1.5.2 Химическая предобработка

Щелочная предоработка

Основой щелочной предобработки является действие некоторых оснований на лигноцеллюлозную биомассу, которые являются эффективными в зависимости от содержания лигнина в биомассе. Щелочная предобработка является более эффективной для растворения лигнина, демонстрируя незначительное растворение целлюлозы и гемицеллюлозы в сравнении с кислотой или гидротермальными процессами (Carvalheiro, F., Duarte, L.C., Gнrio, F.M., 2008. Hemicellulose biorefineries: a review on biomass pretreatments. J. Sci. Ind. Res. 67, 849-864) и, в конечном счете, увеличивает усвояемость целлюлозы.

Щелочные предобработки могут быть выполнены при комнатной температуре и времени в диапазоне от нескольких секунд до нескольких дней. Они вызывают деградацию сахаров в меньшей степени,, чем при предобработке кислотой. Было показано, что щелочные предобработки более эффективны на сельскохозяйственных остатках, чем на древесных материалах (Kumar, P., Barrett, D.M., Delwiche, M.J., Stroeve, P., 2009. Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis and biofuel production. Ind. Eng. Chem. Res. 48, 3713-3729).

Подходящими для щелочной предобработки являются гидроксиды натрия, калия и кальция. NaOH и КОН вызывают набухание, увеличение внутренней поверхности целлюлозы и снижение степени полимеризации и кристалличности, которым способствует разрушение структуры лигнина (Taherzadeh, M.J., Karimi, K., 2008. Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: a review. Int. J. Mol. Sci. 9, 1621-1651).

В качестве химического агента для предобработки был широко изучен гидроксид кальция, известный как гашеная известь. Известь удаляет такие аморфные субстанции, как лигнин, который увеличивает показатель кристалличности и затрудняет доступность целлюлозы (Kim, S., Holtzapple, M.T., 2006. Delignification kinetics of corn stover in lime pretreatment. Bioresour. Technol. 97, 778-785). Известь также удаляет ацетильные группы из гемицеллюлозы, снижая пространственные затруднения для гидролитических ферментов и повышая усвояемость целлюлозы (Mosier, N., Wyman, C.E., Dale, B.D., Elander, R.T., Lee, Y.Y., Holtzapple, M., Ladisch, C.M., 2005. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresour. Technol. 96, 673-686). Известь успешно работала со стеблями кукурузы при температуре от 85-150°C в течение 3-13 ч (Kim, S., Holtzapple, M.T., 2006. Delignification kinetics of corn stover in lime pretreatment. Bioresour. Technol. 97, 778-785). Предобработка с известью имеет низкую стоимость и меньше требований безопасности по сравнению с предобработкой действием NaOH или KOH. Щелочной реагент может быть легко удален из гидролизата реакцией с CO₂ (Mosier, N., Wyman, C.E., Dale, B.D., Elander, R.T., Lee, Y.Y., Holtzapple, M., Ladisch, C.M., 2005. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresour. Technol. 96, 673-686).

Предобработка щелочной перекисью

Добавление окисляющего агента (кислород или H₂O₂) в условия щелочной предобработки (NaOH / Ca(OH)₂) создает лучшие условия для удаления лигнина (Carvalheiro, F., Duarte, L.C., Gнrio, F.M., 2008. Hemicellulose biorefineries: a review on biomass pretreatments. J. Sci. Ind. Res. 67, 849-864). Выходы этанола 0,33 г / г были получены из пшеничной соломы в процессе одновременного осахаривания и коферментации (SSCF) с кишечной палочкой FBR5 с предобработкой щелочным пероксидом (Saha, B.C., Cotta, M.A., 2006. Ethanol production from alkaline peroxide pretreated enzymatically saccharified wheat straw. Biotechnol. Prog. 22, 449-453.). Кроме того, в гидролизатах не были обнаружены фурфурол и гидроксиметилфурфурол (HMF), обладающие ингибиторными свойстами (Taherzadeh, M.J., Karimi, K., 2008. Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: a review. Int. J. Mol. Sci. 9, 1621-1651).

Процедура предобработки щелочной перекисью следующая: измельченную солому пшеницы суспендируют в воде (8,6% вес/объем), содержащей H₂O₂ (0-4.3%, об/об) и доводили до рН 11,5 добавлением NaOH и перемешивают при 25-35°C в течение 3-24 часов. Предобработанную солому доводили до рН 5,0 добавлением концентрированной HCl, затем добавляли ферменты для осахаривания.

Кислотная предобработка

Основная цель этой операции - растворить гемицеллюлозу и сделать целлюлозу более доступными для ферментов. Этот тип предобработки может быть выполнен как с концентрированной, так и с разбавленной кислотами, но по понятным причинам использование концентрированной кислоты менее привлекательно для производства (Wyman, C.E., 1996. Handbook on Bioethanol: Production and Utilization. Taylor Francis, Washington, p. 417).

Предобработка разбавленными кислотами может проходить как при высокой температуре (например, 180°С) в течение короткого периода времени, так и при более низкой температуре (например, 120°С) в течение более длительного времени (30-90 мин). Разбавленная серная кислота не только растворяет гемицеллюлозы, в основном ксилан, но также преобразует растворенную гемицеллюлозу в сахара, пригодные для брожения. Тем не менее, в зависимости от температуры процесса, в реакционной системе могут быть обнаружены такие продукты деградации углеводных полимеров и лигнина, как фурфурол, HMF и фенольные соединения, которые ингибируют метаболизм микроорганизмов в стадии ферментации (Saha, B.C., Iten, L.B., Cotta, M.A., Wu, Y.V., 2005. Dilute acid pretreatment, enzymatic saccharification and fermentation of wheat straw to ethanol. Process Biochem. 40, 3693-3700). Во всяком случае, при действии разбавленных кислот таких продуктов меньше.

Когда солома пшеницы была подвергнута действию 0,75% об/об H₂SO₄ при 121°C в течение 1 ч (Saha, B.C., Iten, L.B., Cotta, M.A., Wu, Y.V., 2005. Dilute acid pretreatment, enzymatic saccharification and fermentation of wheat straw to ethanol. Process Biochem. 40, 3693-3700), выход осахаривания достигает 74%. Также были протестированы соляная, фосфорная и азотная кислоты (Mosier, N., Hendrickson, R., Ho, N., Sedlak, M., Ladisch, M.R., 2005. Optimization of pH controlled liquid hot water pretreatment of corn stover. Bioresour. Technol. 96, 1986-1993).

В качестве альтернативы разбавленной серной кислоте вполне могут быть использованы разбавленные растворы малеиновой и фумаровой кислот (ЖТ = 1:8, 50 мМ малеиновая кислота). Солома пшеницы была предобработана ими с высоким КПД, и малеиновая кислота была более эффективна. Кроме того, с этими органическими кислотами было сформировано меньшее, чем при предобработке серной кислотой, количество фурфурола (Kootstra, A.M.J., Beeftink, H.H., Scott, E.L., Sanders, J.P.M., 2009. Comparison of dilute mineral and organic acid pretreatment for enzymatic hydrolysis of wheat straw. Biochem. Eng. J. 46, 126-131).

Совсем новым направлением является попытка использовать для предобработки твердые суперкислоты. В отличие от серной кислоты, они обнаруживают большую селективность, способны работать при низких и умеренных температурах и атмосферном давлении. Для производства биоэтанола были предложены ниобиевая кислота (Nb₂O₅-nH₂O), цеолит Amberlyst-15, аморфный углерод с пришитыми гидроксильными, карбоксильными и сульфокислотными группами (Zhao, X., Cheng, K., Liu, D. (2009). Organosolv pretreatment of lignocellulosic biomass for enzymatic hydrolysis. Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 82, pp. 815-827).Их большим преимуществом является нетоксичность, отсутствие коррозионных свойств и экологическая безопасность. С более чем 90%-ной селективностью в умеренно жестких условиях (160°С) конвертирует целлюлозу в глюкозу гетерополифосфовольфрамовая кислота H₃PW₁₂O₄₀ (Tian, J., Wang, J., Zhao, S., Jiang, C., Zhang, X., Wang, X. (2010). Hydrolysis of cellulose by the heteropoly acid H₃PW₁₂O₄₀. Cellulose, Vol. 17, pp. 587-594), ещё одним достоинством которой является возможность регененировать каталитическую активность после каждого производственного цикла.

Предобработка органическими растворителями

Для извлечения лигнина из лигноцеллюлозного сырья могут использоваться органические растворители или их водные растворы. Предобработка органическими растворителями (ПОР) похожа на варку целлюлозы с участием органических растворителей, но степень делигнификации при ПОР несколько уступает таковой при варке. Но ПОР обладает рядом других преимуществ: (1) Органические растворители всегда легко регенерировать путем перегонки, (2) при этой регенерации можно выделить лигнин в твердом виде и углеводы в виде сиропа; оба этих вещества могут быть перспективными исходниками (Lora JH, Aziz S (1985) Organosolv pulping: a versatile approach to wood refining. Tappi J 68:94-97; Xuebing Zhao; Keke Cheng & Dehua Liu. Organosolv pretreatment of lignocellulosic biomass for enzymatic hydrolysis. Appl Microbiol Biotechnol. (2009) 82:815-827), следовательно, с ПОР мы приближаемся к реализации идеи использования всех выделенных субстанций.

Тем не менее, у ПОР есть имманентные недостатки. Предварительно обработанные твердые субстанции всегда должны быть промыты органическим растворителем до промывки водой, чтобы избежать осаждения растворенного лигнина, что приводит к значительному усложнению процедуры.

Необходимо полное удаление орграстворителей из системы, так как их остатки подавляют рост микроорганизмов, выполняющих процессы ферментативного гидролиза и брожения.

Органические растворители всегда являются дорогими, поэтому они должен быть регенерированы как можно в большей степени, но это приводит к увеличению потребления энергии.

В связи с летучестью органических растворителей процедура ПОР должна тщательно выполняться и контролироваться. Любая утечка может привести к опасности пожара и взрыва.

В итоге, в настоящее время ПОР является слишком дорогой для предобработки биомассы.

Для большинства процессов ПОР, если предварительная обработка проводится при высоких температурах (185-210°C), нет необходимости добавления кислоты, так как считается, что органические кислоты, высвобождаемые из биомассы, выступают в качестве катализаторов для разрушения лигнин-углеводного комплекса. Однако, с добавлением кислотных катализаторов скорость делигнификации увеличивается, и получают более высокие выходы ксилозы. Хорошими катализаторами для ускорения делигнификации и деградации ксилана являются минеральные кислоты (соляная кислота, серная кислота и фосфорная кислота), а также органические кислоты, такие как муравьиная, щавелевая, ацетилсалициловая и салициловая.

Предобработка спиртами

Диапазон применяемых в ПОР растворителей очень широк, однако использование каждого из влечет за собой как издержки, так и дивиденды. Низкомолекулярные спирты типа метанола или этанола применяются наиболее часто, благодаря их невысокой стоимости, смешиваемости с водой, легкости и экономичности регенерации. Однако процесс работы с ними требует высоких температур и давления. Поэтому для предобработки иногда используют высококипящие многоатомные спирты типа этиленгликоля или глицерина. Предобработка лигноцеллюлозной массы ПОР без добавления катализатора протекает при температурах ниже 170°С, а с катализатором (кислотами, основаниями и солями редкоземельных металлов) - выше 185°С.

В производственном процессе Lignol, запущенном в 2001 году, сочетаются предобработка этанолом с этапом ферментативного осахаривания и брожения. Этанольная делигнификация может быть скомбинирована и обработкой лигноцеллюлозного материала паровым взрывом, который стимулирует разложение гемицеллюлоз и вызывает изменение структуры лигнина, которого, всё же, остается достаточно для того, чтобы вызвать необратимую сорбцию целлюлазы и уменьшение её активности (Berlin, A., Balakshin, M., Gilkes, N., Kadla, J., Maximenko, V., Kubo, S., Saddler, J.N., 2006. Inhibition of cellulase, xylanase and b-glucosidase activities by softwood lignin preparations. J. Biotechnol. 125, 198-209). В этих условиях очистка поверхности целлюлозы от лигнина этанолом уменьшает нецелевой расход фермента (Chen HZ, Liu LY (2007) Unpolluted fractionation of wheat straw by steam explosion and ethanol extraction. Bioresource Technol. 98:666-76).

Предобработка органическими кислотами

Известно, что параметр Гильдебранда (значение д) для максимального растворения лигнина составляет около 11 (Pan XJ, Sano Y (1999) Atmospheric acetic acid pulping of rice straw. IV: Physico-chemical characterization of acetic acid lignins from rice straw and woods. Part 1. Physical characteristics. Holzforschung 53:511-518). Муравьиная и уксусная кислота имеют значения д 12,1 и 10,1, соответственно, что доказывает их потенциальную пригодность для делигнификации. Однако число исследований по делигнификации биомассы этими растворителями весьма ограничено. Во-первых, они обладают высокой коррозионной активностью. Во-вторых, число каппа, характеризующее содержание остаточного лигнина, после обработки этими растворителями довольно велико и усвоение углеводных полимеров целлюлазами протекает не полностью [Vazquez G, Antorrena G, Gonzalez J, Freire S, Crespo I (2000) The influence of acetosolv pulping conditions on the enzymatic hydrolysis of Eucalyptus pulps. Wood Sci Technol 34:345-354]. Наконец, в реальных условиях делигнификации происходит частичное ацилирование углеводов, что является причиной стерического экранирования углеводных фрагментов при атаке ферментами (Pan XJ, Gilkes N, Saddler JN (2006) Effect of acetyl groups on enzymatic hydrolysis of cellulosic substrates. Holzforschung 60:398-401).

Учитывая, что лигнин достаточно лабилен к действию окислителей, а продукты его окислительного расщепления гораздо лучше растворимы в органических кислотах, идея использования для делигнификации органических надкислот представляется вполне естественной. Действительно, применение надмуравьиной кислоты в процессе Milox было достаточно успешным [Sundquist J (1996) Chemical pulping based on formic acid. Summary of Milox research. Paperi Ja Puu 78:92-95], однако невысокая её стабильность склоняет к использованию для делигнификации надуксусной кислоты. Последняя легко генерируется в системе из уксусной кислоты и перекиси водорода с серной кислотой в качестве катализатора; предобработку с надуксусной кислотой можно проводить без повышенного давления и при температуре окружающей среды, пусть даже в течении длительного периода времени. При повышении температуры реакция идет значительно быстрее. Например, предобработанная надуксусной кислотой багасса (кислота берется в половинном количестве к исходному сырью) при 80°C за 2 часа, с более чем 80%ным выходом производит целлюлозу, которая далее успешно конвертируется целлюлазой в глюкозу [Teixeira LC, Linden JC, Schroeder HA (1999a) Optimizing peracetic acid pretreatment conditions for improved simultaneous saccharification and co-fermentation (SSCF) of sugar cane bagasse to ethanol fuel. Renew Energ 16:1070-1073]. Однако, если багассу предварительно обработать щелочью, расход надуксусной кислоты и остаточное содержание лигнина заметно снижаются [Zhao XB, Peng F, Cheng KK, Liu DH (2009) Enhancement of the enzymatic digestibility of sugarcane bagasse by alkali-peracetic acid pretreatment. Enzyme Microb Technol 44:156-164]. Понятно, что в присутствии окислителя фурфурол и гидроксиметилфурфурол теряют свои ингибиторные по отношению к гидролитическим ферментам свойства.

Главным ограничителем в широком использовании этого метода является высокая стоимость процесса.

Предобработка ацетоном

Перспективным растворителем для проведения ПОР является ацетон. Параметр Гильдебранта для ацетона равен 9,9, и по способности растворять лигнин он похож на уксусную кислоту. Кроме того, смесь ацетона с водой хорошо растворяет гемицеллюлозы, а целлюлоза хорошо растворима в фосфорной кислоте. На этих фактах основан метод фракционирования целлюлозы, предложенный в 2007 году [Zhang YHP, Ding SY,Mielenz JR, Cui JB, Elander RT, LaserM,Himmel ME, McMillan JR, Lynd LR (2007) Fractionating recalcitrant lignocellulose at modest reaction conditions. Biotechnol Bioeng 97:214-223]. В нем последовательно используются нелетучая фосфорная кислота, сильно летучий ацетон и вода так, что удается разделить все три компонента лигноцеллюлозы. Целлюлозы, полученные при таком фракционировании, представляют из себя чистую аморфную субстанцию, которая очень легко усваивается целлюлазами. В сравнении с паровым взрывом, эта технология производит сахаров на 20% больше.

Из других органических растворителей для делигнификации в разное время предлагались диоксан, фенол, этилендиамин, N-метил-морфорин-N-оксид, но все они слишком дороги. Впрочем, прорывом может оказаться предложенный совсем недавно для предобработки биомассы мискантуса сульфон бутадиена, равновесная смесь которого с исходными компонентами - 1,3-бутадиеном и двуокисью серы - генерируется непосредственно в процессе реакции [J. Atilio de Frias and Hao Feng. Switchable butadiene sulfone pretreatment of Miscanthus in the presence of water. GreenChem. , 2013, 15, 1067-78]. Процесс предобработки протекает при 90-110°С в течение 18 часов, двуокись серы на 91% гидролизует ксилан гемицеллюлоз, перемещая его в водный раствор, а сульфон бутадиена на 58% растворяет лигнин, при минимальном разложении глюканов. Таким образом, в ходе одного процесса разделяются разделяются все три основных компонента лигноцеллюлозы.

Метод ПОР в будущем, скорее всего, станет составной частью других технологий, использующих принципиально иные физико-химические подходы.

Озонолиз

Озонирование является одним из перспективных методом делигнификации биомассы. Озон легко окисляет лигнин до низкомолекулярных продуктов, в то время как гемицеллюлоза и целлюлоза относительно устойчивы к его действию. Предобработку обычно проводят при комнатной температуре и нормальном давлении. Озонолиз не приводит к образованию соединений, ингибирующих последующие гидролиз и брожение. Эта методика была апробирована на переработке соломы пшеницы и ржи (Garcia-Cubero, M.T., Gonzalez-Benito, G., Indacoechea, I., Coca, M., Bolado, S., 2009. Effect of ozonolysis pretreatment on enzymatic digestibility of wheat and rye straw. Bioresour. Technol. 100, 1608-1613.), а также осиновых опилок [Е.М. Бенько, О.Р. Манисова, А.Г. Худошин, А.Н. Митрофанова, В.В. Лунин. Озонолиз как способ повышения реакционной способности древесины в процессах биоконверсии в сахара. Физикохимия растительных полимеров. Материалы IV международной конференции 14-17 июня 2011 г. Архангельск].

Несмотря на обнадёживающие результаты, полученные в лаборатории, масштабирование этого процесса в производство скорее всего столкнется со значительными проблемами, связанными с высокой токсичностью и агрессивностью озона.

Предобработка ионными жидкостями

В соответствии с принципами «зеленой химии», в качестве наиболее перспективных сред для проведения технологических процессов переработки растительного сырья являются, помимо водно-органических систем, ионные жидкости (ИЖ), которые, кроме достоинств высокоэффективных органических растворителей, обладают также негорючестью и нетоксичностью наряду с чрезвычайно малым давлением паров и высокой растворяющей способностью по отношению ко многим полимерам.

В ИЖ с анионной активностью (например, хлорид 1-бутил-3-метилимидазолия [C4mim]), могут быть одновременно растворены как углеводы, так и лигнин, поскольку ИЖ образуют водородные связи между негидратированным хлорид-ионом в ИЖ, гидроксильными группами углеводов в стехиометрическом отношении 1:1. В результате эффективно нарушается сложный комплекс нековалентных взаимодействий между полимерами целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина при сведении к минимуму образование продуктов разложения. При добавлении в этот раствор воды можно выбрать момент, когда целлюлоза выпадает из раствора, а большая часть лигнина в нем остается. В итоге, с использованием ионной жидкости для предобработки общее время процесса, необходимого для преобразования биомассы в сахар существенно короче - примерно на порядок - чем при использовании традиционных технологий. Это снижает риск заражения биоматериала чужеродными микроорганизмами в процессе осахаривания.

Потенциальная полезность такого подхода была уже продемонстрирована, например, на соломе пшеницы (Li, Q., He, Y.C., Xian, M., Jun, G., Xu, X., Yang, J.M., Li, L.Z., 2009. Improving enzymatic hydrolysis of wheat straw using ionic liquid 1-ethyl-3-methyl imidazolium diethyl phosphate pretreatment. Bioresour. Technol. 100, 3570-3575). В предобработке (130°С, 30 мин) использовался диэтилфосфат 1-этил-3-метилимидазолия, и выход восстанавливающих сахаров после последующего 12-часового ферментативного гидролиза составил 54,8%. Протекание процесса брожения этих сахаров с участием Saccharomyces cerevisiae, подтвердило, что образования ингибиторов ферментных реакций в процессе предобработки не происходит.

Наиболее актуальным вопросом применения ИЖ является их стоимость. В целом, эти субстанции являются непомерно дорогими для их использования в многотоннажных производствах. Кроме того, необходимо приложить усилия к изучению возможности регенерации ИЖ и их использования в замкнутом цикле.

1.5.3 Физико-химические предобработки

Паровой взрыв

В последнее время большое развитие в переработке лигноцеллюлозного сырья получил метод взрывной дефибрации по декомпрессионному принципу (или паровой взрыв). ЛЦС подвергают кратковременному воздействию перегретого пара под давлением (несколько секунд, 240-300°С, 3,5-7,5 МПа) и далее давление сбрасывают, что вызывает паровой взрыв ЛЦС. Механический эффект резкого уменьшения давления приводит к разделению волокон вследствие взрывной декомпрессии. При таких условиях лигнин плавится, частично разрушается, прекращает взаимодействовать с целлюлозой, и выходит из структуры целлюлозы. Кроме того, под действием парового взрыва происходит гидролиз ацетильных групп гемицеллюлоз, что позволяет при продолжении процесса в том же реакторе, но при иных условиях (при температуре 180-220°С и давлении 0,2 МПа) добиться катализируемого уксусной кислотой гидролиза гемицеллюлоз. Поэтому процесс получил название «автогидролиз». Удаление лигнина и гемицеллюлоз очищает поверхность целлюлозного волокна и увеличивает доступ к ним гидролитических ферментов.

Существуют модификации этого процесса, когда обработку ЦСС ведут в более мягких условиях при 190°С в течение 7,5 мин.

К достоинствам этого метода относится относительная нетребовательность к размеру частиц исходного сырья (по Hamelinck, C.N., van Hooijdonk, G., Faaij, A.P.C., 2005. Ethanol from lignocellulosic biomass: techno-economic performance in short-, middle- and long-term. Biomass Bioenergy 28, 384-410, на измельчение и сортировку сырья уходит около трети всей энергии, затрачиваемой на процесс получения биотоплива), что, в совокупности с экологической безопасностью и отказом от энергоемкой химической предобработки, приводит к существенному выигрышу в стоимости процесса.

Обработка жидкой водой при повышенном давлении

Эта процедура делигнификации не требует быстрой декомпрессии и использования какого бы то ни было катализатора. При высоком давлении вода при температурах 160-240°С находится в жидком состоянии и способна в значительной степени растворять гемицеллюлозы. В результате получается две фракции - твердая, обогащенная целлюлозой, и жидкая, обогащенная гемицеллюлозой и производными из неё сахарами. Впрочем, при оптимальном рН процесса (4 - 7) гемицеллюлоза остается в олигомерной форме и образование мономеров из неё сведено к минимуму. Соответственно, образования ингибиторов ферментов также не происходит (Mosier, N., Hendrickson, R., Ho, N., Sedlak, M., Ladisch, M.R., 2005. Optimization of pH controlled liquid hot water pretreatment of corn stover. Bioresour. Technol. 96, 1986-1993). Лигнин в этом процессе частично деполимеризуется и растворяется в горячей воде, но одновременно происходит процесс переконденсации с образованием более высокомолекулярных и более устойчивых к действию воды лигнинов (Wyman, C.E., Dale, B.E., Elander, R.T., Holtzapple, M., Ladisch, M.R., Lee, Y.Y., 2005. Coordinated development of leading biomass pretreatment technologies. Bioresour. Technol. 96, 1959-1966).

Основные преференции процесса - дешевый реагент, отсутствие необходимости в катализаторах и, соответственно, сниженные требования к конструкции реакторов.

Аммиачный взрыв волокна (AFEX)

В этом способе лигноцеллюлозный материал в реакторе под высоким давлением и при температуре 60 - 100°C пропитывают жидким аммиаком, который вызывает набухание волокон. При сбросе давления происходит вскипание аммиака, которое вызывает разрушение биомассы волокна и частичную декристаллизацию целлюлозы. Химическое действие аммиака проявляется в расщеплении связей между лигнином и углеводами (Laureano-Perez, L., Teymouri, F., Alizadeh, H., Dale, B.E., 2005. Understanding factors that limit enzymatic hydrolysis of biomass. Appl. Biochem. Biotechnol. 121, 1081-1099), дезэтерификации ацетильных фрагментов гемицеллюлоз, причем высвобождающаяся уксусная кислота лишена своих каталитических свойств (Kumar, R., Wyman, C.E., 2009. Does change in accessibility with conversion depend on both the substrate and pretreatment technology? Bioresour. Technol. 100, 4193-4202). При этом методе получается только твердый предобработанный материал. Метод дал наилучшие результаты при попытках переработки недревесного сырья, когда, при оптимальных условиях доля перерабатываемых углеводов превышает 90% (Wyman, C.E., Dale, B.E., Elander, R.T., Holtzapple, M., Ladisch, M.R., Lee, Y.Y., 2005. Comparative sugar recovery data from laboratory scale application of leading pretreatment technologies to corn stover. Bioresour. Technol. 96, 2026-2032).

Вариантом этого процесса является рециклическая аммиачная перколяция (ARP), в котором водный раствор аммиака (5-15%) проходит через реактор, заполненный биомассой. Температура, как правило, ограничивается 140-210°C, время реакции до 90 мин, а скорость движения растворителя около 5 мл / мин (Kim, J.S., Kim, H., Lee, J.S., Lee, J.P., Park, S.C., 2008. Pretreatment characteristics of waste oak wood by ammonia percolation. Appl. Biochem. Biotechnol. 148, 15-22), при этом гемицеллюлозы переходят в раствор, а кристаллические участки целлюлозы остаются неизмененными. Это приводит к появлению короткоцепочечного целлюлозного материала с высоким содержанием глюкана (Yang, B., Wyman, C.E., 2008. Pretreatment: the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol. Biofuels Bioprod. Bior. 2, 26-40). Можно добиться снижения энергетических затрат, предварительно замачивая биоматериал в водном аммиаке. Так, при замачивании сырья на 48 часов при температуре 48°С, а затем в процессе одновременного осахаривания и ферментации с использованием рекомбинантной E.coli, KO11 (Kim, T.H., Taylor, F., Hicks, K.B., 2008. Bioethanol production from barley hull using SAA (soaking in aqueous ammonia) pretreatment. Bioresour. Technol. 99, 5694-5702) получен выход этанола в 90% от теоретического.

Главные проблемы и AFEX и ARP связаны с регенерацией и оборотом аммиака в производственном цикле.

Углекислотный взрыв

Углекислый газ в сверхкритическом состоянии является сжиженной субстанцией, которая способна экстрагировать и удалять лигнин с поверхности целлюлозных волокон. При наличии воды углекислый газ образует угольную кислоту, которая способствует гидролизу полимеров. Молекулы СО₂ по размерам сравнимы с водой и аммиаком и потому под давлением могут проникать сквозь мелкие поры лигноцеллюлозы. Взрывная декомпрессия, как и в случае парового взрыва и аммиачного взрыва волокна, нарушает структуру углеводных волокон и увеличивает поверхность для возможной атаки гидролитическими ферментами.

Хотя выходы сахаров при углекислотном взрыве несколько ниже, чем в двух вышеупомянутых процессах, этот метод имеет ряд преимуществ. Во первых, рабочие температуры ниже, что дает выигрыш в энергии. Во вторых, практически не образуются ингибиторы ферментных процессов. Наконец, поскольку выделение углекислого газа является неизбежным спутником любого бродильного производства, проблем с наличием этого реагента не возникнет (Kim, K., Hong, J., 2001. Supercritical CO₂ pretreatment of lignocellulose enhances enzymatic cellulose hydrolysis. Bioresour. Technol. 77, 139-144).

Влажное окисление

Этот процесс протекает в течение всего 10-15 мин при температуре от 170 до 200°C и при давлении кислорода (или обогащенного кислородом воздуха) от 10 до 12 бар (Olsson, L., Jцrgensen, H., Krogh, K.B.R., Roca, C., 2005. Bioethanol production from lignocellulosic material. In: Dimitriu, S. (Ed.), Polysaccharides Structural Diversity and Functional Versatility. Marcel Dekker, New York, pp. 957-993). При температуре выше 170°C процесс становится экзотермическим, что снижает общую потребность в энергии. При влажном окислении большая часть лигнина окисляется, что важно, не до фенольных соединений, которые ингибируют гидролитические ферменты, а до карбоновых и дикарбоновых кислот, которые, напротив, катализируют расщепление гемицеллюлозы. Точно так же в этих условиях подвергаются последующему окислению фурфурол и HMF, что лишает их ингибиторной способности. Для оптимизации реакции окисления фенолов и альдегидов добавлением карбоната натрия создают щелочную среду. Предобработка соломы пшеницы в таких условиях приводит к получению 96% целлюлозы (65% которой превращается в глюкозу), выход же гемицеллюлозы составляет 70% (Klinke, H.B., Ahring, B.K., Schmidt, A.S., Thomsen, A.B., 2002. Characterization of degradation products from alkaline wet oxidation of wheat straw. Bioresour. Technol. 82, 15-26). Метод влажного окисления может сочетаться в производстве биоэтанола с последующим замачиванием водным аммиаком (Martin, C., Thomsen, M.H., Hauggaard, H., Thomsem, A.B., 2008. Wet oxidation pretreatment, enzymatic hydrolysis and simultaneous saccharification and fermentation of clover-ryegrass mixtures. Bioresour. Technol. 99, 8777-8782).

Отличные результаты предобработки дает последовательно применение методов влажного окисления и объёмного взрыва. Этот процесс получил название WEx (в русскоязычной литературе - «влажный взрыв»). Непосредственно после влажного взрыва температура окисленного материала составляет 95-110°С, что обеспечивает его стерильность . По этой технологии из опилок ладанной сосны при температуре 170-175С, давлении кислорода 6,5-7,2 бар и продолжительности процесса около 20 минут с последующей обработкой целлюлазами был получен почти количественный выход мономерных сахаров [D.Rana, V.Rana, B.K. Ahring. (2012) Producing high sugar concentrations from loblolly pine using wet explosion pretreatment. Bioresource Technology, 121, 61-67].

Микроволновая предобработка

В этом случае биомассу погружают в подходящую среду, щелочную (Saifuddin M. Nomanbhay, Refal Hussain, Kumaran Palanisamy Microwave-Assisted Alkaline Pretreatment and Microwave Assisted Enzymatic Saccharification of Oil Palm Empty Fruit Bunch Fiber for Enhanced Fermentable Sugar Yield. Journal of Sustainable Bioenergy Systems Vol.3 No.1, March 2013 PP. 7-17) или кислую (Wei-Hsin Chen, Yi-Jian Tu, Herng-Kuang Sheen, 2011. Disruption of sugarcane bagasse lignocellulosic structure by means of dilute sulfuric acid pretreatment with microwave-assisted heating. Applied Energy, 88, 2726-2734) и подвергают суспензию микроволновому облучению в течение 5 - 20 мин. В щелочной среде при мощности 180 W содержание лигнина и гемицеллюлоз уменьшалось на 74% и 24% соответственно, а общая производительность была в 5,8 раза больше, чем для необработанного микроволновым облучением образца.

В кислой среде при мощности температуре процесса около 190°С были удалены почти все гемицеллюлозы, целлюлоза теряла свою кристаллическую структуру. Судьба лигнина осталась неясной, но детальное изучение возможностей этого процесса ещё впереди.

Предобработка ультразвуком

Основным фактором, усиливающим ферментативный гидролиз после ультразвуковой предварительной обработки, считается стимуляция транспорта фермента к поверхности субстрата. Кроме того, эффект кавитации способствует очистке поверхности целлюлозного волокна от лигниновых и гемицеллюлозных структур. Установлено, что оптимальной температурой процесса является 50°C, что оставляет возможность для функционирования в этих условиях многих ферментов (Yachmenev, V., Condon, B., Klasson, T., Lambert, A., 2009. Acceleration of the enzymatic hydrolysis of corn stover and sugar cane bagasse celluloses by low intensity uniform ultrasound. J. Biobased Mater. Bioenergy 3, 25-31).

Ультразвуковая обработка пока не нашла широкого применения, тем не менее, есть данные об успешном использовании ультразвука для экстракции гемицеллюлозы, целлюлозы и лигнина [Madeleine J. Bussemaker and Dongke Zhang. Effect of Ultrasound on Lignocellulosic Biomass as a Pretreatment for Biorefinery and Biofuel Applications. Ind. Eng. Chem. Res. 2013, 52, 3563?3580]

Сравнение методов предобработки

В таблице приведены основные эффекты, производимые в биомассе растений различными видами предобработки.

Таблица 4. Сравнение различных способов предобработки биомассы

Предобработка	Декристаллизация целлюлозы	Увеличение площади доступной поверхности	Удаление гемицеллюлоз	Удаление лигнина	Образование ингибиторов
Биологическая			ХХ	ХХ
Слабые и разбавленные кислоты1		ХХ	ХХ		ХХ
Щелочи1		ХХ	Х	ХХ	ХХ
Органические растворители
Спирты и ацетон			ХХ	ХХ
Органические кислоты			ХХ	ХХ
Органические надкислоты			Х	ХХ
Озонолиз1	Х		Х	ХХ
Ионные жидкости	ХХ		Х	ХХ
Механическая	ХХ	ХХ	Х	ХХ
Паровой взрыв 1,2		ХХ	ХХ		ХХ
Обработка жидкой водой1		ХХ	ХХ		Х
Аммиачный взрыв волокна (AFEX) 1	ХХ	ХХ	Х
Рециклическая аммиачная перколяция1	ХХ	ХХ	Х
Углекислотный взрыв	ХХ	ХХ	ХХ
Влажное окисление1	Х	ХХ	Х	ХХ	Х
WEx	ХХ		ХХ	ХХ	Х
Микроволновая
Ультразвук

Обозначения: Х - слабый эффект; ХХ - сильный эффект; ¹ - меняет структуру лигнина; 2 - увеличивает кристалличность



2. Разработка плана экспериментальных исследований

Развитие биотехнологий имеет решающее значение, в решении глобальной проблемы перехода от использования невозобновляемых ресурсов к возобновляемому сырью. Это геополитическая задача, которую в связи с глобальным ростом народонаселения, изменением климата планеты, истощением минеральных природных запасов должно решать человечество в целом и отдельные государства в частности. Цель данной работы полностью удовлетворяет целям развития биотехнологий в РФ -проект направлен на разработку научных основ ферментативных технологий конверсии биомассы с целью повышение комплексности и глубины переработки возобновляемого непищевого сырья, включая сельскохозяйственные отходы, создание безотходного производства энергии.

Проект согласуется со следующими направлениями исследований и разработок, поддерживаемых в рамках Технологической платформы «Биоэнергетика»:

· Обеспечение диверсификации российской экономики за счет появления на рынке новых высокотехнологичных продуктов и инновационных технологий биоэнергетики с высоким экспортным потенциалом.

· Создание новой сырьевой базы (возобновляемая непищевая биомасса) для химической и смежных отраслей промышленности, альтернативной ископаемым углеводородам.

· Создание необходимых технологических, правовых и финансово-экономических условий для развития национальной промышленности по производству энергогенерирующих систем, использующих непищевую биомассу и отходы сельского хозяйства; широкого класса экологически чистых моторных топлив; широкого спектра химических, фармацевтических, пищевых и других продуктов.

В результате проведенного обзора современной научно-технической литературы выявлено, что, поставленные в рамках проекта цели направлены на решение актуальных задач современной биотехнологии.

Во-первых, в проекте предусмотрена разработка ферментных методов деполимеризации целлюлозосодержащего сырья на основе биомассы мискантуса. Сообщества микроорганизмов, осуществляющие деградацию лигноцеллюлозной биомассы в природных условиях, задействуют для этого большое количество ферментативных активностей. В ходе работы проводится поиск комбинации ферментативных активностей, которая позволит осуществлять достаточно полную деградацию растительной биомассы. Для успешного ферментирования растительной биомассы существует два подхода: ферментативные или химические системы, способные к деструкции лигнина, и поиск ферментов, разрушающих гемицеллюлозу. Неполное удаление лигнина и гемицеллюлозы существенно замедляет скорость ферментативной деполимерезации целлюлозы. В рамках проекта предусмотрено создание экспериментальных образцов четырех новых ферментных препаратов, ориентированных на переработку биомассы мискантуса в сахара. Для этого выбранные ферменты будут клонированы в E.coli, в результате чего будут получены рекомбинантные штаммы микроорганизмов-продуцентов ферментов комплекса карбогидраз. В качестве эффективных компонентов, способных повысить степень конверсии ЦСС в сахара, перспективны ксиланазы, осуществляющие гидролиз в-1,4-гликозидных связей ксилана. Ксилан является основным структурным элементом гемицеллюлозы. Молекулы ксилана состоят из остатков ксилозы, соединенных 1.4-гликозидными связями. Ксиланы содержат также арабинозу, глюкозу, галактозу и глюкуроновую кислоту. гемицеллюлоз разветвлены и построены из пентоз (ксилозы, арабинозы) или гексоз (маннозы, галактозы, фруктозы). Ксиланазы как ферменты, перспективные для промышленного применения привлекли к себе внимание относительно недавно, но быстро нашли применение в пищевой промышленности [Collins, T., C. Gerday, and G. Feller. 2005. Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases. FEMS Microbiol. Rev. 29: 3- 23. Dutta, T., R. Sengupta, R. Sahoo, S. R. Sinha, A. Bhattacharjee, and S. Ghosh. 2007. A novel cellulase free alkaliphilic xylanase from alkali tolerant Penicillium citrinum: Production, purification and characterization. Lett. Appl. Microbiol. 44: 206- 211]. В настоящее время ксиланазы используются для осветления соков и улучшения консистенции пива [Liu B, Zhang N, Zhao C, Lin B, Xie L, Huang Y. Characterization of a recombinant thermostable xylanase from hot spring thermophilic Geobacillus sp. TC-W7. J Microbiol Biotechnol. 2012 Oct;22(10):1388-94]. Большинство известных ксиланаз имеют оптимум pH в килой или нейтральной среде при достаточно низких температурах, в то время как для промышленного использования желательна устойчивость к относительно высоким температурам и широкий диапазон pH. В этом отношении имеют большой технологический потенциал микроорганизмы термальных местообитаний, поскольку обладают термостабильностью и могут быть использованы в биотехнологических процессах при повышенных температурах [Basen M., Sun J., Adams M. W. Engineering a hyperthermophilic archaeon for temperature-dependent product formation// MBio. 2012. (http://mbio.asm.org/content/3/2/e00053-12.long), Hess M., Katzer M., Antranikian G. Extremely thermostable esterases from the thermoacidophilic euryarchaeon Picrophilus torridus// Extremophiles. 2008. 12(3). P. 351-364. ]. В частности, для разрабатываемых в проекте ферментных комплексов перспективны ксиланазы, обнаруженные нами в геноме термофильных бактерий рода Geobacillus. Виды Geobacillus широко распространены на Земле, эти бактерии способны расти при температурах выше 45°С и их оценивают как весомый источник термостабильных ферментов и биотехнологически перспективных штаммов [McMullan G., Christie J. M., Rahman T. J., Banat I. M., Ternan N. G., Marchant R. Habitat, applications and genomics of the aerobic, thermophilic genus Geobacillus// Biochem.Soc.Trans.2004. 32(2). P. 214- 217].

Во-вторых, в проекте значительные усилия направлены на предварительную подготовку биомассы мискантуса при помощи механических, химических или физико-химических методов предобработки. Отличие биомассы мискантуса от другой растительной биомассы состоит в низком содержании водонерастворимого лигнина, что само по себе облегчает процесс ферментации. В проекте будут разработаны эффективные методы предварительной обработки биомассы мискантуса, позволяющие не менее чем в 3 раза увеличить степень ферментативной конверсии ЦСС до сахаров по сравнению с исходным ЦСС. В результате предварительной механической обработки происходит частичное разрушение компонентов лигноцеллюлозной биомассы, повышается доступность целлюлозы для ферментов.

Важным моментом при разработке любого технологического процесса является подбор адекватных методов контроля. Для оптимизации предобработки биомассы необходимо определить требуемые параметры и научиться их измерять. Для для оценки скорости биоконверсии и выхода целевых продуктов в рамках проекта предусмотрена оптимизация методики оценки эффективности биоконверсии ЦСС на основе биомассы мискантуса в биотопливо новыми ферментными препаратами. Должны быть оценены ферментативная активность, температурный и рН диапазоны, оптимумы работы ферментных препаратов, полученных на основе рекомбинантных штаммов-продуцентов.

Имеющаяся современная методическая база позволяет выполнить поставленные задачи в полном объеме в соответствии с Техническим заданием, Календарным планом и Планом экспериментальных исследований. План экспериментальных исследований представлен в формате Exсel.



3. Разработка методов механической, химической и физико-химической предобработки биомассы мискантуса

Что важно для проведения качественной предобработки:

А) Понимать и уметь использовать особенности выбранного процесса. Например, такие методы предобработки, как варка с гидроксидом кальция, аммиачный взрыв волокна (AFEX) и аммиачная перколяция хорошо подходят для переработки сельхозотходов, но малоэффективны в работе с хорошо структурированными волокнами высших растений (Chandra, R.P., Bura, R., Mabee, W.E., Berlin, A., Pan, X., Saddler, J.N., 2007. Substrate pretreatment: the key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics? Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 108, 67-93). Кислотные обработки дают хороший результат на любом субстрате, но выход за рамки оптимальных условий чреват образованием ингибиторов ферментных реакций.

Б) Стремиться к получению легкоусвояемого ферментами целлюлозного волокна, способного при загрузке фермента не более чем 10 FPU/г целлюлозы к переработке не менее чем на 90% по крайней мере, за 5 дней, а лучше за три (Yang, B., Wyman, C.E., 2008. Pretreatment: the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol. Biofuels Bioprod. Bior. 2, 26-40).

В) Сводить к минимуму образование в процессе предобработки токсичных соединений, а также обладающих ингибиторными свойствами в отношении используемых ферментов. Такими соединениями являются продукты дегидратации углеводов - фурфурол и 2-гидроксиметилфурфурол (Palmqvist, E., Hahn-Hдgerdal, B., 2000. Fermentation of lignocellulosic hydrolysates II: inhibitors and mechanism of inhibition. Bioresour. Technol. 74, 25-33), слабые кислоты типа муравьиной, уксусной и левулиновой, а также различные фенолы, образующиеся при разложении лигнинов (Klinke, H.B., Ahring, B.K., Schmidt, A.S., Thomsen, A.B., 2002. Characterization of degradation products from alkaline wet oxidation of wheat straw. Bioresour. Technol. 82, 15-26).

Г) иметь в виду, что стремление к максимальному измельчению лигноцеллюлозных материалов должно подкрепляться расчетом экономической целесообразности этого процесса.

Д) организуя производственный процесс, не забывать о пожаро-, взрыво- и коррозионной опасности используемых и получаемых соединений.

Е) Комплексность переработки подразумевает максимально полное использование всех образующихся продуктов (Yang, B., Wyman, C.E., 2008. Pretreatment: the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol. Biofuels Bioprod. Bior. 2, 26-40). Необходимо исключить появление проблем, связанных с утилизацией отходов производства.

Ж) Сложение операций предобработки и ферментативного гидролиза должно приводить к растворам с концентрацией сахаров не менее 10%; использование более разбавленных растворов не оптимально для производства.

З) Лигноцеллюлозный материал перед предобработкой должен быть высушен, отделен от чужеродных и некондиционных включений и, после механической предобработки, сведен к унифицированным фракциям - уменьшая, таким образом, расход химикатов и снижая уровень загрязнения сточных вод (Cappelletto, P., Mongardini, F., Bilancini, L., 1998. Nonwood fibers: Miscanthus sinensis. Industria della Carta 2, 56-60).



4. Определение химического состава ЦСС после механической, химической и физико-химической предобработки

4.1 Поиск последовательностей генов, кодирующих ферменты комплекса карбогидраз, разработка вариантов состава комплекса карбогидраз

Расщепление сахаросодержащих полимеров требует синергичной работы нескольких ферментов. Большинство присутствующих на рынке коммерчески доступных комплексов карбогидраз имеют грибное происхождение. Целлюлазы грибного происхождения обладают наибольшей активностью, это относится ко всем трем классам ферментов участвующих в расщеплении целлюлозы: - эндо-целлюлаза, - экзо-целлюлаза, бета глюконаза. В тоже время было показано, что наиболее активные ферменты, участвующие в расщеплении гемицеллюлозы, продуцируются прокариотическими микроорганизмами.

Гемицеллюлоза составляет значительную часть лигноцеллюлозного комплекса, в некоторых случаях доля, приходящаяся на гемицеллюлозу, может достигать 40% от общей сухой биомассы растительного сырья. Кроме значительной доли в массе растения, разрушение гемицеллюлозы важно при гидролизе растительной биомассы, в силу того что она стерически блокирует доступ ферментов целлюлазного комплекса к целлюлозе.

Промышленный ферментативный гидролиз целлюлозосодержащего сырья оптимально проводить при температурах >50°C, следовательно, для разработки эффективной промышленной технологии необходимы ферменты, обладающие повышенной термостабильностью. Температурная стабильность ферментов прокариот коррелирует с температурой их обитания, именно поэтому поиск белковых последовательностей гемицеллюлазного комплекса был проведен среди термоустойчивых бактерий. Найденные по литературным данным последовательности приведены в таблице Х. Последовательности генов карбогидраз, найденые в геномах имеющихся в лаборатории бактерий рода Geobacillus представлены в таблице хх.

Таблица Х Белковые последовательности гемицеллюлазного комплекса термоустойчивых бактерий

Название фермента и вид микроорганизма	Последовательность
Endo-1,4-beta-xylanase family 9 Thermobifida fusca YX	MNHAPASLKSRRRFRPRLLIGKAFAAALVAVVTMIPSTAAHAAVTSNETGYHDGYFYSFWTDAPGTVSMELGPGGNYSTSWRNTGNFVAGKGWATGGRRTVTYSASFNPSGNAYLTLYGWTRNPLVEYYIVESWGTYRPTGTYMGTVTTDGGTYDIYKTTRYNAPSIEGTRTFDQYWSVRQSKRTSGTITAGNHFDAWARHGMHLGTHDYMIMATEGYQSSGSSNVTLGTSGGGNPGGGNPPGGGNPPGGGGCTATLSAGQQWNDRYNLNVNVSGSNNWTVTVNVPWPARIIATWNIHASYPDSQTLVARPNGNGNNWGMTIMHNGNWTWPTVSCSAN
Endo-1,4-beta-xylanase family 5 Thermobifida fusca YX	MKPVRLITAALTTAVLSLPLMVVPASAGPVHDHHPAPHSNAKSERLRWAAPDGFYIGSAVAGGGHHLEQDYPDPFTHDGKYRSILAQQFSSVSPENQMKWEYIHPEPDRYDFAMADKIVDFAERNDQKVRGHTLLWHSQNPEWLEEGDYSPEELREILRDHITTVVGRYAGRIHQWDVANEIFDEQGNLRTQENIWIRELGPGIIADAFRWAHEADPNAELFFNDYNVEGINPKSDAYYELIQELLDDGVPVHGFSVQGHLSTRYGFPGDLEQNLRRFDELGLATAITELDVRMDLPASGKPTPKQLEQQADYYQQALEACLAVEGCDSFTIWGFTDKYSWVPVFFPDEGAATIMTEKYERKPAFFALQQTLREARCADSPKPGPGKPKPGKGPKHDHC
Endo-1,4-beta-xylanase family 10 Thermobifida fusca YX	MTETRHRPSRRARRSLSLLLTSALTAAGLLVTAAPAQAESTLRELAAQNGGRHFGTAIAYSPLNSDAQYRNIAATQFSAITHENEMKWESLEPQRGQYNWSQADNIINFAKANNQIVRGHTLVWHSQLPSWLNNGGFSGSQLRSIMENHIEVVAGRYRGDVYAWDVVNEAFNEDGTLRDSIWYRGMGRDYIAHAFRKAHEVDPDAKLYINDYNIEGINAKSNGLYNLVVDLLRDGVPIHGIGIQSHLIVGQVPSTFQQNIQRFADLGLDVAITELDIRMQMPADQYKLQQQARDYEAVVNACLAVTRCIGITVWGIDDERSWVPYTFPGEGAPLLYDGQYNRKPAWYAVYEALGGDSSGGGPGEPGGPGGPGEPGGPGGPGEPGGPGDGTCAVNYTVVNDWGHGMQGAITVSNTGSSPINNWTLQFSFSGVNISNGWNGEWSQSGSQITVRAPAWNSTLQPGQSVELGFVADKTGNVSPPSQFTLNGATCS
Endo-1,4-beta-xylanase_xylanase T-6 Geobacillus thermodenitrificans NG80-2	MAKTEQSYAKKPQISALHAPQLDQRYKDSFTIGAAVEPYQLLNEKDAQMLKRHFNSIVAENVMKPINIQPEEGKFNFAEADQIVRFAKKHHMDIRFHTLVWHSQVPQWFFLDKEGQPMVNETDPVKREQNKQLLLKRIETHIKTIVERYKDDIKYWDVVNEVVGDDGELRDSPWYQIAGIDYIKVAFQTARKYGGNKIKLYINDYNTEVEPKRSALYNLVKQLKEEGIPIDGIGHQSHIQIDWPSEEEIEKTIIMFADLGLDNQITELDVSMYGWPPRAYLSYDAIPEQKFLDQADRYDRLFKLYEKLSDKISNVTFWGIADNHTWLDSRADVYYDTDGNVIVDPKAPYTRVEKGNGKDAPFVFDPEYNVKPAYWAIIDHK
3.2.1.37 Beta-xylosidase family 52 Geobacillus sp	MPTNVFFNAHHSPVGAFASFTLGFPGKSGGLDLELARPPRQNVFIGVESSHEPGLYHILPFAETAGEDESKRYDIENPDPNPQKPNILIPFAKERIEREFRVATDTWKAGDLTLTIYSPVKAVPDPETASEEELKLALVPAVIVEMTIDNTNGTRTRRAFFGFEGTDPYTSMRRIDDTCPQLRGVGQGRILGIASKDEGVRSALHFSMEDILTATLEENWTFGLGKVGALIADVPAGEKKTYQFAVCFYRGGYVTAGMDASYFYTRFFHNIEEVGLYALEQAEVLKEQAFCSNELIEKEWLSDDQKFMMAHAIRSYYGNTQLLEHEGKPIWVVNEGEYRMMNTFDLTVDQLFFELKMNPWTVKNVLDFYVERYSYEDRVRFPGDETEYPGGISFTHDMGVANTFSRPHYSSYELYGISGCFSHMTHEQLVNWVLCAAVYIEQTKDWAWRDRRLTILEQCLESMVRRDHPDPEKRNGVMGLDSTRTMGGAEITTYDSLDVSLGQARNNLYLAGKCWAAYVALEKLFRDVGKEELAALAGEQAEKCAATIVSHVTEDGYIPAVMGEGNDSKIIPAIEGLVFPYFTNCHEALKEDGRFGDYIRALRQHLQYVLREGICLFPDGGWKISSTSNNSWLSKIYLCQFIARHILGWEWDEQAKRADAAHVAWLTHPTLSIWSWSDQIIAGENYRSKYYPRGVTSILWLEEGE
3.2.1.37 Beta-xylosidase family 52 Thermobifida fusca	MTSPQVTSSPSREEPRAGTIRNPVLTGFYPDPSILRVGDDYYMATSTFEWYPGVTLHHSRDLVHWRPLGGALTETRLLDLAGRRDGAGVWAPALSYRDGLFFLVFTNVASYSGNFWDAPNYVTTAPDITGPWSDPVPLHSLGFDPSLFHDDDGRSWLLSTSMDWRPGRDAFGGIVAQEFSVRDMKLVGEPVIIFTGTEAGVTEAPHIYKRDGWYYLVTAEGGTQWEHQVTVARSRSVTGPYEVDPAGPALTSRHVPEAPLQKAGHASMVETQHGEWYFAHLTGRPMPPSGRCVLGRETALQKIEWSSDGWPRVRNAEPLLEVPGPRGLAPHPWPQPSETDHFDDPTPRPEWSTLRRPFDSSWVSLTERPGYLRIRGGQSPAGLHEPSLVARRLQHRACIFEACLEFKPEDFRQMAGITAYYNTRQWHYLRINRDDRGGVFAGVLTSDRGIIREVGRRISVTGWPKVFLRAEIDRNDLRFAVSSDGSTWADMGVRLDMSILSDEYAEERFGNDPIMWGFTGAFLGLWAHDMTGAGLPADFDFCTYRPQSPS ...

Подобные документы

• Химия в поисках альтернативных источников энергии

  Классификация и представители АИЭ. Использование биомассы в качестве биотоплива. Биодизель. Биогаз. Биоэтанол, как топливо и добавка к нему. Использование LPG, учитывая огромные запасы газа в нашей стране, крайне актуально.
  
  курсовая работа [36,9 K], добавлен 12.05.2007
  

• Химия в поисках альтернативных источников энергии

  Природный газ. Газовый конденсат. Диметилэфир. Шахтный метан. Этанол и метанол. Синтетический бензин. Топливные элементы. Биодизельное топливо. Биогаз. Использование биомассы в качестве биотоплива. Отработанное масло. Биодизель. Биоэтанол, как топливо.
  
  курсовая работа [45,0 K], добавлен 18.06.2008
  

• Современное состояние нефтехимического синтеза. Основные продукты и технологии

  Разработка альтернативных видов топлива и новых направлений в области переработки природного газа и других источников углерода. Технологии синтеза диметилового эфира из биомассы и синтез-газа. Особенности нетрадиционных процессов получения топлива.
  
  контрольная работа [227,2 K], добавлен 04.09.2010
  

• Исследование каталитических процессов прямого гидрокрекинга триглицеридов жирных кислот

  Характеристика биотоплива, биодизель и биоэтанол как его распространенные типы. Основные пути каталитической гидропереработки триглицеридов жирных кислот с целью определения эффективных катализаторов для получения углеводородов топливного назначения.
  
  реферат [275,6 K], добавлен 28.12.2011
  

• Химический состав основных видов сырья спиртового производства

  Особенности химического состава зернового сырья для производства спирта. Строение зерна пшеницы, ржи: альбумины и глобулины, липиды, минеральные вещества. Приготовление замеса свекловичной мелассы, ферментативный гидролиз молекул крахмала до сахарозы.
  
  реферат [24,1 K], добавлен 24.04.2017
  

• Изучение процесса и отработка технологии гидролиза растительных отходов с целью получения спиртов

  Методика получения биоэтанола из растительных отходов. Механизм трансформации целлюлозы в растворимые формы простых углеводов; факторы, влияющие на гидролиз, определение оптимальных условий для протекания процесса; получение штаммов микроорганизмов.
  
  дипломная работа [4,1 M], добавлен 11.10.2011
  

• Одноосновные насыщенные карбоновые кислоты

  Промышленные способы получения карбоновых кислот. Синтезы на основе оксида углерода. Гидролиз нитрилов. Синтез Гриньяра. Гидролиз жиров. Образование галогенангидридов. Декарбоксилирование. Гидратация ацетилена и окисление получаемого ацетальдегида.
  
  реферат [87,8 K], добавлен 21.02.2009
  

• Гидролиз

  Гидролиз как реакция обменного разложения веществ водой. Гидролиз углеводов, белков, аденозинтрифосфорной кислоты. Краткая классификация солей. Слабые кислоты и основания. Гидролиз неорганических соединений: карбидов, галогенидов, фосфидов, нитридов.
  
  презентация [463,7 K], добавлен 01.09.2014
  

• Химические реакции и системы

  Понятие и структура химической системы, классификация и разновидности растворов. Электролиты и электролитическая диссоциация. Гидролиз солей. Химические реакции и их признаки, стехиометрия. Скорость химический реакций, и факторы, влияющие на нее.
  
  контрольная работа [161,5 K], добавлен 17.01.2011
  

• Получение биотоплива из растительного сырья

  Характеристика сущности и назначения биоэтанола - топлива из биологического сырья, получаемого, как правило, в результате переработки стеблей сахарного тростника или семян рапса, кукурузы, сои. Промышленное производство спирта из биологического сырья.
  
  курсовая работа [82,5 K], добавлен 17.05.2012
  

• Гидролиз солей

  Гидролиз как реакция обменного разложения веществ водой. Гидролиз галогеналканов, сложных эфиров, дисахаридов, полисахаридов. Разложение веществ по аниону и катиону. Соли, образованные сильной кислотой и основанием. Способы усиления, подавления гидролиза.
  
  презентация [60,5 K], добавлен 19.11.2013
  

• Фундаментальные законы и теории химии

  Знакомство с законом Авогадро, сущность периодической системы элементов, энергетика химических реакций. Влияние различных факторов на растворимость. Понятие степени электролитической диссоциации. Гидролиз солей, амфотерность оксида и гидроксида алюминия.
  
  шпаргалка [603,3 K], добавлен 26.07.2012
  

• Гидролиз солей. Особенности почвенного гидролиза

  Характеристика гидролиза солей. Виды реакций нейтрализации между слабыми и сильными кислотами и основаниями. Почвенный гидролиз солей и его значение в сельском хозяйстве. Буферная способность почвы: обмен катионов и анионов в процессе минерализации.
  
  контрольная работа [56,1 K], добавлен 22.07.2009
  

• Химический состав основных видов сырья пивоваренного производства

  Основные виды сырья пивоваренного производства: ячменный солод, пшеничный солод и хмель. Углеводы, белки, липиды, полифенолы, минеральные вещества зерна ячменя. Химический состав хмелевых шишек. Окисление и конденсация полифенольных веществ хмеля.
  
  контрольная работа [34,2 K], добавлен 03.06.2017
  

• Синтез этилового спирта

  Получение этилового спирта сбраживанием пищевого сырья. Гидролиз древесины и последующее брожение. Получение этилового спирта из сульфитных щёлоков. Сернокислотный способ гидратации этилена. Физико-химические основы процесса. Отделение гидратации этилена.
  
  дипломная работа [1,2 M], добавлен 16.11.2010
  

• Гидролиз натуральных отходов для получения биотоплива на основе спиртов

  Обзор методов получения глюкозы. Анализ основной реакции: физические, химические свойства и электронная структура целлюлозы, глюкозы и воды. Механизм и кинетическая модель реакции, расчет материального и теплового баланса, расчет объема реактора.
  
  дипломная работа [2,7 M], добавлен 14.05.2011
  

• Гидролиз органических веществ

  Реакции ионного обменного разложения веществ водой. Использование качественных реактивов на крахмал, на белок и на глюкозу. Гидролиз сложных эфиров, белков, аденозинтрифосфорной кислоты. Условия гидролиза органических веществ пищи в организме человека.
  
  разработка урока [206,5 K], добавлен 07.12.2013
  

• Ненасыщенные спирты. Фенолы. Хиноны

  Спирты с двойной углерод-углеродной связью. Виниловый спирт. Реальный аллильный катион. Гидролиз поливинилацетата. Способы получения фенолов. Коксование каменного угля. Хлорный метод. Способ Рашига. Окислительные методы на переработке циклогексана.
  
  реферат [153,1 K], добавлен 21.02.2009
  

• Растворы электролитов. Гидролиз солей

  Расчетные методы определения рН. Примеры уравнений реакций гидролиза солей. Понятие и формулы расчета константы и степени гидролиза. Cмещение равновесия (вправо, влево) гидролиза. Диссоциация малорастворимых веществ и константа равновесия этого процесса.
  
  лекция [21,7 K], добавлен 22.04.2013
  

• Гидролиз солей

  Основные особенности гидролиза, который приводит к образованию слабого электролита. Характеристика гидролиза солей в водном растворе. Значение гидролиза в химическом преобразовании земной коры. Развитие гидролиза в народном хозяйстве и в жизни человека.
  
  конспект урока [124,7 K], добавлен 20.11.2011
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам