20°С:

Эпоксидные группы на поверхности частиц суспензии могут быть модифицированы до тиоловых (меркаптановых) групп путем их реакции с водным раствором сероводорода (сероводородной кислотой), проходящей в мягких условиях (температура 20°С, время реакции 2-4 часа):

Однако, в этом случае авторы отмечают заметную агломерацию модифицируемых частиц: они имели коэффициент вариации 15.5%.

Кроме рассмотренных реакций, возможна также модификация эпоксидных групп на поверхности микросфер путем введения спейсера при их взаимодействии с диаминами или аминокислотами (см. выше).

Для уменьшения гидролиза эпоксидных групп в процессе синтеза суспензии и получения высокой концентрации этих групп на поверхности полимерных частиц в работах [55,56] рекомендуют проводить полимеризацию условиях постепенного дозирования функционального мономера в полимеризующуюся систему[19,77-79].

В литературе описано применение функциональных инициаторов и полифункциональных поверхностно-активных веществ, содержащих в своей молекуле реакционноспособные группы, для синтеза полимерных суспензии с узким РЧР для иммунодиагностики. Однако их применение в основном ограничено высокой стоимостью и отсутствием промышленного производства. В качестве примера полифункциональных инициаторов, позволяющих получать на поверхности частиц суспензии химические группы способны ековалентно связываться с биомолекулами, можно назвать динитрилазо-изо-бромкапроновой кислоты (1) и ди(хлорметилбензоил)пероксид(2) [78].

Примером полифункционального эмульгатора являются соли изомочевины, в частности, гидрохлорид 4-этилфенилметилизотиомочевины [41].

Указанное соединение является катионактивным мономером-эмульгатором, способным к сополимеризации с виниловыми мономерами. В частности, в его присутствии были синтезированы полистирольные микросферы с диаметром 0,15-0,19 мкм и коэффициентом вариации 2,7%, содержащие на поверхности группы изотиомочевины. Их подвергали гидролизу в мягких условиях (pH=10-11, температура 25^oC) в течение 10 минут и получали меркаптановые группы на поверхности частиц[41]. Было обнаружено, что в процессе гидролиза средний диаметр частиц и их РЧР практически не изменяются.

1.1.4 Полимерные суспензии с карбоксильными группами на поверхности частиц

Наиболее часто используются в биотехнологии. Основным и наиболее изученным методом получения полимерных суспензий с карбоксильными группами на поверхности частиц является сополимеризация гидрофобных мономеров с различными ненасыщенными кислотами (акриловой, метакриловой, итаконовой и т.д.), которую проводят в присутствии или отсутствие эмульгатора. Наличие на поверхности микросфер легко диссоциирующих карбоксильных групп сообщает дополнительную стабилизацию частицам, что приводит к повышению устойчивости микросфер к механическим воздействием и низкой температуре (замораживанию) [11,80-83].

Синтез функциональных микросхем с карбоксильной группы на поверхности осуществляет также путем полимеризации и сополимеризации поверхностно-активных мономеров, например, акриламидостеарата натрия(3), соли винилалкилкарбоновых кислот(4) [78]; поверхностно-активных инициаторов, - например 4,4-азобис-4цианпентановой кислоты(5) [78]:

Однако, в виду высокой стоимости, эти полифункциональные компоненты не нашли широкого применения.

Новым интересным методом синтеза полимерных суспензии с карбоксильными группами на поверхности частиц является полимеризация стирола в присутствии ПАВ, нерастворимых в воде и содержащих в своей молекуле карбоксильные группы. К таким ПАВ относятся: ДТК, олигомерные пироксиэфиры [94], альфа-(карбоксиэтил)-омега(триметилсилокси) полидиметилсилоксан, ПДС, в присутствии которых подробно изучена полимеризация стирола.

В присутствии ПАВ подобного типа были получены полистирольные, полиметилметакрилатные, полихлоропреновые и полистиролметакрилатные суспензии с узким распределение частиц по размерам и диаметрами в интервале от 0,2 до 0,9 мкм. Синтезированные полимерные суспензии отличались высокой устойчивостью как при хранении, так и физиологическом растворе, и нашли применение в иммунохимических исследованиях[96].

1.1.5 Синтез полимерных суспензий с амидными группами на поверхности частиц

Для синтеза амидосодержащих полимерных суспензий чаще всего применяют безэмульгаторную сополимеризацию стирола с амидами акриловой и метакриловой кислот [2,25,104-106].

Наиболее подробно изучена безэмульгаторная сополимеризация стирола и акриламида (АА), взятого в количестве 0,1-0,5 масс. % (на стирол) процентов при pH=9 [86]. Авторы разделяют процесс сополимеризации на три стадии: на первой протекает сополимеризация мономеров в водной фазе с образованием олигомеров; на второй полимеризация стирола в частицах, образованных из этих олигомеров и на третьей - сополимеризация АА с растворенным в водной фазе стиролом.

Особое внимание при изучении процесса полимеризации стирола и АА уделяют распределению амидных групп между водной и полимерной фазами: вследствие высокой гидрофильности АА, в водной среде всегда присутствует значительное количество водорастворимого гомополимера [77,78]. Полученные полимерные суспензии имели диаметр в интервале 0,2-0,5 мкм с коэффициентом вариации менее 3%.

1.1.6 Синтез полимерных суспензии с аминогруппами на поверхности частиц

Синтез аминосодержащих полимерных суспензий путем полимеризации каких функциональных мономеров как аминостирол[95], 2-аминоэтилакрилат,2-диметиламинометилметакрилат, аллиламин 66, применяется достаточно редко, что связано как с высокой стоимостью мономеров и низкой устойчивостью полимерных микросфер, полученных на их основе, так и с трудностью полученияузкого распределения частиц по размерам вследствие высокой гидрофильности мономеров. Значительно легче аминосодержащие полимерные суспензии могут быть получены путем модификации готовых суспензий с гидроксильными, хлорметильными, амидными и другими группами.

В качестве примера приведем способ получения полимерных суспензий с аминогруппами на поверхности частиц методом дисперсионной каталитической полимеризации п-аминостирола. Полимеризацию п-аминостирола проводят в присутствии минеральных и органических кислот(с рК_а не более 4,76) и добавок органических жидкостей в количестве 10-80% в расчете на воду, смешивающихся с водой и имеющих диэлектрическую проницаемость меньше чем у воды. В результате полимеризации получают полиаминостирольные микросферы с размером в интервале 0,6-10 мкм с узким распределением частиц по размеру.

Полимерные микросферы с диаметрами 0,2-3,5 мкм и коэффициентом полидисперсности не более 1,08 были также получены методом дисперсионной катионной полимеризации п-аминостирола в водно-метанольной среде при объемном соотношении мономер: вода равном 1:9 концентрации цетилпиридинийбромида 1% масс. в расчете на мономер и концентрации катализатора HCl 10% масс. в расчете на мономер и температуре 60^оС.

1.2 Активация функциональных групп на поверхности частиц полимерной суспензии

1.2.1 Требования к методам активации функциональных групп на поверхности частиц полимерные суспензии

· проходить необратимо и количественно при возможно более мягких условиях;

· не уменьшать стабильность суспензий, не оказывать заметного влияния на их диаметр и РЧР;

· сохранять биохимическую активность молекул биолиганда, ковалентно связанного с функциональными группами на поверхности частиц суспензии.

1.2.2 Карбоксильные группы

Карбоксильные группы на поверхности частиц суспензии могут вступать во взаимодействие с аминогруппами биополимера в присутствии водорастворимых карбодиимидов (ВРК) [80]. Наиболее часто используемыми ВРК являются: 1-циклогексил-3(2-морфолиноэтил) карбодиимидтолуолсульфонат (6) и 1-этил(3-диметиламинопропил) карбодиимидгидрохлорид (7)

Реакция активации протекает по следующей схеме:

Реакцию проводят при температуре 4-6°С и pH=6-7 в течении 2-4 часов в отсутствие или в присутствии инертного буфера типа N-2-гидроксиэтил пиперазин-N-этан сульфоновой кислоты.

К преимуществам данного способа активации функциональных групп следует отнести его простоту, однако вследствие того, что белковые молекулы содержат как карбоксильные, так и аминогруппы, возможно протекание меж- и внутримолекулярного сшивания, что снижает иммунохимическую активность биолиганда [26,104,127,128].

В значительной степени этот недостаток устраняется путем использования двухстадийных методов активации: на первой стадии карбоксильные группы переводятся в активную (но стабильную) форму, микросферы отделяются от дисперсной среды с оставшимися в ней не прореагировавшими компонентами, а затем, на второй стадии, проводят ковалентное связывание с биолигандами.

Среди наиболее распространенных 2-х стадийных методов активации функциональных групп можно назвать так называемый метод "активированных эфиров". Схема протекания процесса активации по работам [2,48,49] выглядит следующим образом:

Кроме N-гидроксибензотриазола могут быть использованы 1-гидроксибензтриазол, N,N-диалкилгидроксиламины и т.д. Условия протекания первой стадии аналогичны описанным выше для "карбодиимидного" метода. После первой стадии проводится очистка суспензии от побочных продуктов. Вторая стадия протекает при температуре 4^оС и pH =7-7,5 в течение 2-3 дней, после чего проводят полную очистку полученного диагностикума от примесей.

Другим возможным способом проведения активации по 2-х ступенчатой схеме, согласно [69], может быть использование реактива Вудворда:N-этил 5-фенилизоксазолин 3'-сульфоната.



В этом случае первая стадия протекает при pH=8,5 температуре 3^оС в течение 3 часов. Получение суспензии с активированными карбоксильными группами на поверхности частиц очищают от побочных продуктов и затем проводят связывание с биолигандами при pH =7, температуре 5^оС в течение 3 часов.

Общим недостатком перечисленных выше методов является высокая стоимость и малая стабильность при хранении используемых реактивов, что делает процесс связывания биомолекул с функциональными группами микросфер плохо воспроизводимым. Кроме того, при использовании указанных методов, биомолекулы оказываются расположенными вблизи поверхности полимерных частиц что может привести к изменению их конформации и уменьшить их биохимическую активность. В связи с этим, распространение получил также метод ведения спейсера в результате реакции карбоксильных групп частиц суспензии с различными диаминами (1,6 диаминогексаном, 1,7 диаминогептаном [47,90-93]. На первой стадии проводят связывание карбоксильных групп на поверхности микросфер с диамином в присутствии ВРК, после чего проводят активацию образовавшихся аминогрупп одним из методов, которые описаны ниже.

1.2.3 Гидроксильные группы

Гидроксильные группы на поверхности частиц полимерной суспензии активируют в 2 стадии цианоген-бромидным методом. Первоначально они взаимодействуют с бромцианом в сильнощелочных средах (pH=10-11) с последующим связыванием с аминогруппами белковых молекул. Реакция протекает по схеме, описанной в [44]:



1 и 2-ая стадии протекают при 25°С в течение 15 минут с периодическим добавлением 2Nраствора гидроксида натрия для поддержания щелочного pH, после чего проводят очистку суспензии от побочных продуктов. 3-ая стадия проводится в 0.1 М боратном буфере при рН=8.0-8.5 и температуре 4°С в течение 4 часов. Непрореагировавшие активированные гидроксильные группы связывают добавлением 0.1 М глицинового буфера с рН=8.5 и проводят полную очистку суспензии.

Этот метод активации может быть использован только для ковалентного связывания биомолекул, устойчивых в сильнощелочных средах. К недостаткам метода следует отнести высокую токсичность бромциана и заметную агрегацию полимерных микросфер в процессе связывании биолигандов с функциональными группами.

Согласно работам [2,75,76], для активации гидроксильных групп также могут быть применены и другие реактивы: тозилхлорид (п-толуолсульфонилхлорид), 2,2,2-трифтор-этансульфонилхлорид [75,76] и карбонил-ди-имидазол [67,68]. Для примера, ниже приведена схема активации гидроксильных групп с использованием тозилхлорида:

Весьма удобным методом активации гидроксильных групп является окисление гликольных групп, которые могут быть легко получены как промежуточное соединение при гидролизе эпоксидных групп или окислении двойных связей в полидиенах (см. ниже). Микросферы с гликолевыми группами на поверхности микросфер получают, как это было сказано ранее, при полимеризации стирола в присутствии декстранов в качестве функциональных поверхностно-активных веществ[59]. Окисление проводят йодной кислотой или ее солями - перйодатами, при комнатной температуре и нейтральном pH в течение 30-60 минут в отсутствие освещения[50,40,41]. В реакцию вступают только гликоли с первичными и вторичными гидроксильными группами, при этом происходит разрыв связи С-С с образованием двух альдегидных групп:

Образовавшиеся побочные продукты отделяются на стадии очистки полимерных микросфер.

1.2.4 Амидные группы

Хотя амидные группы, содержащиеся на поверхности частиц полимерной суспензии, непосредственно не взаимодействуют с белковыми молекулами, в литературе [27,46, 72,73] описаны методы полимераналогичных превращений, позволяющих получить на основе амидсодержащих полимерных суспензий микросферы с другими, легкоактивирующимися группами.

Так, широко используется модификация амидогрупп до гидразидных ^27,46 . Реакция протекает при температуре 50-80°С в течение 7-10 часов по схеме:



Образующиеся в результате реакции гидразиновые группы могут быть переведены либо в карбоксильные, которые требуют дальнейшей активации, либо в азидные группы, способные непосредственно взаимодействовать с биомолекулами.

Первая реакция может быть осуществлена путем реакции гидразидных групп с сукциновым ангидридом [82,83]:

Для получения азидсодержащих полимерных суспензий используется реакция диазотирования, протекающая в присутствии азотистой кислоты при пониженной температуре (2-5°С)², после чего возможно непосредственное взаимодействие биомолекул с азидными группами на поверхности микросфер (рН=7.0-9.5,4 часа):

Следует отметить, что гидразиновые группы по реакционной способности аналогичны аминогруппе -NH2и, следовательно, могут быть активированы теми же способами.

Другим возможным способом модификации амидосодержащих полимерных суспензий является проведение реакции Гоффмана [39,40], заключающейся в переведении амидогрупп в первичные аминогруппы под действием гипохлорида натрия в щелочных условиях. В работах [43,44]были исследованы факторы, влияющие на протекание этого процесса. Было показано, что кроме реакции превращения амидогрупп в аминогруппы, в заметной степени протекает реакция гидролиза с образованием карбоксильных групп, причем степень гидролиза увеличивается при повышении температуры и уменьшении соотношения NaOCl/полиамид. Определены оптимальные условия, позволяющие получить максимальное количество аминогрупп на поверхности частиц суспензии: соотношение концентраций гипохлорида и амидных групп - 0.6-0.9; температура 5-10°С и время проведения процесса 1-2 часа. Показано, что при этих условиях проведения модификации функциональных групп практически не изменяются диаметр частиц суспензии и их РЧР. Описанный способ был применен для ковалентного связывания амидных групп, расположенных на поверхности частиц акриламид-стирольных сополимерных суспензий с ферментами (с использованием глутарового альдегида для активации получившихся аминогрупп) [54].

Перевод амидогрупп в карбоксильные, что часто бывает необходим для повышения стабильности микросфер, может быть осуществлен их гидролизом в щелочной среде в мягких условиях (температура 30°С в течение 3-4 часов)¹⁴⁴. Степень гидролиза, а, следовательно, и концентрация карбоксильных групп на поверхности частиц суспензии, может варьироваться в зависимости от времени проведения процесса, что дает возможность получать частицы с различной концентрацией карбоксильных групп на поверхности.

Наконец, полимерные дисперсии с гидроксильными группами на поверхности могут быть получены исходя из амидсодержащих суспензий путем реакции гидроксиметилирования[2,144].

Полимерные суспензии с аминогруппами на поверхности частиц могут быть легко активированы путём реакции с различными дифункциональными соединениями, вследствие высокой реакционной способности первичных аминогрупп.

Наибольшее распространение получил метод активации при помощи глутарового альдегида, что связано как с легкостью проведения реакции активации, так и сдоступностью самого реактива. Изучение реакции показало [85,86,87], что первичная аминогруппа взаимодействует с глутаровым альдегидом по схеме:

Хотя метод является весьма простым, однако в процессе активации наблюдается заметная агрегация полимерных микросфер вследствие их сшивания.

Вместо глутарового альдегида могут быть использованы также и другие дифункциональные соединения: 1,5-дифтор 2,4-динитробензол, 4,4'-дифтор 3,3'-динитрофенилсульфон, 2,4-дихлор 6-карбоксиметилсульфон [. Недостатками этих методов является высокая стоимость реагентов, а также длительное время проведения реакции ковалентного связывания функциональных групп с биомолекулами (4-7 дней)². В тоже время указанные методы дают более воспроизводимые результаты по свойствам тест-систем, чем наблюдаемые при использовании глутарового альдегида, свойства которого определяются условиями и сроком его хранения (возможно протекание полимеризации).

Таким образом, приведенные выше данные показывают, что при синтезе функциональных полимерных суспензий, пригодных для иммунодиагностических исследований, основным этапом является реакция гетерофазной полимеризации. Выбор условий ее проведения определяет стабильность суспензий, диаметр частиц и их распределение по размерам. Функциональные группы на поверхности микросфер получают как в процессе синтеза, так и путем модификации полученных полимерных суспензий.

1.3 Принципы модификации полимерных микросфер полупроводниковыми флуоресцентными нанокристаллами

Существует ряд принципиально различающихся принципов формирования композиционных материалов на основе высокомолекулярных соединений и КТ. Основными из них являются: синтез макромолекул, как правило, относящихся к классу полимерных щеток, с привитыми (трансплантированными) КТ; создание монолитной трехмерной полимерной матрицы, интерколированной КТ; модификация природных полимеров, например, белков и полинуклеотидов, путем образования ковалентных или электростатических связей с КТ и, безусловно, использование полимерных микрочастиц, в качестве платформы для иммобилизации на их поверхности КТ. Все указанные пути создания композиционных материалов на основе полимеров и КТ предназначены для обеспечения реализации в максимальной степени преимуществ каждого из этих компонентов. Функция полимера не ограничивается только выполнением роли "носителя" и стабилизатора КТ, но и обеспечивает специфическое взаимодействие созданного материала с тестируемым объектом. КТ, сконцентрированные и закрепленные в пространстве благодаря физическим свойствам макромолекул, обеспечивают высокий квантовый выход, например, преобразованного электромагнитного излучения, что позволяет повысить чувствительность методов определения локализации КТ в исследуемой системе и получить информацию о физико-химических характеристиках микроокружении КТ.

Развитие передовых методов исследования закономерностей протекания различных химических реакций, включая биохимические как invivo, так иinvitro, основано на использование флуоресцентных зондов. Отличительной особенностью таких объектов должна быть их высокая химическая и физико-химическая стабильность, компактность и высокий квантовый выход сигнала. Такими характеристиками обладают наноразмерные частицы полупроводниковых материалов, например, сульфиды переходных металлов. Такие частицы, представляющие собой КТ имеют значительно большую эффективность в квантовых переходах относительно традиционных флуорофоров, являющихся органическими красителями или флуоресцентными белками. Появление доступных флуоресцентных зондов, основанных на КТ, может обеспечить выполнение прорывных научно-исследовательских и диагностических работ во многих научных областях [1A-5A], включая секвенирование ДНК, профилирование генов, визуализация эволюции биологических молекул в реальном времени, фундаментальные биофизические исследования перераспределения энергии и вещества на клеточном уровне в сложных живых организмах.

Флуоресцентные зонды, построенные на КТ, характеризующиеся повышенной яркостью и мультиплексированными возможностями необходимы для анализа особенностей строения и поведения отдельных молекул в диагностике и исследовании закономерностей развития сложных заболеваний человека. Трудность проведения которых обусловлена наличием небольшого количества измененных генов и белков на фоне большого числа объектов нативного строения (например, в случаях исследования рака и атеросклероза) [6A-10A].

КТ, кроме всего, могут служить основой для конструирования сложных зондовых систем, обладающих возможностью одновременного возбуждения (эмиссии) нескольких типов квантов (нескольких длин волн, обеспечивающих различный цвет свечения) при использовании одного источника возбуждающего электромагнитного излучения. При этом исходящий электромагнитный поток отличается минимальным спектральным перекрытием между смежными цветами и замечательной фотостабильностью [11A-13A] относительно синтетических органических флуорофоров.

В работах представлены результаты создания таких систем в области: иммунодиагностики[15,49]; сенсорных систем [19-22] [23-25]. Использование органических полимерных материалов в качестве носителей КТ, во многом, определяется несколькими факторами. Во-первых, полимерные цепи отличаются высоким разнообразием конформационных состояний (гибкостью, способностью к изменению формы) и фазовых состояний от молекулярного раствора до многофазных макрообъектов. Во-вторых, макромолекулы могут содержать разнообразные функциональные группы, которые способны эффективно образовывать с наночастицами и их прекурсорами (в процессе синтеза КТ в присутствие полимера) дисперсионные или ван-дер-Ваальсовы, электростатические, водородные или ковалентные связи. Такие возможности образования различных типов химических связей определяется химическим составом макромолекулярной цепи. Например, гомополимеры, сополимеры и блок-сополимеры могут быть синтезированы из нескольких мономеров и мономерных смесей различной природы. Кроме того, полимерная цепь, характеризующаяся возможностью варьирования ее длины и многочисленных комбинации последовательности остатков мономеров, составляющих полимерные носители, могут быть "настроены", чтобы оптимизировать архитектуру создаваемого композиционного материала.

Возможность управления архитектурой (атомным строением) гибридной фазы, позволяет разработать полимерные материалы с контролируемыми гидрофильными/гидрофобными свойствами, положительным или отрицательным зарядом, рН или термочувствительные сенсоры, с высоким удельным сопротивлением или проводимостью.

КТ, представляющие собой дисперсию сульфидов или оксидов переходных металлов, как известно [Адамс], характеризуются высокой поверхностной свободной энергией, что обуславливают высокую вероятность их агломерации[66].

В работе [80] предложена методика синтеза и представлены результаты исследования свойств композиционных полимер-КТ микросфер. В качестве полимерного носителя авторами выбран полистирол, поверхность которого модифицирована поли-2-метилпропеноилоксиэтилтриметил хлоридом. Таким образом, полимерным носителем КТ в этом случае являются полимерные микросферы, имеющие строение типа ядро/оболочка. Полистирольное ядро покрыто слоем, сформированным из полиэлектролитных щеток, дополнительно сшитых N,N-метиленбисакриламидом. Полученная полиэлектролитная оболочка полимерной частицы обеспечивает эффективное удерживание КТ на поверхности микросферы благодаря электростатическим взаимодействиям. Авторы указывают, что путем изменения плотности прививки полиэлектролитных цепей поли-2-метилпропеноилоксиэтилтриметл хлоридом и рН реакционной системы можно контролировать число иммобилизированных на поверхности полимерной микросферы число КТ. Аналогичные результаты получены при использовании в качестве катионного полиэлектролита, формирующего оболочку на поверхности полистирольных микросфер, поли-2-диэтиламиноэтилметакрилата[83].

Другим примером, системы построенный по принципу полимерного носителя, характеризующегося строением типа ядро/оболочка, с иммобилизированными на его поверхности КТ, являются полистирольные микросферы, покрытые слоем полипиррола[15], рис.1.

В этой работе показано, что эффективность иммобилизация КТ на поверхности полимерного носителя зависит от химической модификации производного пиррола, используемого - материала оболочки носителя. Возможность получения на поверхности полимерных микросфер нормированного количества как амино-, так карбоксильных групп, открывает возможность закрепление на их поверхности дополнительно к КТ и биолиганды. Последнее свойство рассматриваемой системы необходимо для осуществления конструирования сенсорных тест систем, построенных на фиксации иммунологических реакций.

Для ковалентного присоединения белков, а именно, иммуноглобулинов различного строения, наибольшую эффективность проявил N-сукцинимидиловый эфир пиррола. Введение в водную дисперсию модифицированных полимерных микросфер раствора антител, соответствующего использованному иммуноглобулину для модификации полимерного носителя привело к лавинообразному процессуфлокуляции полимерных частиц во всем объеме тест пробы. Этот процесс можно фиксировать визуально благодаря размеру использованных микросфер. Диаметр которых мог изменяться в пределах 0,5 - 1,5 мкм, в зависимости от выбранного образца первоначально синтезированных полистирольных частиц. По мнению авторов, это может указывает на то, что, несмотря на возможность конформационных изменений полипептидной цепи иммуноглобулина в результате ковалентного связывания их с поверхностью полимерных частиц, биомакромолекулы сохраняют свою биологическую активность. Аминопроизводные пиролла для создания оболочки на полистирольных микросферах были использованы в работах[93] [95] [96] [28].

Существуют указания [94] на то, что можно использовать карбоксилированный пиролл для получения полимерной оболчки на поверхности полистирольной микросферы. Обогащение межфазной поверхности полимерный носитель - водная среда, позволяет иммобилизовать на ней иммуноглобулины с различной изоэлектрической точкой. А так же, КТ, полученные в различных условиях, то есть, полученных при избытке катионов или анионов, входящих в их состав. Так избыток ионов Cd²⁺ при синтезе КТ обеспечивает положительный заряд, а - S^-2 - отрицательный заряд этих наночастиц.

Регулирование мольного соотношения пиролла и функционализированного пиролла (амино или карбокси) можно заранее прогнозировать количество КТ способных иммобилизироваться на поверхности полимерных микросфер [197]. Безусловно, это возможно осуществить только при строгом контроле значения рН в реакционной смеси и выборе КТ, характеризующихся подходящим зарядом. Должно существовать строгое соответствие между значением рН, типом КТ и видом модификации пиролла. КТ, характеризующиеся отрицательным зарядом можно эффективно иммобилизировать на поверхности полимерного носителя, содержащего аминированный пиролл при значениях рН водной фазы ниже 4-5. И наоборот, положительно заряженные КТ можно в контролируемом режиме закрепить на поверхности полимерных частиц при использовании карбоксилированного пиролла и рН выше 7.

Рис. 1.3.1 Схема построения полимерного носителя имеющего строение ядро/оболочка, способного иммобилизировать на межфазной границе КТ [15].

Значительное число современных методов синтеза флуоресцентных зондов основанных на КТ требуют использования полимерного носителя (платформы) для них [19A-27A]. Это связано с необходимостью обеспечения агрегативной устойчивости КТ на всех этапах производства и применения такого рода материала. Кроме этого, использование полимерного носителя, который обеспечивает сохранение высокой концентрации КТ в небольшом локальном объеме, позволяет повысить эффективность регистрации местоположения зонда. Применяемый полимер создает микрочастицу с размером, порядка, 0,1 мкм и содержанием КТ, примерно, 10⁵ штук. Необходимым условием высокой эффективности данного типа зондов, является сохранение равномерного распределения КТ в объеме полимерной матрицы. Воспроизводимость результатов применения флуоресцентных зондов в большой степени зависит от ширины распределения полимерных частиц по размерам. Чем уже это распределение, тем выше чувствительность и селективность использованных зондов.

В работах [27A, 32А] указывается преимущества использования блок-сополимеров на основе окиси этилена и другого гидрофобного мономера при конструировании полимерной матрицы предназначенной для иммобилизации КТ. Образование мицеллоподобных частиц на основе таких блок-сополимеров способны сохранять квантово-химические свойства КТ. Поскольку качественные КТ (полученного в органическом растворителе при повышенных температурах), как правило, имеют гидрофобную поверхность и сосредотачиваются в углеводородном (гидрофобном) ядре частицы, образуемой полимерной цепью блок-сополимера. При этом все частицы сохраняют свою индивидуальность, то есть, отсутствует процесс их коагуляции при концентрировании.

...