Хімічна модифікація олігонуклеотидів і синтез їх кон’югатів

Форма плазміди	Металокомплекс TACN, мМ
	Cu (ІІ)	Eu (ІІІ)	Tb (ІІІ)	Fe (ІІІ)	Mn (ІІ)	V (ІІІ)	Zn (ІІ)	К
	0,5	0,1	0,5	0,1	0,5	0,1	0,5	0,1	0,5	0,1	0,5	0,1	0,5	0,1
I	0	72	59	74	55	73	0	68	40	76	13	75	74	77	77
II	93	28	41	26	45	27	83	32	60	24	80	25	26	23	23
III	7	0	0	0	0	0	17	0	0	0	7	0	0	0	0

Якщо 0,5 мМ комплекси були ефективними нуклеазами, в концентрації 0.1 мМ жоден з них не продемонстрував значної активності.

Здатність комплексів TACN здійснювати дволанцюгові розриви в ДНК досить неочікувана, оскільки відомо мало невеликих молекул з такою активністю. Утворення лінійної ДНК відбувається переважно в результаті інтеркаляції реагента в двоспіральну ДНК, що в даному випадку малоймовірно.

Розщеплення ДНК проходило без зовнішніх активаторів, на відміну від комплексів, які вимагають додавання окисника (Н₂О₂, KHSO₅ тощо). Здається ймовірним, що розщеплення комплексами TACN (в 1-шу чергу лантаноїдними) відбувається шляхом гідролізу міжнуклеотидних зв'язків.

Синтез олігонуклеотидного кон'югату TACN. В роботі вперше отримано олігонуклеотидний кон'югат TACN. Для цього розробили метод синтезу похідної макроциклу з N-карбоксиалкільною лінкерною групою. N-алкільний замісник залишає вільною електронну пару на атомі азоту і не має негативного впливу на комплексоутворення, на відміну від N-ацильних похідних.

Проалкілювати N,N'-діацильовану похідну TACN 60 6-хлорбутанолом у присутності K₂CO₃ та KI або іншими методами не вдалось. Алкілювання 60 5-бромвалеріановою кислотою теж не привело до утворення похідної 62, що містить вільну СООН-групу. Ймовірною причиною може бути швидке перетворення галогенкарбонової кислоти у малоактивний лактон в основних умовах. Проте реакція з етил-5-бромвалератом в цих умовах пройшла легко і з хорошим виходом (86%) отримали сполуку 63. Не вдалось селективно гідролізувати естерну групу в інтермедіаті 63 з утворенням похідної 62 без одночасного відщеплення N-трифторацетильних груп. Для отримання реагента 62 застосували двостадійний процес: кислотним гідролізом 63 повністю деблокували, після чого аміногрупи інтермедіату 64 повторно ацилювали етилтрифторацетатом.

Реагент 62 використали для введення TACN в олігонуклеотид. В реакцію з похідною 62 вводили 5'-аміноалкіл-T₁₅ (65) у присутності активатора ВОР-НОВТ. Продукт конденсації обробляли водним аміаком для відщеплення N-трифторацетильних захисних груп від макроциклу, після чого кон'югат 66 очищали гель-електрофорезом (вихід 47%).

Нуклеазну активність комплексів TACN-T₁₅, вивчали на поліаденіловій кислоті. Кон'югат 66 інкубували з полі-А в присутності солей Cu(II) та Eu(III) (1.5 екв. відносно ліганда). Співвідношення Т/А в реакційній суміші становило близько 1:7. Як і у випадку АрА, комплекс європію був значно активнішим, ніж комплекс міді, з яким розщеплення РНК не спостерігалось. Комплекс TACN-T₁₅ з Eu³⁺ виявився гідролітично активним. Під його дією розщеплювалось близько 30% полі-А. При цьому не спостерігалось помітного розщеплення T₁₅, тобто в дуплексі ДНК/РНК деградує в основному РНК.

Потрійні кон'югати олігонуклеотидів

Кон'югати металопорфірин-олігонуклеотид-флуорофор. Як описано вище, синтез кон'югатів флуоресцентних порфіринів малоефективний, тому ми розробили метод синтезу флуоресцентно мічених кон'югатів олігонуклеотидів з Mn-порфірином. Вперше було отримано гібриди 67, що містять одночасно флуоресцентну мітку та хімічну нуклеазу.

Для введення флуорофора в 3'-кінець олігонуклеотида його синтез проводили на модифікованому барвником носії. Порфірин приєднували до 5'-аміномодифікованих олігомерів, мічених флуоресцеїном, в присутності реагента ВОР. В процесі реакції спостерігалось утворення нового типу побічного продукту внаслідок ацилювання фенольного гідроксилу барвника активованим порфірином. Ця побічна реакція виявилась оборотною: в кислому середовищі флуоресцеїновий хромофор регенерується. Значно покращував ефективність реакції кон'югації короткочасний гідроліз надлишку ВОР перед додаванням амінокомпонента, що виключає активацію СООН-групи флуоресцеїну.

Спектри поглинання кон'югатів 67при pH 8 містять смуги олігонуклеотида (260 нм), металопорфірину (468 нм) та флуоресцеїну (494 нм). Молекулярні маси кон'югатів, отримані з електроспрей-мас-спектрів, виявились на 17 одиниць нижчими від очікуваних. Встановлено, що це є наслідком трансформації фрагменту тіосечовини -NH-CS-NH- у гуанідинову групу -NH-C(NH)-NH- в лінкері під час високотемпературного амонолізу модифікованого олігомера. Під час амонолізу при кімнатній температурі така трансформація практично не відбувається.

Синтез флуоресцентно міченого кон'югату олігонуклеотид-пептид. Для досягнення своєї біологічної мішені антисенсовий реагент повинен в першу чергу проникнути через клітинну мембрану. Ускладнений транспорт гідрофільних олігонуклеотидів через ліпофільні плазматичні мембрани суттєво обмежує їхнє терапевтичне застосування. Одним із шляхів покращення транспорту є кон'югація олігонуклеотидів з переносниками, до яких відносяться і транспортні пептиди. Для дослідження транспорту кон'югатів олігонуклеотид-пептид у клітину дуже важливою є легкість детекції. Ми синтезували олігонуклеотид, до 3'-кінця якого приєднано флуоресцентну групу, а до 5'-кінця - транспортний пептид.

В роботі використали олігонуклеотид 18bGal та пептид Cys-Thr-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-CONH₂, фрагмент транспортного домену великого Т-антигена вірусу SV40, на N-кінці якого міститься залишок цистеїну, через який зручно проводити кон'югацію. Олігонуклеотид 18?Gal, що містив флуоресцеїн на 3'-кінці, отримали твердофазним синтезом на модифікованому носії 14. В 5'-кінець олігомера вводили аміноалкільну групу і деблокували олігонуклеотид 68 амонолізом при кімнатній температурі.

Для кон'югації з пептидом застосували метод утворення тіоетерного зв'язку через залишок цистеїну. В аміноалкіл-олігонуклеотид 68 селективно вводили йодацетильну групу обробкою надлишком йодоцтового ангідриду у водно-органічному буфері (рН 8). За даними ВЕРХ, практично повна трансформація в йодацетамід 69 відбувається вже за 2 год., і при цьому не фіксується утворення помітної кількості побічних продуктів. Кон'югацію 69 з пептидом (10 екв) проводили у слабкоосновному водному буфері (рН 8). Реакція утворення гібриду 70 проходила швидко (2 год.) та чисто.

Структуру гібриду 70 підтвердили методом електроспрей-мас-спектрометрії (експериментальна молекулярна маса 7565,5, обчислена 7566,98).

Синтез олігонуклеотидів та їхніх аналогів у розчині

Н-фосфонатний синтез олігонуклеотидів у розчині. Н-Фосфонатний метод широко використовується в твердофазному синтезі олігонуклеотидів та їхніх аналогів. Проте для синтезу в розчині, де на кожній стадії проводиться очистка продуктів, він не застосовувався, оскільки продукти конденсації - динуклеозид-Н-фосфонати - гідролітично нестійкі і в процесі виділення розкладаються. Однак лише синтез у розчині дозволяє отримувати олігонуклеотиди в препаративному масштабі десятків та сотень міліграмів, що необхідно для деяких задач біології та медицини. Нами запропоновано новий синтетичний підхід - Н-фосфонатний синтез у розчині, що ґрунтується на окисленні нестійких діестерів фосфористої кислоти перед виділенням продуктів конденсації.

Синтетичний цикл включає стадії конденсації Н-фосфонату 71 з ОН-компонентом 72 і окислення утвореного відносно нестійкого інтермедіату 73 водним йодом безпосередньо в реакційній суміші. Стійкий діестер 74 виділяють і детритилюють. Отриманий таким чином димер 75 вводять в конденсацію з наступним Н-фосфонатом з утворенням тримера 76, і т.д.

Встановлено, що додатковий реакційний центр, що з'являється в продуктах конденсації 74-76, - міжнуклеотидний фосфат, - в умовах синтезу не вступає в побічні реакції. Фосфодіестери типу 74 і 76, а також детритильовані олігомери 75, виділяли за допомогою обернено-фазової хроматографії на триметилсиліл-силікагелі. Цим же методом очищали і повністю деблоковані кінцеві продукти. Виходи детритильованих N,3'-O-захищених олігомерів типу 75 становили 60-95%.

Ефективність методу доведена синтезом ряду олігодезоксинуклеотидів, серед яких модельні оліготимідилати (Tp)₄T і (Tp)₇T та октамер GGAATTCC (лінкер EcoRI). Крім цього, синтезовано ди- та тримери AT, AC, AG та ATC, які використовували для вивчення збуджених станів НК та процесів переносу енергії в ДНК. Цим методом отримано і (2'-5')-олігоаденілати.

Синтез (2'-5')-олігоаденілатів із використанням О-нуклеофільного каталізу. (2'-5')-Олігоаденілати (2-5А) відіграють ключову роль в механізмі противірусної дії інтерферону, процесах диференціації клітин, апоптозу і є перспективними медичними препаратами. Природні 2-5А швидко розпадаються в клітині під дією нуклеаз, а їхні аналоги, які містять модифікації, в тому числі такі, що підвищують стійкість до нуклеаз, часто мають вищу біологічну активність. Було розроблено метод синтезу 2-5А фосфотриестерним методом у розчині з використанням каталізатора конденсації N-окису 4-етоксипіридину (ЕРО) О-нуклеофільні каталізатори поєднують високу нуклеофільність з низькою основністю і забезпечують м'які умови проведення реакції, що важливо в синтезі досить лабільних олігорибонуклеотидів. Отримали триаденілат 81a та його аналоги, що містять на 3'-кінці епоксигрупу (81b) чи залишок кордицепіну (81c).

Нуклеотидним компонентом конденсацій служив фосфодіестер 77, ОН-компонентами похідні нуклеозидів 78a-c. Використовували активуючий реагент TPSCl (2,5 екв відносно Р-компонента) та каталізатор конденсації EPO. В реакцію в піридині чи ацетонітрилі вводили 3 екв. N-окису відносно TPSCl та 25% надлишок P-компонента відносно ОН-компонента. В синтезі спостерігались висока швидкість конденсацій (4-5 хв.) та їх вихід (86-92%). Тримери 81 очищали іонообмінною хроматографією (загальний вихід 25-35%).Для порівняння сполуки 81a-c отримали з використанням N-нуклеофільного каталізатора метилімідазолу. В цьому випадку реакції конденсації проходили значно повільніше (до 15 хв.) та з нижчими виходами (80-85%), і утворювались менш чисті реакційні суміші.

Отже, використання О-нуклеофільного каталізу конденсації дозволило досягти високої ефективності синтезу олігоаденілатів.

Біологічна активність деяких модифікованих олігонуклеотидів

Терапевтичний та профілактичний ефект епокси-(2'-5')-олігоаденілату при аутоімунному пошкодженні міокарду. В дослідженнях, проведених спільно з к.б.н. Л.Л. Сидорик та д.б.н. П.В. Погрібним, вивчили терапевтичний ефект 3'-епокси-аналога триаденілату 81b в розвитку експериментального аутоімунного пошкодження міокарда. Встановлено, що препарат у низьких концентраціях має імуномодулюючу та кардіопротекторну дію на мишей з міозин-індукованим пошкодженням міокарда. При цьому виражений вплив спостерігався при введенні дози препарату 5 мкг/кг, що призводило до зниження рівня антитіл проти міозину мишей та значного зменшення ступеня пошкодження міокарда вже на 14-ту добу. Імуномодулюючий ефект вищої дози (50 мкг/кг) виявився менш чітким, проте зберігався довше. 81b позитивно впливав і на розвиток пошкодження міокарду при профілактичному введенні (за день до імунізації). При цьому більшим виявився вплив вищої дози препарату: на 14-ий день після введення доз 5 та 50 мкг/кг рівень антитіл проти міозину був відповідно в 2 та 6 разів нижчим, ніж у мишей контрольної групи. Таким чином, тринуклеотид 81b є перспективним препаратом для терапії та профілактики серцевих хвороб, пов'язаних із аутоімунним пошкодженням міокарду.

Вплив олігоаденілатів на проліферацію і міграцію стовбурових клітин кісткового мозку. При дослідженні впливу 2-5А на деякі функції стовбурових клітин кісткового мозку (ККМ), проведеному спільно з к.б.н. З.Ю. Ткачуком, встановлено, що нормальний триаденілат 81a та його епокси-аналог 81b стимулюють проліферацію ККМ мишей in vitro. Природний тример гальмував апоптозні процеси в клітинах, а при концентрації 10^-6-10^-7 М стимулював їхню проліферацію. Його аналог 81b теж гальмував апоптоз в ККМ (в концентрації 10^-5 М майже вдвічі). Він також підвищував рівень проліферації, і в концентрації 10^-6 М відповідний показник зростав удвічі. Показана здатність олігоаденілатів 81a-b у низьких концентраціях (10^-5-10^-6 М) стимулювати міграцію та включення клітин кісткового мозку мишей-донорів у селезінку мишей-реципієнтів при сингенній трансплантації in vivo. Отже, 2'-5'-олігоаденілати можуть бути перспективними препаратами при лікуванні онкологічних хвороб та захворювань крові.

Антисигнатурні олігонуклеотиди як протимікробні засоби. Антисенсові олiгонуклеотиди, комплементарні до певних ділянок мРНК, мають ряд недолiків, основним з яких є необхiднiсть забезпечити їх високу концентрацiю в клiтині, оскільки з кожного гена утворюється значна кiлькiсть копій молекул мРНК, якi слід блокувати. Член-кореспондент НАН України І.Г. Скрипаль запропонував принципово новий пiдхід до створення антимiкробних засобiв на основі олiгонуклеотидiв, у якому мішенями є консервативні, так званi сигнатурнi дiлянки рибосомних РНК мiкроорганiзмiв, зокрема, 16S рРНК. Механізм інгібування може ґрунтуватися на зв'язуванні реагентів з рРНК, що спричиняє блокування процесу її просторової укладки та складання малої субодиниці рибосоми.

У співпраці з І.Г. Скрипалем вивчено процеси пригнічення молікутів модифікованими олігонуклеотидами, комплементарними до деяких сигнатурних ділянок 16S рРНК та рибосомного оперону ДНК цих мікроорганізмів. Показано, що олігонуклеотиди, модифiкованi iмiдазофеназином, ефективно інгібують транскрипцiю в молiкутах in vitro. Так, транскрипцiя пригнічувалась реагентами ОІ-4 і ОІ-5 (див. Табл. 1) на 79-80%, а ОІ-3 на 54%. Ефективність модифiкованих олiгомерів суттєво вища, нiж немодифiкованих аналогiв.

Процес трансляції в безклітинній системі in vitro найефективніше (до 60%) пригнічували олігонуклеотиди, комплементарні до 3'-кінцевої ділянки 16S рРНК. Реагент ОІ-6 інгібував трансляцію на 60%, однак його немодифікований аналог продемонстрував практично таку ж активність (58%), а аналог ОІ-7 із двома залишками Pzn виявився майже вдвічі менш ефективним (35% інгібування). Отже, модифікація імідазофеназином не збільшує ефективність інгібування трансляції.

Вивчено процес пригнічення білкового синтезу in vivo у молікутів Mycoplasma fermentans та Acholeplasma laidlavii тіофосфатними аналогами олігонуклеотидів, комплементарних до ділянок 16S рРНК, що відповідають за зв'язування з рибосомним білком S4. Тіоаналоги значно стійкіші до дії нуклеаз порівняно з природними олігомерами. Використано такі послідовності, отримані Н-фосфонатним методом (ps - тіофосфатна група):

ТА-1: 5'-CpsApsTpsApsGpsTpsTpsApsG-3'

ТА-2: 5'-CpsTpsApsTpsGpsTpsApsTpsTpsA-3'.

Реагенти комплементарні відповідно до сигнатурної ділянки 499-507 усіх мікоплазм та ділянки 523-532 усіх молікутів. Вплив на трансляцію спостерігався вже в концентрації 250 нМ, а максимальний рівень пригнічення біосинтезу білка (57-73% через 4 год.) досягався при концентрації реагентів 1 мкМ, і при її збільшенні в 10 разів практично не змінювався. Отже, оптимальна концентрація реагентів для пригнічення трансляції становить 0,5-1 мкМ. Тіофосфатні аналоги ефективно гальмують ріст клітин мікроорганізмів in vivo в дуже низьких концентраціях (100 нМ), причому при одночасному використанні двох реагентів, комплементарних до різних ділянок 16S рРНК (50 нМ кожного), досягається майже повне (95-98%) пригнічення молікутів.



Висновки

У дисертації наведено нове вирішення наукової проблеми, що полягає у розробці ефективних методів синтезу модифікованих олігонуклеотидів та олігонуклеотидних кон'югатів. Запропоновано комплекс синтетичних підходів, що охоплює всі основні аспекти хімічної модифікації олігонуклеотидів та ковалентного приєднання до них інших молекул різних класів, і вивчено деякі фізико-хімічні та біологічні властивості отриманих сполук.

1. Створено нові полімерні носії на основі мікросферичного аеросилогелю “Силохром-2” для синтезу олігонуклеотидів, у т.ч. 3'-модифікованих.

2. Запропоновано нові Н-фосфонатні та фосфітамідні реагенти для модифікації олігонуклеотидів, які дозволяють отримувати кон'югати по 5'- та 3'-кінцю, а також у будь-якому місці всередині послідовності.

3. Досліджено реакції конденсації з використанням фосфонієвих та уронієвих активуючих реагентів, які дають змогу в м'яких умовах приєднувати до олігонуклеотидів широкий спектр молекул, а також отримувати полімерні носії.

4. Синтезовано серію олігонуклеотидів, модифікованих глікозидами iмiдазофеназину. Розроблено нові реагенти для модифікації олігонуклеотидів імідазофеназином через лінкерну групу. Встановлено, що приєднаний барвник, стабілізує комплекси олігонуклеотидів, підвищуючи температуру плавлення на 10-12°С для дуплексних i на 15-20°С для триплексних структур.

5. Запропоновано метод синтезу кон'югатів олігонуклеотидів з хімічною нуклеазою - Mn(III)-комплексом тетра(4-N-метилпіридиній)порфірину. Вперше отримано кон'югати флуоресцентних катіонних порфіринів (неметалізованого та Zn-комплексу). Вперше синтезовано олігонуклеотиди, які містять металопорфірин у внутрішніх 2'-положеннях, що дозволяє досягти оптимального позиціонування нуклеази відносно сайту розщеплення та її високої специфічності.

6. За допомогою хромато-мас-спектрометрії та 2D-ЯМР ідентифіковано новий продукт окислення гуаніну - дегідрогуанідіногідантоїн. Запропоновано новий метод детекції 5'-альдегідних фрагментів розщеплення ДНК, який поєднує хімічну модифікацію та хромато-мас-спектрометрію. Встановлено структуру аддуктів тимідин-5'-альдегіду з О-алкілгідроксиламіном та трісом. Розроблено метод синтезу дезоксирибозилсечовини, одного з продуктів окислення ДНК.

7. Показано, що комплекси 1,4,7-тріазациклононану з Cu(ІІ), Eu(ІІІ) та Tb(ІІІ) активно розщеплюють дирибонуклеотид АрА. Комплекси цих металів, а також Co(ІІ), Fe(ІІІ), Mn(ІІ) і V(ІІІ) виявили нуклеазну активність щодо ДНК. Вперше отримано олігонуклеотидний кон'югат TACN. Встановлено, що європієвий комплекс T₁₅-TACN здатен розщеплювати поліаденілову кислоту.

8. Вперше поєднанням твердофазного синтезу на модифікованих носіях та пост-синтетичної кон'югації отримано потрійні гібриди флуорофор-олігонук-леотид-металопорфірин та флуорофор-олігонуклеотид-транспортний пептид.

9. Вперше запропоновано новий метод олігонуклеотидного синтезу - Н-фосфонатний синтез у розчині. Вперше проведено синтез (2'-5')-триаденілату та його аналогів, що містять 3'-кінцевий залишок епокси-аденозину та кордицепіну, фосфотриестерним методом з використанням О-нуклеофільного каталізу.

10. Встановлено, що (2'-5')-олігоаденілати стимулюють проліферацію та міграцію стовбурових клітин кісткового мозку мишей та впливають на їхній апоптоз. Показано, що епокси-аналог (2'-5')-триаденілату в концентрації 5-50 мкг/кг має імуномодулюючу та кардіопротекторну дію.

11. Встановлено, що антисигнатурні олігонуклеотиди, модифіковані іміда-зофеназином, інгібують in vitro процеси транскрипції (до 80%) та трансляції (до 60%) у молікутів. Тіофосфатні аналоги інгібують трансляцію ефективніше (до 73% в концентраціях 0,5-1 мкМ), а при одночасному використанні двох аналогів, комплементарних до різних ділянок 16S рРНК, при концентрації 50 нМ кожного досягається майже повне (95-98%) пригнічення молікутів in vivo.



Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Дубей И.Я., Ляпина Т.В., Федоряк Д.М. Синтез олигонуклеотидов Н-фосфонатным методом в растворе // Биоорг. химия. - 1992. - T. 18, № 4. - C. 550-554.

2. Дубей И.Я., Ляпина Т.В., Галкин А.П., Федоряк Д.М. Получение высоко-эффективного полимерного носителя на основе микросферического аэросилогеля “Силохром-2” для твердофазного синтеза фрагментов ДНК // Биополимеры и клетка. - 1993. - T. 9, № 4. - C. 26-31.

3. Дубей И.Я., Ляпина Т.В., Федоряк Д.М. Микросферический аэросилогель “Силохром-2” - высокоэффективный носитель для твердофазного синтеза олигонуклеотидов // Биоорг. химия. - 1993. - T. 19, № 5. - C. 589-592.

4. Dubey I.Y., Fedoryak O.D., Tkachuk O.M., Fedoryak D.M. Preparation of the fluorescein reagent for solid-phase oligonucleotide 5'-labelling and its use for the synthesis of fluorescently labelled PCR primers for HIV-1 detection // Биополимеры и клетка. - 1995. - T. 11, № 3-4. - C. 35-41.

5. Егоров О.В., Скрипаль И.Г., Дубей И.Я., Федоряк О.Д., Федоряк Д.М. Ингибирование трансляции in vivo у молликутов тиофосфатными аналогами олигодезоксирибонуклеотидов // Мікробіол. журн. - 1996. - T. 58, № 4. - C. 11-19.

6. Yarmoluk S.M., Kostenko A.M., Kryvorotenko D.V., Dubey I.Y. Nucleoside N-acylation with active derivatives of amino acids // Биополимеры и клетка. - 1996. - T. 12, № 5. - C. 50-55.

7. Skripal I.G., Babichev V.V., Panchenko L.P., Egorov O.V., Korobkova K.S., Dubey I.Y., Fedoryak D.M., Shalamay A.S. Antisignature oligonucleotides and their analogs as inhibitors of mollicutes - cofactors of HIV // Мікробіол. журн. - 1997. - T. 59, № 2. - C. 3-11.

8. Dubey I., Pratviel G., Meunier B. Preparation of cationic non-metallated- or zinc-porphyrin-oligonucleotide fluorescent conjugates // Compt. Rend. Acad. Sci. (Paris). - 1998. - T.1, Ser. IIc. - P. 259-267.

9. Зозуля В.М., Благой Ю.П., Дубей І.Я., Федоряк О.Д., Щербакова А.С., Федоряк Д.М. Стабілізація дуплексних та триплексних комплексів оліготимідилату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину // Биополимеры и клетка. - 1998. - T. 14, № 1. - C. 54-61.

10. Yarmoluk S.M., Kostenko A.M., Kornushyna O.S., Dubey I.Y. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. 4. Efficient 5'-fluorescent labelling of oligonucleotides with monomethyne pyrylium cyanine dye Cyan 39 // Биополимеры и клетка. - 1998. - T. 14, № 1. - C. 82-86.

11. Dubey I.Y., Fedoryak D.M. Synthesis and use of disulfide-based H-phosphonate reagent for 3'- and/or 5'-oligonucleotide labelling via mercaptoalkyl linker // Биополимеры и клетка. - 1998. - T. 14, № 2. - C. 163-172.

12. Dubey I., Pratviel G., Meunier B. Modification of the thiourea linkage of fluorescein-oligonucleotide conjugate to a guanidinium motif during ammonia deprotection // Bioconjugate Chem. - 1998. - V.9, № 5. - P. 627-632.

13. Макітрук В.Л., Шаламай А.С., Дубей І.Я., Федоряк Д.М. Синтез та вивчення антисенсових олігонуклеотидів, модифікованих імідазофеназиновими нуклеозидами // Биополимеры и клетка. - 1999. - T.15, № 5. - C. 367-373.

14. Zozulya V., Shcherbakova A., Dubey I. Calculating helix-to-coil transitions of duplexes formed by phenazine-conjugated oligonucleotide, using fluorescence melting data // J. Fluorescence. - 2000. - V.10, № 1. - P. 49-53.

15. Дубей І.Я., Дубей Л.В. Препаративний синтез та деякі властивості 2'-дезоксирибозилсечовини, продукту окислювальної деградації ДНК // Біополімери і клітина. - 2001. - T. 17, № 4. - C. 325-330.

16. Dubey I., Pratviel G., Meunier B. Synthesis and DNA cleavage of 2'-O-aminolinked metalloporphyrin-oligonucleotide conjugates // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1. - 2000. - № 18. - P. 3088-3095.

17. Yarmoluk S.M., Kostenko A.M., Dubey I.Y. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. XIX. New method for the covalent labeling of oligonucleotides with pyrylium cyanine dyes // Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2000. - V. 10, № 19. - P. 2201-2204.

18. Dubey I., Pratviel G. Robert A., Meunier B. Convenient method for the preparation of 2'-deoxyribosylurea by thymidine oxidation and NMR study of both anomers // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. - 2001. - V. 20, № 8. - P. 1463-1471.

19. Сидорик Л.Л., Дубей И.Я., Бобык В.И., Козлов А.В., Федоркова О.М., Ковеня Т.В., Рябенко Д.В., Сергиенко О.В., Трунина И.В., Погребной П.В., Мацука Г.Х. Терапевтические эффекты действия различных доз 2'-5'-олигоаденилата при экспериментальном миозининдуцированном повреждении миокарда // Доповіді НАН України. - 2001. - № 9. - C. 161-165.

20. Сидорик Л.Л., Дубей И.Я., Бобык В.И., Козлов А.В., Федоркова О.М., Ковеня Т.В., Рябенко Д.В., Сергиенко О.В., Трунина И.В., Погребной П.В., Мацука Г.Х. Эффекты профилактического действия различных доз 2'-5'-олигоаденилата при экспериментальном миозининдуцированном повреж-дении миокарда // Доповіді НАН України. - 2001. - № 10. - C. 171-174.

21. Angeloff A., Dubey I., Pratviel G., Bernadou G., Meunier B. Characterization of a 5'-aldehyde terminus resulting from the oxidative attack at C5' of a 2-deoxyribose on DNA // Chem. Res. Toxicol. - 2001. - V. 14, № 10. - P. 1413-1420.

22. Chworos A., Coppel Y., Dubey I., Pratviel G., Meunier B. Guanine oxidation: NMR characterization of a dehydro-guanidinohydantoin residue generated by a 2e-oxidation of d(GpT) // J. Am. Chem. Soc. - 2001. - V. 123, № 25. - P. 5867-5877.

23. Кудря В.Ю., Ящук В.М., Дубей І.Я. Збуджені електронні стани нуклеотидів - елементарних ланок ДНК // Вісник фізика (Київський національний університет ім. Т. Шевченка). - 2002. - вип. 4. - С. 39-42.

24. Zozulya V., Blagoi Yu,, Dubey I., Fedoryak D., Makitruk V., Ryazanova O., Shcherbakova A. Anchorage of an oligonucleotide hybridization by a tethered phenazine nucleoside analogue // Biopolymers-Biospectroscopy. - 2003. - V. 72, № 4. - P. 264-273.

25. Dubey L.V., Dubey I.Y. Onium salts as coupling reagents in the preparation of silica polymer supports for solid phase oligonucleotide synthesis // Ukr. Bioorg. Acta. - 2004. - V. 1, № 1-2. - P. 23-28.

26. Dubey L.V., Dubey I.Ya. Side reactions of onium coupling reagents BOP and HBTU in the synthesis of silica polymer supports // Ukr. Bioorg. Acta. - 2005. - T. 2, № 1. - C. 13-19.

27. Dubey L.V., Dubey I.Y. Preparation of bifunctional silica polymer support for the synthesis of 3'-labeled oligonucleotides // Біополімери і клітина. - 2005. - T. 21, № 4. - C. 365-369.

28. Yashchuk V.M., Kudrya V.Yu., Dubey I.Ya., Prasad P.N., Suga H., Golovach G.P., Fedorovych R.D. Synthetic and biological functional macromolecules with excitation-energy transfer for nanoelectronics // Nanosystems, Nanomaterials, Nanotechnologies. - 2006. - V. 4, № 1. - P. 173-188.

29. Дубей І.Я. Кон'югати олігонуклеотидів з інтеркаляторами: синтез та біологічна активність // Ukr. Bioorg. Acta. - 2006. - V. 4, № 1. - P. 42-59.

30. Yashchuk V.M., Kudrya V.Yu., Losytskyy M.Yu., Dubey I.Ya., Ohulchansky T.Y., Suga H., Yarmoluk S.M. The effect of triplet-triplet excitation energy transfer on the DNA self-protection mechanism // Наукові записки НаУКМА: Сер. фіз.-мат. наук. - 2006. - T. 51. - C. 48-56.

31. Дубей І.Я., Федоряк Д.М. Нові реагенти для модифікації олігонуклеотидів імідазофеназином // Ukr. Bioorg. Acta. - 2006. - V.4, № 2. - P. 3-9.

32. Ткачук З.Ю., Дубей І.Я., Яковенко Т.Г., Семерникова Л.І., Шаповал С.О., Артеменко В.С., Дубей Л.В. Синтез 2'-5'-олігоаденілатів та їхній вплив на проліферацію і міграцію стовбурових клітин кісткового мозку мишей in vitro та in vivo // Біополімери і клітина. - 2007. - T. 23, № 1. - C. 14-20.

33. Dubey I., Dubey L., Piletska E., Piletsky S. Metal complexes of 1,4,7-triazacyclononane and their oligonucleotide conjugates as chemical nucleases // Ukr. Bioorg. Acta. - 2007. - V. 5, № 1. - P. 11-19.

34. Дубей І.Я., Дубей Л.В., Федоряк Д.М. Синтез 3'- та 3',5'-модифікованих олігонуклеотидів на функціоналізованому силікагелі “Силохром-2” // Біополімери і клітина. - 2007. - T. 23, № 2. - C. 137-142.

35. Дубей І.Я., Дубей Л.В., Федоряк Д.М., Зозуля В.М. Синтез 5'-кон'югатів олігонуклеотидів з інтеркалятором імідазофеназином // Ukr. Bioorg. Acta. - 2007. - V. 5, № 2. - P. 33-38.

36. Yashchuk V.M., Kudrya V.Yu., Losytskyy M.Yu., Dubey I.Ya., Suga H. Electronic excitation energy transfer in DNA. Nature of triplet excitations capturing centers // Mol. Cryst. Liq. Cryst. - 2007. - V. 467. - P. 311-323.

37. Yashchuk V.M., Kudrya V.Yu., Savchenko I.V., Golovach G.P., Dubey I.Ya., Fedorovich R.D., Suga H., Grazulevicius J.V. Synthetic and biological functional compounds with direct excitons conductivity for nanoelectronic devices // Mol. Cryst. Liq. Cryst. - 2007. - V. 468. - P. 275-288.

38. Дубей І.Я., Дубей Л.В. Синтез (2'-5')-триаденілатів та їх аналогів з використанням О-нуклеофільного каталізу реакції міжнуклеотидної конденсації // Біополімери і клітина. - 2007. - T. 23, № 6. - C. 538-544.

39. Дубей І.Я. Синтез флуоресцентно міченого кон'югату олігонуклеотида з транспортним пептидом на модифікованому носії “Силохром-2” // Біополімери і клітина. - 2008. - Т. 24, № 2. - С. 171-175.

40. Патент № 2224524 Российской Федерации, МПК7 А61К31/7088, С07Н21/64. Олигонуклеотиды для подавления жизнедеятельности патогенных микроор-ганизмов и способ подавления их жизнедеятельности / Скрипаль И.Г., Егоров О.В., Федоряк Д.М., Дубей И.Я. - Заявл. 29.03.2002; опубл. 27.02.2004, Бюл. № 6.

41. Патент № 67139А України, МПК7 А61К35/66, А61К35/76. Спосіб пригнічення життєдіяльності мікроорганізмів блокуванням сигнатурних послідовностей їх рибосомальних рибонуклеїнових кислот комплементарними (антисигнатурними) олігодезоксирибонуклеотидами / Скрипаль І.Г., Єгоров О.В., Федоряк Д.М., Дубей І.Я. - Заявл. 25.07.2003; опубл. 15.06.2004, Бюл. № 6.

42. Dubey I.Y., Lyapina T.V., Fedoryak D.M. H-phosphonate oligonucleotide synthesis in solution // International Congress “Synthetic oligonucleotides: frontiers and problems of practical application”. - Moscow, 23-30 June 1991 / Nucleic Acids Res. Symp. Ser. - 1991. - № 24. - P. 270.

43. Dubey I.Y., Lyapina T.V., Fedoryak D.M. Study of the H-phosphonate synthesis of deoxyoligonucleotides and their derivatives // French-Ukrainian conference “Genes transfer and regulation of their expression in eucaryotes”. - Kiev, 6-10 September 1993. - 2 P.

44. Дубей І.Я., Федоряк О.Д., Ткачук О.М., Федоряк Д.М. Флуоресцентний реагент для твердофазного синтезу нерадіоактивно мічених PCR-праймерів для детекції HIV-1 // Тези доповідей 1-ої Національної науково-практичної конференції з проблем ВІЛ/СНІД. - Київ, 24-26 січня 1995. - С. 52-53.

45. Shcherbakova A., Zozulya V., Dubey I., Lober G., Fedoryak D. Fluorescence study of molecular hybridization of oligonucleotides modified with nucleoside phenazine derivative // World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. - Nice, France, 14-19 September 1997 / Med. Biol. Engin. Comput. - 1997. - V. 35, Suppl. I. - P. 122.

46. Yarmoluk S.M., Kostenko A.M., Dubey I.Y. New approach toward oligonucleotide labeling with cyanine dyes // Abstracts of the 8^th European Conference on Spectroscopy of Biological Molecules. - Twente, The Netherlands, 29 August - 2 September 1999. - P. 9-10.

47. Shcherbakova A., Zozulya V., Blagoi Yu., Dubey I., Fedoryak O., Fedoryak D. Molecular hybridization of decathymidylate modified with a phenazine derivative // Abstracts of the 18^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology Beyond the Genome. - Birmingham, UK, 16-20 July 2000. - P. 456.

48. Федоряк Д.М., Дубей І.Я., Скрипаль І.Г. Антисигнатурні олігонуклеотиди - новий підхід до створення антимікробних засобів // VIII з'їзд Українського біохімячного товариства. - Чернівці, 1-3 жовтня 2002 / Укр. біохім. журн. - 2002. - Т. 74, № 46 (дод. 2). - C. 13.

49. Danylchenko N., Dubey I., Zozulya V., Ryazanova O. Tethered phenazine nucleoside analogue as a stabilizer of antisense oligonucleotide hybridization // Abstracts of the 10^th European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules. - Szeged, Hungary, 30 August - 4 September 2003. - P. 100.

50. Dubey I., Davidenko I., Popov S. DNA labeling with imidazo[4,5-b]phenazine intercalating agent // Abstracts of the 20^th International Congress on Heterocyclic Chemistry. - Palermo, Italy, 31 July - 5 August 2005. - P. 356.

51. Zozulya V., Ryazanova O., Shcherbakova A., Dubey I. Imidazophenazine nucleoside analogue as a fluorescent probe and stabilizer of antisense oligonucleotide hybridization // Abstracts of the XXVIII European Congress on Molecular Spectroscopy. - Istanbul, Turkey, 3-8 September 2006. - P. 119.

52. Дубей І.Я., Дубей Л.В., Бобик В.І., Козлов О.В., Рябенко Д.В., Сергієнко О.В., Погрібний П.В., Солдатенко М.О., Сидорик Л.Л. Терапевтичний ефект епокси-аналога 2'-5'-олігоаденілату на аутоімунне міозин-індуковане пошкодження міокарда: експериментальне дослідженя // Матеріали ІХ Українського біохім. з'їзду. - Харків, 24-27 жовтня 2006. - Т. 2. - С. 50-51.

53. Yashchuk V.M., Kudrya V.Yu., Fedorovich R.D., Dubey I.Ya., Savchenko I.O., Golovach G.P., Suga H. New molecular functional structures based on the DNA fragments with neutral and charged excitations energy transfer for organic nanoelectronics // Abstracts of the Winter School on Organic Electronics. - Planneralm, Austria, 27 January - 2 February 2007. - P. 46.



Анотація

Дубей І.Я. Хімічна модифікація олігонуклеотидів і синтез їх кон'югатів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора хімічних наук за спеціальністю 02.00.10 - біоорганічна хімія. - Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2008.

Дисертацію присвячено розробці методів хімічного синтезу модифікованих олігонуклеотидів та кон'югатів. Запропоновано нові полімерні носії для синтезу природних та модифікованих олігонуклеотидів, Н-фосфонатні та фосфітамідні реагенти для функціоналізації та введення репортерних груп в олігонуклеотиди. Розроблено ефективні методи синтезу кон'югатів із флуоресцеїном, імідазо[4,5-b]феназином, катіонними порфіринами та їхніми металокомплексами, 1,4,7-тріазациклононаном (TACN). Отримано потрійні гібриди флуоресцентно мічених олігонуклеотидів з металопорфірином та транспортним пептидом.

Вивчено нуклеазну активність порфірину Mn-TMPyP та комплексів TACN з перехідними металами. Встановлено структуру та запропоновано методи детекції ряду нестабільних продуктів розщеплення ДНК хімічними нуклеазами.

Досліджено біологічну активність (2'-5')-олігоаденілатів та модифікованих антисигнатурних олігонуклеотидів.



Аннотация

Дубей И.Я. Химическая модификация олигонуклеотидов и синтез их конъюгатов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия. - Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2008.

Диссертация посвящена разработке методов химического синтеза модифицированных олигонуклеотидов и олигонуклеотидных конъюгатов.

В работе предложены новые полимерные носители для олигонуклеотидного синтеза на основе микросферического аэросилогеля “Силохром-2”. Получены полимеры, содержащие защищенную алифатическую аминогруппу, а также модифицированные флуоресцеином, позволяющие получать меченые олигомеры непосредственно в процессе твердофазного синтеза.

Разработаны новые Н-фосфонатные и фосфитамидные реагенты для функционализации олигонуклеотидов и введения в них репортерных молекул. В их числе универсальный Н-фосфонатный дисульфидный реагент, позволяющий вводить тиольные группы как в 3'-, так и в 5'-конец последовательности. Пост-синтетическая модификация полученных тиольных производных позволяет получать олигонуклеотиды с одной или двумя репортерными группами. Н-фосфонатное производное флуоресцеина позволяет синтезировать 5'-меченые олигонуклеотиды твердофазным методом. Предложен новый метод модификации внутренних положений олигонуклеотидов с использованием производного нуклеозида, содержащего аминоалкильный заместитель в 2'-положении.

Комплексное изучение ониевых активирующих реагентов - фосфониевого BOP и урониевого HBTU - на разных этапах получения модифицированных олигонуклеотидов показало, что они эффективно катализируют реакции образования амидных и сложноэфирных связей как в синтезе полимерных носителей, так и биоконъюгатов. Это позволяет рассматривать эти соединения как универсальные реагенты химии нуклеиновых кислот.

Разработаны эффективные методы синтеза конъюгатов олигонуклеотидов с широким спектром молекул, в большинстве случаев использующие ониевые катализаторы.

Синтезированы олигонуклеотиды, содержащие гликозиды интеркалятора имидазо[4,5-b]феназина, а также разработаны новые реагенты для пост-синтетического введения имидазофеназина через алкильный линкер. Показано, что присоединенный краситель стабилизирует комплементарные комплексы олигонуклеотидов, повышая температуру плавления на 10-12°С для дуплексных и 15-20°С для триплексных структур.

Изучена нуклеазная активность Mn(III)-комплекса катионного порфирина TMPyP. Предложен новый метод синтеза конъюгатов олигонуклеотидов с Mn-TMPyP. Впервые получены конъюгаты флуоресцентных порфиринов TMPyP и его Zn-комплекса. Впервые синтезированы олигонуклеотиды, содержащие остаток порфирина во внутренних 2'-положениях последовательности, что позволяет достичь оптимального позиционирования нуклеазы относительно сайта расщепления и ее высокой специфичнсти.

При помощи хромато-масс-спектрометрии и 2D-ЯМР идентифицирован новый продукт окисления гуанина - дегидрогуанидиногидантоин. Предложен новый метод детекции неустойчивых 5'-альдегидных фрагментов расщепления ДНК, объединяющий химическую модификацию и хромато-масс-спектрометрию.

Установлена структура аддуктов тимидин-5'-альдегида с трисом и О-алкилгидроксиламином. Разработан метод синтеза дезоксирибозилмочевины - одного из продуктов окисления и радиолиза ДНК.

Установлено, что комплексы 1,4,7-триазациклононана (TACN) с Cu(ІІ), Eu(ІІІ) и Tb(ІІІ) активно расщепляют дирибонуклеотид АрА. Эти же комплексы, а также производные Co(ІІ), Fe(ІІІ), Mn(ІІ) и V(ІІІ), проявляют нуклеазную активность относительно ДНК. Впервые получен олигонуклеотидный конъюгат этого азамакроцикла. Показано, что европиевый комплекс T₁₅-TACN способен расщеплять полиадениловую кислоту.

Впервые сочетанием твердофазного синтеза на модифицированных носителях и пост-синтетической конъюгации получены гибриды флуоресцентно меченых олигонуклеотидов с металлопорфирином и транспортным пептидом.

Предложен новый метод олигонуклеотидного синтеза - Н-фосфонатный синтез в растворе. Разработан препаративный метод синтеза (2'-5')-аденилатов и их аналогов, содержащих 3'-концевой остаток эпокси-аденозина и кордицепина, фосфотриэфирным методом в присутствии О-нуклеофильного катализатора.

Исследование биологической активности полученных препаратов показало, что антисигнатурные олигонуклеотиды, содержащие остатки имидазофеназина, а также их тиофосфатные аналоги, эффективно ингибируют транскрипцию и трансляцию в моликутах. (2'-5')-Олигоаденилаты стимулируют пролиферацию и миграцию стволовых клеток костного мозга мишей и влияют на их апоптоз, имеют иммуномодулирующую и кардиопротекторную активность.



Summary

Dubey I.Ya. Chemical modification of oligonucleotides and synthesis of their conjugates. - Manuscript.

Thesis for Doctor of chemical sciences degree in speciality 02.00.10 - bioorganic chemistry. - Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2008.

Thesis is devoted to the development of methods of chemical synthesis of modified oligonucleotides and oligonucleotide conjugates. New polymer supports for the synthesis of natural and modified oligonucleotides, H-phosphonate and phosphitamide reagents for oligonucleotide functionalization and attachment of reporter molecules have been proposed. Efficient methods of the preparation of oligonucleotide conjugates with fluorescein, imidazo[4,5-b]phenazine, cationic porphyrins and their metalocomplexes, and 1,4,7-triazacyclonionane (TACN), have been developed. Triple hybrids of fluorescently labeled oligonucleotides with metaloporphyrin and transport peptide have been obtained.

Nuclease activity of Mn-TMPyP porphyrin and TACN complexes with transition metals have been studied. The structures of some labile products of DNA cleavage by chemical nucleases have been established and methods of their detection have been proposed.

Biological activity of (2'-5')-oligoadenylates and modified antisignature oligonucleotides has been studied.

Размещено на Allbest.ru

...