Гелеві системи на основі акрилових мономерів для іммобілізації стовбурових клітин

Наявність комірок у структурі гелю зумовлює можливість насичення його поживним середовищем, яке містить в своєму складі молекули різного розміру. В якості модельної системи були обрані гідрогелі з комірками різної величини, що були сформовані при синтезі пороутворювачем поліетиленгліколем (ПЕГ) з молекулярною масою 200, 400, 2000, 4000, 6000. При цьому було встановлено, що використання для формування комірок в гідрогелі пороутворювача з відносно низькою молекулярною масою (ПЕГ-200) дозволило сформувати значну кількість макрокомірок, що, в свою чергу, значно підвищує сорбційну здатність гідрогелів. Наведення залежності приросту ваги Q гідрогелів, до складу яких при синтезі було введено 10,5 % пороутворювачів різної молекулярної маси, від концентрації ПЕГ-200 в розчині, в якому проводилось набухання. Так, для гідрогелевого співполімеру на основі АА й АК (3:1) спостерігається приріст ваги зразку в дистильованій воді 75 г/г та 32 г/г в розчину ПЕГ-200 з масовою концентрацією 40 %. Тоді як введення в композицію при синтезі 10,5 % ПЕГ-200 призводить до зростання приросту ваги до 254 та 153 г/г відповідно. Використання пороутворювачів з більшою молекулярною масою виявилось недоцільним, оскільки значна частина макромолекул не видаляється з пор гідрогелю і тим самим зменшує поровий простір.

Приріст ваги гідрогелів при набуханні в розчинах ПЕГ-200 забезпечується сорбуванням не лише молекул води, а й макромолекул. Дане твердженя базується на рефрактометричному дослідженні зміни концентрації розчину ПЕГ-200, в якому проводилось набухання гідрогелів. Для вивчення сорбційних властивостей гідрогелів в залежності від їх пористості використовували співполімери АА та АК (75:25 %, МБА - 0,079 %), при синтезі яких формували додаткові макропори з використанням пороутворювачів різної молекулярної маси (зразок № 1 - ПЕГ-200, зразок № 2 - ПЕГ-4000). За отриманими даними обраховано сорбцію макромолекул полімеру та розчинника. Встановлено, що обидва зразки переважно сорбують розчинник (воду), ніж макромолекули ПЕГ-200. Максимальна сорбція макромолекул гелем № 1 виявлена при концентрації розчину 40 %. Для зразку № 2 величина сорбції макромолекул поступово знижується зі зростанням концентрації розчину. Величина граничної сорбції для зразку № 1 в 15 раз перевищує аналогічну величину для зразку № 2. З отриманих результатів випливає, що сорбція полімеру залежить від концентрації розчину (максимум при 40 %) та становить 60 г/г для гідрогелю, сорбційна ємність якого була підвищена формуванням при синтезі макропор з використанням пороутворювача з відносно низькою молекулярною масою.

Слід зазначити, що значна частина розчину, у якому відбувається набухання гелів, сорбується протягом 5-6 годин, а кінетичні залежності мають вигляд кривих насичення. Максимальний приріст ваги Qmax при набуханні гідрогелів зменшується при підвищенні концентрації зшиваючого агента, що зумовлено обмеженям еластичності макромолекулярної сітки. Встановлено, що низькі температури (-52 °С) не впливають на сорбційні та механічні властивості гелів, які набухли до рівноважного стану у 10 % розчині кріконсерванту.

Співвідношення мономерів істотно впливає на фізико-хімічні властивості гідрогелів. Так, по мірі заміщення гідрофільних ланок АА на гідрофобні АН ланки зменшується величина Qmax при набуханні гідрогелів, що пояснюється зниженням сольватації зв'язків макромолекули гелю. Залежність ступеня набухання гідрогелів від вмісту ланок АК має більш складний характер. Максимальний приріст ваги Qmax при набуханні в дистильованій воді спостерігається для співполімерного гідрогелю складу АА:АК =3:1. Механічна міцність гідрогелів збільшується по мірі заміщення в ПААГ гідрофільних ланок АА на гідрофобні ланки АН. Однак, незважаючи на поліпшення механічних характеристик співполімерних гідрогелів з високим вмістом АН, внаслідок значної гетерогенності втрачають прозорість, що ускладнює спостереження за приростом біомаси клітин на їх поверхні. Величина коефіцієнту заломлення гідрогелів зростає при підвищенні концентрації зшиваючого агента та при заміщенні ланок акриламіду на ланки акрилонітрилу.

Шостий розділ містить відомості про спосіб створення біокомпозитних ранових покрить та результати їх клінічних випробувань.

Запропоновано спосіб та отримано зразки біокомпозитного ранового покриття для лікування опікових ран, ефективність використання якого підтверджено результатами клінічних випробувань. Створення ранового покриття складається з таких стадій: співполімеризація акрилових мономерів з подальшою глибокою відмивкою полімеру, що синтезовано у вигляді монолітних пластин, від залишків непрореагованих токсичних мономерів; насичення отриманого полімерного матеріалу поживним середовищем; нанесення клітинної суспензії на поверхню гідрогелевих пластин; культивування клітин до утворення моношару.

В Центрі термічної травми та пластичної хірургії МКЛ №2 (м. Київ) проведено апробацію розробленого гідрогелевого матеріалу з іммобілізованими МСК при лікуванні ран на ранніх стадіях опікової хвороби. Зразки гідрогелевого матеріалу наносили на попередньо очищені від некротичних тканин рани. Через добу покриття видаляли та проводили аутотрансплантацію шкіри. На наступну добу сітчасті трансплантати з коефіцієнтом збільшення 1:3 були життєздатні та повністю фіксовані на поверхні рани, через 4-5 діб переходили на судинний тип харчування. На 6-7 добу відмічена активна крайова епітелізація сітчастих проміжок по рановій поверхні, яка завершувалась на 7-10 добу. В контрольних дослідженнях подібні явища спостерігались на значно пізніших термінах та 20 % трансплантатів підверглася лізису.

Висновки

1. У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у створенні гідрогелевих систем на основі акрилових мономерів та встановленні колоїдно-хімічних механізмів цілеспрямованого впливу на їх біосумісність з клітинами тваринного походження та ефективність іммобілізації клітин на поверхні гелів.

2. Вперше досліджено колоїдно-хімічні та біохімічні механізми адгезії мезенхімальних стовбурових клітин до поверхні акрилових гелів і встановлено, що гетероадагуляція залежить від адсорбції на гелях водорозчинних екзометаболітів. Для системи "мезенхімальна стовбурова клітина - акриловий гель" доведено вплив далекодіючих та короткодіючих факторів адгезії. Показано, що адсорбція водорозчинних екзометаболітів клітин на поверхні гелів призводить до посилення ступеню гідрофобності полімера, зниження його електрокінетичного потенціалу та величини потенціального бар'єру, розрахованого за теорією ДЛФО. Величина дальньої потенціальної ями при цьому не змінюється і є достатньою для гетероадагуляції (10 kT).

3. Встановлено вплив хімічного складу гелів та наповнювача на процеси іммобілізації та культивування мезенхімальних стовбурових клітин. Виявлено, що оптимальний склад гелю на основі акриламіду та акрилонітрилу для культивування цих клітин має співвідношення мономерних ланок 5:3 та концентрацію зшиваючого агента 0,684%. Введення до складу гелю високодисперсного кремнезему (0,25 % від загальної маси композиції) підвищує приріст біомаси клітин у 5 разів зі скороченням часу культивування від 5 до 3 діб.

4. За результатами дослідження процесів сорбції і десорбції показано, що акрилові гелі, в залежності від хімічного складу, сорбують альбумін людини фізично або хімічно. Наявність ланок акрилонітрилу у співполімерах з акриламідом призводить до фізичної адсорбції білка, а за наявності ланок акрилової кислоти - до хімічного зв`язування.

Для поліакриламідних гелів характерною є як фізична, так і хімічна адсорбція білка. При дослідженні сорбції водних розчинів поліетиленгліколю ПЕГ-200 акриловим гелем, який синтезовано з використанням тієї ж речовини у якості пороутворювача, спостерігається збільшення сорбції як розчинника, так і речовини за рахунок підвищення еластичності макромолекулярної сітки полімера. Встановлено, що низькі температури не впливають на сорбційні та механічні властивості гелів, які набухли до рівноважного стану у 10% розчині кріконсерванту.

5. Встановлено, що отримані акрилові гелі, незалежно від хімічного складу, є катіонітами за рахунок значної кількості карбоксильних груп, які утворилися внаслідок лужного гідролізу функціональних груп акриламіду. Статичним рН-метричним титруванням показано, що поліакриламідний гель і співполімери акриламіду й акрилонітрилу сорбують гідроксил-іони лише в сильнолужній області (рН 10-12), а співполімери акриламіду й акрилової кислоти сорбують як гідроксил-іони, так і протони водню (рН 4-12). Адсорбція в кислій області обумовлена утворенням резонансних структур протонованою карбоксильною групою. Показано, що в інтервалі рН = 1-10 ступінь набухання гелів різного складу не змінюється, а при рН=12,5 різко зростає у декілька разів.

6. Показано, що з підвищенням вмісту ланок акрилонітрилу у складі макромолекулярної сітки та ступеню зшивання зростає механічна міцність гелів (до 500 кПа), еластичність (до 350%) та їх гетерогенність і, як наслідок, збільшується коефіцієнт заломлення світла (до 1,4000).

Це пояснюється підвищенням ефективної густини зшивання гелю й зниженням молекулярної маси ланки, обмеженої сусідніми зшивками, що й підтверджено розрахунками за теорією Флорі-Хаггінса. Значна еластичність гелів обумовлена пористою внутрішньою структурою (середній розмір макропор - 20 мкм, та нанопор - 20 нм).

7. Запропоновано спосіб та отримано зразки біокомпозитного ранового покриття для лікування опікових ран, ефективність використання якого підтверджено результатами клінічних випробувань.

Список опублікованих праць за темою дисертації

Косенко О.О. Кополімерні гідрогелеві мембрани для іммобілізації та культивування стовбурових клітин людини / О.О. Косенко, Л.Л. Лукаш, Ю.М. Самченко, Т.А. Рубан, З.Р. Ульберг, С.І. Лукаш // Біополім. і клітина. - 2006. - Т. 22, № 2. - С. 143-148. (Постановка та проведення експерименту по синтезу гелів та дослідженню їх властивостей, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні статті.)

Косенко О.О. Штучний еквівалент шкіри на основі кополімерних гідрогелевих мембран з іммобілізованими мезенхімальними стовбуровими клітинами людини / О.О. Косенко, Л.Л. Лукаш, Ю.М. Самченко, Т.А. Рубан, З.Р. Ульберг, Н.П. Галаган // Біополім. і клітина.- 2006.- Т. 23, № 6.- С.446-451. (Постановка та проведення експерименту по синтезу гелів та дослідженню їх властивостей, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні статті.)

Косенко О.А. Гидрогелевые нанореакторы с иммобилизированными мезенхимальными стволовыми клетками / О.А. Косенко, Ю.М. Самченко, З.Р. Ульберг, Л.Л. Лукаш, Г.П. Козинец // Наносистемы, наноматериалы и нанотехнологии. Коллоидные системы и новейшие технологии. - 2007. - Т. 5, спецвып. 1. - С. 173-181. (Постановка та проведення експерименту, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні статті.)

Пат. UA № 82583, МПК 7 A61К 31/74, A61К 35/12, A61L 15/00, A61L 27/00, A61Р 17/02. Біосумісний гідрогель медичного призначення та спосіб його одержання / Самченко Ю.М., Лукаш Л.Л., Косенко О.О., Ульберг З.Р., Рубан Т.О., Козинец Г.П. ; заявники та патентовласники. - № a 2006 07473; заявл. 05.07.06; опубл. 10.01.08., Бюл. № 1. (Постановка та проведення експерименту, проведення патентного пошуку, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні патенту.)

Surface properties of copolymeric hydrogels of medical purpose / Kosenko O.A., Samchenko Yu.M., Ulberg Z.R. // Theoretical and experimental studies of interfacial phenomena and their thechnological applications: X ukr.-polish symp., 26-30 sept. 2006.: proc. of symp., part 1. - Lviv-Uzlissia, 2006. - .P. 166-167. (Постановка та проведення експерименту, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні тез.)

Смачивание сополимерных гидрогелів медиинского назначения / Косенко О.А., Самченко Ю.М., Ульберг З.Р. // Коллоидные системы. Свойства, материалы, применение: междунар. конф.-школа, 28 августа-1сентября 2006 г.: тезисы докл. - Одесса, 2006. - С. 69-70. (Постановка та проведення експерименту, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні тез.)

Гідрогелеві матеріали медичного призначення / Самченко Ю.М., Косенко О.О., Ульберг З.Р., Немиро С.А. // Світ. федер. укр. лік. тов.: міжнар. конф., 28-30 серпня 2006 р.: тези доп. - Полтава, 2006. - С. 513-514. (Постановка та проведення експерименту, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні тез.)

Методы контроля содержания остаточных мономеров в сополимерных гидрогелях медицинского назначения / Самченко Ю.М., Косенко О.А., Покровский В.А., Герцюк М.Н., Ульберг З.Р. // Аналітичний контроль якості та безпеки продукції промислового виробництва і продовольчої сировини: науч. конф., 22-26 травня 2006 р.: тезисы докл. - Одеса, 2006. - С. 67-68. (Синтез гелів, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні тез.)

Пористість та сорбційна ємність гідрогелів / Косенко О.О., Самченко Ю.М. // Сучасні проблеми хімії: VII всеукр. конф. студ. та асп., 18-19 травня 2006 р.: тези доп. - К., 2006. - С. 297. (Постановка та проведення експерименту, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні тез.)

Capabilities effect of biological covers on a phase of proliferation / Kozinetc G.P., Коvаlеnkо О.M., Lukash L.L., Voronin A.V., Коsеnkо О.O. // 12th Congress of the European Burn Association, 12-15 sept. 2007: proc. of congr. - Budapesht, Hungary, 2007. - P. 10-11. (Синтез гелів, участь у проведенні експерименту та написанні тез.)

Copolymer hydrogels of medical purpose with immobilized medicinal preparations and cells / Samchenko Yu., Ulberg Z., Kosenko O. // Ceramics, cells and tissues: 11th annual sem. & meeting, 2-5 oct. 2007: proc. of sem. - Faenza, Italy, 2007. - P. 54. (Постановка та проведення експерименту, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні тез.)

Сополимерные гидрогели медицинского назначения с иммобилизованными лекарственными препаратами и клетками / Самченко Ю.М., Ульберг З.Р., Косенко О.А. // Нанорозмірні системи: будова, властивості, технології: конф., 21-23 листопада 2007: тези доп. - К., 2007. - С. 436. (Постановка та проведення експерименту, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні тез.)

Исследование механизма избирательной биоадгезии-гетерокоагуляции мезенхимальных клеток человека на поверхности акриловых гидрогелей // Косенко О.А., Эстрела-Льопис В.Р., Ульберг З.Р. // Сучасні проблеми хімії: VIII всеукр. конф. студ. та асп., 21-23 травня 2007 р.: тези доп. - К., 2007. - С. 116. (Постановка та проведення експерименту, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні тез.)

On the possible reasons of the selective heteroadagulation of human being mesenchimal cells on the acrylic hydrogel surface / Estrela-Llopis V. R., Ulberg Z.R., Kosenko O.A. // ІІІ междунар. конф. по колл. хим. и физ.-хим. Мех., 24-28 июня 2008: тезисы докл. - М., 2008. - С. 10. (Постановка та проведення експерименту, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні тез.)

Синтетичні мембрани на основі гідрогелевих нанореакторів / Самченко Ю.М., Коновалова В.В., Побігай В.А., Косенко О.О., Бурбан А.Ф., Ульберг З.Р. // Методи хімічного аналізу: ІІІ міжнар. симп., 27 - 30 травня 2008 р.: тези доп. - Севастополь, 2008. - С. 45-46. (Постановка та проведення експерименту, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні тез.)

Размещено на Allbest.ru