Гелеві системи на основі акрилових мономерів для іммобілізації стовбурових клітин

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОКОЛОЇДНОЇ ХІМІЇ ІМ. Ф.Д. ОВЧАРЕНКА

УДК 544.773.432; 576.52

Спеціальність 02.00.11 - колоїдна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

ГЕЛЕВІ СИСТЕМИ НА ОСНОВІ АКРИЛОВИХ МОНОМЕРІВ ДЛЯ ІММОБІЛІЗАЦІЇ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН

КОСЕНКО ОЛЬГА ОЛЕКСАНДРІВНА

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка Національної академії наук України.

Науковий керівник: доктор хімічних наук, професор Ульберг Зоя Рудольфівна, Інститут біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка Національної академії наук України, директор

Офіційні опоненти:

доктор хімічних наук, професор Манк Валерій Веніамінович, Національний аграрний університет, професор кафедри колоїдної й органічної хімії та якості пестицидів

доктор хімічних наук, провідний науковий співробітник Рябов Сергій Володимирович, Інститут хімії високомолекулярних сполук Національної академії наук України, старший науковий співробітник

Захист відбудеться " 4 " грудня 2008 р. о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.209.01 при Інституті біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України за адресою: 03142, Київ, бульв. Академіка Вернадського, 42, к. 132.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України (03142, Київ, бульв. Академіка Вернадського, 42, к. 409)

Автореферат розісланий "1" листопада 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 26.209.01, кандидат технічних наук В.А. Прокопенко

Анотації

Косенко О.О. Гелеві системи на основі акрилових мономерів для іммобілізації стовбурових клітин. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.11 - колоїдна хімія. - Інститут біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України, Київ, 2008.

Дисертацію присвячено вивченню колоїдно-хімічних закономірностей та умов синтезу біосумісних щодо мезенхімальних стовбурових клітин гідрогелів на основі акрилових мономерів та розробка на їх основі біокомпозитних покрить для лікування опікових ран. Визначено умови проведення радикальної кополімеризації акрилових мономерів, внаслідок чого утворюються біосумісні гідрогелі, для яких характерним є високий водовміст, достатня механічна міцність й еластичність, та внутрішня структура яких характеризується наявністю нанорозмірних порових комірок. Показано, що ефективність іммобілізації й культивування мезенхімальних стовбурових клітин залежить від складу акрилових гелів та підсилюється інкорпоруванням до структури гідрогелю частинок високодисперсного кремнезему. хімічний колоїдний стовбуровий

Досліджено колоїдно-хімічні закономірності, що визначають біосумісність гідрогелів й ефективність іммобілізації клітин на їх поверхні. Показано, що адгезія клітин до акрилових гідрогелів визначається селективною адсорбцією водорозчинних екзометаболітів на поверхні останніх. Запропоновано уточнений відомий механізм гетероадагуляції клітин до твердих поверхонь. Встановлено закономірності та запропоновано механізми взаємодії гелевих систем з розчинниками різної термодинамічної якості при різних значеннях рН розчину та температури. Досліджено сорбційні властивості акрилових гідрогелів щодо низькомолекулярних та високомолекулярних сполук. Визначено залежність механічних та оптичних параметрів гідрогелів від їх складу. Запропоновано технологічну схему створення біокомпозитних ранових покрить типу "штучна шкіра" призначених для використання при лікуванні опікових ран. Проведено клінічні випробування розроблених ранових покрить.

Ключові слова: акрилові гідрогелі, зшиті полімери, властивості поверхні, гетероадагуляція, адгезія, іммобілізація, стовбурові клітини, біокомпозитні ранові покриття.

Косенко О.А. Гелевые системы на основе акриловых мономеров для иммобилизации стволовых клеток. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата химических наук по специальности 02.00.11 - коллоидная химия. - Институт биоколлоидной химии им. Ф.Д. Овчаренка НАН Украины, Киев, 2008.

Диссертация посвящена изучению коллоидно-химических закономерностей и условий синтеза биосовместимых относительно мезенхимальных стволовых клеток гидрогелей на основе акриловых мономеров и разработке на их основе биокомпозитных покрытий для лечения ожоговых ран. Определены условия проведения радикальной кополимеризации акриловых мономеров, вследствие чего синтезируются биосовместимые гидрогели, для которых характерно высокое водосодержание, достаточная механическая прочность и эластичность, и внутренняя структура которых характеризуется наличием наноразмерных поровых ячеек. Проведено иммобилизацию мезенхимальных стволовых клеток на поверхности гелевых материалов и показано, что эффективность иммобилизации и культивации мезенхимальных стволовых клеток зависит от состава акриловых гидрогелей и может быть усилена добавлением частиц высокодисперсного кремнезёма (оптимум 0,25 % от общей массы композиции), инкорпорированных в структуру гидрогеля. Установлено, что использование такого наполнителя повышает прирост биомассы клеток в 5 раз и сокращает время их культивирования от 5 до 3 суток.

Исследовано колоидно-химические закономерности, что определяют биосовместимость гидрогелей и эффективность иммобилизации клеток на их поверхности. Установлено, что взаимодействие клеток с поверхностью акриловых гидрогелейв и, соответственно, еффективность их иммобилизации, усиливается при переходе от сополимеров акриламида и акрилонитрила к сополимерам акриламида и акриловой кислоты (АА-АН > AA > AA-AK). Такая особенность связана с адсорбцией водорастворимых экзометаболитов на поверхности гелей, что в свою очередь приводит к усилению степени гидрофобности полимера, снижению его електрокинетического потенциала и потенциального барьера. Предложено уточненный механизм гетероадагуляции клеток животного происхождения к твёрдым поверхностям.

Установлены закономерности и предложен механизм взаимодействия гелевых систем с различными растворителями при разных значениях рН раствора и температуры. С использованием теории Флори-Хаггинса охарактеризовано гидрофильно-гидрофобные параметры гелей разного состава. Также установлено, что низкие температуры не влияют на сорбционные и механические свойства гелей, которые предварительно набухли до равновесного состояния в растворе криоконсерванта. Определена зависимость механических и оптических параметров гидрогелей от их состава. Показано, что с повышением числа звеньев акрилонитрила в составе макромолекулярной сетки и степени сшивання увеличивается механическая прочность гелей и их гетерогенность и, как следствие, увеличивается коефициент преломления света.

Установлено, что акриловые гели независимо от химического состава являются катионитами, так как вследствие щелочного гидролиза функциональных групп акриламида образуется значительное количество карбоксильных групп. Показано, что полиакриламидные гели и сополимеры акриламида и акрилонитрила сорбируют гидроксил-ионы только в сильнощелочной области (рН = 10-12), а сополимеры акриламида и акриловой кислоты сорбируют как гидроксил-ионы, так и протоны водорода, что обясняется образованием резонансных структур протонированой карбоксильной группы. Также показано, что в широком диапазоне рН = 1-10 степень набухання гелей разного состава не меняется, а при рН = 12,5 резко возрастает в несколько раз.

Исследованы сорбционные свойства акриловых гидрогелей относительно низкомолекулярных и высокомолекулярных соединений. Показано, что независимо от состава акриловые гели сорбирують молекулы альбуміна: для полиакриламидных гелей характерным является физическое и химическое сорбирование альбуміна, а для сополимеров акриламида и акрилонитрила только физическое. Наличие значительного количества карбоксильных групп в составе сополимерных гелей на основе акриламида и акриловой кислоты приводит к химическому необратимому сорбированию белковых молекул. Использование при синтезе порообразователей различной молекулярной массы позволяет регулировать сорбционные свойства гелей относительно низкомолекулярных соединений и растворов полимеров.

Предложено технологическую схему создания биокомпозитных раневых покрытий типа "искусственная кожа", что предназначены для использования при лечении ожоговых ран. Проведены клинические испытания разработанных раневых покрытий.

Ключевые слова: акриловые гидрогели, сшитые полимеры, свойства поверхности, гетероадагуляция, адгезия, иммобилизация, стволовые клетки, биокомпозитные раневые покрытия.

Kosenko O.A. Gels systems based on acrylic monomers for stem cells immobilization. - Manuscript.

The dissertation for competition of scientific degree of candidate of science (chemistry) in specialty 02.00.11 - colloidal chemistry. - The F.D. Ovcharenko Institute of Biocolloidal Chemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2008

This dissertation is devoted to the colloidal-chemical investigations in stem cells bio-compliant acrylic hydrogels synthesis aspects regularitys and in subsequent development of bio-composites for burn wounds coverings. Acryl monomers radical copolymerization parameters for bio-compliant hydrogels synthesis were investigated, which leads to high water content, convenient strength-elasticity properties and nano-dimensional internal structure cells. It was established, that efficiency of immobilization and cultivation of stem cells depends on acrylic hydrogels composition and it can be improved by incorporation of high-dispersed silica in the internal structure.

Biocompatibility of hydrogels and efficiency of stem cells immobilization on their surface are determined by colloidal-chemical regularitys. It was established, that acryl hydrogels adhesion of stem cells is defined by selective adsorption of aqueous-soluble exo-metabolites on hydrogels surface. Specified mechanism for hard-base heteroadagylation of stem cells was proposed. The correlation parameters were investigated and mechanism for hydrogels systems interactions with various nature solvents at different pH values of solvent and temperature was proposed. Investigations were also made for hydrogels sorption properties determining in relation to low-molecular and high-molecular compounds. The correlations between hydrogels composition and their mechanical and optical properties were established. The technological scheme creation of bio-composite wound coverings as artificial equivalent of skin with immobilized stem cells for medical treatment of burn wounds was proposed. Successful clinical testing of the developed wound coverings was provided.

Key words: acrylic hydrogels, cross-linked polymers, interfacial properties, heteroadagulation, adhesion, immobilization, stem cells, bio-composite wound covering.

Загальна характеристика роботи

Актуальність роботи. В останні роки пильна увага дослідників прикута до мезенхімальних стовбурових клітин людини (МСК) завдяки їх унікальним властивостям. Як відомо, такі клітини успішно використовують в різних областях медицини, зокрема, при лікуванні уражень шкіри різної етіології. Для розробки біотехнологій є необхідним використання полімерних носіїв для іммобіліз мезенхімальних стовбурових клітин та для використання в якості ранового покриття. Такі полімерні матеріали повинні відповідати ряду вимог: бути біосумісними, киснепроникними, еластичними, нетоксичними, міцними, доступними за ціною, а також володіти високою сорбційною здатністю щодо водних розчинів лікарських препаратів та живильних середовищ. На сьогодні розроблено безліч полімерних носіїв клітин та ранових покриттів. Проте й дотепер не створено полімерних матеріалів, які б поєднували властивості носія клітин й відповідали б вимогам до ранових покриттів. Тому створення таких матеріалів на основі акрилових гідрогелів для іммобілізації та культивування мезенхімальних стовбурових клітин, є актуальною задачею, вирішення якої дозволить отримати нові унікальні матеріали біомедичного призначення, зокрема для лікування опікових ран на ранніх стадіях опікової хвороби.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась згідно з планами відомчих тем відділу колоїдної технології природних систем Інституту біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України: "Створення нового класу органофільних гідрогелів з покращеними механічними, сорбційними та дифузійними характеристиками" (2002-2004 рр, № держреєстрації 0102V007056); "Гідрогелеві нанореактори для отримання високодисперсних благородних металів для потреб медицини та каталізу" (2005-2007 рр, № держреєстрації 0105V001546); "Отримання та дослідження гідрогелевих біомедичних систем з електро-, фото- та магніторегулюючими властивостями" (2008-2010 рр., № держреєстрації 0107U008521); а також Комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України "Наносистеми, наноматеріали та нанотехнології": "Гідрогелеві нанореактори для отримання високодисперсних колоїдних металів" (2006 р., № держреєстрації 0103V006027); "Створення матеріалів біосумісних з клітинами кісткової тканини на основі гідроксиапатиту та металів (срібло, золото, платина) з використанням гідрогелевих нанореакторів (2007 р., № держреєстрації 0103V006028).

Мета роботи - дослідження колоїдно-хімічних закономірностей та умов синтезу біосумісних щодо МСК гелих систем на основі акрилових мономерів та отримання на їх основі біокомпозитних покриттів для лікування опікових ран.

Для досягнення поставленої мети слід було розв'язати наступні задачі:

Ш Провести дослідження радикальної співполімеризації акриламіда (АА), акрилонітрила (АН) та акрилової кислоти (АК) з отриманням гелевих матеріалів, яким притаманна значна біосумісність, зокрема щодо МСК, та внутрішня структура яких характеризується наявністю нанорозмірних порових комірок, що розширить можливості регулювання сорбційних та електроповерхневих властивостей останніх.

Ш Вивчити колоїдно-хімічні механізми біосумісності гелевих матеріалів, що забезпечують можливість направленої іммобілізації та культивування зазначених вище клітин на поверхні полімерної пластини з метою створення біокомпозитних матеріалів типу "штучної шкіри" для лікування опікових ран.

Ш Дослідити колоїдно-хімічні властивості синтезованих гелевих матеріалів, їх взаємодію з розчинниками різної хімічної природи, в тому числі водним розчином поживного середовища для культивування клітин; вивчити вплив рН та низьких температур на ці процеси; визначити залежність гідрофільно-гідрофобних, електроповерхневих та механічних властивостей гелів від їх мономерного складу.

Ш З'ясувати закономірності іммобілізації та культивування МСК на поверхні гідрогелевих пластин й розробити методи отримання біокомпозитних гідрогелевих матеріалів та підтвердити функціональні можливості матеріалів апробацією в клінічних умовах.

Об'єкт дослідження - процеси синтезу полімерних матеріалів для іммобілізації та культивування клітин.

Предмет дослідження - закономірності створення на основі акрилових мономерів біосумісними щодо мезенхімальних стовбурових клітин гідрогелевих систем з заданими колоїдно-хімічними властивостями.

Методи дослідження - метод електрофорезу для визначення електрокінетичного потенціалу клітин та дисперсного гелю; рефрактометричний метод для визначення коефіцієнту заломлення світла гелевими системами; фотоколориметричний метод для визначення концентрації альбуміну у водному розчині при дослідженні адсорбції гелями білків; статичне рН-метричне титрування для визначення кислотно-основних параметрів полімерів; метод скануючої, просвічуючої електронної мікроскопії для вивчення структурних особливостей зшитих полімерів; методи виміру крайового кута на межі поділу фаз для визначення гідрофільно-гідрофобних характеристик гелів; визначення міцності на розрив та відносного подовження полімеру для вивчення механічних параметрів зшитих гелів; метод комп'ютерного моделювання для визначення величини потенціального бар'єру та дальньої потенціальної ями, для розрахунку структурних параметрів зшитих гелевих систем, для створення математичної моделі кінетичних залежностей набухання гелів різного складу.

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблено наукові основи синтезу біосумісних щодо МСК акрилових гелевих систем з заданими колоїдно-хімічними властивостями. Встановлено залежність ефективності іммобілізації клітин на поверхні гелів, їх сорбційної ємності, розміру порових комірок, механічних, оптичних й дифузійних параметрів від їх хімічного складу, частоти зшивання, загальної частки зшитого полімеру, гідрофільно-гідрофобного балансу та ступеню заповнення порових комірок. Показано, що оптимальні параметри притаманні гідрогелю на основі АА та АН зі співвідношенням мономерних ланок 5:3, концентрацією зшиваючого агента 0,684 % та вмістом зшитого полімера 50 %. Запропоновано спосіб та проведено іммобілізацію МСК на поверхні гелевої акрилової системи.

Вперше для системи "МСК - акриловий гідрогель" досліджено колоїдно-хімічні та біохімічні механізми адгезії, а саме: удосконалено відомий механізм гетероадагуляції клітин з твердими поверхнями. Встановлено, що гетероадагуляція визначається адсорбцією водорозчинних екзометаболітів клітин на поверхні гелів. Експериментально доведено вплив далекодіючих та короткодіючих факторів адгезії на гетероадагуляцію зазначених клітин до поверхні акрилових гелів.

Практичне значення одержаних результатів. В результаті проведених досліджень створено біокомпозитний матеріал із заданими властивостями, який захищено патентом України на винахід та використання якого для лікування опікових ран підтверджено результатами клінічних випробувань у профільному медичному закладі. Встановлено, що при тривалому зберіганні гелів за умов низьких температур (-52 єС) їх властивості не змінюються, якщо при насиченні гелів до розчину поживного середовища додати 10 % кріоконсерванту.

Особистий внесок здобувача полягав у плануванні та виконанні основних експериментальних досліджень та теоретичних розрахунків, наведених у дисертаційній роботі. Постановка проблеми, визначення напрямку та задач дослідження, формулювання теми дисертації, аналіз, інтерпретація та узагальнення одержаних результатів проводились спільно з науковим керівником роботи д.х.н., професором Ульберг З.Р. за участю наукового консультанта д.х.н., пр.н.с. Самченка Ю.М. (ІБКХ). Огляд наукової літератури, підготовка та оформлення друкованих праць, написання тексту дисертаційної роботи виконано дисертантом особисто. Дослідження біосумісності гідрогелів щодо МСК проведено у співпраці з д.б.н., с.н.с. Лукаш Л.Л. та м.н.с. Рубан Т.О. (Інститут молекулярної біології та генетики людини НАН України, Київ). Створення математичної моделі кінетичних залежностей набухання гелів проведено разом з н.с. Лукаш С.І. (Інститут кібернетики НАН України, Київ). Електрофоретичні дослідженя та теоретичні розрахунки, інтерпретація одержаних результатів та формулювання висновків проведено у співпраці з к.х.н., с.н.с. Естрела-Льопіс В.Р. та м.н.с. Бородіновою Т.І.. (ІБКХ). Клінічні випробування створеного дослідного зразку гідрогелевого ранового покриття проведено д.м.н., професором Козинцом Г.П. (Центр термічної травми та пластичної хірургії МКЛ №2, Київ). Електронно-мікроскопічні дослідження проводились за участю гол. спец. Савкіна О.Г. (ІБКХ). Результати досліджень, виконаних у співпраці, отримані за участю автора на всіх етапах.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи доповідались на X Українсько-Польському Симпозіумі "Теоретичні та експериментальні дослідження поверхневих явищ та їх технологічного застосуваня" (Львів, Узлісся, 2006 р.); Міжнародній конференції-школі "Колоїдні системи. Властивості, матеріали, застосування" (Одеса, 2006 р.); XI Конгресі Світової федерації українських лікарських товариств (Полтава, 2006 р.); науковій конференції "Аналітичний контроль якості та безпеки продукції промислового виробництва і продовольчої сировини" (Одеса, 2006 р.); Сьомій Всеукраїнській конференції студентів та аспірантів "Сучасні проблеми хімії" (Київ, 2006 р.); XII Конгресі Європейської опікової асоціації (Будапешт, 2007 р.); XI Щорічному семінарі "Кераміка, клітини та м'які тканини" (Фаєнза, Італія, 2007 р.); Конференції "Нанорозмірні системи. Будова, властивості, технології" (Київ, 2007); ІІІ Міжнародній конференції з колоїдної хімії й фізико-хімічної механіки (Москва, 2008 р.); ІІІ Міжнародному симпозіумі "Методи хімічного аналізу" (Севастополь, 2008 р.).

Основний зміст роботи викладено у 15 наукових працях, з них у 3 статях у наукових фахових виданнях, 1 патенті України на винахід, та 11 тезах доповідей на вітчизняних та міжнародних конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 154 сторінках та складається зі вступу, 6 розділів, висновків і списку використаної літератури, що включає 227 джерел на 23 сторінках. Робота проілюстрована 14 таблицями, 39 рисунками. Містить 1 додаток (2 сторінки).

Основний зміст роботи

У вступі обгрунтовано актуальність теми роботи, сформульовано мету та задачі роботи, визначено об'єкт та предмет дослідження, висвітлено наукову новизну одержаних результатів та їх практичне і теоретичне значення.

В першому розділі подано огляд наукової літератури, в якому основну увагу приділено аналізу сучасних уявлень про методи формування гелевих систем, їх будову, колоїдно-хімічні властивості, описано типи, властивості та використання МСК в медицині, а також висвітлено проблему лікування опікових ран в Україні та світі.

В другому розділі наведено обґрунтування та опис основних об'єктів дослідження. Детально висвітлено теоретичні та експериментальні методи, що були використані в роботі.

При синтезі гелевих систем використовували акриламід (АА), акрилонітрил (АН), акрилову кислоту (АК) та зшиваючий агент N,N'-метилен-біс-акриламід (МБА). Виробник - фірма "MERCK" (Німеччина). Для ініціювання радикальної полімеризації використовували окисно-відновну систему персульфат калію - метабісульфіт натрію ("SIGMA", США). Для створення додаткових макропор у макромолекулярній сітці гідрогелів використовували неіоногенні молекулярні пороутворювачі поліоксиетиленгліколеві ефіри етиленгліколю (фарм.) марок ПЕГ-200, ПЕГ-400, ПЕГ-2000, ПЕГ-4000, ПЕГ-6000 ("Барва", Україна). В якості наповнювача використовували високодисперсний кремнезем "Силікс", наданий Міжгалузевим науково-технічним комплексом "Хімія поверхні" НАН України (м. Київ), та силікагель (ш 10 мкм), на поверхні якого сформовано нанорозмірні частинки металів (концентрація золота, срібла, платини, паладію складає 1 мг/г силікагелю), наданий Лабораторією аналітичних досліджень та хімічного аналізу (ІБКХ).

При дослідженні біосумісності гідрогелів використовували МСК людини лінії 4ВL2 отримані з периферійної донорської крові, поживне середовище "Dulbecco's Modified Eagle's Medium" (DMEM) та ембріональну сиворотку крові телят ("SIGMA", США). Дослідження проводили в Інституті молекулярної біології та генетики людини НАН України (Київ).При моделюванні процесу адсорбції білків сиворотки крові на поверхні гідрогелів використовували альбумін донорский ("Біофарма", Україна).

Синтезували гідрогелі у вигляді монолітних пластин з використанням скляних плоскопаралельних шаблонів. При синтезі циліндричних гелів композицію заливали в скляні трубки (ш 10 мм). Дисперсні гідрогелі одержували двостадійним розтиранням в керамічній ступці рівноважно набухлого зразку та висушеного. Для відокремлення тонких фракцій використовували ситовий й седиментаційний методи.

Електрокінетичний потенціал клітин та дисперсного гелю визначали методом електрофорезу. Використовували горизонтальну камеру закритого типу глибиною 340 мкм з платиновими електродами, відстань між якими складала 2 см. Після заповнення камери суспензією на електроди подавали напругу 10 - 16 В від джерела постійного струму "Б 5-45" (або "ЛІПС-35"). Виміри проводили на нижньому стаціонарному рівні 74 мкм від дна камери. Спостереження за переміщенням частинок/клітин здійснювали за допомогою мікроскопа "ЛЮМАМ Р-1" ("ЛоМо") з використанням об'єктиву 9х 0,2 та окуляру 12х. Час проходження частинками та клітинами відстані 110 мкм (ціна поділки 2 мкм) вимірювали за допомогою секундомера з точність до 0,1 с. Коефіцієнт заломлення світла гелевими пластинами (товщина 1 мм), що набухли до рівноважного стану в дистильованій воді, визначали рефрактометрично ("ІРФ-454 БМ"). Адсорбцію білків акриловими гелями досліджували фотоколориметричним методом (КФК-2) із використанням розчину Бенедикта. Кислотно-лужні параметри полімерів визначали методом статичного рН-метричного титрування ("рН-150МА", електрод "ЕСК-10601/4"). Час встановлення рівноваги складав 5 діб. Вивчення структурних особливостей зшитих полімерів здійснювали методом скануючої, просвічуючої електронної мікроскопії ("Tesla-BS-340", "Tesla"; "ПЕМ-У", "Селмі"). Для збереження структури гідрогелів рівномірно набухлі зразки витримували при -52 єС протягом доби та піддавали ліофільній сушці ("Alpha 1-4 LD-2", "Christ"). Для визначення гідрофільно-гідрофобних характеристик гелів використовували методи виміру крайового кута на межі поділу фаз повітря-гель-рідина (метод краплі або бульбашки) та рідина-гель-рідина (вибіркове змочування). Механічні параметри гелів у рівноважно набухлому стані визначали з використанням модифікованого приладу Вейлера-Ребіндера. Швидкість розтягування зразків складала 1,5310-3 м/с. Експериментальні результати обробляли загальноприйнятими статистичними методами. За кінцевий результат приймали середнє значення не менш як з п'яти паралельних експериментів. Методом комп'ютерного моделювання створено математичну модель кінетичних залежностей набухання гелів різного складу, розраховано величини потенціального бар'єру та дальньої потенціальної ями, визначено структурні параметри зшитих гелевих систем.

Третій експериментальний розділ присвячено дослідженням закономірностей впливу мономерного складу гідрогелів та наповнювачів на їх біосумісність щодо МСК. З метою пошуку оптимального для культивування МСК складу гідрогелів було синтезовано методом гомофазної радикальної співполімеризації у водному середовищі при кімнатній температурі близько 150 зразків у діапазоні від поліакриламідного гелю (ПААГ) до гідрогелю з еквімолярним співвідношенням мономерів АА й АН (або АК). Також варіювався вміст зшиваючого агента МБА: 0,079, 0,188, 0,375, 0,638, 0,654, 0,750, 0,956 % від загальної маси композиції. Гідрогелі синтезували у вигляді пластин товщиною 1 мм. Після завершення полімеризації зразки промивали в дистильованій воді при її значному надлишку протягом 10 діб при температурі 65 оС.

Проведені електронно-мікроскопічні дослідження показали, що в результаті співполімеризації зазначених мономерів формуються просторово зшиті гідрогелі, яким притаманна пориста внутрішня структура.

Макропори таких гелів мають форму сферичних каналів. Поверхня гідрогелевої пластини є відносно однорідною - розмір неоднорідностей складає 200-400 нм Також було встановлено, що пориста структура акрилових гідрогелів характеризується не лише макропорами, а й порами з переважним розміром 20 нм Відзначимо, що найбільш вузький розподіл нанопор за розмірами притаманний гідрогелям на основі АА й АН, а зі зростанням вмісту ланок АК і при переході до поліакриламідного гелю (ПААГ) спостерігається збільшення розмірів пор. Пориста структура гідрогелів зумовлює їх значний водовміст (до 80 %), що забезпечує можливість насичення поживним середовищем для подальшого дослідження біосумісності гідрогелів. Основним показником біосумісності гідрогелів слугує ефективність іммобілізації та культивування на їх поверхні МСК.

Експериментально показано, що через добу після висіву клітин на більшість зразків ПААГ та співполімерів АА та АН спостерігалося прикріплення клітин до поверхні гідрогелів, часткове розпластування, викликане первинною взаємодією клітини та субстрата, а також агрегація клітин у конгломерати різної величини з подальшим відкріпленням їх і переходом у суспензійний стан. Найбільш виразну зміну морфології клітин у процесі культивування виявлено при використанні зразків співполімерних гідрогелів на основі АА та АН, які характеризуються 50 % вмістом зшитого полімера у гідрогелі та концентрацією зшиваючого агента 0,654 %. Встановлено, що для зразків даної серії характерна значна біосумісність з МСК. Однак, утворення суцільного клітинного моношару на поверхні гідрогелю спостерігалося лише для зразків із відсотковим співвідношенням гідрофільних ланок АА та гідрофобних АН 34,62:15,38 та 32,05:17,95 при концентрації зшиваючого агента МБА 0,654 % від загальної маси композиції (або співвідношення мономерів 9:4 та 5:3, відповідно). Гідрогелі навіть з незначним вмістом АК (0,5 %) виявилися непридатними для підтримки життєдіяльності клітин через властиву їм кислу реакцію, що призводить до різкої зміни рН поживного середовища та, як наслідок, утворення детриту (загибелі клітин).

Ефективність іммобілізації клітин на гідрогелевих пластинах оцінювали при спостереженні під інвертованим мікроскопом шляхом змивання їх розчином поживного середовища. Для гідрогелів на основі співполімерів АА та АН характерною є висока ефективність іммобілізації МСК. Клітини були закріплені на поверхні на стільки міцно, що перевести їх в суспензійний стан можна було лише обробивши гель розчином трипсину з натрій етилендиамінтетраацитатом.

З літературних джерел відомо, що високодисперсний кремнезем суттєво впливає на адгезію клітин до твердих поверхонь. У зв'язку з цим було досліджено вплив високодисперсного кремнезему на адгезію МСК до поверхні акрилових гідрогелів. До полімерної сітки гідрогелю (АА:АН = 5:3, МБА - 0,654 %), для якого була показана краща біосумісність з МСК у порівнянні з іншими зразками, при синтезі інкорпорували частинки високодисперсного кремнезему "Силікс" в різних масових концентраціях (0,0025, 0,025, 0,25, 0,50, 0,75, 1,00, 1,25, 3,125 % від загальної маси композиції). Встановлено, що зазначений вплив має яскраво виражений концентраційний характер (табл. 1). Введення до складу гідрогелю високодисперсного кремнезему в концентрації 0,25 % призводить до прискорення гетероадагуляції клітин до гідрогелевої поверхні (утворення суцільного клітинного моношару фіксували на 3 добу). Також відмічено 5-разове збільшення популяції клітин в порівнянні з контролем (ненаповнений зразок). При підвищенні (0,5 і 0,75 %) та пониженні (0,025 і 0,0025) вмісту наповнювача утворення суцільного клітинного моношару спостерігали на 4 добу та відмічено незначний приріст біомаси. Високі концентрації кремнезему (1,00, 1,25, 3,125 %) виявились токсичними, що призвело до загибелі клітин.

Відомо, що за стандартною методикою клітини тваринного походження культивують в посуді із кварцового скла. Як видно з даних, наведених в табл. 1, за однакових умов культивування клітин на кварцовому склі та гідрогелевій пластині, до складу якої введено 0,25 % високодисперсного кремнезему, виявилось ефективним. Тому гідрогелі зазначеного складу можуть бути використані в якості твердого носія для іммобілізації та культивування МСК. Для дослідження впливу металів на культивування клітин було синтезовано гідрогелі на основі співполімеру АА та АН (5:3, МБА - 0,654 %) з інкорпорованим частинками силікагелю, на поверхні якого сформовано нанорозмірні частинки металів (фракція силікагелю ш 10 мкм, концентрація металів 1 мг/г).

Таблиця 1 Залежність приросту біомаси клітин від концентрації наповнювача високодисперсного кремнезему "Силікс"

Як видно з даних, наведених в табл. 2, гідрогелі, до складу яких введено твердий наповнювач в концентрації 0,125 та 0,3125 % з нанорозмірним частинками металів, є нетоксичним щодо МСК. Також відмічено збільшення популяції клітин відносно ненаповненого зразку (115 тис.). Однак, для зразків, що містять наповнювач з нанорозмірними частинками срібла (0,125 й 0,3125 %) й золота (0,3125 %), відмічено переважну іммобілізацію клітин на скляній поверхні чашок Петрі (під пластиною). Такий ефект посилюється з підвищенням концентрації наповнювача. При максимальній концентрації наповнювача відмічено пригнічення клітин та в деяких випадках їх загибель внаслідок токсикозу. Однак, в цілому скляна поверхня чашок Петрі (627 тис.) виявилась більш придатною для культивування МСК, ніж акрилові гідрогелі з наповнювачем.

Таблиця 2 Залежність приросту біомаси клітин від вмісту силікагелю зі сформованими на поверхні нанорозмірними частинками металів (фракція силікагелю ш 10 мкм, концентрація металів 1 мг/г)

Четвертий розділ містить результати теоретичних та експериментальних дослідженнь механізму гетероадагуляції МСК до поверхні акрилових гідрогелів.

Умовно біосумісність співполімерних гідрогелів щодо МСК відповідає ряду: АА-АН ПААГ АА-АК.

Вперше для системи "МСК - акриловий гідрогель" проведено дослідження колоїдно-хімічних механізмів гетероадагуляції. В основу дослідження покладено відомі механізми: перший пов'язаний з електрофоретичним дрейфом частинки/клітини в електричному полі дифузійного потенціалу клітини, та другий - із зміною поверхневого заряду частинки (поверхні) при адсорбції на ній водорозчинних екзометаболітів. Досліджували вплив адсорбції екзометаболітів клітин на поверхневий заряд частинок гідрогелів різного хімічного складу (метод мікроелектрофорезу) та на ступінь гідрофільності (вимір кута змочування). Використовували поживне середовище з додаванням 510 % сиворотки крові телят, в якому культивували 100 тис. клітин протягом 5 діб (ПСВМ - поживне середовище з водорозчинними метаболітами), внаслідок чого відбувається накопичення екзометаболітів клітин. У якості порівняння використовували вихідне поживне середовище (ПСЧ - поживне середовище чисте).

Для проведення дослідження було обрано гідрогелі, для яких раніше була показана різна біосумісність щодо МСК, а саме: АА-АН (5:3) - клітини утворили моношар на поверхні гідрогелевої пластини; ПААГ - відмічено значну біосумісність гелю та деякий приріст біомаси; АА-АК (5:3) - гель несумісний з МСК. Концентрація зшиваючого агента МБА для всіх зразків складала 0,684 % й вміст зшитого полімера 50 % від загальної маси композиції.

Як видно, -потенціал частинок гідрогелів у ПСВМ в порівнянні з ПСЧ змінюється. Очевидно, після контакту з клітинами в поживному середовищі з'являються нові поверхнево-активні речовини, які виділяються клітинами. З підвищенням концентрації поживного середовища зміна -потенціалу () для гідрогелю АА-АК при СПС 2,5 % незначна. Проте -потенціал частинок ПААГ у середовищі після контакту з клітинами помітно зменшується (по модулю) при СПС 1 %. Найбільш значне зниження -потенціалу в ПСВМ в порівнянні з ПСЧ відмічено для частинок гідрогелю АА-АН при мінімальній концентрації СПС 0,5 %