Розробка та удосконалення методів аналізу органічних лікарських речовин загального дослідження при проведенні судово-медичних експертиз

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Національний фармацевтичний університет

УДК 615.91:615.212.7:615.07] 001.76

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора фармацевтичних наук

РОЗРОБКА ТА УДОСКОНАЛЕННЯ МЕТОДІВ АНАЛІЗУ ОРГАНІЧНИХ ЛІКАРСЬКИХ РЕЧОВИН ЗАГАЛЬНОГО ДОСЛІДЖЕННЯ ПРИ ПРОВЕДЕННІ СУДОВО-МЕДИЧНИХ ЕКСПЕРТИЗ

Маміна Олена Олександрівна

Харків - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі аналітичної хімії Національного фармацевтичного університету України (м.Харків).

Науковий консультант: доктор хімічних наук, професор БОЛОТОВ ВАЛЕРІЙ ВАСИЛЬОВИЧ Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри аналітичної хімії

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор КОВАЛЬОВ ВОЛОДИМИР МИКОЛАЙОВИЧ Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри фармакогнозії

доктор фармацевтичних наук, професор БУРЯК ВАЛЕРІЙ ПРОКОПОВИЧ Запорізький державний медичний університет, завідувач кафедри токсикологічної та неорганічної хімії

доктор фармацевтичних наук, професор ВЕТЮТНЕВА НАТАЛІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України, завідувачка кафедри контролю якості і стандартизації лікарських засобів

Захист відбудеться “31“ жовтня 2008 року о 10 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Національного фармацевтичного університету (611168, м.Харків, вул. Блюхера,4).

Автореферат розісланий “27“ вересня 2008 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук, професор Л.М.Малоштан

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Органічні лікарські речовини загального дослідження при проведенні судово-медичних експертиз (алкалоїди - похідні ізохіноліну, тропану, пурину, хіноліну та ациклічні алкалоїди, похідні фенотіазину, п-амінобензойної і барбітурової кислот) широко застосовуються у медичній практиці. В літературі описані чисельні випадки важких та летальних отруєнь лікарськими речовинами в результаті перевищення доз при самолікуванні, сумісному застосуванні з іншими препаратами та алкоголем, при наркотичній залежності, а також у випадках суїциду.

У хіміко-токсикологічних дослідженнях зазначених отрут застосовуються багатостадійні, довготривалі та недостатньо ефективні методи виділення з біологічного матеріалу. Значна частина методик скринінгу, ідентифікації та кількісного визначення отрут, які наведені в літературі, характеризуються багаточисельністю і різноманітністю умов, можуть застосовуватися лише для індивідуальних отрут або обмежених груп речовин та не відповідають сучасним вимогам до аналізу біологічних обґєктів.

У звґязку із зростанням явищ наркоманії та токсикоманії, розповсюдженням комбінованих отруєнь актуальним є обґрунтування методології хіміко-токсикологічного аналізу органічних лікарських речовин загального дослідження за допомогою нових ефективних, експресних і економічних методів та удосконалених існуючих методик.

Звґязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертацію виконано у відповідності з планом науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету (“Хімічний синтез, виділення та аналіз нових фармакологічно активних речовин, встановлення звґязку “структура-дія”, створення нових лікарських препаратів” номер державної реєстрації 0198U007011) та Проблемної комісії “Фармація” МОЗ і АМН України.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи є обґрунтування методологічних підходів у розробці схем хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на органічні лікарські речовини загального дослідження, складовими яких є ефективні та експресні методи їх ізолювання хлороформом з біологічних обґєктів, нові ефективні, економічні та удосконалені методики скринінгу, ідентифікації і кількісного визначення зазначених речовин.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі: токсикологічний органічний лікарський скринінг

* теоретично та експериментально обґрунтувати застосування хлороформу, як ефективного ізолюючого агента досліджуваних речовин з біологічних обґєктів при попередньому висушуванні безводним натрію сульфатом;

* вивчити вплив факторів (маси натрію сульфату безводного в колонці, швидкості витікання екстрагенту з колонки, обґєму екстрагенту, рН середовища, природи кислот та лугів, довготривалості контакту кислот та лугів з тканинами органів трупу) на процес ізолювання речовин хлороформом з біологічного матеріалу;

* розробити ефективні методики очищення хлороформних витяжок з біологічного матеріалу методами рідинної екстракції та тонкошарової хроматографії (ТШХ);

* запропонувати методики ідентифікації та кількісного визначення досліджуваних речовин у хлороформних витяжках у присутності структурних аналогів або речовин, які можуть застосовуватися разом із ними з вико-рисканням високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) і газо-рідинної хроматографії (ГРХ);

* розробити методики визначення отрут на основі оптимальних умов утворення та екстрагування іонних асоціатів речовин основного характеру з кислотними індикаторами: метиловим оранжевим, бромтимоловим синім та азобарвником на основі теофілідину;

* запропонувати схеми скринінгових досліджень біологічних обґєктів на основі ВЕРХ-скринінгу іонних асоціатів з метиловим оранжевим, скринінгу речовин основного характеру з використанням двох кислотних індикаторів

- метилового оранжевого та азобарвника на основі теофілідину; вивчити вплив рН середовища на здатність до утворювання іонних асоціатів досліджуваними отрутами основного характеру із сульфофталеїновими барвниками та розробити умови ТШХ-скринінгу іонних асоціатів отрут з тимоловим синім при оптимальному значенні рН. На підставі виконаних досліджень розробити схеми скринінгу біологічних рідин на отрути;

* порівняти ефективність ізолювання досліджуваних речовин з біологічного матеріалу загальноприйнятими у хіміко - токсикологічному аналізі методами (Васильєвої О.О., Стаса-Отто, Крамаренка В.П., Саломатіна Є.М., Карташова В.А., Валова Р., Попової В.І.) з розробленим нами методом ізолювання хлороформом;

* дослідити можливість визначення досліджуваних речовин в органах отруєних тварин (щурів); у біологічних обґєктах при гнилістних змінах на основі розроблених методик;

* на підставі виконаних досліджень обґрунтувати методологію розробки схем хіміко-токсикологічного аналізу біологічних обґєктів на органічні лікарські речовини загального дослідження.

Обґєкт дослідження. Органічні лікарські речовини загального дослідження при проведенні судово-медичних експертиз (згідно наказу № 6 МОЗ України від 17.01.1995 р).

Предмет дослідження. Хіміко-токсикологічне дослідження органічних лікарських речовин загального аналізу основного та кислотного характеру.

Методи дослідження. Для ідентифікації, кількісного визначення, скринінгу досліджуваних речовин у водних розчинах та у витяжках з біологічних обґєктів використовували хроматографічні (ВЕРХ, ГРХ, ТШХ) та спектральні (екстракційна фотометрія, УФ-спектрофотометрія та похідна спектрофотометрія) методи. Для ізолювання досліджуваних речовин з біологічного матеріалу використовували загальноприйняті у хіміко-токсикологічному аналізі органічних лікарських речовин методи (Васильєвої О.О., Стаса-Отто, Крамаренка В.П., Карташова В.А.), а також метод ізолювання хлороформом, який запропонований нами.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на основі систематичних досліджень теоретично та експериментально обґрунтовано напрямки розробки та удосконалення методів аналізу органічних лікарських речовин загального дослідження з використанням хлороформу, як ефективного ізолюючого агента в умовах безперервної екстракції. На основі розроблених методик хіміко-токсикологічного дослідження запропоновано методологічні підходи щодо удосконалення схем аналізу витяжок з біологічного матеріалу на зазначені речовини.

Вперше проведено дослідження впливу різних факторів (маси натрію сульфату безводного в колонці, швидкості витікання екстрагенту з колонки, обґєму екстрагенту, рН середовища, природи кислот і лугів та довготривалості їх контакту з отрутами і тканинами органів трупу) на процес екстракції досліджуваних речовин хлороформом з тканини печінки. Встановлено оптимальні умови для ефективного екстрагування отрут основного та кислотного характеру. Визначено оптимальні умови очищення хлороформних витяжок з біологічного матеріалу від співекстрактивних речовин рідинною екстракцією гексаном і хлороформом та ТШХ-методом. Вивчено втрати досліджуваних отрут на усіх етапах очищення хлороформних екстрактів за розробленими методиками.

Запропоновано уніфіковані умови ВЕРХ-аналізу для усіх досліджуваних речовин при проведенні скринінгу, ідентифікації і кількісного визначення індивідуальних речовин та їх сумішей. Визначено оптимальні умови ГРХ-аналізу отрут у витяжках з біологічних об'єктів. Показано можливість застосування похідної спектрофотометрії для визначення досліджуваних отрут у хлороформних витяжках в умовах нивілювання впливу співекстрактивних речовин.

Запропоновано оптимальні умови утворювання та екстрагування хлороформом їх іонних асоціатів з кислотними індикаторами - метиловим оранжевим, бромтимоловим синім та азобарвником на основі теофілідину. Розроблені методики застосовано для кількісного визначення досліджуваних речовин у секційному матеріалі та біологічних рідинах.

Вперше запропоновано методологічний підхід до використання здатності отрут утворювати іонні асоціати із зазначеними індикаторами в розроблених умовах як критерію для їх розділення на групи. Цей підхід надає переваги скринінговим дослідженням, обумовлені підвищенням вибірковості досліджень, значним скороченням часу пошуку отрут, отриманням надійних результатів на етапі хроматографічного аналізу іонних асоціатів завдяки застосуванню індикатора як загального внутрішнього стандарту для усіх досліджуваних речовин.

Розроблено умови скринінгу іонних асоціатів отрут з метиловим оранжевим при застосуванні ВЕРХ- та ГРХ- методів, скринінгу речовин основного характеру з використанням двох кислотних індикаторів (метилового оранжевого та азобарвника на основі теофілідину). Вивчено вплив рН середовища на здатність до утворювання іонних асоціатів досліджуваними отрутами основного характеру із сульфофталеїновими барвниками та розроблено умови ТШХ-скринінгу іонних асоціатів отрут з тимоловим синім. На підставі виконаних досліджень обґрунтувати методологію розробки схем скринінгу біологічних рідин на отрути.

Вперше виконано систематичні дослідження по виділенню хлороформом речовин загального аналізу основного та кислотного характеру з тканини печінки трупу та порівняно ефективність розробленого методу та загальноприйнятих у хіміко-токсикологічному аналізі методів ізолювання органічних отрут. Показано можливість застосування розроблених методик для визначення досліджуваних речовин в органах отруєних тварин (щурів); у біологічних обґєктах при гнилістних змінах. На підставі виконаних досліджень обґрунтувано методологію розробки схем хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на отрути основного та кислотного характеру.

Новизну проведених досліджень підтверджено отриманням рішення про видачу деклараційних патентів на корисні моделі за заявками № u 2008 04733 і № u 2007 04735 від 5.06.2008 р. та поданням заявки на винахід № а 2007 07104 від 25.06.2007 р.

Практичне значення отриманих результатів. За результатами наукових досліджень підготовлено методичні рекомендації “Пробопідготовка біологічного матеріалу при судово-токсикологічних дослідженнях деяких лікарських речовин основного та кислотного характеру”, “Скринінг деяких наркотичних та токсичних речовин основного характеру з використанням іонних асоціатів” та “Визначення амлодипіну в біологічному матеріалі”, які впроваджено у практичну діяльність обласних бюро судово-медичної експертизи міст України - Харкова (акт від 7.03.2008); Чернігова (акт від 18.02.2008); Кіровограда (акт від 17.03.2008); інформаційні листи “Судово-хімічне дослідження клофеліну” і “Методика скринінгу сечі на наркотичні та токсичні речовини основного характеру з використанням високоефективної рідинної хроматографії”, які впроваджено у практичну діяльність обласних бюро судово-медичної експертизи міст України - Харкова (акт від 31.03.2003); Черновців (акт від 9.09.2003); Львова (акт від 24.11.2003).

Запропоновані методики хіміко-токсикологічних досліджень органічних лікарських речовин загального аналізу впроваджено в практичну діяльність відділень судово-медичної токсикології обласних бюро судово-медичної експертизи міст України - Львова (акт від 25.11.2002); Дніпропетровська (акт від 24.09.2002); Харкова (акт від 5.04.2002); Луганська (акт від 15.04.2002); в науково-дослідну роботу фармацевтичних факультетів медичних унівеситетів Запоріжжя (акт від 18.10.2001); Львова (акт від 4.02.2002), ХМАПО (акт від 30.03.2002); Луганська (акт від 11.03.2002), Вінниці (акт від 8.04.2003); Тернополя (акт від 25.04.2005), а також увійшли до методичних рекомендацій зі спеціалізації «Хіміко-токсикологічний аналіз» (Харків, 2001) та методичних рекомендації з курсу “Експрес-аналіз гострих інтоксикацій” для студентів денної форми навчання за спеціальністю “Фармація” (Харків, 2000), які впроваджено у навчальний процес кафедр фармацевтичних факультетів медичних вищих навчальних закладів України - Запоріжжя (акт від 14.05.2002), Львова (акт від 22.05.2002), Києва (акт від 21.01.2003), Вінниці (акт від 11.11.2003), Луганська (акт від 4.10.2002), Тернополя (акт від 22.04.2005).

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною завершеною науковою працею. Особисто здобувачем проведені патентно-інформаційний пошук, експериментальні дослідження, статистична обробка, аналіз та систематизація отриманих результатів, сформульовані висновки.

Разом з науковим консультантом розроблено програму, визначені мета і завдання дослідження, методичні підходи до експериментального вивчення хіміко-токсикологічного аналізу органічних лікарських речовин загального дослідження за допомогою нових ефективних, експресних і економічних методів та удосконалених існуючих методик.

У наукових працях, опублікованих у співавторстві, дисертантом наведені результати власних експериментальних досліджень, взято участь в аналізі та узагальненні отриманих даних та у написанні статей.

Дослідження методом високоефективної рідинної хроматографії проведено на базі НВФ „Аналітика” (м.Харків), методом газо-рідинної хроматографії - на базі Харківського обласного бюро судово-медичної експертизи.

Апробація результатів дисертації. Основний зміст дисертаційної роботи доповідався на V Національному зїзді фармацевтів України “Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті” (Харків, 1999), IX Конгресі світової федерації украінських лікарських товариств, присвяченому 25-річчю СФУЛТ(Луганськ-Київ-Чикаго,2002), на науково-практичних конференціях “Лекарства-человеку” (Вильнюс,1998), “Вчені України - вітчизняній фармації” (Харків,2000), ”Фармація XXI століття” (Харків,2002), ”Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія”(Харків,2003), ”Україна науковаґ2003” (Дніпропетровськ, 2003), ”Наука і освіта'2004” (Дніпропетровськ,2004), ”Динаміка наукових досліджень'2004”(Дніпропетровськ,2004), ”Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок”(Тернопіль, 2004), “Проблеми діагностики, профілактики та лікування екзогенних та ендогенних інтоксикацій (Чернівці, 2004),”Стан, перспективи судово-токсикологічної служби та наукових досліджень” (Харків, 2005), ”Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономічні дослідження лікарських засобів та біологічно актичних добавок” (Харків,2006), «Perspektywiczne opracowania nauki I techniki - 2007» (Przemyњl, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 51 друкована робота, з них 27 статей (7 - одноосібних) у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 19 тезів доповідей на науково-практичних вітчизняних і міжнародних конференціях та конгресах, 3 методичні рекомендації та 2 інформаційні листа.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 294 сторінках друкованого тексту, вміщує 54 таблиці, 35 рисунків, 10 схем та 8 діаграм і складається з вступу, огляду літератури, пґяти розділів, загальних висновків і списку використаної літератури, який містить 283 найменування (185 - кирилицею і 97 - латиницею) та додатків на 101 стор.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

При виборі обґєктів дослідження, ми керувались наказом МОЗ України від 17 січня 1995 р. № 6 «Правила проведення судово-медичних експертиз (досліджень) речових доказів у відділеннях судово-медичної токсикології бюро судово-медичної експертизи» (додаток № 3 «Перелік токсикологічних речовин, які підлягають судово-токсикологічному дослідженню»):

група речовин, дослідження на які повинні проводитись при загальному аналізі - морфіну гідрохлорид, кодеїну фосфат, кокаїну гідрохлорид, тримеперидину гідрохлорид (промедол); хлорпромазину гідрохлорид (аміназин), прометазину гідрохлорид (дипразин), левомепромазину гідрохлорид (тизерцин); атропіну сульфат, скополаміну гідробромид, амобарбітал натрій (барбаміл), етамінал натрію (пентобарбітал), барбітал натрій, фенобарбітал;

група речовин, на які поширюється загальний аналіз у залежності від клінічної, секційної картини, результатів гістологічного, гістохімічного дослідження - прокаїну гідрохлорид (новокаїн), лідокаїн (ксикаїн); метамізолу натрієва сіль (анальгін), кофеїн, хініну гідрохлорид, ефедрину гідрохлорид, дифенгідраміну гідрохлорид (димедрол), клонідину гідрохлорид (клофелін);

група речовин, які мають наркотичні та токсичні ефекти (фентанілу цитрат, бупренорфіну гідрохлорид, тригексифенідилу гідрохлорид (циклодол), пентоксифілін (трентал) та які не увійшли до наведеного списку.

Для досліджень нами були застосовані біологічні обґєкти (печінка, сеча, кров) з найбільшою локалізацією отрут при розподіленні у тканинах органів та біологічних рідинах.

Теоретичне обґрунтування вибору хлороформу, як ефективного екстрагента речовин різної природи з біологічних обґєктів, базувалось на його здатності до утворення стійких сольватів та на взаємодії з ліпідними фрагментами плазматичних мембран клітин. На ефективність екстракції отрут хлороформом мали вплив гідрофобні взаємодії молекул органічного розчинника з малогідратованими неполярними фрагментами молекул отрут та утворення водневих звґязків, що обумовлювало асоціації неполярних груп з молекулами хлороформу з витисканням частини гідратної води.

Вивчення впливу різних факторів на процес ізолювання хлороформом досліджуваних речовин з біологічного матеріалу та очищення хлороформних витяжок (розділ 3). Згідно з даними літератури у хіміко-токсикологічних дослідженнях зазначених отрут застосовуються методи виділення з біологічного матеріалу Васильєвої О.О., Стаса-Отто, Крамаренка В.П., які є багатостадійними, довготривалими та недостатньо ефективними.

В результаті проведених досліджень нами розроблено новий метод ізолювання органічних лікарських речовин загального дослідження з біологічного матеріалу, заснований на безперервної екстракції речовин хлороформом з тканин органів трупу при попередньому висушуванні безводним натрію сульфатом та зміні рН середовища.

Вивчення впливу таких факторів, як: статичного та динамічного режимів екстрагування, маси безводного натрію сульфату, обґєму хлороформу для елюювання речовин, швидкості витікання елюента з колонки проводили на прикладі дифенгідраміну.

Вивчення впливу зміни рН середовища при застосуванні різних за силою кислот та лугів, довготривалості контакту розчинів кислоти та луга з біологічним обґєктом на ступінь екстракції отрут (на прикладі кодеїну і барбамілу) та співекстрактивних речовин обумовлювало вибір оптимальних умов ізолювання деяких наркотичних та токсичних речовин основного та кислотного характеру хлорофоромом з тканини печінки трупу.

Дослідження нами були проведені на штучних сумішах. Для чого середні проби подрібненої печінки масою по 5,0-10,0 г, що не зазнала гнилісних змін, змішували з лікарською речовиною. Експеримент виконували на органах тварин або застосовували експертний матеріал (частину внутрішніх органів, які залишились після проведення судово-токсикологічного аналізу).

Для руйнування клітин та зневоднення тканини печінки при проведенні екстракції отрут хлороформом через добу до проб додавали по 15-20 г безводного натрію сульфату, розтирали у ступці до утворення сипкої маси та екстрагували речовини хлороформом обґємом 100 мл.

Для очищення отриманих витяжок (обґємом ~ 90 мл) застосовували метод рідинної екстракції гексаном та хлороформом. Кількісне визначення проводили методами екстракційної фотометрії з метиловим оранжевим та УФ-спектрофотометрії.

Результати, наведені в табл.1., свідчать про ефективність застосування методики безперервної екстракції у колонці у порівнянні з одноступеневою екстракцією речовини та експресність (включає менше стадій при екстрагуванні речовини) у порівнянні з чотириступеневою екстракцією.

Таблиця 1 - Результати визначення дифенгідраміну у хлороформних витяжках з тканини печінки (n = 5, Р = 95%)

Для вивчення впливу факторів (маси натрію сульфату безводного у колонці, швидкості витікання екстрагенту з колонки, обґєму екстрагенту) на процес ізолювання досліджуваних речовин з тканини печінки трупу хлороформом на прикладі дифенгідраміну нами був використаний метод латинського квадрату 3х3 та дисперсійний аналіз.

Вибір факторів обумовлений їх внеском у процес екстракції: (А) - маса безводного натрію сульфату, г (а1 -10 , а2 -20 , а3 -30); (В) - швидкість витікання хлороформу з колонки, крап/хв (в1 - 20, в2 - 60, в3 - 100); (С) - обґєм екстрагенту, мл (с1 - 50, с2 - 100, с3 - 150).

План і результати експерименту та дисперсійний аналіз надані у табл. 2. Значущість факторів А, В та С для процесу екстракції досліджуваної речовини була перевірена при використанні критерію Фішера.

Встановлено, що значущими є усі досліджувані фактори, але найбільш істотний вплив виявляє обґєм екстрагенту (С), менший внесок характерний для маси сорбенту (А) та швидкості витікання хлороформу з колонки (В).

Для зміни рН середовища нами були застосовані водні розчини кислот та лугів, які найбільш широко використовувались у загальноприйнятих методах ізолювання отрут з тканин органів: для речовин основного характеру - 25% розчин амонію гідроксиду, 0,1 М розчин натрію гідроксиду; для речовин кислотного характеру - 10% розчин кислоти щавлевої, 0,1 М розчин кислоти хлористоводневої.

Попередньо нами була проведена порівняльна оцінка значень фону домішок, для чого до середніх проб подрібненої тканини печінки вносили 0,5 мл водних розчинів відповідних кислот або лугів. рН обґєкту встановлювали за універсальним індикатором. Значення рН тканини печінки до внесення кислот або лугів дорівнювали 7,0-7,5; після додавання до проби кислот - 1,0-2,0; лугів - 11,0-12,0.

Таблиця 2 - Матриця планування експерименту, його результати та дисперсійний аналіз експериментальних даних

Для вивчення впливу розчинів кислот та лугів на фон домішок нами був застосований метод прямої УФ-спектрофотометрії в діапазоні 220 - 310 нм. УФ-спектри поглинання співекстрактивних речовин були визначені у присутності 0,1 М розчинів натрію гідроксиду та кислоти хлористоводневої, а також без зміни рН середовища.

Аналіз УФ-спектрів, згідно рис.1., свідчить, що при підкисленні або підлуговуванні тканини печінки трупу криві поглинання мало змінювались у порівнянні з результатами, отриманими без зміни рН середовища.

Результати вивчення впливу розчинів сильних та слабких кислот і лугів та довготривалості контакту (5 і 15 хв) 0,1 М розчинів кислоти хлористоводневої та натрію гідроксиду з пробами тканини печінки на екстракцію отрут з тканини печінки хлороформом свідчили про відсутність значних змін їх ступеня виділення, що обумовлено активною дією вказаних реактивів на досліджувані речовини та біологічний матеріал в момент розтирання проб з безводним натрію сульфатом (гомогенізації), коли відбувається інтенсивний розрив клітин та вплив кислоти і луга на руйнування звґязків отрут з біогенними сполуками та утворення молекулярних форм речовин (табл.3).

Рис.1. УФ-спектри поглинання домішок після екстракції з тканини печінки: 1 - хлороформом без зміни рН; 2 - після додавання 0,5 мл 0,1 М розчину NaOH; 3 - після додавання 0,5 мл 0,1 М розчинуHCl

Таблиця 3 - Результати вивчення впливу рН середовища, природи кислот і лугів та довготривалості контакту кислот та лугів з біологічним матеріалом (n=5, Р = 95%)

Нами було розроблено три варіанта методики екстракційного очищення гексаном (А, Б, В) первинних хлороформних витяжок (схема 1) та проведена їх порівняльна оцінка на прикладі дифенгідраміну.

Встановлено, що більші втрати досліджуваних речовин відбуваються при застосуванні варіанту методики (Б). Отримані дані обумовлені наявністю двох етапів очищення - гексаном та хлороформом, утворенням емульсій, для руйнування яких використовували центрифугування зі швидкістю 3000 об/хв протягом 7-10 хв.

Схема 1. Порівняльна оцінка варіантів методики екстракційного очищення гексаном первинних хлороформних витяжок, які містили дифенгідрамін

Варіанти методики (А та В) дозволяли виділити близькі за значенням кількості отрути, але варіант методики (В) може мати обмеження у застосуванні, обумовлене розчинністю досліджуваних речовин у гексані. Таким чином, для ефективного очищення первинних хлороформних витяжок гексаном нами був вибраний варіант методики (А).

ТШХ-очищення витяжок проводили за умовами, що застосовують у загальному ТШХ-скринінгу та які визнано стандартними Міжнародним комітетом з систематичного токсикологічного аналізу Міжнародної асоціації судових токсикологів.

Вивчено втрати досліджуваних отрут основного та кислотного характеру (на прикладі кодеїну та барбамілу) на усіх етапах очищення хлороформних витяжок за розробленими методиками рідинної екстракції, які складали - 2,4-3,4%, та ТШХ-очищення - 3,5-4,4% отрут.

Розробка оптимальних умов ідентифікації та кількісного визначення досліджуваних речовин (розділ 4). Встановлено уніфіковані умови аналізу органічних лікарських речовини загального дослідження ВЕРХ-методом, придатні для аналізу індивідуальних речовин, їх сумішей та скринінгу у біологічних обґєктах.

ВЕРХ-дослідження отрут проводили на мікроколоночному рідинному хроматографі «Міліхром А-02» (ЗАТ “ЕкоНова”, Новосибірськ, РФ) у зворотньо-фазному варіанті при застосуванні металевої колонки з неполярним сорбентом - Nucleosil - 100 - 5, C18; при використанні лінійного градієну від елюенту А (10% ацетонітрилу та 90% буферного розчину рН 2,8) до елюенту Б (100% ацетонітрилу) протягом 25 хв; швидкості надання розчиннику - 100 мкл/хв; температурі колонки -35 - 37С; тиску насосу - 2,6 - 2,8 МПа; обґєму проби для введення- 1-5 мкл.

Багатоканальне УФ-спектрофотометричне детектування речовин проведено за 7 довжинами хвиль - 210, 230, 240, 260, 280, 300 та 330 нм, при цьому кожній речовині на хроматограмі відповідали 7 піків з однаковим часом утримування, але з різними амплитудами, прямо пропорційними екстинкції. Коефіцієнти симетрії піків досліджуваних речовин були менше 2,0 -2,5, розраховані значення коефіцієнтів ємності були від 2 до 10, що свідчило про придатність хроматографічної системи.

Параметри ідентифікації досліджуваних отрут ВЕРХ-методом наведені в табл.4. Застосування вище зазначених умов хроматографування при аналізі багатокомпонентних сумішей речовин, природнього та синтетичного походження, подібних за будовою (наркотичних речовин, алкалоїдів похідних пурину, хіноліну, пиридину та піперидину, ізохінолину та похідних кислоти барбітурової) (рис.2) надавало можливості достатньо добре розділяти речовини та проводити подальшу обробку одержаних результатів.

Для оцінки хроматографічного розділення сумішей розраховували: коефіцієнт симетрії піку, коефіцієнт ємності, селективність, коефіцієнт розділення піків (табл. 5).

Розроблені умови ВЕРХ-аналізу застосовано для кількісного визначення речовин у модельних розчинах та біологічних обґєктах (сеча,кров) на прикладі кофеїну, бупренорфіну та етаміналу.

Для аналізу речовин у витяжках з біологічних рідин розроблено модифікації методик екстракції речовин основного та кислотного характеру із сечі та крові за допомогою хлороформу та очищення від домішок при застосуванні рідинної екстракції гексаном та хлороформом з водної фази (схема 2, рис.3-5). .

Таблиця 4 - Параметри утримування та спектральні відношення досліджуваних речовин (n = 5)

Рис.2. Хроматограма суміші речовин, похідних пурину:1 - теоброміну (25,0 мкг/мл); 2 - теофіліну (25,0 мкг/мл); 3 - кофеїну (25,0 мкг/мл); 4 - пентоксифіліну (50,0 мкг/мл).

Таблиця 5 - Основні хроматографічні параметри розділення піків речовин

Рис.3. Хроматограма екстракта із сечі, який містив:1 - кофеїн; 2 - пентоксифілін. 

Рис. 4. Хроматограма екстракта із сечі, який містив: 1 - морфін; 2 - кодеїн; 3 - бупренорфін

Результати ВЕРХ-аналізу речовин у біологічних рідинах надані в табл. 6. Для підтвердження відтворюваності одержаних результатів було проведено порівняльну оцінку двох методів аналізу - ВЕРХ та екстракційної фотометрії або УФ-спектрофотометрії. Встановлено, що при використанні F-критерію, розбіжність дисперсій незначна, тому методики характеризуються однаковою відтворюваністю.

Схема 2. Екстракція речовин основного та кислотного характеру із сечі та крові

Рис.5. Хроматограма екстракта із крові, який містить етамінал

Таблиця 6 - Результати ВЕРХ-визначення лікарських речовин у біологічних рідинах при застосуванні розроблених методик аналізу (n=5, Р = 95%)

ГРХ-аналіз був нами проведений за домогою газового хроматографа «Кристал-2000» за умовами хроматографування: скляна колонка з сорбентом Хроматон N-AW-DMCS (0,16-0,20 мкм) завдовжки 3 м та діаметром - 3 мм; рідка фаза - 5% SE-30, детектор електронно-захватний. Обґєм введеної проби - 1-5 мкл (дозування та введення проб виконували за допомогою мікрошприца «Hamilton» місткістю 10 мкл).

Проведено вибір температурного режиму та швидкості надання азоту для аналізу індивідуальних речовин (на прикладі кофеїну) та їх сумішей. Встановлено, що при застосуванні ізотермічного температурного режиму (колонки - 190єС, детектору -220єС, випарника - 210єС), швидкості надання - азоту - 20,0 мл/хв на хроматограмі спостерігались симетричні піки кофеїну та чітке розділення піків етанолу та кофеїну (рис.6).

При дослідженні сумішей речовин як розчинник був застосований ацетон; на хроматограмах відмічалось чітке розділення піків ацетону та речовин в умовах програмованому температурному режиму (колонки - від 100єС до 250єС із зміною 20єС в хв, електронно-захватного детектор 260єС, випарнику - 260єС), швидкості надання газу - 60,0 мл/хв (рис.7).

Рис.6. Хроматограма етанольного розчину кофеїну:1 - етанол; 2 - кофеїн (50,0 мкг/мл)

Рис.7. Хроматограма ацетонового розчину прокаїну (25,0 мкг/мл)

Аналіз індивідуальних отрут методом газо-рідинної хроматографії проводили після ТШХ-скринінгу. У розроблених умовах ГРХ-аналізу нами були визначено часи утримування отрут, розраховані коефіцієнти симетрії піків та показники ефективності хроматографічної колонки(табл.7).

Таблиця 7 - Аналіз досліджуваних речовин ГРХ-методом

Розроблені умови ГРХ-аналізу нами застосовано при дослідженні витяжок з крові на прикладі прокаїну. Встановлено, що розроблені методики дозволяли визначити прокаїну в крові ГРХ - до 60,7±5,0% та екстракційною фотометрією з метиловим оранжевим до 62,5 ±3,5 %. Встановлено, що за F-критерієм наведені вище методики аналізу мали незначні розбіжності дисперсій методів.

При проведенні досліджень методом екстракційної фотометрії нами були застосовані кислотні індикатори - метиловий оранжевий та бромтимоловий синій та азобарвник на основі теофілідину. Для вибору оптимальних умов екстракційно-фотометричного аналізу отрут та скринінгових досліджень нами виконано модифікування методик у напрямках утворення іонних асоціатів та фотометрирування отриманих розчинів. Розраховано коефіцієнти регресії градуювальних графіків кількісного визначення отрут за розробленими методиками; інтервали лінійності графіків та результати аналізу отрут в модельних розчинах.

Встановлено, що розроблені методики придатні для дослідження біологічних обґєктів (на прикладі аналізу прометазину у сечі). При проведенні порівняльної оцінки методів екстракційної фотометрії (до 70,1±4,9%) та УФ-спектрофотометрі (до 73,5 ±4,7%) встановлено їх незначні розбіжності, що вказувало на однакову відтворюваність розроблених методик.

Застосування методу похідної спектрофотометрії дозволило нивілювати вплив фону домішок та надавало можливості отримувати надійні та обґєктивні результати при відсутності контрольних проб (на прикладі пентоксифіліну). Другу похідну від спектрів поглинання (d 2A / d л2) розраховували за допомогою поліноміальної апроксимації методом найменших квадратів (рис.8). Встановлено, що за розробленими методиками методом похідної спектрофотометрії можливо визначити до 71,91±4,03% пентоксифіліну в екстрактах з тканини печінки. При порівнянні дисперсій за F-критерієм для похідної спектрофотометрії та УФ-спектрофотометрії встановлено, що обидві методики практично рівноцінні.

Розробка варіантів скринінгу органічних лікарських речовин загального дослідження у біологічних обґєктах (розділ 5). Вперше запропоновано методологічний підхід до застосування можливості утворення досліджуваними речовинами іонних асоціатів із зазначеними індикаторами за розробленими умовами як критерій для розділення отрут на групи при скринінгових дослідженнях.

Розроблена нами схема ВЕРХ-скринінгу отрут основного характеру з використанням іонних асоціатів з метиловим оранжевим базувалась на двох етапах: I етап - розділення речовин на дві групи в залежності від здатності утворювати іонні асоціати з метиловим оранжевим за розроблених умов - хлорпромазин, кодеїн, дифенгідрамін, тригексифенідил, фентаніл, клонідин, прометазин, кокаїн, левомепромазин, лідокаїн, прокаїн, папаверин, тримеперидин, хінін та не утворювати - морфін, пентоксифілін, кофеїн, теобромін, теофілін, ксантинол, ефедрин.

Рис.8. УФ-спектри витяжок з проб тканини печінки після ТШХ-очищення: 1 - проба, яка містить пентоксифілін; 2, 4 - друга похідна відповідних спектрів; 3 - контрольна проба.

II етап - ідентифікація індивідуальних речовин ВЕРХ-методом за хроматографічними характеристиками, отриманими в результаті аналізу іонних асоціатів за розроблених умов хроматографування. Ідентифікацію ВЕРХ-методом речовин, що не утворювали іонних асоціатів, також проводили за параметрами утримування та спектральними відношеннями.

Встановлено, що розроблені умов...