Хімічна модифікація олігонуклеотидів і синтез їх кон’югатів

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

АВТОРЕФЕРАТ

ХІМІЧНА МОДИФІКАЦІЯ ОЛІГОНУКЛЕОТИДІВ І СИНТЕЗ ЇХ КОН'ЮГАТІВ

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі сигнальних систем клітини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України та в лабораторії хімії нуклеїнових кислот Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, м. Київ.

Офіційні опоненти:

доктор хімічних наук, старший науковий співробітник Смолій Олег Борисович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу хімії білків і пептидів доктор хімічних наук, професор Толмачов Олексій Іванович, Інститут органічної хімії НАН України, провідний науковий співробітник відділу кольору та будови органічних сполук

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Швед Анатолій Давидович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, завідувач відділу синтетичних біорегуляторів

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02660, Київ-94, вул. Мурманська, 1).

Автореферат розіслано 26 серпня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Синтетичні олігонуклеотиди - потужний інструмент в арсеналі молекулярної біології. Вони широко використовуються як ДНК/РНК-зонди, інгібітори експресії генів, праймери для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), в синтезі генів та секвенуванні нуклеїнових кислот (НК), при вивченні білково-нуклеїнової взаємодії і т.д. Бурхливий розвиток біотехнології та молекулярної медицини викликав особливий інтерес до модифікованих олігонуклеотидів та їхніх кон'югатів з іншими молекулами зі специфічними властивостями, серед яких флуоресцентні мітки, інтеркалятори, хімічні нуклеази, ліпофільні молекули, білки тощо. Хімічно модифіковані олігонуклеотиди володіють особливими, часто унікальними характеристиками. Це винятково цінні реагенти для дослідження фундаментальних біологічних та фізико-хімічних властивостей НК, і в той же час існують широкі можливості їхнього діагностичного та терапевтичного застосування в медицині, а також використання в біотехнології. Тому зараз існує значна потреба в модифікованих олігонуклеотидах. Методи хімічного синтезу природних олігонуклеотидів сьогодні досить добре розроблені, проте отримання багатьох видів структурно різноманітних модифікованих олігонуклеотидів, спрямоване введення в олігомери бажаних модифікацій, приєднання багатьох лігандів, синтез неприродних аналогів олігонуклеотидів, як правило, спряжені зі значними труднощами. Це зумовлено як складністю будови олігонуклеотидів, присутністю в їхній структурі численних реакційноздатних функціональних груп, так і значною хімічною та біологічною лабільністю біополімерів. Тому важливим завданням сучасної біоорганічної хімії є пошук нових підходів до синтезу модифікованих олігонуклеотидів. Виходячи з цього, важливо розширити арсенал доступних методів та реагентів для хімічної модифікації олігонуклеотидів у м'яких умовах, знайти нові підходи до синтезу їхніх кон'югатів, а також дослідити фізико-хімічні властивості та біологічну активність нових модифікованих олігонуклеотидів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами та темами. Роботу виконано в рамках Національної програми “Профілактика СНІД в Україні”, теми “Розробка нових ефективних методів діагностики СНІД, що базуються на використанні нерадіоактивних олігонуклеотидних міток” (1991-1993, № держреєстрації 0395U01037) та “Створення високочутливих тест-систем для діагностики і пригнічення життєздатності мікоплазм, причетних до захворювань СНІД, а також респіраторного та урогенітального трактів людини” (1994-1995, № держреєстрації 0194U005451); Державної програми розвитку трансплантології та генної терапії, тема “Створення технології виробничого синтезу та підготовка нормативної документації на новий фармакологічний препарат для трансплантології” (проект ДКНТ України № 8/52-98, 1998-2000); в рамках держбюджетних тем ІМБіГ НАН України “Вивчення впливу аналогів 2'-5' олігоаденілатів (2'-5'А3) на активність фосфодіестерази цАМФ та на концентрацію циклічних нуклеотидів за умов імуносупресії в органах та тканинах тварин” (№ 2.2.4.15, 1999-2003, № держреєстрації 0101U000358) та “Вивчити взаємодію аналогів 2'-5'-олігоаденілатів з фосфодіестеразами циклічних нуклеотидів і провести моніторинг нових протизапальних препаратів in vitro та in vivo” (№ 2.2.4.15, 2004-2008, № держреєстрацiї 0104U000162). В останній темі здобувач був науковим керівником, у всіх інших - відповідальним виконавцем. Робота була підтримана науковими фондами INTAS (“Specific inhibition of microorganisms by antisignature oligonucleotides and their analogues”, грант № 97-3-1158, 1998-2000), JREI (Великобританія) (“Macrocyclic metal complexes as a part of anti-sense DNA probe”, грант GR/R05574, 2004), УНТЦ (“Potential anticancer agents based on porphyrins interaction with G-quadruplexes of telomeric DNA”, грант № 3172, 2005-2007).

Мета і задачі дослідження. Основна мета роботи полягала в розробці комплексу нових методів хімічної модифікації синтетичних олігонуклеотидів та отримання їхніх кон'югатів із молекулами різних класів, а також вивченні фізико-хімічних та біологічних властивостей модифікованих олігонуклеотидів.

Для досягнення поставленої мети слід було розв'язати наступні задачі:

створення нових полімерних носіїв для твердофазного синтезу нормальних та модифікованих олігонуклеотидів;

функціоналізація олігонуклеотидів у заданому положенні;

кон'югація олігонуклеотидів з різними лігандами, серед яких флуорофори, інтеркалятори, хімічні нуклеази і пептиди;

синтез неприродних аналогів олігонуклеотидів;

вивчення спектральних властивостей кон'югатів та їхньої взаємодії з НК;

оцінка біологічної активності синтезованих сполук.

Об'єкт дослідження - синтетичні олігонуклеотиди, їхні кон'югати та аналоги.

Предмет дослідження - реакції хімічної модифікації олігонуклеотидів.

Методи дослідження - хімічний синтез, тонкошарова хроматографія (аналіз реакційних сумішей), високоефективна рідинна хроматографія (аналіз перебігу реакцій та чистоти продуктів, виділення олігонуклеотидів), гель-електрофорез (виділення олігонуклеотидів), абсорбційна та флуоресцентна спектроскопія (вивчення структури сполук та їхньої взаємодії з НК), ЯМР- та мас-спектрометрія (встановлення структури сполук).

Наукова новизна одержаних результатів. Створено нові полімерні носії для синтезу олігонуклеотидів та їхніх кон'югатів на основі мікросферичного аеросилогелю “Силохром-2” з ефективними поліамідними лінкерами.

Запропоновано серію нових Н-фосфонатних та фосфітамідних реагентів для модифікації олігонуклеотидів, що дозволяють отримувати кон'югати як по 5'-, так і по 3'-кінцю олігонуклеотида, а також у будь-якому місці всередині послідовності через положення 2' дезоксирибози.

Розроблено ефективні методи кон'югації з використанням фосфонієвих та уронієвих активуючих реагентів, що дають можливість у м'яких умовах приєднувати до олігонуклеотидів широкий спектр репортерних молекул.

На основі розроблених підходів одержано, у більшості випадків вперше, та досліджено кон'югати олігонуклеотидів з молекулами різних класів. Серед них флуорофори (флуоресцеїн, введений пост-синтетично чи в процесі твердофазного синтезу), інтеркалятори (імідазофеназин у вигляді глікозиду чи приєднаний через лінкерну групу), хімічні нуклеази (металокомплекси катіонних порфіринів, азамакроциклу 1,4,7-тріазациклононану). Вперше комбінацією твердофазного синтезу на модифікованих барвником полімерних носіях та пост-синтетичної кон'югації отримано потрійні гібриди хімічна нуклеаза-олігонуклеотид-флуорофор, транспортний пептид-олігонуклеотид-флуорофор.

За допомогою спектрально-флуоресцентних методів досліджено механізми взаємодії кон'югатів олігонуклеотид-імідазофеназин з комплементарними НК. Показано, що приєднання нейтрального хромофора значно стабілізує дуплексні та триплексні комплекси, ймовірно, за рахунок iнтеркаляцiї. При цьому температура плавлення зростає на 10-12^оС для дуплексних i на 15-20^оС для триплексних структур, що співставимо зі стабілізуючою дією катіонних інтеркаляторів.

Вивчено механізм дії деяких хімічних нуклеаз та можливість детекції лабільних продуктів розщеплення НК. Встановлено високу селективність розщеплення ДНК-мішені Mn(III)-комплексом тріс(метилпіридиній)порфірину, приєднаними до внутрішніх положень вектора-олігонуклеотида й орієнтованих у малу борозенку дуплексу. Ідентифіковано новий продукт окислення гуаніну металопорфірином - дегідрогуанідіногідантоїн. Для визначення деяких нестійких фрагментів розщеплення ДНК розроблено нові методи, що поєднують хімічну модифікацію та хромато-мас-спектрометрію.

Вперше запропоновано новий метод олігонуклеотидного синтезу - Н-фосфонатний синтез у розчині.

Практичне значення одержаних результатів полягає у розробці нових ефективних методів та реагентів для одержання ряду класів модифікованих олігонуклеотидів. На основі вітчизняного силікагелю “Силохром-2” розроблено полімерні носії для синтезу природних та модифікованих олігонуклеотидів, близькі за ефективністю до комерційних носіїв на основі скла CPG, проте значно дешевші. Висока ефективність онієвих солей в реакціях утворення амідних та естерних зв'язків у синтезі носіїв та кон'югатів робить їх універсальними реагентами хімії НК. Розроблено технологію препаративного синтезу 2'-5'-олігоаденілатів - перспективних препаратів для лікування деяких серцево-судинних і онкологічних захворювань - з використанням О-нуклеофільного каталізу. Антисигнатурні олігонуклеотиди, в першу чергу тіофосфатні аналоги, виявили високу протимікробну активність у низьких концентраціях (100 нМ). Значущість результатів підтверджено патентами України та Російської Федерації. Здобувач у складі авторського колективу удостоєний Державної премії України в галузі науки і техніки за 2001 р. за цикл робіт “Теорія і практика створення антисигнатурних олігодезоксирибонуклеотидів як універсальних антимікробних засобів (фундаментальні дослідження)”.

Особистий внесок здобувача є визначальним на всіх етапах дослідження і полягає в загальній постановці завдання, виборі об'єктів дослідження, плануванні та проведенні експериментів, аналізі експериментальних та літературних даних, формулюванні висновків. Усі дослідження, матеріали яких ввійшли до дисертації, проводились за безпосередньої участі здобувача. Автор особисто виконав основну частину експериментів із хімічного синтезу олігонуклеотидів, реагентів для їхньої модифікації, модельних сполук. Спектро-флуоресцентні дослідження кон'югатів імідазофеназину виконані спільно з д.ф.-.м.н., проф. Ю.П. Благим та к.ф.-м.н. В.М. Зозулею (Фізико-технічний інститут низьких температур НАН України, Харків). Частина спектроскопічних досліджень олігонуклеотидів проведена на фізичному факультеті Київського національного університету ім. Т. Шевченка (д.ф.-м.н., проф. В.М. Ящук, к.ф.-м.н В.Ю. Кудря). Нуклеазну активність кон'югатів вивчали разом з проф. Б. Меньє і д-ром Ж. Пратвієль (Лабораторія координаційної хімії, Тулуза, Франція), к.х.н. С.А. Пілецьким (Кренфілдський університет, Великобританія). Біологічну активність 2'-5'-олігоаденілатів вивчали к.б.н. З.Ю. Ткачук та к.б.н. Л.Л. Сидорик під загальним керівництвом академіка НАН України Г.Х. Мацуки в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України, д.б.н. П.В. Погрібний в Інституті експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Активність антисигнатурних олігонуклеотидів досліджували в Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під керівництвом член-кореспондента НАН України І.Г. Скрипаля. Результати досліджень опубліковано в спільних публікаціях, підготовлених до друку здобувачем або за його безпосередньої участі. Автор висловлює щиру подяку к.б.н. Д.М. Федоряку (Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України) за багаторічну співпрацю та підтримку, а також усім колегам, що брали участь у виконанні роботи.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися на Міжнародному конгресі “Synthetic oligonucleotides: frontiers and problems of practical application” (Москва, 1991), Французько-українській конференції “Перенос генів та регуляція їх експресії в еукаріотах” (Київ, 1993), І та ІІІ з'їздах Українського біофізичного товариства (Київ, 1994; Львів, 2002), 1-ій Національній науково-практичній конференції з проблем ВІЛ/СНІД (Київ, 1995), XII International Round Table “Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications” (La Jolla, USA, 1996), 13^eme Journee d'Etude “Chimie-Biologie” (Toulouse, France, 1997), World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering (Nice, France, 1997), Міжнародній конференції “Фізика біологічних систем“ (Пуща-Водиця, 1998), 8^th European Conference on Spectroscopy of Biological Molecules (Twente, The Netherlands, 1999), 6^th International Conference on Methods and Applications of Fluorescence Spectroscopy (Paris, France, 1999), 18^th International Congress “Biochemistry and Molecular Biology Beyond the Genome” (Birmingham, UK, 2000), І та ІІІ Міжнародних конференціях “Фізика рідкого тіла: сучасні проблеми“ (Київ, 2001, 2005), 5^th International Symposium on Functional ?-Electron Systems (Ulm/Neu-Ulm, Germany, 2002), VIII з'їзді Українського біохімічного товариства (Чернівці, 2002), Міжнародній конференції “Спектроскопія в спеціальних застосуваннях“ (Київ, 2003), 8^th Conference on Methods and Applications of Fluorescence: Spectroscopy, Imaging and Probes (Prague, Czech Republic, 2003), Х і ХІІ European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules (Szeged, Hungary, 2003; Bobigny, France, 2007), Міжнародній конференції “Електронні процеси в органічних матеріалах (Київ, 2004), 20^th International Congress on Heterocyclic Chemistry (Palermo, Italy, 2005), Міжнародній конференції “Сучасні проблеми оптики конденсованої матерії” (Київ, 2006), III Міжнародній конференції з водневих зв'язків і молекулярних взаємодій (Київ, 2006), XXVIII European Congress on Molecular Spectroscopy (Istanbul, Turkey, 2006), ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006), Українсько-німецькому симпозіумі з нанобіотехнології (Київ, 2006), Winter School on Organic Electronics (Planneralm, Austria, 2007), 4^th International Chemistry Conference Toulouse-Kiev (Toulouse, France, 2007).

Публікації. Основний зміст роботи викладено в 39 статтях у наукових фахових виданнях (з них 1 огляд), 2 патентах та 30 тезах доповідей.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, дев'яти розділів, висновків та списку літератури, що налічує 542 найменування.

Робота містить 51 схему, 12 таблиць та 24 рисунки. Повний обсяг роботи становить 365 сторінок.

Основний зміст

Полімерні носії для твердофазного синтезу олігонуклеотидів

Однією з найважливіших проблем твердофазного синтезу олігонуклеотидів є вибір полімерного носія. Нами розроблені нові носії на основі вітчизняного мікросферичного силікагелю “Cилохром-2”, близького за фізичними параметрами до скла CPG-1000, яке вважається оптимальним для олігонуклеотидного синтезу.

Для підвищення ефективності носія збільшують відстань між ним та олігонуклеотидом за допомогою спейсерів (лінкерів). Найкращі виходи та гомогенність олігонуклеотидів досягаються з відносно жорсткими лінкерами, які знаходяться у витягнутій конформації. Ми використали лінкер амінопропіл-сукцинат-етилендіамін-сукцинат, що складається з 4-атомних фрагментів, зв'язаних амідними зв'язками, і тому відносно негнучкий. Аналогічними властивостями володіє лінкер, що містить дигліциновий фрагмент. Розроблені методи синтезу полімерів з такими лінкерами з використанням фосфонієвих та уронієвих активуючих реагентів.

Синтез носія дигліцинового типу проводили, виходячи з амінопропіл-модифікованого силікагелю 1. На двох стадіях приєднання N-Fmoc-захищеного гліцину (Fmoc - флуоренілметоксикарбоніл) застосували активуючий реагент HBTU або BOP в присутності каталізатора 1-гідроксибензотріазолу (HOBT). Після кожного приєднання Fmoc-захист знімали піперидином. N-кінцеву аміногрупу лінкера Gly-Gly полімера 5 ацилювали янтарним ангідридом, а на карбоксильованому полімері 6 імобілізували захищені нуклеозиди, отримавши серію носіїв 7. Синтез носіїв 8, що містять лінкер сукцинат-етилендіамін-сукцинат, проводили, виходячи з полімера 1. Його аміногрупи ацилювали янтарним ангідридом, до введених карбоксильних груп методом активованих естерів приєднували етилендіамін, повторною обробкою амінованого полімера янтарним ангідридом нарощували лінкер і здійснювали посадку нуклеозидів на СООН-модифікований полімер.

Як правило, нуклеозид-модифіковані полімери отримують приєднанням сукцинатів нуклеозидів до амінованого носія. Перевага використаного нами приєднання нуклеозидів до карбоксильованих полімерів полягає в тому, що відпадає необхідність синтезувати 3'-сукцинати чотирьох нуклеозидів. Реакція утворення амідного зв'язку в присутності онієвих реагентів є одним із поширених методів пептидного синтезу. Утворення естерного зв'язку в цих умовах менш розповсюджене, оскільки знижена порівняно з амінами нуклеофільність ОН-групи ускладнює перебіг реакції. Однак імобілізація нуклеозидів пройшла ефективно. Ємність носіїв становила 25-35 мкмоль/г нуклеозидів, причому вона була на 10-20% вищою при використанні HBTU, порівняно з ВОР. HBTU дещо активніший від ВОР, хоча й менш стійкий у розчині в присутності сильних основ. Проте обидва вони ефективніші за класичний конденсуючий реагент триізопропілбензолсульфохлорид у присутності N-метилімідазолу (TPSCl-MeIm): виходи реакцій конденсації з утворенням амідних та естерних зв'язків у випадку онієвих реагентів на 10-30% вищі.

Середні виходи реакцій конденсації в синтезі олігонуклеотидів на полімерах 7 та 8 дуже близькі, проте чистота олігомерів, синтезованих на полімері 8, помітно вища. Можливо, це пов'язано з тим, що його лінкер дещо довший, ніж у полімері 7. Надалі для синтезів використовували в основному полімер 8, на якому Н-фосфонатним методом отримали декілька десятків олігонуклеотидів довжиною до 35-членних, зокрема фрагменти гена металотіонеїну Neurospora crassa. Виходи конденсацій (97,5-99% у автоматичному і 96-98% у ручному варіанті синтезу) відповідали або й перевершували досягнуті на носієві CPG.

Синтез флуоресцентно мічених олігонуклеотидів

Існує два основних шляхи приєднання репортерних молекул до олігонуклеотидів. Перший з них ґрунтується на синтезі олігомерів, що містять аміно- чи меркаптоалкільні групи, з подальшою кон'югацією з відповідними молекулами. В іншому підході репортерну групу вводять в процесі твердофазного синтезу олігонуклеотида, після чого деблокують та виділяють готовий кон'югат. Запропоновано і полімерні носії, що містять репортерні групи на певних лінкерах.

Флуоресцеїн-модифікований носій на основі “Силохрому-2”. Ми розробили носій на основі “Силохрому-2” для синтезу 3'-модифікованих олігонуклеотидів. Аміногрупу амінодіолу 9 захищали Fmoc-групою, а первинний гідроксил N-захищеного інтермедіату тритилювали. 1,3-Захищений синтон 10 переводили в сукцинат 11, який приєднували до полімера, що містив лінкер амінопропіл-сукцинат-етилендіамін, в присутності уронієвого реагента HBTU. Далі спейсер подовжили, ввівши в нього Fmoc-захищений b-аланін.

Носії 12 і 13 можна використовувати для синтезу олігомерів із аліфатичною аміногрупою на 3'-кінці. Ці біфункціональні носії можна застосувати і в синтезі пептидів (через амінолінкер). Для отримання носія для прямого синтезу 3'-мічених олігонуклеотидів аміногрупу лінкера деблокували та приєднали до неї ізотіоціанат флуоресцеїну (FITC). Для уникнення побічних реакцій по фенольних гідроксилах барвника їх захищали півалоїльними групами, які деацилюються при амонолізі. Вміст барвника в отриманому полімері 14 становив 28 мкмоль/г. Після детритилювання носій містить вільну аліфатичну ОН-групу.

Синтез флуоресцеїн-мічених олігонуклеотидів на модифікованому носії. На полімері 14 фосфітамідним методом синтезували пентадекатимідилат T₁₅ (префікс d для позначення дезоксинуклеотидів всюди опущено). Для отримання 3'-міченої похідної олігомер після синтезу відщеплювали від носія та деблокували амонолізом і очищали електрофорезом. Для приєднання другого барвника в 5'-кінець олігонуклеотида на полімері карбонілдіімідазольним методом вводили аміноалкільну групу та виділяли 5'-функціоналізований олігомер. Він реагував з FITC у водно-органічному середовищі (рН 9.5). Другий флуорофор приєднувався майже кількісно з утворенням подвійно міченого олігомера. Кон'югати очищали гель-електрофорезом.

Спектри поглинання кон'югатів демонструють присутність одного чи двох залишків барвника. Олігонуклеотидна частина кон'югату не поглинає у видимій області, де спостерігається смуга флуоресцеїну (?_max 494 нм), а в УФ-області спектру поглинають і нуклеотидні основи, і барвник. Співвідношення інтенсивностей поглинання кон'югатів в УФ- та видимій області А₂₆₀/A₄₉₄ становило 2,04 та 1,18 для моно- та біс-міченого T₁₅, що добре узгоджується з розрахованими величинами (відповідно 2,00 та 1,10).

Синтез модифікованих олігонуклеотидів з використанням дисульфідного реагента. Тіол-модифіковані олігонуклеотиди є привабливими реагентами для синтезу кон'югатів та розв'язання багатьох біологічних задач. Нами запропоновано новий Н-фосфонатний реагент 15, що дозволяє вводити SH-групи як в 3'-, так і в 5'-кінець олігомера. Реагент, отриманий шляхом тритилювання та фосфорилювання ОН-груп 3,3'-дипропанолдисульфіду, вводять як Р-компонент Н-фосфонатної конденсації під час олігонуклеотидного синтезу.

5'-Тіольні похідні (17, варіант А) отримували приєднанням реагента на останній стадії після завершення нарощування нуклеотидної послідовності. Реакцію проводили у присутності конденсуючого реагента півалоїлхлориду, а утворену гідрофосфорильну групу окисляли до фосфодіестерної водним йодом. Для синтезу 3'-модифікованих олігомерів (20, варіант В) Н-фосфонат 15 вводили в полімер, на якому далі проводили синтез олігонуклеотида. Пост-синтетичне розщеплення S-S-зв'язків дитіотреїтолом (DTT) генерує тіольні групи на кінцях олігонуклеотидів. При введенні реагента 15 на першій та останній стадіях синтезу отримують олігомери, функціоналізовані по обох кінцях. Так синтезували пентадекатимідилат з одною та двома тіольними групами.

Отримали кон'югати Т₁₅, які містили 1 або 2 залишки флуоресцеїну, використавши реакцію SH-групи з електрофільною тіол-специфічною похідною барвника - йодацетамідофлуоресцеїном. Моно- (21) та біс-мічений T₁₅ виділили обернено-фазовою хроматографією з виходом відповідно 78 та 57%.

Отже, використання дисульфідного реагента 15 забезпечує ефективний спосіб кон'югації олігонуклеотидів із флуорофорами та іншими репортерними молекулами через меркаптоалкільний лінкер. Запропонований реагент можна вважати універсальним, оскільки він, на противагу більшості реагентів для модифікації, дає можливість функціоналізувати олігонуклеотиди по обох кінцях.

Н-фосфонатна похідна флуоресцеїну для прямого твердофазного синтезу мічених олігонуклеотидів. Введення репортерних груп в олігонуклеотиди в процесі твердофазного синтезу є зручним та ефективним методом отримання кон'югатів. Для цього необхідні відповідні фосфорильовані похідні молекул, які потрібно приєднати. Нами розроблений простий метод синтезу Н-фосфонатних похідних флуоресцеїну для прямого мічення олігонуклеотидів по 5'-кінцю. Фенольний гідроксил метилового естеру флуоресцеїну 22 алкілювали, вводячи лінкерну групу. Реакцію з диметокситритил-захищеним 4-хлорбутанолом чи 2-хлоретанолом проводили в ДМФ у присутності К₂СО₃ як основи та йодиду калію як каталізатора. Інтермедіат 23 детритилювали, а гідроксиалкільну похідну барвника 24 фосфорилювали тріс(тріазоліл)фосфіном, отримавши Н-фосфонат 25.

Реагент 25 служив Р-компонентом Н-фосфонатної конденсації на останній стадії олігонуклеотидного синтезу. Після амонолізу отримували 5'-мічені олігомери 28. За допомогою реагента 25 синтезували ряд флуоресцеїн-мічених дезоксиолігонуклеотидів, у т.ч. праймери для ПЛР-ампліфікації ділянки env геному вірусу HIV-1 (SK68 та SK69):

SK68: 5'-AGCAGCAGGAAGCACTATGG-3'

SK69: 5'-CCAGACTGTGAGTTGCAACAG-3'

Спектри поглинання мічених олігонуклеотидів у воді містять смуги при 260 та 454 нм, а їхній максимум емісії знаходиться при 510 нм. Залишок барвника алкільований по фенольному гідроксилу, в результаті чого аніон хромофора в лужному середовищі не утворюється, і у кон'югатів реагента 25 спостерігається лише незначна залежність спектрів від рН.

При використанні реагента 25b з етиленовим лінкером вихід мічених олігомерів був низьким. Встановлено, що барвник, приєднаний до тимідину в результаті конденсації з Н-фосфонатом 25b, відщеплюється в процесі амонолізу кон'югату. Оскільки залишок флуоресцеїну є електроноакцепторною групою, кон'югати похідної 25b, що містять арилоксиетиленовий фрагмент біля атома фосфору, чутливі до реакції ?-елімінування, що не відбувається в кон'югатах 25a.

Кон'югати олігонуклеотидів з імідазо[4,5-b]феназином

Дослiдження в галузi синтезу антисенсових олiгонуклеотидів спрямованi в першу чергу на вирiшення проблем, пов'язаних зi збiльшенням стабiльностi їх комплексiв, покращенням транспорту в клітину та підвищенням стійкості до дії нуклеаз. Часто до олiгонуклеотидів приєднують сполуки, здатнi стабiлiзувати комплекс олiгонуклеотид-мiшень за рахунок iнтеркаляції. Як правило, такi групи вводять по кiнцях послiдовностi пост-синтетично через відповідний лiнкер.

Синтез олігонуклеотидів, що містять глікозиди імідазофеназину. Ефективними інтеркалятором є iмiдазо[4,5-b]феназин. Для його введення в олiгонуклеотиди в лабораторії А.С. Шаламая було запропоновано пiдхiд, у якому хромофор замiщує основу в потрiбному положеннi нуклеотидної послiдовностi. Отриманi нами за цим принципом кон'югати мiстили хромофор, зв'язаний з вуглеводним залишком глiкозидним зв'язком. Метод ґрунтується на одержаннi N₁-рибозиду чи -дезоксирибозиду iмiдазофеназину з подальшим перетворенням у похiднi, якi можна вводити в олiгонуклеотид у процесi твердофазного синтезу. Для цього отримали рибофуранозид 29 та Н-фосфонат 2'-дезоксианалога 30.

Для синтезу олiгонуклеотидів, що мiстять аномальний нуклеозид на 3'-кiнцi, його імобілізували на полiмерному носiї. Полімер модифiкували доступнiшими рибозидами шляхом утворення естерного зв'язку мiж його СООН-групою та 2'- або 3'-гiдроксилом нуклеозида. Величина посадки нуклеозидів на полімер 31 становила 35-37 мкмоль/г. Носій мiстить нуклеозиднi залишки, зв'язанi по двох різних положеннях рибози, що не впливає на синтез олiгонуклеотидів.

Для введення залишку iмiдазофеназину в iншi положення олiгонуклеотидів використовували 3'-H-фосфонатний реагент 30, який служив Р-компонентом реакцiї конденсацiї на потрiбнiй стадiї синтезу послiдовностi в тих же умовах, що й Н-фосфонати природних нуклеозидів.

За допомогою реагента 30 хромофор можна ввести в будь-яке положення послідовності, крiм 3'-термiнального. При цьому синтез може проводитись як на звичайних носiях, так i на полiмерах 31 з імобілізованим імідазофеназином. Це дозволяє синтезувати олiгонуклеотиди, модифiкованi по 3'-кiнцю i одночасно по будь-якому іншому положенню послiдовностi. Отримали серію олiгонуклеотидів, що мiстять глікозиди iмiдазофеназину (Табл. 1). Серед них модельнi олігомери (ОІ-1, 2) і послідовності, комплементарнi до певних консервативних, так званих сигнатурних, дiлянок рибосомного оперону та 16S рРНК молiкутiв (ОI-3 - ОI-7) та E. coli (ОI-8, 9).

Інтенсивна жовта флуоресценцiя iмiдазофеназину робить його зручною репортерною групою для детекцiї НК та вивчення процесiв комплексоутворення. В електронних спектрах кон'югатів поруч з УФ-поглинанням олігонуклеотиду та iмiдазофеназину при 260-270 нм реєструється смуга барвника у видимiй областi (385 нм). Максимум емiсiї iмiдазофеназину в складi кон'югатів спостерiгається при 537-539 нм.

Приєднання барвника значно стабiлізує комплекси олiгонуклеотидів. Так, введення 3'-кінцевого глікозиду Pzn в декатимiдилат (dT)₁₀ підвищує температуру плавлення його дуплексiв з комплементарними poly-A або (dA)₁₅ на 10-12°С і ще бiльше (на 15-20°С) стабiлiзує триплексні комплекси.

Спектро-флуоресцентні дослiдження кон'югатів, проведені в лабораторії к.ф.-.м.н. В.М. Зозулі (Фізико-технічний інститут низьких температур НАН України, Харків) показали, що найбільш імовірним типом зв'язування хромофора є iнтеркаляцiя. При цьому стабiлiзуючий вплив нейтральних та катiонних iнтеркаляторів феназинового ряду на комплекси практично однаковий.

Таблиця 1 Дезоксиолiгонуклеотиди, модифiкованi нуклеозидами iмiдазофеназину (Pzn)

Приєднання імідазофеназину через алкільний лінкер. Оскільки синтез глікозидів імідазофеназину є досить складним, було вирішено отримати простіші похідні для введення через аліфатичну лінкерну групу. Розроблено реагенти для пост-синтетичної модифікації олігонуклеотидів залишком імідазофеназину. Похідні 38 та 41 отримали алкілюванням імідазофеназину 36 відповідно етилбромпропіонатом та бромбутилацетатом з наступним гідролізом естерних груп та, у випадку реагента 41, фосфорилюванням. Знайдено ефективний метод м'якого N₁-алкілювання в присутності поташу як основи та йодиду калію як каталізатора. Вихід продуктів алкілювання становив 75-81%. Цей підхід раніше застосовано нами для О-алкілювання флуоресцеїну. Реагент 38 можна використати для пост-синтетичної модифікації через аміноалкільний лінкер, а Н-фосфонат 41 - для твердофазного синтезу 5'-модифікованих олігонуклеотидів.

Реагент 38 застосували для модифікації олігонуклеотида Т₁₅. Мічення проводили через попередньо приєднану до 5'-кінця олігомера аміноалкільну групу. В реакцію вводили 10-кратний надлишок похідної 38 в присутності активуючого реагента BOP-НОВТ. Реакція кон'югації досить швидка (1,5-2 год) і досягається практично кількісна трансформація вихідного амінокомпонента. Кон'югат 43 виділили за допомогою гель-електрофорезу з виходом близько 30%.

Спектр поглинання кон'югату 43 подібний до спектрів олігонуклеотидів, модифікованих нуклеозидом Pzn. В УФ-області смуги поглинання інтеркалятора (для вільного барвника l_max=264 нм) та оліготимідилату (l_max=266 нм) практично співпадають. У видимій ділянці спектра спостерігається смуга хромофора при 386 нм. Співвідношення iнтенсивностей поглинання кон'югату в УФ- та видимiй області (A₂₆₆/A₃₈₆=9,1) знаходиться у хорошiй вiдповiдностi з величиною, розрахованою за коефiцiєнтами екстинкцiї барвника та олiготимідилату (8,8).

Кон'югати олігонуклеотидів із хімічними нуклеазами

Кон'югати катіонних порфіринів. Одним із шляхів підвищення антисенсової активності олігонуклеотидів є їх приєднання до хімічних нуклеаз - низькомолекулярних сполук, здатних розщеплювати НК за механізмом гідролізу чи окислення. Одною з найактивніших хімічних ДНКаз є Mn(III)-комплекс тетра(4-N-метилпіридиній)порфірину (Mn-TMPyP), який ефективно зв'язується з ДНК і здатний розщеплювати її після активації окисником типу KHSO₅. Нами розроблений ефективний метод синтезу кон'югатів Mn-TMPyP. Вперше отримано олігонуклеотидні кон'югати з флуоресцентними порфіринами - неметалізованим TMPyP і його Zn-комплексом замість нефлуоресцентного Mn-TMPyP - для вивчення транспорту в клітину. хімічний синтетичний олігонуклеотид

Антисенсові олігонуклеотиди були спрямовані проти мРНК b-галактозидази E. Coli, а саме 17- та 18-членної мішеней в кодуючому районі гена LacZ у плазміді pUTSVLacZ. Відповідні антисенсові послідовності позначено 17bGal та 18bGal. Для підвищення стійкості кон'югатів до дії клітинних нуклеаз до 3'-кінця приєднували 7-членну послідовність 5'-GCGAAGC-3', що утворює стабільну міні-шпилькову структуру (олігонуклеотиди 24bGal і 25bGal).

Для введення порфіринового фрагменту отримали похідну трикатіонного аналога з карбоксибутильним лінкером, введеним в пара-положення фенільної групи. Цей реагент приєднували до 5'-аміноалкіл-олігонуклеотидів після активації СООН-групи системою ВОР-НОВТ. В результаті отримали серію кон'югатів ОР-1 - ОР-10.

У випадку комплексу Mn(III) відбувалось швидке перетворення вихідного олігонуклеотида в кон'югат із високим виходом. Спостерігалось утворення нового типу побічних продуктів (10-20%), які відповідали приєднанню до олігонуклеотиду двох чи більше залишків порфірину. Встановлено, що утворення полі-модифікованих олігомерів відбувається за двома механізмами - шляхом ацилювання активованим естером екзоциклічних аміногруп нуклеозидів, у першу чергу цитозину, та полі-амінованих олігомерів, які утворюються на етапі введення аміноалкільної групи карбонілдіімідазольним методом.

Рис. Структура кон'югатів дезоксиолігонуклеотидів з порфіринами

18bGal: 5'-GTTGTAAAACGACGGCAT-3'

25bGal: 5'-GTTGTAAAACGACGGCATGCGAAGC-3'

17bGal: 5'-CGAGTAACAACCCGTCG-3'

24bGal: 5'-CGAGTAACAACCCGTCGGCGAAGC-3'

Після очистки виходи кон'югатів ОР-2, 5, 7, 9 становили 25-30%.

Подібні реакції з похідними неметалізованого та Zn-порфірину були значно менш ефективними. Із-за сильної взаємодії цих порфіринів з НК (інтеркаляція, стекінг чи агрегація) їх ковалентне приєднання , а також розділення реакційних сумішей, виявилось ускладненим. Вихід очищених кон'югатів ОР-3, 6, 8, 10 становив всього 3-5%, а сполуки ОР-1 та ОР-4 виділили з виходом 5-10%. Низька активність похідних неметалізованого порфірину та Zn-комплексу, порівняно з комплексом Mn(III), може пояснюватися тим, що в останньому іон металу містить два аксіальних ліганди, що стерично ускладнюють нековалентні взаємодії планарного порфіринового ядра. Інші ж порфірини таких лігандів не містять.

Спектри поглинання кон'югатів містять дві основні смуги: в районі 260 нм (олігонуклеотидна частина з вкладом порфірину) та смуга Соре порфіринового фрагмента у видимій області (468, 442 та 438 нм для Mn-, Zn- та неметалізованого порфірину). Співвідношення інтенсивностей поглинання у видимій та УФ-області добре узгоджуються з величинами, обчисленими за коефіцієнтами екстинкції порфіринів та олігонуклеотидів (Табл. 2).

Таблиця 2 Спектральні дані олігонуклеотидів та їхніх кон'югатів із порфіринами

Модифікація олігонуклеотидів по внутрішніх 2'-положеннях та нуклеазна активність кон'югатів Mn(III)-комплексу катіонного порфірину. Раніше було показано, що механізм розщеплення ДНК Mn-TMPyP включає гідроксилювання СН-зв'язків залишків дезоксирибози та окислення гуанінових основ. Mn-TMPyP має високу спорідненість до малої борозенки АТ-багатих ділянок двоспіральної ДНК. В (AT)₃-сайті металопорфірин здійснює пряме розщеплення ДНК, причому продуктами є фрагменти ДНК, які закінчуються 3'-фосфатом і 5'-альдегідом, що утворюються в результаті гідроксилювання C5'-положення дезоксирибози. Коли в дволанцюговій ДНК-мішені відсутні сайти (AT)₃, а також при дії реагента на одноланцюгову ДНК, відбувається переважно окислення гуанінових гетероциклів.

Для досягнення сайт-специфічності нуклеазу приєднують до вектора-олігонуклеотида. В кон'югатах першого покоління порфіриновий фрагмент приєднували до 5'-кінця олігонуклеотида. Проте молекулярні моделі показали, що при орієнтації у малу борозенку дуплексу вектор-мішень у нуклеази найкращий доступ до залишків вуглеводів, на які спрямована атака металокомплексів-окисників. Оптимальним місцем приєднання є 2'-положення нуклеозидів.

Для отримання таких кон'югатів ми запропонували новий загальний метод 2'-O-модифікації нуклеозидів. На Схемі 10 наведено синтез 3'-O-фосфітаміду цитидину, модифікованого N-захищеною аміноалкільною групою. Використали захист 3'- та 5'-гідроксилів нуклеозиду циклічною силільною групою та введення аміноалкільної групи в положення 2' з використанням 1,1'-карбонілдіімідазолу (CDI). Вихід реагента 49 відносно цитидину становив 23%.

При включенні фосфітаміду 49 в олігонуклеотид отримують олігомери, що містять у заданому положенні послідовності аміноалкільну групу.

Вивчено розщеплення ДНК кон'югатами Mn-порфірину, приєднаного до внутрішніх 2'-положень олігонуклеотидів. Мішенню служив 35-мер 5'-CAGAGGAGAGCAAGAAATGGAGCCAGTAGATCCTA-3', а вектором була 19-членна послідовність 5'-GGCTCCATTTCTTGCTCTC-3', комплементарна до фрагмента G6-C24 мішені. За допомогою реагенту 49 отримали серію векторів з 2'-аміноалкільною групою. Залишки аміно-модифікованого цитидину вводили замість дезоксицитидину в положення C5, C6 або C11. Після виділення 2'-аміноалкіл-модифікованих олігомерів отримали їхні кон'югати з Mn-порфірином. Точки приєднання металокомплексу до вектора обрали так, щоб залишок нуклеази був орієнтований у задане місце дуплексу. Порфіриновий фрагмент, зв'язаний з 2'-положенням нуклеозидів C5 та C6, змушений розташуватись у малій борозенці в напрямку до (AT)₃-сайту дуплексу вектор-мішень. Порфірин, приєднаний до нуклеотида C11, орієнтований у протилежний від (AT)₃-сайту бік. Синтезували також кон'югат, в якому нуклеаза приєднана до 5'-кінця вектора.

Експерименти з розщеплення ДНК проводили з 5'-[³²P]-міченою мішенню в 50 мМ фосфатному буфері, ініціюючи реакцію додаванням KHSO₅. Через 1 год. при 0°C реакційні суміші аналізували гель-електрофорезом. Пряме розщеплення ДНК ілюструється доріжками 1-4 та 9-12, утворення піперидин-лабільних модифікацій за рахунок окислення гуаніну - доріжками 5-8 та 13-16.

Результати експериментів показали, що металопорфіринова група 5'-кон'югату в першу чергу реагує з найдоступнішими залишками гуаніну в одноланцюговій ділянці дуплексу (G22, G26). С5- та С6-кон'юговані нуклеази з високою специфічністю взаємодіяли з (AT)₃-сайтом, який був основним місцем пошкодження ДНК. C11-кон'югат, як і очікувалось, не взаємодіяв з цим сайтом. Реакційна здатність, спрямована на гуанінові основи, виявилась головним механізмом окислювального пошкодження ДНК-мішені для всіх кон'югатів.

Утворення 5'-альдегідів при розщепленні міжнуклеотидного зв'язку та деякі їхні реакції. При окисленні ДНК деякими хімічними нуклеазами, в т.ч. порфіринами, спостерігається утворення фрагментів, що містять 5'-кінцеву альдегідну групу. Реакція йде через гідроксилювання атома C5' дезоксирибози, що веде до спонтанної ?-елімінації сусідньої фосфатної групи та розриву одного ланцюга ДНК-дуплексу з утворенням 3'-фосфатного та 5'-альдегідного фрагментів. Аналіз останніх можливий методами ВЕРХ чи електрофорезу: продукти ідентифікують після додаткових хімічних перетворень (окислення, відновлення) шляхом порівняння зі стандартами. Необхідність синтезу олігонуклеотидних стандартів, часто важкодоступних, обмежує можливості даного підходу. В роботі вперше здійснено прямий аналіз 5'-альдегідних фрагментів з використанням методу хромато-електроспрей-мас-спектрометрії (LC/ES-MS). Проаналізували реакційні суміші, утворені при розщепленні Mn-TMPyP модельного 7-членного дуплексу, продукти деградації якого легко розділяються ВЕРХ. Послідовності олігомерів були підібрані таким чином, щоб при розщепленні дуплексу утворювався лише один розрив: дуплекс містив сайт специфічного зв'язування порфірину (А^.Т)₃.

В результаті взаємодії нуклеази з цим сайтом відбувалося селективне розщеплення по залишку G, розміщеному на 3'-кінці триплету A₃ в олігомері І. При цьому не спостерігалося помітного розщеплення олігомера ІІ. В реакційній суміші присутні олігомер ІІ, залишок олігомера І та два фрагменти останнього - САААр та 5'-альдегідо-GCG. ES-MS-спектри І, ІІ та CAAAp відповідали очікуваним. однак мас-спектр 5'-альдегідного фрагмента містив сигнали з m/z, які не відповідали очікуваній молекулярній масі 883,2. Основні сигнали відповідали втраті кінцевого альдегідо-нуклеозида (m/z 635,2, фрагмент pCG) та фрагментам із гідратованою альдегідною групою (m/z 900,4 і 449,7). Трансформація 5'-альдегідо-GCG в pCG відбувалася в процесі електроспрей-іонізації. Лише слабкі сигнали при 882,3 та 440,7 відповідали самому альдегідо-GCG. При інкубації реакційної суміші в тріс-буфері в ній з'являвся новий компонент, на основі молекулярної маси (m/z 985,1 і 492,4) ідентифікований як аддукт трісу та альдегідо-GCG.

Отже, здатність альдегідів нуклеотидів реагувати з нуклеофілами та розпадатися за механізмом b-елімінації приводить до того, що молекулярні піки альдегідного фрагменту в мас-спектрі надто слабкі для однозначної ідентифікації. Вирішенням проблеми стала дериватизація СН=О-групи безпосередньо перед LC/MS-аналізом реагентом, що швидко та селективно реагує з альдегідами з утворенням стабільних продуктів. Було знайдено, що ефективним реагентом для цієї мети є карбоксиметоксиламін NH₂OCH₂COOH. Інкубація реакційної суміші, отриманої при розщепленні ДНК, з цим реагентом протягом години достатня для кількісного перетворення альдегіду в О-заміщений оксим. Далі суміш аналізують LC/MS. Розроблений метод детекції не вимагає олігонуклеотидних стандартів чи спеціальної обробки реакційної суміші (крім додавання єдиного реагенту).

Для встановлення структури продуктів, що утворюються при взаємодії 5'-альдегідних фрагментів ДНК з оксиламіном та трісом, отримано відповідні похідні 5'-альдегіду тимідину. Продукти обох реакцій досить стійкі в процесі очистки. Їх структуру встановили за допомогою ЯМР. 3'-Захищений альдегід 51 в реакції з оксиламіном дає суміш E- та Z-ізомерів оксиму 52 у співвідношенні 3:1. Продукт реакції з трісом містить оксазолідиновий цикл та новий хіральний центр при C5'. Методом 2D-ЯМР-спектроскопії встановлено, що утворюється виключно 5'-R-ізомер 54, причому тимінова основа перебуває в анти-конформації відносно глікозидного зв'язку, а оксазолідиновий цикл перпендикулярний до неї. Одна з CH₂OH-груп може стабілізувати цю структуру за рахунок утворення водневого зв'язку з атомом азоту оксазолідинового циклу, а його NH-протон може взаємодіяти з фуранозним атомом кисню, додатково стабілізуючи структуру.

В S-ізомері атоми кисню оксазолідинового та фуранозного циклів були б просторово зближеними, дестабілізуючи структуру за рахунок електростатичного відштовхування. Це може пояснити, чому практично не утворюється S-ізомер 54. Ймовірно, термодинамічний контроль реакції через рівновагу циклічної та відкритої форм 54 та 53 зсуває популяцію ізомерів (спочатку можливе утворення їхньої суміші) в бік стабільнішої 5'-R-конфігурації.

Дегідрогуанідіногідантоїн - новий продукт окислення гуаніну в складі ДНК металопорфірином. Крім розщеплення фосфодіестерних зв'язків, комплекси Red-Ox-активних металів здатні окислювати гетероциклічні основи ДНК, в першу чергу гуанін. Продукти окислення часто нестійкі в лужних умовах. За допомогою хромато-мас-спектрометрії детектували кілька продуктів окислення гуаніну Mn-TMPyP в коротких олігонуклеотидах. Один із основних продуктів окислення гуаніну мав молекулярну масу на 4 одиниці більшу, ніж у вихідного гетероциклу, і його позначили G+4. Для цієї невідомої сполуки ми запропонували структуру дегідрогуанідіногідантоїну. Для її підтвердження вивчили продукти окислення модельного дезоксидинуклеотида GpT. Метою було виділення сполуки (G+4)pT в препаративному масштабі (5-10 мг) та її ЯМР-аналіз. Окислення динуклеотида привело до утворення двох продуктів. Одним із них був відомий імідазолон-вмісний динуклеотид, іншим - похідна (G+4)pT. Остання виявилась недостатньо стійкою для прямого аналізу, тому її відновили NaBH₄ до стабільної похідної, яку позначили (G+6)pT. При цьому утворились два продукти (співвідношення 35:65) з одною молекулярною масою, які виділили хроматографічно та встановили структуру 2D-ЯМР. Вони виявились діастереомерами гуанідіногідантоїну (при відновленні утворюється новий хіральний центр).

Індивідуальні діастереомери (G+6)pT здатні до ізомеризації за рахунок кето-єнольної таутомерії протона Н*. При окисленні обох ізомерів (G+6)pT утворюється єдиний продукт (G+4)pT, що доводить його структуру.

Запропоновано можливий механізм утворення дегідрогуанідіногідантоїну через утворення 5,8-дигідроксигуаніну з наступним декарбоксилуванням при С-6.

При окисленні вільного дезоксигуанозину утворюється не сполука G+4, а похідна імідазолону. При окисленні залишку гуаніну в складі одноланцюгової ДНК утворюється близько 50% продукту G+4 (у випадку короткого GpT - близько 10%), тоді як при окисленні дуплексної ДНК G+4 є основним продуктом реакції. Ймовірно, це зв'язано з утворенням водневих зв'язків у дволанцюговій і меншою мірою одноланцюговій ДНК, які стабілізують структуру G+4.

Отже, комбінацією хімічної модифікації нестійкого інтермедіату та ЯМР-аналізу стабільного продукту вперше вдалось встановити структуру одного з основних продуктів окислення ДНК металокомплексами. Цей результат важливий і для розуміння механізмів процесів, які відбуваються при радіолізі ДНК.

Синтез та деякі властивості дезоксирибозилсечовини. Серед продуктів розпаду ДНК під дією окисників та іонізуючої радіації знайдені похідні сечовини. При окисленні гуаніну в олігонуклеотидах Mn-TMPyP детектують продукти з молекулярною масою, що відповідає перетворенню гуаніну в залишок сечовини. В рамках дослідження механізму дії хімічних нуклеаз ми отримали 2'-дезоксирибозид сечовини. Вибір методів синтезу цього глікозиду обмежений. Розроблений нами новий, значно ефективніший від відомих, метод синтезу включає окислення 5'-захищеного тимідину 55 KMnO₄ з утворенням тимідингліколю 56 та його гідроліз при рН 12. В ПМР-спектрі продукту 57 присутні набори сигналів двох ізомерів у співвідношенні 3:1. За допомогою ефекту Оверхаузера встановлено, що сполука 57 зразу ж після синтезу є сумішшю a- та b-аномерів, у якій a-аномер є основним компонентом (75%), хоча отримана вона з b-тимідину 55. При зберіганні в розчині співвідношення аномерів поступово змінюється приблизно до 55:45. В результаті глікозиди сечовини не вдається виділити в аномерно чистій формі. Ізомеризація суміші аномерів 57 досить повільна, тому можна припустити, що джерелом неочікуваної появи a-аномера може бути легкість ізомеризації інтермедіату 56.

Частину 5'-захищеного глікозиду 57 детритилювали з утворенням 2'-дезоксирибозилсечовини 58. Спектр ¹Н-ЯМР продукту виявився досить складним, оскільки ця сполука з вільною 5'-ОН-групою здатна до ізомеризації в піранозидну структуру. В результаті утворюється рівноважна суміш аномерів фуранозиду 58а та піранозиду 58b із співвідношенням компонентів приблизно 3:10:2:5.

Хімічні нуклеази на основі 1,4,7-тріазациклононану (TACN). Останнім часом широко вивчаються нуклеолітичні властивості координаційних комплексів макроциклів, серед яких 1,4,7-тріазациклононан 59. Відомо, що деякі його комплекси здатні розщеплювати НК. Особливо цікавими є комплекси лантаноїдів, які не мають окислювальних властивостей і здійснюють розщеплення за гідролітичним механізмом. Ми дослідили каталітичну активність комплексів TACN з рядом перехідних металів у реакціях розщеплення РНК та ДНК.

Експерименти на модельному дирибонуклеотиді АрА проводили з 5 екв. комплексів TACN з Co(II), Cu(II), Eu(III), Fe(III), Mn(II), Tb(III), V(III), V(IV) та Zn(II). Реакції розщеплення контролювали обернено-фазовою ВЕРХ. Основними продуктами розщеплення АрА є аденозин і його 3'-фосфат, тобто реакція йде за гідролітичним механізмом. Сам TACN неактивний, як і солі металів за його відсутності. Лише комплекси міді, європію та тербію були активними в ряду Cu(II) < Tb(III) < Eu(III). Комплекс Eu³⁺ гідролізував 33% ApA за 48 год. при кімнатній температурі та рН 7.4. Отже, комплекси TACN з лантаноїдами Eu³⁺ і меншою мірою Tb³⁺ (вихід реакції 22%) демонструють значну гідролітичну активність. Помітно нижчою є ефективність комплексу Cu²⁺ (9%), а інші метали, в т.ч. сильні окисники, не виявили нуклеазної активності.

Експерименти з розщеплення ДНК проводили з плазмідою pBR322. Реакційні суміші аналізували електрофорезом в агарозному гелі і кількісно визначали вміст НК в смугах за флуоресценцією бромистого етидію.

Продуктами розщеплення суперспіралізованої дволанцюгової плазмідної ДНК (форма І) є відкрита кільцева (форма ІІ) та лінійна (форма ІІІ) ДНК. Форма ІІ утворюється в результаті одинарного розриву в одному з ланцюгів ДНК, а форма ІІІ є результатом другого розриву в комплементарному ланцюзі близько до першого сайту розщеплення (Табл. 3).

Таблиця 3 Вміст форм плазмідної ДНК в реакційних сумішах, отриманих при дії комплексів TACN на плазміду pBR322. К - контроль (плазміда в 50 мМ HEPES, 0.5 мМ TACN, метал відсутній)