Из графика, представленного выше, отчётливо видно, что наибольшего значения молекулярная масса образующегося полимера достигает в среде трет-бутилового спирта, в то время как для ряда метанол-этанол наблюдается монотонная зависимость. Это объясняется тем, что трет-бутанол, по сравнению с метанолом, этанолом и изопропанолом, является плохим передатчиком цепи.

3.2.1.1 Влияние объёмного соотношения мономер/растворитель на конечный диаметр полистирольных частиц

Для получения полимерных суспензий с диаметрами частиц в интервале размеров от 2 до 6 мк с узким распределением по размерам, было изучено влияние объёмного соотношения мономер/растворитель на эти характеристики полимерной суспензии. Полученные результаты приведены в таблице 3.2.1.1.1

Таблица 3.2.1.1.1. Эффективный диапазон проведения дисперсионной полимеризации стирола в спиртовых средах.

	Метанол	Этанол	Изопропанол	Трет-бутанол
Концентрация мономера, %об	d, мкм	P	d, мкм	P	d, мкм	P	d, мкм	P
20	1,10	1,017	1,70	1,013	2,20	1,017	2,60	1,018
25	1,30	1,017	1,90	1,015	2,50	1,018	3,43	1,016
35	1,60	1,018	2,60	1,020	3,0	1,011	4,00	1,013
40	2,31	1,018	3,20	1,013	3,60	1,014	5,20	1,010

Исследования проводились в пределах концентраций мономера от 20 до 40% (объёмных). Вне данного диапазона проведение полимеризации нецелесообразно по нескольким причинам:

При концентрации мономера <20%

А) При проведении полимеризации мономеров в метаноле и этаноле, образующиеся частицы имели недостаточный размер даже при проведении процесса до глубоких степеней конверсии.

Б) При проведении полимеризации в изопропаноле и трет-бутаноле значения показателя полидисперсности полученных дисперсий не удовлетворяли требованиям, предъявляемым к микросферам для дальнейшего их использования.

В) Проведение полимеризации мономеров при низком содержании мономера нецелесообразно и по экономическим причинам, т.к. существует необходимость в высоком выходе продукта.

При концентрации мономера >40%

А) При проведении полимеризации мономеров в метаноле и этаноле наблюдалось значительное увеличение полидисперсности.

Б) При проведении полимеризации мономеров в изопропаноле и трет-бутаноле при превышении 40% концентрации мономера наблюдалась вторичная нуклеация частиц на поздних стадиях процесса. Это приводило к бимодальному распределению частиц по размерам.

На рис. 3.2.1.1.1 - 3.2.1.1.4. представлены зависимости среднего диаметра полимерной дисперсии от объёмной концентрации мономера в реакционной системе для каждого растворителя, применяемого в исследовании.

Таким образом, эффективным диапазоном концентраций мономера является интервал от 20 до 40% объёмных. В этом интервале концентраций мономера были получены полимерные суспензии с диаметрами частиц от 1 до 5мк, использованные в дальнейшем в качестве затравочных при синтезе частиц большего размера.

Рис.3.2.1.1.1.Зависимость среднего диаметра микросфер от объёмной концентрации мономера при проведении полимеризации в среде метанола



Рис.3.2.1.1.2. Зависимость среднего диаметра микросфер от объёмной концентрации мономера при проведении полимеризации в среде этанола

Рис.3.2.1.1.3. Зависимость среднего диаметра микросфер от объёмной концентрации мономера при проведении полимеризации в среде изопропанола



Рис.3.2.1.1.4. Зависимость среднего диаметра микросфер от объёмной концентрации мономера при проведении полимеризации в средетрет-бутанола

3.2.1.2 Влияние температурного профиля на процесс полимеризации и свойства конечной дисперсии

В процессе работы было исследовано, влияние на процесс дисперсионной полимеризации, а, следовательно, и на свойства получаемой дисперсии интенсивности и длительности нагрева реакционной смеси до температуры полимеризации. При этом весь процесс полимеризации делили на определённое количество стадий, отличающихся температурой проведения процесса. Было обнаружено, что изменяя количество стадий, температурные параметры проведения процесса, можно в значительной степени влиять на диаметр полимерных микросфер и их распределение по размерам. Совокупность данных факторов можно объединить в т.н. "температурный профиль полимеризации".

Программируемый термокриостат JulaboCF41 посредством программного обеспечения (EasyTemp) позволяет пошагово контролировать температурный профиль полимеризации, а именно:

1. Количество стационарных точек, т.е. число ступеней, соответствующих изменению температуры в реакторе.

2. Интенсивность нагрева

3. Длительность поддержания заданной температуры

Влияние температурного профиля исследовали на примере модельной дисп. полимеризации стирола в трет-бутиловом и этиловом спирте при объёмной концентрации мономерной фазы, лежащей в нижнем и верхнем пределе эффективного диапазона концентраций (20 и 40% соответственно).

За начало отсчёта времени полимеризации берётся момент введения мономерной фазы в дисперсионную среду, содержащую стабилизатор. Этому моменту соответствует достижение температуры в реакторе, равной 50^оС. Данное действие продиктовано целью максимально использовать эффективный распад инициатора и избежать преждевременного инициирования на стадии, предшествующей моменту нуклеации. Это позволяет максимально нивелировать возмущения, вносимые инициирующими радикалами в протекание стадии образования полимерной цепи и её роста с момента инициирования до потери ею растворимости и выпадения в дисперсионную среду.

Представляло интерес оценить влияние интенсивности и времени нагрева реакционной системы на кинетику изменения диаметров частиц и их распределения по размерам в течение стадии формирования дисперсной системы. Считая, что начальная стадия полимеризации оказывает определяющее влияние на дисперсный состав конечной полимерной суспензии, было принято решение провести полимеризацию при двух различных температурных профилях. Профиль№1 отличается от профиля №2 количеством ступеней, характеризующих изменения температуры процесса полимеризации, длительностью и характером роста температуры на начальной стадии процесса.

Влияние каждого профиля на кинетику процесса, размеры частиц и распределение их по размерам показано ниже на примере дисперсионной полимеризации стирола в этаноле и трет-бутаноле.



Рис. 3.2.1.2.1.Температурный профиль дисперсионной полимеризации стирола в среде этанола и трет-бутанола при прочих равных условиях. (№1).

Рис.3.2.1.2.2. Кинетика дисперсионной полимеризации стирола в среде трет-бутанола при различной концентрации мономера, профиль 1. а- 40%, б-20%.



Рис 3.2.1.2.3. Кинетика дисперсионной полимеризации стирола в среде этанола при различной концентрации мономера. Профиль 1

Рис. 3.2.1.2.4. Характеристики частиц, полученных при проведении дисперсионной полимеризации по профилю №1 при концентрации мономера 40% об. а) в среде трет-бутанола, б) в среде этанола.

Рис. 3.2.1.2.5. Температурный профиль дисперсионной полимеризации стирола в среде этанола и трет-бутанола при прочих равных условиях. (№2).

Рис 3.2.1.2.6. Кинетика дисперсионной полимеризации стирола в среде трет-бутанола, профиль 2



Рис 3.2.1.2.7. Кинетика дисперсионной полимеризации стирола в среде трет-бутанола, профиль 2

Рис.3.2.1.2.8. Микрофотографии полимерных дисперсий, полученных при полимеризации стирола в А) трет-бутаноле, Б) - этаноле.

Полученные результаты показали, что природа растворителя практически не влияет на кинетические закономерности протекания процесса при выбранном температурном профиле. Кинетические кривые имеют общий вид для всего ряда растворителей (метанол-трет-бутанол), Меняется только конечный диаметр частиц и их распределение по размерам.

3.2.2 Дисперсионная полимеризация глицидилметакрилата

Дисперсионную полимеризацию глицидилметакрилата проводили в среде этанола с использованием ДАК в качестве инициатора, диоктилсульфосукцината натрия (АОТ) и поли-N-винилпирролидона в качестве стабилизаторов, и воды как регулятора дисперсности образующейся полимерной суспензии.

На протяжении всей серии опытов концентрация мономера, установленная экспериментальным путём, оставалась постоянной; равно как и общий объем реакционной смеси.

Рис. 3.2.2.1. Схема проведения дисперсионной полимеризации глицидилметакрилата

Таблица 3.2.2.1. Рецептура дисперсионной полимеризации глицидилметакрилата

Вещество	Навеска
1. ГМА	20 мл
2. ПВП К-30	2,8 г
3.Диоктилсульфосукцинат натрия (АОТ)	2,6 г
4. Спирт	75 мл
5.Вода	От 0 до 5 об.%
6.Динитрил азо-бис изомасляной кислоты (ДАК)	От 0,1 до 0,3 г

1. 1. В круглодонном реакторе в спирте одновременно растворяются ПВП, АОТ, ДАК и вода до гомогенного раствора. Температура процесса 40 С. Нагрев применяется для ускорения растворения компонентов.

2. После полного растворения компонентов системы, температура поднимается до 50 ^оС. При этой температуре в реакционную среду вводится мономер. Это делается с целью предотвращения преждевременной нуклеации.

3. После полного растворения мономера температура поднимается до 67 С согласно температурному профилю со скоростью 0,5 С/мин и удерживается при этом значении 1 час. При этом необходимо тщательно следить за моментом и температурой нуклеации. При нуклеации прозрачная гомогенная реакционная смесь начинает опалесцировать и со временем становится молочно-белой вследствие образования полимерной фазы.

С момента нуклеации течение полимеризации зависит от температурного профиля проведения процесса. Варьируя количество стационарных температурных точек, можно в значительной степени влиять на дисперсный состав конечной дисперсии. По истечении второго часа полимеризации температура поднимается до 72 ?С и удерживается на этом уровне в течение всего оставшегося времени полимеризации. Общее время полимеризации - 3 часа с момента нуклеации.

Температура нуклеации является важным параметром процесса и позволяет приближенно оценить конечный диаметр полученных микросфер.

Таблица 3.2.2.2. Дисперсионная полимеризация ГМА

В таблице 3.2.2.2. представлена серия опытов по проведению дисперсионной полимеризации глицедилметакрилата. Начало исследованиям положил первый опыт по известной ранее рецептуре. Полученные частицы не соответствовали требованиям к размеру и полидисперсности. Были предприняты попытки скорректировать размер использованием некоторых количеств воды, однако это приводило к уширению РЧР. Далее был проведён опыт с уменьшенным количеством инициатора ДАК (1% вместо 1,5% к мономерной фазе), что помогло уменьшить размер частиц до 2,5 мкм.

Одновременно с этим было зафиксировано время нагрева реакционной смеси до температуры, соответствующей температуре полураспада за 6 часов (для ДАК это 67^оС), что позволило добиться воспроизводимости опытов (ранее имело место отсутствие корреляции между опытами). Опыты с количествами инициаторов менее 1% масс.для ДАК и соответствующими по молям количествами других инициаторов (перекись бензоила и Luperox) позволили нам получить частицы меньшего размера (1-1,5 мкм) с узким РЧР. Наконец, альтернативным способом получения 2,5-мкм частиц пГМА была последняя рецептура с несколько иным подходом к регулированию размера частиц: использовалось повышенное количество воды (1:1 к этанолу), большее количество стабилизатора ПВП и инициатора ДАК. Однако РЧР данных частиц оказалось шире, и для дальнейших модификаций использовалась рецептура, приведённая в таблице 3.2.2.1.

Таблица 3.2.2.3. Дисперсионная полимеризация стирола и используемые температурные профили

Номер опыта (T-butanol+Styrene+H2O,мл)	Диаметр мкм	РЧР мкм	Профиль температур	Выход %	Комментарии
AS1/104 (1100+425+100)	3,43		3
AS1/12 (1100+400+20)	4,5	0,55	1		Вторичная нуклеация
AS1/113 (1100+400+35)	3,9	0,51	2	80
AS1/38 (1100+400+50)	3,8	0,51	1
AS1/123 (1100+400+50)	2,92	0,41	5
AS1/43 (1100+400+70)	3,3	0,4	1
AS1/13 (1100+400+80)	3,24	0,41	1
AS1/14 (1100+400+100)	3,16	0,4	1	84	Вторичн. нуклеация
AS1/99 (1100+400+100)	2,47	0,28	5	50
AS1/101 (1100+400+100)	2,85	0,2	5	32	AIBN 4,5%, Втор. нуклеация
AS1/109 (1100+400+100)	2,1	0,26	6
AS1/112 (1100+400+100)	1,85	0,24	7	60
AS1/121 (1100+400+100)	1,78	0,28	8
AS1/126 (1100+400+115)	-		8		Полидисперсность
AS1/15 (1100+400+130)	-		1		Коагуляция
AS1/34 (1100+375+40)	3,38		1
AS1/36 (2200+750+80)	3,33	0,4	1		AS1/34 повторение
AS1/65 (1050+350+10)	3,82	0,48	2
AS1/49 (1100+350+0)	3,5	0,4	2	71,5
AS1/44 (1100+350+0)	3,4	0,41	1
AS1/86 (550+175+8)	3,18	0,48	3		AIBN 4,5%, 2л реактор
AS1/78 (1100+350+25)	2,47	0,31	3
AS1/82 (1100+350+25)	2,46	0,31	3	70	Пол-я при 72 С 2 часа
AS1/93 (1100+350+25)	2,51		3		AIBN Fluka 3%
AS1/83 (1100+350+25)	2,93	0,43	3	85	AIBN 4,5%
AS1/87 (1100+350+25)	3,56	0,57	3	72	AIBN 6%
AS1/33 (1100+350+40)	3,25	0,38	1
AS1/81 (1100+350+50)	2,43	0,3	3
AS1/32 (1100+350+60)	3,11	0,41	1
AS1/67 (1100+350+60)	3,06	0,4	2
AS1/17 (1100+350+80)	2,93	0,42	1
AS1/18 (1100+350+80)	2,99	0,36	1
AS1/19 (1100+350+80)	2,99	0,43	1
AS1/69 (1100+350+80)	2,97	0,42	2
AS1/74 (1100+350+80)	2,83	0,37	2		Окончание при 73 С
AS1/88 (1100+350+80)	2,68	0,39	4
AS1/46 (750+239+10)	-		1		Вторичная нуклеация
AS1/47 (750+239+7)	-		1		Вторичная нуклеация
AS1/16 (1100+300+80)	2,42	0,3	1
Номер опыта (i-Propanol+Styrene+H2O, мл)	Диаметр мкм	РЧР мкм	Профиль температур	Выход, %	Комментарии
AS1/128 (500+150+200)	1,48	0,11	2	78
AS1/135 (2000+720+800)	1,51	0,12	2		AS1/128 x4
AS1/132 (500+180+200)	1,82	0,22	2

Температурные профили (Температура, °C Время, мин)

1	2	3	4	5	6	7	8
50-67 30	50-67 30	50-67 60	50-70 20	40-67 60	40-67 30	30-67 30	21-67 60
67 60	67 60	67 60	70 60	67 60	67 60	67 60	67 60
67-70 7	67-70 7	67-70 7	70-72 7	67-70 7	67-70 7	67-70 7	67-70 7
70 60	70 60	70 60	72 60	70 60	70 60	70 60	70 60
70-72 7	70-72 7	70-72 7	72-74 7	70-72 7	70-72 7	70-72 7	70-72 7
72 60	72 60	72 300	74 300	72 240	72 60	72 60	72 60
72-74 7	72-74 7				72-74 7	72-74 7	72-74 7
74 60	74 240				74 240	74 240	74 240
74-76 7
76 120

В таблице 3.2.2.3 показаны результаты опытов по проведению дисперсионной полимеризации стирола в среде трет-бутанола и изо-пропанола. Из них следует некая зависимость размера полимерных микросфер и их полидисперсности от применяемого температурного профиля. Также серия данных опытов доказывает важность регулирования температуры именно на стадии нуклеации; на завершающих стадиях полимеризации изменения в температурном профиле не вносят существенных изменений в конечные параметры частиц. Эти данные соответствовали результатам, приведённым ранее при обсуждении результатов по полимеризации стирола.

Таким образом, увеличение времени нагрева от момента загрузки до начала нуклеации, равно как и понижение температуры загрузки мономера, приводит к уменьшению среднего диаметра частиц и их полидисперсности. Идея использования программируемого температурного профиля состоит в том, чтобы контролировать протекание множества зависимых от температуры процессов, имеющих место в ходе дисперсионной полимеризации: скорость образования первичных частиц, скорость полимеризации в ПМЧ, скорость образования олигомерных цепей в непрерывной фазе, интенсивность поглощения первичными частицами олигомерных цепей, осаждённых из непрерывной фазы. Ранее процесс проводился с максимальной скоростью нагрева реакционной смеси, что приводит к положительным результатам лишь тогда, когда состав рецептуры тому не препятствует. Таким образом, если температура повышается слишком интенсивно, первичные частицы образуются слишком рано, соответственно, их начальный размер слишком мал; процесс полимеризации в ПМЧ идёт очень интенсивно, а система склонна к образованию агрегатов частиц, т.н. "вторичных частиц" (высокодисперсных частиц). Результат их образования можно наблюдать на фото ниже:

Рис.3.2.2.2. Микрофотография пГМА микросфер при вторичной нуклеации

Наоборот, при плавном регулировании температуры во время нуклеации процесс дисперсионной полимеризации протекает без образования "вторичных частиц", процесс становится полностью воспроизводимым от опыта к опыту. Удовлетворительный результат проведенной дисперсионной полимеризации показан на фото ниже. Частицы монодисперсны, распределение по размерам унимодальное.

Рис.3.2.2.3Микрофотография монодисперсныхпГМА микросфер

Интересно отметить и влияние количества инициатора на конечный размер частиц и их полидисперсность. С повышением концентрации инициатора размер частиц повышается, так же повышается их полидисперсность и склонность к вторичной нуклеации (при фиксированном температурном профиле). Итак, с целью регулирования размеров частиц было решено использовать изменения в концентрации инициатора, а не добавление некоторых количеств воды. Полимеризация частиц, которые в дальнейшем использовались в модификациях, проводилась в среде чистого этанола.

Таким образом, был зафиксирован важнейший параметр при проведении дисперсионной полимеризации - температура, а сам процесс проводился с применением программируемого температурного профиля. Была найдена оптимальная рецептура синтеза, отвечающая следующим характеристикам микросфер: размер - 2,5 мкм (см. подробнее п.3.2), РЧР - наиболее узкое (ширина пика не более 15% от ср. диаметра частиц).

3.3 Затравочная полимеризация

3.3.1 Затравочная полимеризация глицидилметакрилата

Затравочную сополимеризацию глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата проводили в присутствии ПГМА затравочных частиц со средним диаметром 2,5 мкм, в присутствии пероксида бензоила в качестве инициатора с соотношением мономерной фазы к полимерной 1:8.

Стоит отметить, что целевой диаметр полимерных микросфер составляет 5 мкм. Это обусловлено, прежде всего, размером эритроцитов, ведь их аналогами при проведении реакции латекс-агглютинации и являются синтезируемые частицы. Кроме того, ПГМА-микросферы того же размера седиментируют со схожей с эритроцитами скоростью.

Рис.3.3.1.1. Схема проведения затравочной полимеризации.

Технологически частицы данного размера возможно получить различными способами. Можно использовать рецептуру одностадийного синтеза дисперсионной полимеризацией частиц размера 5 мкм, но в таком случае любые манипуляции с микросферами в агрессивных средах приведут к разрушению нативной структуры полимера, сделав невозможным проведение довольно большого количества необходимых полимераналогичных реакций. Также с увеличением размера будет в значительной степени повышаться полидисперсность частиц.

Гораздо рациональнее использовать затравочную полимеризацию в предварительно набухших пГМА-микросферах. Это даёт возможность варьировать соотношение мономерной и полимерной фазы, регулируя тем самым степень набухания и конечный размер, использовать сшиватели для придания стойкости частицам к воздействиям агрессивных сред, использовать добавки к мономерной фазе (пигменты, флуоресцентные метки, модифицирующие агенты, другие мономеры и т.д.). Кроме того, при правильно подобранном соотношении мономерная фаза: полимерная фаза частицы сохранят монодисперсность; их РЧР будет уже, чем при использовании только дисперсионной полимеризации.

Была проведена серия опытов по определению оптимального соотношения мономер: полимер. Дело в том, что без использования специальных добавок, набухаемость полимера в растворителях весьма ограничена, а при слишком низких соотношениях мономер/полимер степень сшивки будет недостаточной, и стадия затравочной полимеризации не приведёт к желаемому эффекту.

Для определения верхней границы набухаемости достаточно было наблюдать результат в световой микроскоп: появляется полидисперсность, образование частиц начинает происходить не за счёт набухших мономере затравочных частиц, а за счёт стабилизации капель мономера в водной фазе, а также коалесценции ПМЧ. Нижняя граница набухаемости была определена посредством помещения заполимеризованных частиц в сильный растворитель - дихлорметан. При недостаточном количестве мономерной фазы даже при использовании значительной части сшивателя (ЭГДМА) частицы всё равно растворялись.

Таблица 3.3.1.1.. Результат исследования степени набухания 2,5-мкм затравочных ПГМА частиц в мономерной фазе состава 90% ГМА-10% ЭГДМА

Согласно формуле, соответствующей в идеале полному набуханию мономера в полимере

М : П=n³-1, где n=d_к/d_н,

было выбрано соотношение мономерной фазы к полимерной, равное 7:1. По данной формуле такое соотношение фаз приводит к увеличению частиц в 2 раза в ходе затравочной полимеризации, при этом достигается оптимальная структура микросфер.

Итак, если цель - получение 5-мкм микросфер, затравочные частицы должны быть диаметром 2,5-мкм.

Таблица 3.3.1.2. Рецептура затравочной полимеризации на ПГМА-частицах

Вещество	Навеска
1. Затравочные ПГМА микросферы	5 г
2. 1% раствор ПВС в воде	500 мл
3.ГМА+ЭГДМА	40 г
4. Перекись бензоила (75%)	0,4 г

1. В реактор загружается водная затравочная суспензия в 1% растворе ПВС.

2. Параллельно в мономерной фазе растворяется инициатор

3. Полученная смесь вводится в реактор

4. Проводится набухание затравочных ПГМА частиц мономером в течение 30 минут при температуре 50 ^оС

5. После этого температура в реакторе поднимается до 80 ^oС. С этого момента ведется отсчет времени полимеризации.

Полимеризацию ведут 2 часа при температуре 80 ^oС. По истечении указанного времени процесс прекращают.

Рис. 3.3.1.2. Результаты исследования образца методом динамического светорассеяния

Выше показаны результаты определения размера частиц по окончании затравочной полимеризации методом динамического светорассеяния.

Одной из важнейших задач, в процессе получения полимерных суспензий является удаление из их объема остаточного мономера. Присутствие остаточного мономера негативно отражается на устойчивости полимерных суспензий при хранении, и при иммобилизации биолигандов на поверхность частиц.

Конечный размер частиц позволяет далее при очистке не использовать центрифугирование, а промывать их на фильтре Шота мелкой пористости (Por.3 марки SchottDuran). Стоит отметить, что остаточный мономер и олигомеры хорошо удаляются водой при использовании системы ГМА-ЭГДМА.

Для определения остаточного мономера в объеме полимерной суспензии использовали спектрофотометрический метод. Суть его заключается в отгонке мономеров из пробы полимерной суспензии с метанолом (содержащим n-трет-бутилпирокатехин для предотвращения полимеризации мономера) и определение мономера в отгоне по поглощению света с длиной волны 282 ± 3 нм.

Удаление остаточного мономера в частицах после проведения затравочной полимеризации производится промыванием на фильтре Шота избытком деионизованной воды после предварительного центрифугирования. В отличие от микросфер состава полистирол-полидивинилбензол, не требуется экстракция остаточного мономера и олигомеров органическими растворителями, поскольку ГМА довольно гидрофилен, так что промывки водой частиц вполне достаточно. В экспериментальных целях проводилась экстракция ПГМА микросфер дихлорметаном после предварительной очистки водой, и по результатам анализа состава экстрагента олигомеров не было обнаружено.

3.3.2 Анализ наличия функциональных групп

Для подтверждения наличия функциональных групп в полимерных микросферах использовался элементный анализ и ИК-спектроскопия. Данные элементного анализа (выраженные в % масс.) были интерпретированы в степень конверсии по отношению к мономерным звеньям таким образом, что при модификации 100% мономерных звеньев степень модификации будет 100%.

Данные элементного анализа. Сигнал элементного анализа о наличии азота является достаточным доказательством присутствия аминогрупп в искомом образце, притом первичных и вторичных аминогрупп при простой модификации готовых пГМА частиц будет поровну (одна аминогруппа диамина взаимодействует с глицидильной группой пГМА цепи, вторая остаётся свободной).

Таблица 3.3.2.1.. Данные элементного анализа

Для сравнения был взят образец хлорметилированных-аминированных полистирольных частиц. Как видно из таблицы, аминированиепГМА микросфер протекает с достаточно высокой конверсией, причём с увеличением сшивки степень превращения несколько снижается, однако по функциональности аминированныеп(ГМА-ЭГДМА) частицы могут конкурировать с полистирольными хлорметилированнымиаминированными.

Данные ИК-спектроскопии.

ИК-спектры в диффузно рассеянном свете (образец+KBr):

GMA-25%EGDMA, oxy

GMA-5%EGDMA, MN-NH2

PSt, 4%DVB, CM, EDA-ECH

GMA, 25%EGDMA, EDA-ECH

Для анализа наличия функциональных групп в образцах была проведена ИК-спектроскопия. Группы, содержащие кислород, тяжело поддаются расшифровке при проведении элементного анализа, поскольку кислород содержат также молекулы ГМА и ЭГДМА.

По данным ИК-спектров, большое количество карбоксигрупп наблюдается при гидролизе пГМА с последующим окислением (GMA-25%EGDMA, oxy). Отчётливо выделяется пик в диапазоне 1700-1800 cm^-1, соответствующий карбоксильным соединениям, который в сравнении с остальными образцами, синтезированными на основе ГМА-ЭГДМА (GMA-5%EGDMA, MN-NH2, GMA, 25%EGDMA, EDA-ECH), является наиболее интенсивным. Интересно отметить, что в других вариантах модификации пГМА микросфер данный пик присутствует, но его интенсивность несравнимо меньше, и сформирована в основном за счёт эфирных групп ГМА и ЭГДМА. Образец на основе полистирола (PSt, 4%DVB, CM, EDA-ECH), используемый нами как контроль, данного пика не содержал вообще.

Не удалось определить содержание аминогрупп, используя данные ИК-спектроскопии: для всех образцов в диапазоне 3700-3000 cm^-1наблюдается один большой пик, в котором накладываются CH, OHи NH-пики.

Наличие эпоксигрупп после модификации эпихлоргидрином было успешно выявлено пиками средней интенсивности антисимметричных валентных колебаний оксиранового кольца в диапазоне 865-750 cm^-1. Интересно отметить, что данный пик характерен как для образца модифицированного пГМА, так и для модифицированного пСт (GMA, 25%EGDMA, EDA-ECHи PSt, 4%DVB, CM, EDA-ECHсоответственно).пГМА образцы GMA-25%EGDMA, oxyи GMA-5%EGDMA, MN-NH2данного пика не содержали.

3.4 Затравочная полимеризация стирола

полимерный микросфера нанокристалл биотехнология

Был проведён синтез монодисперсных сшитых полимерных микросфер с диаметром порядка 5мкм с целью их дальнейшей модификации. Это позволяет получать на их основе полимерные микросферы с высокой плотностью ковалентно-связанных с поверхностью аминогрупп, что было необходимо для разработки целого ряда носителей биолигандов для РЛА.

Общая схема процесса представлена на рисунке 3.4.1.



Рис. 3.4.1. Схема проведения затравочной полимеризации.

Процесс проводился путём набухания линейных полистирольных микросфер смесью стирола и дивинилбензола, выступающего в роли сшивающего агента, по рецептуре, представленной в таблице 3.4.1.1. Выбор соотношения полимер/мономерная фаза продиктован широко известной формулой, описывающей набухание стирола в собственном мономере.

m=n³-1,

где n-кратность увеличения диаметра полимерной микросферы при набухании в мономере, m - показатель массы мономера, которую необходимо впитать частице, чтобы увеличить свой диаметр в n раз. Поскольку требовалось получить полимерную дисперсию со средним диаметром порядка 5мкм, было принято решение провести полимеризацию на затравочных частицах размером 2,5 мкм. В этом случае соотношение полимер:мономерная фаза составило 1:8, что укладывается в естественные пределы набухания полистирола.

Табл. 3.4.1.1. Рецептура проведения затравочной полимеризации стирола.

Вещество	Навеска
1. Затравочные ПСт микросферы	5 г
2. 2% раствор ПВС в воде	500 мл
3.Стирол	38 г
4. Перекись бензоила (75%)	0,4 г
5. Дивинилбензол 80% (DVB)	2г
Бихромат калия	0,5 г

1. В реактор загружается водная затравочная полимерная суспензия в 2% растворе поливинилового спирта (ПВС) и бихромата калия.

2. Параллельно в мономерной фазе растворяется инициатор

3. Мономерная фаза вводится в реактор

4. Проводится набухание затравочных полистирольных частиц мономером в течение двух часов минут при температуре 50 ^оС

5. После этого температура в реакторе поднимается до 80 ^oС. С этого момента ведется отсчет времени полимеризации.

Полимеризацию ведут 5 часов при температуре 80 ^oС. По истечении указанного времени процесс прекращают.

Полноту набухания затравочных частиц мономером контролировали с помощью светового микроскопа с нанесённой градуировочной шкалой.

На рисунке 3.4.1.1. представлены микрофотографии полученных полистирольных микросфер со степенью сшивки 4%.

Рис.3.4.1.1. Микрофотография сшитых полистирольных микросфер с d=5мкм, полученных методом затравочной полимеризации.

3.5 Модификация поверхности полимерных микросфер флуоресцентными нанокристаллами (КТ)

Полимерные микросферы могут содержать визуализурующие метки, в частности квантовые точки, которые определяют их применение в различных видах анализа с визуальной или инструментальной детекцией результатов биоспецифических реакций.

Квантовые точки (КТ) представляют собой полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы, размеры которых, как правило, находятся в диапазоне от 1 до 10 нм и состоят из атомов элементов, находящихся в II-VI (например, CdSe) или II-V (например, InP) группах периодической таблицы Д.И. Менделеева. Квантовые точки обладают фотостабильностью и высоким квантовым выходом и широко применяются в современных методах флуоресцентной визуализации и оптической диагностики, в частности для флуоресцентного анализа биологических образцов, исследования иммунохимических реакций, диагностики различных вирусных и инфекционных заболеваний и заболеваний сердечно-сосудистой системы, например, исследования кровеносного русла, состояния сосудов и капилляров.

Из литературы известно известны различные способы получения полимерных микросфер, содержащих квантовые точки, направленные на включение квантовых точек либо в объем полимерных микросфер, либо на локализацию на их поверхности. Такие способы основаны на: 1) набухании полимерных микросфер в растворителе и введении квантовых точек; 2) послойном осаждении квантовых точек на поверхность микросфер;

3) электростатическом взаимодействии; 4) непосредственном ковалентном присоединении квантовых точек; 5) включении квантовых точек в процессе синтеза полимерных микросфер.

Также известен способ включения квантовых точек в полистирольные микросферы в процессе эмульсионной полимеризации стирола. Однако, полученные полимерные микросферы характеризовались широким распределением по размерам и низкой интенсивностью флуоресценции.

Введение квантовых точек на стадии синтеза полимерных микросфер снижает их агрегативную устойчивость при хранении, что усложняет процесс их получения с заданным комплексом свойств. Кроме того, такой подход является трудоемким и малоэффективным.

В литературе описан также способ включения квантовых точек в полиакролеиновые и сополимерные (акролеин/стирол) микросферы путем их набухания в смеси растворителей пропанол-2/ хлороформ, содержащей квантовые точки [11].

Для этого функционализированные сополимерные (акролеин/стирол) микросферы, поочередно обрабатываются положительно заряженным полиэлектролитом, затем отрицательно заряженным полиэлектролитом, что приводит к формированию полиэлектролитного комплекса на поверхности микросфер, и после двукратного повторения процедуры последовательного осаждения полиэлектролитного комплекса в один или более слоев вводят квантовые точки [5].

В работе предложен оригинальный способ иммобилизации КТ на поверхность полимерных микросфер.

Методология этого процесса состояла в том, что готовят раствор квантовых точек в органическом растворителе, содержащем катионактивный ПАВ, представляющий собой соль четвертичного аммониевого основания, в количестве 1-2 % мас., таким образом, что концентрация квантовых точек в растворе составляет 0,1-1,0 г/л, к раствору добавляют полимерные микросферы при соотношении полимер: раствор квантовых точек, равном 1:1, полученную смесь подвергают ультразвуковой обработке, затем выдерживают в течение 2-6 часов при комнатной температуре и диспергируют в С ₂-С ₄-алифатическом спирте, содержащем катионактивный ПАВ, представляющий собой соль четвертичного аммониевого основания, взятый в количестве 1-2 % мас., выдерживают в течение 5-15 минут, затем центрифугируют для выделения образовавшегося осадка, состоящего из полимерных микросфер, содержащих квантовые точки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в качестве растворителя используются хлороформ, дихлорэтан стирол, толуол или метилметакрилат, в качестве С ₂-С ₄-алифатического спирта - этанол, в качестве катионактивного ПАВ - алкилдиметилэтилбензиламмоний хлорид.

Настоящее изобретение может быть продемонстрировано следующими примерами, которые носят иллюстрирующий характер.

При осуществлении заявленного способа использовали квантовые точки марки QD-Light - поставляются Центром высоких технологий ФГУП "НИИПА" (http://www.nanotech-dubna.ru) в толуольном либо хлороформном растворе концентрацией 1 г/л.

Необходимой концентрации квантовых точек в растворе (0,1-1,0 г/л) добиваются разбавлением исходного раствора квантовых точек.

При осаждении на полимерную поверхность квантовые точки ведут себя одинаково вне зависимости от того, в каком растворителе они диспергированы: в толуоле, хлороформе или их смеси. Их устойчивость и способность к самоагрегации определяется исключительно степенью стабилизации и отсутствием резкого перехода от неполярной среды к полярной.

Разработанный способ позволяет получать полимерные микросферы требуемого размера, содержащие на поверхности прочно иммобилизованные флуоресцентные нанокристаллы. Полученные результаты демонстрируются фотографиями, представленными на рисунках 3.5.1.

По результатам подана авторская заявка на способ получения полимерных композитов, содержащих в поверхностном слое флуоресцентные нанокристаллы.



Рис.3.5.1. Полимерные микросферы с d=5мкм, содержащие на поверхности слой флуоресцентных нанокристаллов.

3.6 Выбор полистирольных микросфер для разработки диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации

Для создания диагностических тест-систем были использованы полистирольные суспензии, синтезированные методом затравочной полимеризации в присутствии функциональных кремнийорганических ПАВ, что позволило получить полистирольные микросферы, содержащие в поверхностном слое аминогруппы - АГ(КО) (3.6.1.), карбоксигруппы - КГ(КО) (рис. 3.6.2.) и эпоксигруппы - ЭГ(КО) (рис. 3.6.3.).

Гистограммы распределения частиц по размерам приведены на рисунках 3.6.1В, 3.6.2.В и 3.6.3В. Видно, что полистирольные микросферы имели средний диаметр 5 мкм и узкое распределение частиц по размерам. При анализе полимерных суспензий в световом микроскопе было обнаружено, что полистирольные микросферы агрегируют в фосфатно-солевом буферном растворе. Анализ углов смачивания, результаты которого приведены на рисунках 18Б, 19Б и 20Б, показал, что поверхность полистирольных микросфер в значительной степенигидрофобна, угол смачивания > 90⁰. Характеристики полистирольных суспензий, полученных в присутствии кремнийорганических ПАВ, содержащих амино-, карбокси- и эпоксигруппы, приведены в таблице 3.

Таблица 3.6.1. Характеристики полистирольных суспензий, полученных методом затравочной полимеризации в присутствии кремнийорганических ПАВ, содержащих различные функциональные группы

Тип частиц	D, мкм	Dw/Dn	ж, мВ	Количество функц. групп, ммоль/г	Устойчивость в NaCl, М	Угол смачивания
АГ (КО)	4,9 ± 0,3	1,025	10,6 ± 7,2	0,044 ± 0,004	0,05	1280 ± 20
КГ (КО)	4,9 ± 0,3	1,027	-37,6 ± 11,1	0,038 ± 0,004	0,05	1340 ± 30
ЭГ (КО)	4,8 ± 0,3	1,024	-11,2 ± 9,4	0,013 ± 0,005	0,05	1230 ± 20

Существенно понизить агрегацию полимерных микросфер удалось путем гидрофилизации их поверхности полимерным ПАВ (поливиниловым спиртом) и увеличением концентрации аминогрупп на поверхности частиц при хлорметилировании и последующем аминировании поверхности полимерных микросфер. Микрофотографии полученных полимерных частиц и гистограммы распределения их по размерам, а также результаты определения углов смачивания и дзета-потенциала приведены на рисунках 3.6.4 и 3.6.5.



Рисунок 3.6.1. Полистирольные микросферы, полученные методом затравочной полимеризации в присутствии кремнийорганического ПАВ, содержащего аминогруппы: А - электронная микрофотография; Б - микрофотография капли воды на поверхности слоя плотноупакованных полимерных микросфер; В - гистограмма распределения частиц по размерам; Г - дзета-потенциал

Рисунок 3.6.2. Полистирольные микросферы, полученные методом затравочной полимеризации в присутствии кремнийорганического ПАВ, содержащего карбоксильные группы: А - электронная микрофотография; Б - микрофотография капли воды на поверхности слоя плотноупакованных полимерных микросфер; В - гистограмма распределения частиц по размерам; Г - дзета-потенциал

Рисунок 3.6.3. Полистирольные микросферы, полученные методом затравочной полимеризации в присутствии кремнийорганического ПАВ, содержащего эпоксидные группы: А - электронная микрофотография; Б - микрофотография капли воды на поверхности слоя плотноупакованных полимерных микросфер; В - гистограмма распределения частиц по размерам; Г - дзета-потенциал

Рисунок 3.6.4. Полистирольные микросферы, полученные методом затравочной полимеризации в присутствии смеси аминосодержащего кремнийорганического ПАВ и полимерного ПАВ: А - электронная микрофотография; Б - микрофотография капли воды на поверхности слоя плотноупакованных полимерных микросфер; В - гистограмма распределения частиц по размерам; Г - дзета-потенциал

Рисунок 3.6.5. Полистирольные микросферы, полученные методом затравочной полимеризации с последующей модификацией аминосодержащими веществами: А - электронная микрофотография; Б - микрофотография капли воды на поверхности слоя плотноупакованных полимерных микросфер; В - гистограмма распределения частиц по размерам; Г - дзета-потенциал



Рисунок 3.6.6. Полистирольные микросферы, полученные: А - методом затравочной полимеризации в присутствии аминосодержащего кремнийорганического гемини-ПАВ, Б - методом затравочной полимеризации в присутствии смеси аминосодержащего кремнийорганического и полимерного ПАВ, В - методом затравочной полимеризации с последующей модификацией аминосодержащими веществами; х1, х2, х3 - доля частиц, находящихся в одиночном состоянии или входящих в состав дуплетов и триплетов; агрегаты - доля частиц, находящихся в агрегированном состоянии.

Видно, что полистирольные микросферы, полученные методом затравочной полимеризации в присутствии аминосодержащего кремнийорганического ПАВ, находятся в агрегированном состоянии. Доля полимерных микросфер, входящих в состав агрегатов, состоящих более, чем из 3 частиц, превышает 75%, а доля полимерных микросфер, находящихся в индивидуальном состоянии, составляет 12,3%. Гидрофилизация поверхности полимерных микросфер Для повышения агрегативной устойчивости частиц, необходимо было гидрофилизовать поверхность полимерных микросфер. Для этого полимерные микросферы, полученные методом затравочной полимеризации, модифицировали процессом хлорметилирования и аминирования. В этом случае полимерные суспензии характеризовались отсутствием агрегатов (0,0%) и высокой долей частиц, находящихся в индивидуальном состоянии (82,8%). В таблице 3.6.2. приведены характеристики полученных полистирольных суспензий.

Таблица 3.6.2. Характеристики полистирольных суспензий, полученных методом затравочной полимеризации в присутствии смеси кремнийорганического и полимерного ПАВ (АГ(КО+ПВС)), и полистирольных суспензий, модифицированных хлорметилированием-аминированием (АГ(ХМ))

Тип частиц	D, мкм	Dw/Dn	ж, мВ	Количество функц. групп, ммоль/г	Устойчивость в NaCl, М	Угол смачивания
АГ (КО+ПВС)	4,9 ± 0,3	1,023	-4,5 ± 5,5	0,031 ± 0,004	0,15	1070 ± 20
АГ (ХМ)	4,9 ± 0,3	1,025	43,6 ± 8,1	0,820 ± 0,007	0,25	520 ± 30

Наибольшей агрегативной устойчивостью в буферных растворах характеризовались полистирольные микросферы со средним диаметром 5 мкм, модифицированные хлорметилированием с последующим аминированием. (таблица 4). Данная полимерная суспензия была использована при создании диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации.

3.7 Работка нового типа частиц - носителей с развитой поверхностью

Был предложен принципиально новый подход к созданию частиц полимерного носителя, позволяющий увеличить как удельную поверхность, так и скорость их седиментации. Суть данного подхода заключалась в получении композиционных полимерных частиц путем формирования на поверхности полимерных микросфер большого диаметра оболочку из полимерных частиц малого диаметра за счет ковалентного связывания функциональных групп, содержащихся в их поверхностном слое (рис. 32).

Рисунок 3.7.1. Получение полимерных частиц с развитой удельной поверхностью

Для этого были использованы полимерные частицы двух размеров. Первые - со средним диаметром 5 мкм - были получены методом затравочной полимеризации стирола в присутствии функциональных кремнийорганических гемини-ПАВ и содержали в поверхностном слое амино-, карбокси- и эпоксигруппы (пункт 2). Несмотря на это их поверхность была гидрофобна (угол смачивания ~ 1200), по-видимому, из-за экранирования функциональных групп в надмолекулярных структурах, образованных гемини-ПАВ в поверхностном слое частиц. Полимерные микросферы были устойчивы в воде, но агрегировали в буферных растворах высокой ионной силы.

Вторые частицы - со средним диаметром 0,4 - 0,7 мкм (рис. 33, 34, 35) - были синтезированы методом гетерофазной полимеризации стирола в присутствии тех же функциональных кремнийорганических ПАВ.

В этом случае поверхность частиц была гидрофильной (угол смачивания ~ 50⁰) (таблица 14), что, видимо, объясняется иным механизмом формирования поверхностного слоя и образования надмолекулярных структур ПАВ, в которых функциональные группы не экранированы.

Таблица 3.7.1. Характеристики полистирольных суспензий, полученных методом гетерофазной полимеризации в присутствии кремнийорганических гемини-ПАВ

Тип частиц	D, мкм	Dw/Dn	ж, мВ	Количество функц. групп, ммоль/г	Устойчивость в NaCl, М	Угол смачивания
АГ (КО)	0,49 ± 0,04	1,015	- 23,1 ± 7,6	0,465 ± 0,005	0,25	510 ± 30
КГ (КО)	0,46 ± 0,04	1,013	- 27,6 ± 8,1	0,520 ± 0,005	0,25	550 ± 20
ЭГ (КО)	0,65 ± 0,03	1,018	- 21,9 ± 3,7	0,185 ± 0,015	0,25	490 ± 20



Рисунок 3.7.2. Полистирольные частицы, полученные методом гетерофазнойполимеризации в присутствии кремнийорганического гемини-ПАВ, содержащего аминогруппы: А - электронная микрофотография; Б - микрофотография капли воды на поверхности слоя плотноупакованных полимерных микросфер; В - гистограмма распределения частиц по размерам; Г - дзета-потенциал

Рисунок 3.7.3. Полистирольные частицы, полученные методом гетерофазной полимеризации в присутствии кремнийорганического гемини-ПАВ, содержащего карбоксильные группы: А - электронная микрофотография; Б - микрофотография капли воды на поверхности слоя плотноупакованных полимерных микросфер; В - гистограмма распределения частиц по размерам; Г - дзета-потенциал

Рисунок 3.7.4. Полистирольные частицы, полученные методом гетерофазной полимеризации в присутствии кремнийорганического гемини-ПАВ, содержащего эпоксидные группы: А - электронная микрофотография; Б - микрофотография капли воды на поверхности слоя плотноупакованных полимерных микросфер; В - гистограмма распределения частиц по размерам; Г - дзета-потенциал

Первые частицы из-за их агрегации не могли быть использованы в качестве носителей биолигандов. Вторые - были использованы при получении диагностических тест-систем для постановки реакции латексной агглютинации "на стекле". В качестве специфических биолигандов были использованы сывороточный альбумин человека, гамма-иммуноглобулин человека и столбнячный и дифтерийный анатоксины. Полистирольные частицы сохраняли агрегативную устойчивость на всех этапах получения диагностических тест-систем. Наблюдаемая высокая чувствительность реакции латексной агглютинации на стекле подтверждала наличие на поверхности полимерных частиц функциональных групп и химических связанных с ними биолигандов в достаточных количествах.

Полистирольные частицы со средним диаметром 0,4 - 0,7 мкм были использованы при формировании оболочки на поверхности полистирольных микросфер со средним диаметром 5 мкм путем химического связывания их функциональных групп по известным методикам. Для исключения агрегации частиц большого диаметра активацию их функциональных групп и иммобилизацию полимерных частиц малого диаметра на их поверхность проводили в воде.

Композиционные частицы характеризовались устойчивостью в буферных растворах высокой ионной силы и не меняли своих свойств во времени.

Согласно расчетным данным удельная поверхность полученных частиц в среднем в 3,5 раза больше удельной поверхности исходных полистирольных микросфер.

На рисунке 36 представлены микрофотографии композиционных полимерных частиц, полученных на основе полистирольных микросфер, содержащих различные функциональные группы.



Рисунок 3.7.5. Полистирольные частицы с развитой удельной поверхностью, полученные путем фиксации: А - полистирольных частиц со средним диаметром 0,5 мкм, содержащих в поверхностном слое аминогруппы, на поверхность полистирольных микросфер со средним диаметром 5 мкм, содержащую аминогруппы; Б - полистирольных частиц со средним диаметром 0,7 ...