Размещено на http://www.allbest.ru/

Глава 1

1.1 Биоэтанол как биотопливо

Биоэнергетика - это отрасль энергетики, основанная на использовании источников энергии органического происхождения для получения тепловой, электрической и механической энергии (для производства тепла, электричества и моторного топлива) (ГОСТ 54531-2011). Известны три основных способа переработки биомассы в целях получения энергии: традиционное сжигание в виде дров, термохимические способы получения топлива и биоконверсия. Биоэтанол относится к видам биотоплива, получаемым методом биоконверсии. Это жидкое спиртовое топливо, которое производится из сельскохозяйственной продукции, содержащей крахмал или сахар, например, из кукурузы, зерновых или сахарного тростника. В отличие от спирта, из которого производятся алкогольные напитки, топливный этанол не содержит воды и производится укороченной дистилляцией (две ректификационные колонны вместо пяти).

Основная часть этанола производится в Северной и Южной Америке, мировым лидером является Бразилия. В Евросоюзе принят закон о доведении доли автомобильного биоэтанола до 5.75%, поэтому производство этанола растет за счет активного увеличения объемов его производства такими странами, как Испания, Франция, Германия и Италия. На африканском континенте в производстве этанола лидирует Южноафриканская республика, где из мелассы производится 70% этанола региона. Китай и Индия приняли программу о доведении доли биотоплива до 5%. Согласно «Дорожной карте», опубликованной американским департаментом энергии (US DOE), в США планируется ускорить разработку способов конверсии биомассы в биотопливо с тем, чтобы довести долю биотоплива до 30% к 2030 году [“Breaking the Biological Barriers to Cellulosic Ethanol: A joint Research Agenda,” Department of Energy, SC-0095. 2005]. По данным Российской биотопливной ассоциации (http://www.bioethanol.ru/Legislation/ LegislationRussia/) в последнее время в России тоже появился значительный интерес к использованию биоэтанола в моторных топливах, разработан государственный стандарт на жидкие моторные топлива, содержащие 5%-10% (по объему) этанола, предназначенные для автомобильных двигателей с принудительным зажиганием (ГОСТ Р 52201-2004). Действующими стандартами допускается добавление в автомобильные бензины до 10% биоэтанола. Предполагаемое внедрение в России стандартов на моторное топливо, соответствующие требованиям Евро-4 и Евро-5 потребует обязательного использования в моторном топливе оксигенатов, наиболее подходящим из которых является биоэтанол. Биоэтанол повышает октановое число, является оксигенатом (обеспечивает более полное сгорание топлива), что приводит к уменьшению выбросов вредных веществ в атмосферу В 2001 г. вклад топлива из биомассы в энергобаланс мира составлял 1,1 - 1,2 млрд.т нефтяного эквивалента при общем вкладе всех возобновляемых источников энергии 1,36мл рд.т. К 2040 г. Потребление энергии в мире прогнозируется на уровне 13,5 млтд.т нефтяного эквивалента, а использование возобновляемых источников к этому времени составит 47,7%, в то время как применение топлива из биомассы должно составить 23,8% или 3,21 млрд.т нефтяного эквивалента (ГОСТ 52808-2007).

Этанол является единственным горючим, которое не повышает эмиссии тепличных газов, поскольку двуокись углерода абсорбируется в фазе роста растений [Пекоус Л.В. Производство топливного и питьевого спирта (этанола) в США, НовоНордиск США http://www.sergeyosetrov.narod.ru /Production_alcohol_in_USA.htm]. По оценкам Управления по охране окружающей среды США, бензин является крупнейшим источником искусственных канцерогенных веществ. Благодаря добавлению этанола бензин обогащается кислородом, что способствует более полному сгоранию и уменьшению выбросов окиси углерода на 30%. Он также уменьшает выбросы токсичных веществ на 30%, а выбросы летучих органических соединений - более чем на 25%.

В последние десятилетия наблюдается стабильная тенденция сокращения доли использования ископаемого углеводородного сырья за счет его замены на альтернативное сырье растительного происхождения. В 2010 году в Российской федерации утверждены Технические условия (ГОСТ Р 53200-2008) на производство биоэтанола из растительного сырья. Можно производить спирт почти из любого сырья, содержащего крахмал, но существуют определенные различия в оборудовании, в используемых ферментах, осахаривающих крахмал и условиях, которые требуются для эффективного использования различного сырья, содержащего крахмал. Использование биоэтанола в качестве альтернативы нефти в значительной степени зависит от биотехнологии растений. Для полной замены топлива из нефти на биотопливо потребовалось бы более 100 миллионов гектаров земли при урожайности биомассы 50 т/га и эффективности конверсии 75% (Таблица) [Henry , 2010].

биотопливо сахаросодержащий микроорганизм растение

Таблица 1 Оценка площади для выращивания биомассы необходимой для полной замены топлива из нефти на биотопливо (из расчета потребления топлива 3930 миллионов тонн в год, BP statistical review of world energy 2009, http://www.bp.com/productlanding.do?categoryId=6929&contentId=7044622) [Henry , 2010].

1.2 Растительная биомасса как возобновляемый источник сахаросодержащего сырья

Целлюлоза - это гомополимер, состоящий из молекул глюкозы, соединенных в-1,4 связью. Количество звеньев глюкозы в молекуле целлюлозы во вторичной клеточной стенке растений как правило варьирует от 7000 до 14000, в первичной клеточной стенке молекулы целлюлозы состоят из около 500 звеньев глюкозы. Между отдельными молекулами целлюлозы образуются ван-дер-ваальсовы и водородные связи, в результате чего формируются микрофибриллы и волокна целлюлозы. Внутри микрофибриллы все молекулы целлюлозы имеют одинаковую ориентацию, восстановленные концы соседних сахарных цепей расположены на одном конце микрофибриллы. Упорядоченные в микрофибриллы молекулы формируют кристаллическую решетку волокна, перемежающуюся с аморфными фрагментами. Степень кристаллизации в природной целлюлозе составляет 60-90%. По данным рентгеноструктурного анализа различают как минимум 4 кристаллических формы.

Первичная клеточная стенка растений состоит из целлюлозных фибрилл, погруженных в матрикс, в состав которого входят другие полисахариды (рисунок 1). Матрикс состоит из полисахаридов, которые для удобства описания делят обычно на пектины и гемицеллюлозы. Пектины -- это кислые полисахариды с относительно высокой растворимостью. Гемицеллюлозы -- это смешанная группа полисахаридов, растворимых в щелочах. У гемицеллюлоз, как и у целлюлозы, молекулы имеют форму цепи, однако их цепи короче, менее упорядочены и сильно разветвлены. Клеточные стенки гидратированы: 60--70% их массы обычно составляет вода. По свободному пространству клеточной стенки вода перемещается беспрепятственно. У некоторых клеток, например, у клеток мезофилла листа, на всем протяжении их жизни имеется только первичная клеточная стенка. Однако у большинства клеток на внутреннюю поверхность первичной клеточной стенки (снаружи от плазматической мембраны) отлагаются дополнительные слои целлюлозы, так возникает вторичная клеточная стенка. В любом слое вторичного утолщения целлюлозные волокна располагаются под одним и тем же углом, но в разных слоях этот угол различен, чем и обеспечивается еще большая прочность структуры. Некоторые клетки, такие, как трахеальные элементы ксилемы и клетки склеренхимы, претерпевают интенсивную лигнификацию (одревеснение). При этом все слои целлюлозы пропитываются лигнином -- сложным полимерным веществом, не относящимся к полисахаридам. Лигнин скрепляет целлюлозные волокна и обеспечивает твердый и жесткий матрикс, усиливающий прочность клеточных стенок на растяжение и, в особенности, на сжатие. Это главный опорный материал дерева. Он также предохраняет клетки от повреждения под действием физических и химических факторов.

Рисунок 1 - Структура стенки растительной клетки.

Вся растительная биомасса представляет собой композицию одних и тех же составных частей - экстрагируемых веществ, целлюлозы, гамицеллюлозы, крахмала, пектинов, лигнина, белка и золы. У разных растений различается лишь их соотношение (рисунок 2). Механическая и химическая предобработка может также до некоторой степени изменить соотношение компонентов.

К экстрагируемым веществам относят все вещества, находящиеся вне растительной клетки и не являющиеся структурными компонентами клеточной стенки. Эти вещества могут быть легко экстрагированы водой или органическими растворителями. Механическая, физическая или химическая обработка биомассы может приводить к высвобождению содержимого клеток и увеличению количества экстрагируемых веществ.

Целлюлоза, гемицеллюлоза, крахмал, пектины и лигнин являются углеводами и представляют собой различные полимеры пента и гекса сахаров. Крахмал - полимер глюкозы, молекулы которой соединены альфа-гликозидными связями. Крахмал содержится в запасающих органах растений - клубнях, корнеплодах и семенах. Основным полисахаридом стеблей и листьев растений является целлюлоза. Это также полимер глюкозы, однако молекулы глюкозы в целлюлозном волокне соединяются бета-гликозидными связями. Пектины - разветвленные полисахариды, состоящие главным образом из молекул галактуроновой кислоты и её метилового эфира, - наиболее распространены во фруктах и молодых тканях растений.

Рисунок 2 - Композиционный состав биомассы различных видов растений. [Hames B.R. Biomass Compositional Analysis for Energy Applications Jonathan R. Mielenz (ed.), Biofuels, Methods in Molecular Biology, vol. 581, 145 - 167].

Лигнин производится клеткой когда она уже фактически закончила рост. Это нерегулярный полимер, разветвленные макромолекулы которого построены главным образом из остатков замещенных фенолоспиртов. Содержание золы в растительной биомассе фактически характеризует неорганические компоненты. В зависимости от состава полисахаридов клеточной стенки, растения предпочтительнее для пищи, корма или биоэнергетики [Henry , 2010]. Так, например, переработка сахарного тростника дает два cопродукта - сахар и биоэтанол. В мире производится 1560 миллионов тонн сахарного тростника, в основном в Бразилии (33%) и Индии (22,6%). Сахарного тростника снимают 3-8 урожаев с одного корня. Урожайность 50 - 150 т/га. Биомасса сахарного тростника разделяется на две части - сахарный сироп (меласса) и оставшиеся выжатые части стеблей (багасса). Из сахарного сиропа получают патоку, а багассу или непосредственно сжигают в печах, или перерабатывают в биоэтанол [Tammisola, 2010]. Багасса насыщена остаточными сахарами после удаления сахарного сиропа и обладает достаточной экономической эффективностью для получения этанола с помощью существующих технологий.

1.2.1 Энергетические культуры

Идеальная энергетическая культура должна обладать высокой эффективностью использования ресурсов, иметь устойчивый потенциал для сбора и преобразования солнечной энергии в биомассу с максимальной эффективностью и при минимальных затратах и экологических последствиях. Эти характеристики во многом определяются фотосинтетической системой растения (С3 или С4). Метаболический вариант фотосинтетической фиксации CO₂ у растений с С4-фотосинтезом отличается тем, что первыми стабильными соединениями при фиксации СО₂ являются четырехуглеродные органические кислоты -- яблочная и аспарагиновая. Отличительной особенностью С4- растений является высокая скорость фиксации СО₂ в расчете на единицу поверхности листа, более высокая общая фотосинтетическая продуктивность, быстрая скоростью роста. К С4- типу относятся некоторые виды растений в основном тропических и очень небольшое число видов из умеренных широт.

[Dohleman F.G., Long S.P. More productive than maize in the midwest: how does Miscanthus do it? Plant Physiol. 2009 August; 150(4): 2104-2115].

Различают три направления развития биотопливного сырья: увеличение общего количество биомассы, произведенной на гектар в год, поддержание устойчивой продуктивности при минимизация затрат, и увеличение количество топлива, которое может быть произведено из единицы биомассы. Перспективные для биоэнергетики растения должны отвечать следующим критериям:

возможность легкой генетической модификации,

большое накопление биомассы,

высокий индекс урожайности,

низкая потребность в удобрениях,

способность расти на маргинальных землях,

собираемая биомасса должна храниться в поле,

высокая плотность загрузки биомассы,

высокая эффективность использования воды,

высокая эффективность использования азота,

плантации должны быть устойчивы к появлению сорняков,

низкая себестоимость биомассы,

оптимальный химический состав биомассы,

возможность извлекать из биомассы побочные продукты с высокой добавочной стоимостью.

В качестве потенциальных энергетических растений исследуют водоросли и высшие растения. Введение в агрокультуру новых видов растений, дающих большие урожаи биомассы с высоким содержанием целлюлозы и низким содержанием лигнина, выращиваемых традиционными методами сельского хозяйства, может оказаться перспективным способом вовлечения новых источников возобновляемого растительного сырья для многоцелевого использования.

1.2.2 Мискантус как новый перспективный вид сырья

Наряду с такими известными видами как пшеница, овес, кукуруза, крапива, конопля, подсолнечник, лен и др. появляются и активно вводятся в практику все новые растения, среди которых наибольшую продуктивность по биомассе имеет мискантус (рисунок 3).

Рисунок 3 - питомник мискантуса ИЦиГ СО РАН.

Мискантус - род многолетних травянистых растений семейства мятликовых. К роду Miscanthus относят более 20 видов, распространенных от тропической и Южной Африки до Восточной и Юго-Восточной Азии. В России на Дальнем Востоке встречается 3 вида: мискантус сахароцветный (Miscanthus sacchariflorus), мискантус краснеющий (Miscanthus purpurascens), мискантус китайский (Miscanthus sinensis) (http://www.plantarium.ru/ page/view/item/41884.html). Для целей энергетики мировым сообществом рассматривается Miscanthus x giganteus - стерильный триплоидный гибрид Miscanthus sinensis и Miscanthus sacchariflorus (Hodkinson & Renvoize, 2001). По данным IENICA - CROPS DATABASE, его продуктивность составляет 11,7-25,3 т сухой биомассы с гектара в год. В Дании зафиксирован сбор 44 т сухой биомассы/га/год, в США более 60 т [www.ienica.net/cropsdatabase.htm, Heaton E.A. et al., 2008]. В настоящее время мискантус в связи с хорошей урожайностью сухой биомассы, засухоустойчивостью и зимостойкостью рассматривается также как один из наиболее перспективных источников возобновляемого целлюлозосодержащего сырья (www.ienica.net/cropsdatabase.htm). Коэффициент конверсии солнечной энергии в биомассу у мискантуса составляет 4075 г/м². Для сравнения, у проса прутьевидного (многолетний злак высокотравных прерий) этот коэффициент равен 1146 г/м² [Heaton E.A. et al., 2008].

Мискантус, в отличие от тропических С4 растений, обладает замечательной особенностью расти в прохладном климате не снижая продуктивности. По результатам определения химического состава содержание целлюлозы составляет в пределах 44 %, лигнина 17 %, гемицеллюлозы 24 %. [Dohleman F.G., Long S.P. More productive than maize in the midwest: how does Miscanthus do it? Plant Physiol. 2009 August; 150(4): 2104-2115].

1.3 Гидролиз растительной биомассы микроорганизмами

Гидролиз растительной биомассы микроорганизмами - ключевой момент круговорота углерода в природе. Целлюлоза является нерастворимым субстратом для микроорганизмов. Нерастворимость целлюлозы привела к тому, что её деградация осуществляется либо секретируемыми клеткой ферментами, либо комплексом ферментов, ассоциированным с внешней поверхностью клеточной стенки микроорганизма. Существует по меньшей мере пять разных механизмов, которые микроорганизмы используют для гидролиза целлюлозы, в основе каждого лежит ферментативная деполимеризация полисахаридов клеточной стенки растений. Экстраклеточная локализация ферментативного комплекса накладывает свои ограничения: белки целлюлозолитического комплекса должны быть достаточно устойчивы к протеолизу. С другой стороны, продукты гидролиза целлюлозы зачастую оказываются удобным субстратом для других микроорганизмов, в результате образуются сообщества микроорганизмов с большим разнообразием отношений. Ферменты, катализирующие деполимеризацию целлюлозы тем или иным образом, называются целлюлазами. Эффективный гидролиз целлюлозы требует совместной работы как минимум трех типов целлюлаз: эндоглюканазы (1,4-в-D-глюкан глюкогидролаза, EC 3.2.1.4), экзоглюканазы (1,4-в-D-глюкан целлобиогидролаза, EC 3.2.1.91) и в-глюкозидазы (в-D-глюкозид глюкогидролаза, EC3.2.1.21).

Ферменты, расщепляющие целлюлозу до сахаров, широко распространены в природе но, главным образом, вырабатываются микроорганизмами-сапротрофами: бактериями, археями и грибами. Целлюлазная система грибов (например, Trichoderma reesei) содержит все три основных активности: эндоглюканазную, экзоглюканазную и в-глюкозидазную, работающие синергично [Mukherjee PK, Horwitz BA, Kenerley CM. Secondary metabolism in Trichoderma--a genomic perspective. Microbiology. 2012 Jan;158(Pt 1):35-45. Dashtban M, Buchkowski R, Qin W. Effect of different carbon sources on cellulase production by Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei) strains. Int J Biochem Mol Biol. 2011;2(3):274-86.]. Эндоглюканазы атакуют аморфные зоны целлюлозных волокон, формируя места для экзоглюканаз, которые могут «откусывать» целлобиозные молекулы от более кристаллизованных областей волокна. В заключение, в-глюкозидазы гидролизуют целлобиозу. В отличие от целлюлозолитической системы аэробных грибов Trichoderma reesei, целлюлозолитическая система большинства анаэробных микроорганизмов организована в большой мультипротеиновый комплекс - целлюлосому, - закреплённый на внешней стороне клетки. Целлюлосома содержат от 15 до 25 различных целлюлаз и гемицеллюлаз, объединённых некаталитическим белком - скаффолдином, её молеклярный вес составляет от 2 до 6,5 х 10⁶ кДа. [Pinheiro BA, Gilbert HJ, Sakka K, Sakka K, Fernandes VO, Prates JA, Alves VD, Bolam DN, Ferreira LM, Fontes CM. Functional insights into the role of novel type I cohesin and dockerin domains from Clostridium thermocellum. Biochem J. 2009 Dec 10;424(3):375-84.]. Связывание обеспечивают консервативные гидрофобные повторы, называемые докеринами, и комплементарные им рецепторы скаффолдина - когезины. На поверхности одной клетки Clostridium thermocellum располагается несколько целлюлосом, чем обеспечивается надёжная фиксация микроорганизма на волокне целлюлозы. Упорядоченность ферментов в составе целлюлосомы облегчает доступ ферментов к субстрату. Локализация микроорганизма в непосредственной близости к месту появления сахаров дает преимущества в доступе к этим питательным веществам. Некоторые анаэробные бактерии утратили способность нести целлюлосому на поверхности клетки, в этих культурах можно обнаружить фракцию свободных целлюлосом в культуральной жидкости [Mohand-Oussaid O, Payot S, Guedon E, Gelhaye E, Youyou A, Petitdemange H. The extracellular xylan degradative system in Clostridium cellulolyticum cultivated on xylan: evidence for cell-free cellulosome production. J Bacteriol. 1999 Jul;181(13):4035-40.].

1.4 Биотехнологии на основе биомассы растений

Задача ферментирования растительной биомассы решается уже длительное время, но интенсивные исследования были начаты относительно недавно (Canilha L., Chandel A.K., dos Santos Milessi T.S., Antunes А.F.А., da Costa Freitas W.L., das Graзas Almeida Felipe M., da Silva S.S. Bioconversion of Sugarcane Biomass into Ethanol: An Overview about Composition, Pretreatment Methods, Detoxification of Hydrolysates, Enzymatic Saccharification, and Ethanol Fermentation J Biomed Biotechnol. 2012; 2012: 989572. Published online 2012 November 26. doi: 10.1155/2012/989572, Dashtban M., Schraft H., Qin W.

Fungal Bioconversion of Lignocellulosic Residues; Opportunities & Perspectives Int J Biol Sci. 2009; 5(6): 578-595., Jцnsson L.J., Alriksson B., Nilvebrant N.-O. Bioconversion of lignocellulose: inhibitors and detoxification Biotechnol Biofuels. 2013; 6: 16. Published online 2013 January 28. doi: 10.1186/1754-6834-6-16,

Silva J.P.A., Carneiro L.M., Roberto I.C. Treatment of rice straw hemicellulosic hydrolysates with advanced oxidative processes: a new and promising detoxification method to improve the bioconversion process Biotechnol Biofuels. 2013; 6: 23. Published online 2013 February 15. doi: 10.1186/1754-6834-6-23). В настоящее время в мире нет коммерчески оправданной технологии производства целлюлозного этанола. Ключевой проблемой технологического процесса остается себестоимость деполимеризации целлюлозы. Существует два основных типа биоконверсии: (1) биокаталитические технологии, основанные на использовании ферментов, свободных или иммобилизованных на специальных носителях; (2) технологии микробиологического синтеза, основанные на использовании специальных штаммов-продуцентов. Для получения целевых продуктов используют последовательно оба подхода.

Некоторые бактерии способны использовать для роста достаточно широкий спектр субстратов от простых моносахаров до сложных углеводов. Именно такие бактерии используются для микробиологической конверсии биомассы в целевые продукты. На рисунке 4 приведены графики продукции водорода, лактата и ацетата термофильными бактериями Caldicellulosiruptor saccharolyticus (порядок Clostridiales) и галофильными бактериями Thermotoga neapolitana (порядок Thermotogales) [de Vrije T, Bakker RR, Budde MA, Lai MH, Mars AE, Claassen PA. Efficient hydrogen production from the lignocellulosic energy crop Miscanthus by the extreme thermophilic bacteria Caldicellulosiruptor saccharolyticus and Thermotoga neapolitana. Biotechnol Biofuels. 2009 17;2(1):12. doi: 10.1186/1754-6834-2-12]. Оптимум температур составляет 70°С для первых и 80 °С для вторых. Продукция водорода на предобработанной щелочью и гидролизованной ферментами биомассе мискантуса составила более 75 % от теоретически ожидаемого. В качестве побочных продуктов обе бактерии производят ацетат и лактат.

Рисунок 4 - Продукция водорода (круги), ацетата (треугольники) и лактата (ромбы) С. Saccharolyticus (темные фигуры) и T. Neapolitana (светлые фигуры) на гидролизате мискантуса. Исходные концентрации моносахаров 10 г/л, 14 г/л и 28 г/л слева направо [de Vrije T].

Svetlitchnyi с соавторами получили термостабильный консорциум, состоящий из разрушающих целлюлозу бактерий рода Caldicellulosiruptor и бактерий, продуцирующих этанол рода Thermjanaerobacter. Бактерии рода Thermjanaerobacter в качестве субстрата могли использовать целлобиозу, глюкозу, ксилозу и ксилан. Полученный в результате консорциум мог конвертировать в этанол, лактат и ацетат 30 % биомассы тополя и 33 % биомассы мискантуса [Svetlitchnyi V. A., Kensch O., Falkenhan D. A., Korseska S. G., Lippert N., Prinz M., Sassi J., Schickor A., Curvers S. Single-step ethanol production from lignocellulose using novel extremely thermophilic bacteria// Biotechnol. Biofuels. 2013. 6(31). doi: 10.1186/1754-6834-6-31].

Идеальным продуцентом этанола на сегодняшний день являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae. S. cerevisiae обладают высокой продуктивностью этанола, устойчивостью к его высоким концентрациям, хорошо изучены в генетическом плане. Именно поэтому ряд авторов предпринимает попытки провести генетическую модификацию дрожжей с целью введения в геном генов целлюлаз. В работах по созданию сшитых ферментных конструкций (миницеллюлосом), содержащих несколько доменов комплекса, показано, что при иммобилизации на поверхности дрожжей эндоглюканазы, экзоглюканазы и бета-галактозидазы происходит почти 9-тикратное увеличение активности целлюлазного комплекса по сравнению со свободными ферментами. Такое увеличение активности достигается повышением локальной концентрации ферментов в одном месте. Кроме синергизма от одновременной работы разных ферментов, значительное повышение активности комплексу придает и включение целлюлозосвязывающего домена. Продукция этанола на микрокристаллической целлюлозе в качестве единственного источника углерода генетически модифицированными дрожжами S. cerevisiae, несущими на своей поверхности миницеллюлосому составила 1,412 мг/л [Wen F, SunJ, Zhao HM: Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Appl EnvironMicrobiol 2010, 76:1251-1260, Fan LH, Zhang ZJ, Yu XY, Xue YX, Tan TW. Production of minicellulosomes from Clostridium cellulovorans for the fermentation of cellulosic ethanol using engineered recombinant Saccharomyces cerevisiae. Hyeon JE, Yu KO, Suh DJ, Suh YW, Lee SE, Lee J, Han SO. FEMS Microbiol Lett. 2010 Sep 1;310(1):39-47, Fan L.-H., Zhang Z.-J., Yu X.-Y., Xue Y.-X., and Tan T.-W. Self-surface assembly of cellulosomes with two miniscaffoldins on Saccharomyces cerevisiae for cellulosic ethanol production. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 14;109(33):13260-5]

1.4.1 Ферментативный гидролиз

Гликозид гидролазы - большой класс ферментов, осуществляющих широкий спектр реакций, включая расщепление целлюлозы и гемицеллюлозы до моносахаридов. Различные ферменты этого класса могут иметь как высокую специфичность к субстрату, так и быть способными использовать широкий их спектр. Изначально эти ферменты разделяли на группы на основании субстратной специфичности, но, так как для большинства из них она не определялась или определялась для малого количества субстратов, то сейчас гликозид гидролазы разделяют на несколько семейств на основании их последовательностей и трехмерной структуры. В настоящее время насчитывают 132 семейства и 14 кланов гликозид гидролаз (http://www.cazy.org/).

Даже внутри одного генома разнообразие гликозид гидролаз может быть значительным; кроме того, для этого типа ферментов характерно модулярное строение: присутствие в одном ферменте каталитического гидролазного домена и углевод-связывающего домена (CBM). Углевод-связывающие домены имеют небольшой размер и заметно увеличивают активность фермента, сближая гидролазный домен с субстратом (Shoseyov et al., 2006). Все гликозид гидролазы (за исключением семейства 4) осуществляют гидролиз гликозидной связи при помощи одного из двух механизмов (Yip, Withers, 2006): с обращением аномерной конфигурации субстрата, либо с его сохранением.

Эффективный гидролиз целлюлоз требует совместного действия эндо- и экзоглюканаз, взаимодействующих с нерастворимым субстратом, и в-глюкозидаз, расщепляющих олигосахара (рис. 5).

Рисунок 5 - Схема ферментативного расщепления целлюлозы (из Yoeman et al., 2010).

Эндоглюканазы случайным образом разрушают внутренние глюкозидные связи, тем самым быстро увеличивая количество восстанавливающих концов цепей полисахаридов. Экзоглюканазы отщепляют олигонуклеотиды (главным образом, целлобиозу) с восстанавливающего или невосстанавливающего концов, что приводит к быстрому высвобождению олигонуклеотидов, но медленному уменьшению длины полимера (Percival, Zhang, 2006). Целлобиоза - две молекулы глюкозы, соединенные в-1,4-связью. Расщепление целлобиозы до глюкозы осуществляется в-глюкозидазами. Некоторые ферменты этой группы могут также расщеплять более длинные олигосахариды и целлодекстрины; в этом случае они называются целлодекстриназами. Гидролиз целлобиозы в-глюкозидазами необходим, так как целлобиоза ингибирует эндо- и экзоглюканазы (Shen et al., 2008).

1.4.2 Эндоглюканазы

Эндоглюканаза - фермент расщепляющий цепь целлюлозы в случайном месте в середине цепи - способна к расщеплению аморфной целлюлозы и плохо справляется с кристаллической целлюлозой. Эндо-1,4-в-D-глюканазы относятся к семействам 5-9, 12, 44, 45, 48, 51, 61, 74 гликозидгидролаз. Наибольший технологический потенциал имеют термостабильные эндоглюканазы, большинство из них относится к семейству 12, а также к семействам 5, 8 и 45 (Ando et al., 2002). Термостабильные эндоглюканазы были получены из темофильных бактерий и архей, а также из мезофильных и умеренно термофильных грибов. Для многих из этих белков была проведена гетерологичная экспрессия и определены их основные характеристики. Кроме микроорганизмов, термофильная эндо-1,4-в-глюканаза была получена из моллюска Mytilus edulis (Xu et al., 2000). Этот фермент оказался способен сохранять ферментативную активность в течение 10 мин при 100°С. Известны несколько ферментов, имеющих оптимальную активность при температурах 100°С или выше. Эндоглюканаза археи Pyrococcus furiosus, относящаяся к семейству 12, сохраняет ферментативную активность даже при 120°С (Bauer et al., 1999). У этого фермента отсутствует углевод-связывающий домен, что характерно для многих термостабильных эндоглюканаз. Отсутствие углевод-связывающего домена приводит к слабой гидролитической активности на кристаллическом субстрате (Szijarto et al., 2008).

Как правило, время сохранения активности фермента заметно снижается при увеличении температуры выше точки его максимальной активности. Так, для эндоглюканазы CelB Thermotoga neapolitana, время полужизни при 106°С составляет 130 мин, в то время как при 110°С оно уменьшается до 26 мин (Bok et al., 1998).

Считается, что термостабильность эндоглюканаз во многих случаях обеспечивается гликозилированием, а удаление гликозилирования приводит к уменьшению термостабильности (Hong et al., 2003). Гликозилированные глюканазы встречаются, главным образом, у грибов.

Оптимумы pH у эндоглюканаз варьируют в широких пределах. Так, эндоглюканаза термоацидофильной археи Sulfolobus solfataricus, относящаяся к семейству 12, имеет время полужизни 8 ч при 80°С и pH 1.8 (Huang et al., 2005). Известно, что эндоглюканаза T. aurantiacus способна сохранять свою структуру при 100°С и pH 2.8 (Murray et al., 2001).

Существуют также ферменты, которые наряду с эндоглюканазной активностью обладают и другими типами активности. Было показано, что термостабильная эндоглюканаза из T. maritime обладает также и экзоглюканазной активностью (Chhabra et al., 2002). Эндоглюканаза, выделенная из генома S. solfataricus имеет эндоксиланазную активность (Maurelli et al., 2008).

Для ряда экзоглюканаз семейства 12, включая термостабильную эндоглюканазу из генома гипертермофильной бактерии Rhodothermus marinus (Crennell et al., 2002) известны трехмерные структуры. Показано, что два глутамата (Glu166 и Glu200) консервативны у всех ферментов этого семейства и являются, соответственно, нуклеофилом и донором протонов. У ферментов семейства 8 в этих позициях находятся, соответственно, аспарагин и глутамат; у ферментов семейства 45 - два аспарагина (Collins et al., 2005; Yennawar et al., 2006).

Таблица 2 Термостабильные эндоглюканазы

Экзоглюканазы

Таблица 3 Термостабильные экзоглюканазы

Большинство в-1,4-экзоглюканаз относится к семействам 5, 6, 7, 9 и 48 глюкозид гидролаз. Эти ферменты прикрепляются к концам молекулы целлюлозы и затем движутся вдоль нее, отщепляя молекулы целлобиозы. Активный сайт этих ферментов имеет форму туннеля, и в связи с этим в-1,4-экзоглюканазы способны связываться только с концами молекулы целлюлозы.

в-глюкозидазы

в-глюкозидазы встречаются у представителей всех групп живых существ. Они гидролизуют в-глюкозидную связь в ди- и олигосахаридах, а также в арил-, амино-, алкил-в-D-глюкозидах и цианогенных глюкозидах. По субстратной специфичности их разделяют на арил-в-глюкозидазы, которые расщепляют арил-в-глюкозиды, целлобиазы, гиролизующие только целлоолигосахариды, и в-глюкозидазы смешанной активности, к которым относятся большинство в-глюкозидаз. По аминокислотной последовательности в-глюкозидазы относятся к двум семействам гликозид гидролаз, GH1 и GH3.

в-глюкозидазы часто являются лимитирующим звеном в расщеплении целлюлозы, так как отвечают за удаление целлобиозы, которая ингибирует эндо- и экзоглюканазы. Известно большое количество термостабильных в-глюкозидаз.

Гемицеллюлазы

Гемицеллюлоза - разветвленный полимер, состоящий, как правило, из различных полисахаридов: ксиланов, глюканов, ксилоглюканов, каллозы, маннанов и глюкоманнанов. Основной компонент гемицеллюлозы, ксиланы, является разветвленным полимером, основа которого состоит из остатков D-ксилопираноз, соединенных в-1,4-связью. Боковые цепи ксиланов включают L-арабинозу, D-ксилозу, глюкуроновую кислоту и ее метиловый эфир, D-глюкозу и D-галактозу. Основные типы ксиланов - глюкуроноксилан, арабиноксилан и глюкуроноарабиноксилан, причем соотношение их в значительных пределах варьирует у разных растений.

Различные компоненты гемицеллюлозы соединены ковалентными связями между собой, а также с целлюлозой и пектином (Marcus et al., 2008). В связи с этим, расщепление лигноцеллюлозы до сахаров обязано включать стадию деполимеризации гемицеллюлозы. Ферментативный гидролиз гемицеллюлозы требует большого количества активностей (рис. 6). Как минимум, для гидролиза гемицеллюлозы требуются эндо-в-1,4-ксиланаза (EC 3.2.1.8), ксилан-1,4-в-ксилозидаза (ЕС 3.2.1.37), а-L-арабинофуранозидаза (ЕС 3.2.1.55), а-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.139), ацетилксиланэстераза (ЕС 3.1.1.72), ферулоилэстераза (ЕС 3.1.1.73), маннан-эндо-1,4-в-маннаназа (ЕС 3.2.1.78), в-1,4-маннозидаза (ЕС 3.2.1.25), арабинан-эндо-1,5-а-L-арабинозидаза (ЕС 3.2.1.99).

Рисунок 6 - Схема ферментативного расщепления ксилана (Yeoman et al., 2010). A, расщепление ксилана до ксилоолигсахаридов. B, расщепление ксилоолигосахаридов до моносахаридов.

Технологическое использование ферментов

В промышленности используются в-1,4-экзоглюканазы бактерий рода Clostridium. Геном C. thermocellum содержит четыре фермента этого типа, относящихся к семейству 5, 15- к семейству 9 и 4 - к семейству 48. Экзоглюканазы клостридий наиболее активны при термпературах 60-75°С и pН 5.0-6.5. Экзоглюканазы некоторых других бактерий превосходят их по своим качествам. Самая термостабильная на сегодняшний день экзоглюканаза выделена из термофильной бактерии Thermotoga sp. FjSS3-B1. Наибольшая активность этого фермента наблюдается при 105°С. Этот фермент способен расщеплять аморфную целлюлозу и карбоксиметилцеллюлозу до целлобиозы. Его активность, однако, невелика, что свидетельствует о необходимости использования его совместно с другими целлюлазами.

Гликозидгидролаза C. thermocellum - СelO -, относящаяся к семейству 5, способна расщеплять как кристаллическую целлюлозу, так и целлодекстрины, в-глюкан и карбоксиметилцеллюлозу (Zverlov et al., 2002).

Две экзоглюканазы, выделенная из генома C. thermocellum, также способны расщеплять широкий спектр субстратов: карбоксиметилцеллюлозу, лихенан, ксилан и паранитрофенильные производные целлобиозы и лактопиранозы (Tuka et al., 1990).

Существуют и перспективные термостабильные экзоглюканазы, выделенные из геномов грибов, например, Thermoascus aurantiacus, Talaromyces emersonii и представителей рода Cladosporium. Грибные экзоглюканазы, как правило, содержат каталитический домен, соединенный с углевод-связывающим доменом при помощи гибкого пептидного линкера, обогащенного пролином, серином и треонином. Voutilainen et al. (2008) выделили из геномов грибов Acremonium thermophilum, Thermoascus aurantiacus и Chaetomium thermophilum и продемонстрировали их высокую активность на различных субстратах.

Экзоглюканазы, относящиеся к семействам 5 и 7 сохраняют аномерную конфигурацию субстрата, в то время как семейства 6, 9 и 48 обращают ее. Известны кристаллические структуры некоторых представителей семейства 7 (Parkkinen et al., 2008). Ферменты этой группы содержат в-сэндвич, образующий целлюлозосвязываюший домен туннельной формы. Направленный мутаганаз белка Cel7A T. reesei показал, что в активном сайте этого фермента есть три каталитические аминокислоты: Glu212 является нуклеофилом, Glu217 - донор протонов, а Asp214 контолирует расположение и протонирование Glu212 при помощи водородной связи между этими аминокислотами. Активный сайт имеет форму длинного туннеля, в котором помещаются до 10 гликозильных субъединиц. Активные центры экзоглюканаз, принадлежащих к семейству 5, формируют струкуру a(в/a), в то время как для представителей семеств 9 и 48 характерны структуры (a/a) 6.

Если эндоглюконазу сшить с целлюлозосвязывающим доменом, то активность работы фермента существенно повышается и комплекс приобретает способность к деградации микрокристаллической целлюлозы. Исследование свойств целлюлозосвязывающего домена, показало, что его связывание с микрофибриллами целлюлозы приводит к “распушению” микрокристаллической целлюлозы. [Ciolacu D, Kovac J, Kokol V. The effect of the cellulose-binding domain from Clostridium cellulovorans on the supramolecular structure of cellulose fibers.Carbohydr Res. 2010 Mar 30;345(5):621-30. Epub 2009 Dec 29.] Последовательная обработка микрокристалической целлюлозы целлюлозосвязывающим доменом без дополнительной эндоглюканазной активности, а затем эндоглюканазой, также обеспечивает успешную деградацию микрокристаллической целлюлозы [ Hall M, Bansal P, Lee JH, Realff MJ, Bommarius AS. Biological pretreatment of cellulose: enhancing enzymatic hydrolysis rate using cellulose-binding domains from cellulases.Bioresour Technol. 2011 Feb;102(3):2910-5. Epub 2010 Nov 9.].

Работу большинства ферментов ингибирует наличие продукта. Эндо- и экзоглюканазы сильно ингибирует присутствие целлобиазы. Кроме того, эндоглюконаза может стерически ингибироваться концами целлюлозной микрофибриллы в месте разрыва. Образовавшиеся восстановленный и невосстановленный концы цепи могут закрывать доступ к целым нитям целлюлозы.

Кристаллическая целлюлоза в растительной биомассе в значительной степени покрыта гемицеллюлозой и лигнином, в связи с чем, важен не только синергизм целлюлозолитических ферментов но и совместная работа с ферментами способными к деградации гемицеллюлозы и лигнина. В работе Moraпs было показано значительное увеличение ферментативной активности комплекса эндоглюканазы и экзоглюканазы добавлением эндоксиланазы и экзоксиланазы по сравнению как со свободными ферментами, так и с отдельно собранными целлюлазным и ксиланазным комплексами [Moraпs S, Barak Y, Caspi J, Hadar Y, Lamed R, Shoham Y, Wilson DB, Bayer EA. Cellulase-xylanase synergy in designer cellulosomes for enhanced degradation of a complex cellulosic substrate. MBio. 2010 Dec 14;1(5). doi:pii: e00285-10. 10.1128/mBio.00285-10].

По-поводу лигнин-разрушающих ферментов существуют различные мнения. Так, поскольку, наличие целлюлосомы характерно для анаэробных бактерий, в то время как ферменты, разрушающие лигнин, требуют для своей работы окислительных условий, включение ферментов деструкции лигнина в целлюлосому не считается эффективным [Martнnez AT, Ruiz-Dueсas FJ, Martнnez MJ, Del Rнo JC, Gutiйrrez A. Enzymatic delignification of plant cell wall: from nature to mill Curr Opin Biotechnol. 2009 Jun;20(3):348-57. Epub 2009 Jun 6]. С другой стороны, химерный белок, содержащий лакказу (разрушающий лигнин фермент) и целлюлозосвязывающий домен достаточно успешно осуществлял делигнификацию [Navaneetha Santhanam, Dayakar V. Badri, Stephen R. Decker, Daniel K. Manter, Kenneth F. Reardon, Jorge M. Vivanco Lignocellulose Decomposition by Microbial Secretions Secretions and Exudates in Biological SystemsSignaling and Communication in Plants Volume 12, 2012, pp 125-153].

Ферментативного осахаривание лигноцеллюлозной биомассы действием лигнинразрушающих грибов, часто называемое биопалпингом, является экологически чистым методом. В биопалпинге обычно используют грибы белой гнили, например, Phanerochaete chrysosporium, Ceriporia lacerata, Cyathus stercolerus, Pleurotus ostreau, Pycnoporus cinnarbarinus и, особенно, Ceriporiopsis subvermispora. Все эти грибы разрушают лигнин и гемицеллюлозу в большей или меньшей степени, но не затрагивают целлюлозу (Sдnchez, C., 2009. Lignocellulosic residues: biodegradation and bioconversion by fungi. Biotechnol. Adv. 27, 185-194.). Деградация лигнина грибами белой гнили происходит под действием лигнин-деградирующих ферментов, таких как пероксидазы и лакказы (Kumar, R., Wyman, C.E., 2009. Effects of cellulase and xylanase enzymes on the deconstruction of solids from pretreatment of poplar by leading technologies. Biotechnol. Prog. 25, 302-314). Поскольку действие этих грибов приводит к серьёзному уменьшению прочности древесины, расход энергии на механическое измельчение растительной массы перед вторичной обработкой в рафинере снижается на 25-30 %. Если же вторичная обработка связана с использованием кислоты или щелочи, то биологическая предобработка не только снижает технологическую нагрузку этими, в общем-то агрессивными веществами, но и снижает концентрацию образующихся из компонентов биомассы под действием этих реагентов ингибиторов ферментных реакций. Кроме того, биопалпинг может сочетаться с предобработкой органическими растворителями, как например в биосинтезе этанола из буковой щепы в синхронном процессе осахаривания и ферментации (SSF) (Itoh, H., Wada, M., Honda, Y., Kuwahara, M., Watanabe, M., 2003. Bioorganosolve pretreatments for simultaneous saccharification and fermentation of beech wood by ethanolysis and white rot fungi. J. Biotechnol. 103, 273-280).

Главными проблемами, связанными с использованием биоделигнификаторов, являются сравнительно небольшая скорость протекания биохимических процессов, а также нецелесообразность использования биореакторов в виду большого объема сырья. Именно поэтому в настоящее время долговременный процесс биологической предподготовки предпочитают проводить в буртах, ингибируя активность нежелательной микрофлоры и стимулируя действие биоделигнификаторов.

Иллюстрацией текущих возможностей биопалпинга является 10-дневная обработка соломы пшеницы грибками Pichia stipitis, обладающими высокой лигнин-деградирующей и низкой в отношении целлюлозы активностями. В результате уменьшилось количество загружаемой кислоты, увеличился выход моносахаров и снизилась концентрация ингибиторов ферментов. В конечном счете, выход этанола составил 0,48 г /г используемого сырья, а объёмная производительность - 0,54 г этанола/л (Kuhar, S., Nair, L.M., Kuhad, R.C., 2008. Pretreatment of lignocellulosic material with fungi capable of higher lignin degradation and lower carbohydrate degradation improves substrate acid hydrolysis and eventual conversion to ethanol. Can. J. Microbiol. 54, 305-313).

1.5 Методы предобработки биомассы

Предобработка - это термин, используемый для описания физического, биологического, химического или физико-химического процесса разрушения матрицы клеточной стенки, направленного на удаление или изменение структурных единиц лигнина и гемицеллюлозы с одновременным сохранением структуры целлюлозы. Физические предобработки нацелены на уменьшение размеров и механическое разрушение кристаллической структуры компонентов клеточной стенки растения, в то время как биологическая предобработка базируется на использовании микроорганизмов, которые растут на биомассе и обладают способностью разрушать лигнин. Химические предобработки обычно не только более эффективны в удалении большого количества лигнина и / или гемицеллюлоз, но способны также частично солюбилизировать целлюлозу (например, щелочная обработка, действие разбавленных и концентрированных кислот Бренстеда, пероксидов, органических растворителей и ионных жидкостей). Физико-химические предобработки обычно являются комбинацией физических и химических методов обработки биомассы, с химическим под высоким давлением, с последующей быстрой декомпрессией (например, аммиачный взрыв волокна (AFEX), углекислотный взрыв). Каждый из этих методов обладает своими преимуществами и недостатками, однако общим для них является то, что любая версия предобработки остается самой дорогой стадией в процессе производства биотоплива и химических веществ из лигноцеллюлозной биомассы.

1.5.1 Механическая предобработка

В природе проблема разрушения кристаллической структуры целлюлозного волокна успешно решается за счет симбиоза микроорганизмов с насекомыми, такими как кузнечики, жуки древоточцы или термиты. В древесине с физическим жеванием термитом, Coptotermes formosanus, происходит структурная и композиционная модификация лигниновой структуры и частичная деградация углеводов, которые важны для эффективного разложения клеточной стенки микроорганизмами-симбионтами [Biotechnol Biofuels. 2012; 5: 11.Advanced biorefinery in lower termite-effect of combined pretreatment during the chewing process Jing Ke, Dhrubojyoti D Laskar,Difeng Gao, Shulin Chen].

Самым простым производственным методом разрушения кристаллической структуры целлюлозного волокна является измельчение на мельнице. Как правило, в опубликованных работах для измельчения биомассы используются шаровые мельницы. Механическая обработка занимает от 20 минут до двух часов [Hiroyuki Inoue, Shinichi Yano, Takashi Endo, Tsuyoshi Sakaki, Shigeki Sawayama. Combining hot-compressed water and ball milling pretreatments to improve the efficiency of the enzymatic hydrolysis of eucalyptus. Biotechnol Biofuels. 2008; 1: 2]. Предел измельчения (тонина помола) в таких мельницах составляет до 0,5 мм. К механическим методам предобработки биомассы относят различные способы измельчения, такие как резка, дробление или помол. Степень измельчения варьирует от 10 - 30 мм при резке до 0,2 - 2 мм при помоле. (Sun, Y., Cheng, J., 2002. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresour. Technol. 83, 1-11.). Показано, что достаточно интенсивные способы измельчения, такие как помол на шаровых и молотковых мельницах, вибрационные обработки, улучшают ферментативный гидролиз растительной биомассы (Taherzadeh, M.J., Karimi, K., 2008. Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: a review. Int. J. Mol. Sci. 9, 1621-1651.). В частности, для биомассы мискантуса показано, что выход глюкозы и ксилозы в процессе ферментативного гидролиза различается более чем в два раза при использовании фракций биомассы 300 мкм и 60 мкм в пользу фракции 60 мкм [Yoshida M, Liu Y, Uchida S, Kawarada K, Ukagami Y, Ichinose H, Kaneko S, Fukuda K. Effects of cellulose crystallinity, hemicellulose, and lignin on the enzymatic hydrolysis of Miscanthus sinensis to monosaccharides. Biosci Biotechnol Biochem. 2008 Mar;72(3):805-10].

Основным недостатком интенсивной механической обработки является высокая энергозатратность.

Принципиально другим подходом, сочетающим механическую и физическую предобработки является экструзия. Экструдеры обычно используют для формования изделий из пластмасс. Процесс заключается в продавливании гранул полимера под высоким давлением через фильеры. При продавливании экструдером растительной биомассы нарушается структура целлюлозного волокна, повышается доступность углеводов для ферментов [Alvira P., Tomбs-Pejу E., Ballesteros M., Negro M.J. Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review. Bioresource Technology 101 (2010) 4851-4861].

Для улучшения степени конверсии целлюлозы в моносахара многие авторы предлагают сочетание механических и химических методов. Так в работе Lin с соавторами показано, что повышение выхода глюкозы и ксилозы в результате ферментативного гидролиза достигается комбинацией помола на шаровой мельнице с химической обработкой одним из следующих реагентов H₂SO₄, HCl, HNO₃, CH₃COOH, HCOOH, H₃PO₄, and NaOH, KOH, Ca(OH)₂, NH₃·H₂O [Lin Z, Huang H, Zhang H, Zhang L, Yan L, Chen J. Ball milling pretreatment of corn stover for enhancing the efficiency of enzymatic hydrolysis Appl Biochem Biotechnol. 2010 Nov;162(7):1872-80].