Введение

Развивающиеся в последние годы исключительно быстрыми темпами нанотехнологии находят все более широкое применение в медицине и фармацевтике, в частности при разработке способов векторной (направленной) доставки лекарственных веществ. Из множества видов исследованных наноразмерных частиц и материалов уже несколько десятилетий внимание исследователей привлекают циклодекстрины. Трехмерная структура циклодекстринов придает им некоторые свойства, которые оказались очень интересны для фармакологии, медицины, пищевой промышленности, косметологии и других областей. В течение нескольких лет интенсивно изучаются потенциальные возможности использования природных циклодекстринов и их синтетических производных для улучшения определенных свойств лекарств, например, растворимости, стабильности и биодоступности.

Целью данной работы было получение амфифильных производных в- циклодекстрина реакцией этерификации, а также комплексов включения на основе в-циклодекстрина и некоторых монокарбоновых насыщенных кислот и нестероидных противовоспалительных средств, представляющих определенный фармакологический интерес.

Глава I. Литературный обзор

Олигосахариды - углеводы, состоящие из нескольких моносахаридных остатков. Олигосахариды (от греч. «olygos» - немногий), состоящие из одинаковых моносахаридных остатков, называют гомополисахаридами, а из разных - гетерополисахаридами [1]. Глюкопираноза - мономер, из которого образуются два наиболее важных полисахарида: крахмал и целлюлоза [2].

Циклодекстрины (ЦД) относятся к классу природных макроциклических олигосахаридов, в которых фрагменты D-глюкопиранозы соединены б-1-4- гликозидными связями. Циклодекстрины, получаемые путем ферментативной изомеризации крахмала, представляют собой белые кристаллические порошки, нетоксичные, практически не имеющие вкуса [3].

Семейство циклодекстринов включает в себя три основных продукта: б-, в-, г-циклодекстрины, состоящие, соответственно, из шести (n = 1), семи (n = 2) и восьми (n = 3) глюкопиранозных остатков, строение которых представлено на рисунке 1 [4].

Рисунок 1 - Строение б-, в- и г-циклодекстринов

1.1 История открытия циклодекстринов

История циклодекстринов начинается в конце XIX века во Франции с работ французского фармацевта и химика Антуана Вильерса, который изучал действие ферментов на различные углеводы, в частности на процесс брожения картофельного крахмала в присутствии бактерий Bacillus aminobacter. Cтудент известного профессора Бертло, Антуан, был специалистом по токсикологиии и работал на только что открытой кафедре аналитической химии в Школе Фармации в Париже. Как профессор аналитической химии в той же школе, где он оставался с 1886 по 1924 гг., Вильерс особенно был увлечен различными аспектами химии природных веществ, включая углеводов и алкалоидов. Его научная работа была представлена в двух докторских мемуарах (1880) и 29 других междисциплинарных работ, посвященных химии (добывающей, органической, неорганической и физической химии), фармации и микробиологии. В начале 1890-х годов в ходе экспериментов по расщеплению и разложению углеводов под действием ферментов Вильерс отметил появление нежелательных кристаллов с заданными свойствами; он обнаружил молекулы циклодекстринов, так произошло их открытие.

В феврале 1891 г. во французском научном журнале «The Proceedings of the Acadйmiedes Sciences», который издавался Парижским химическим обществом, Вильерс подробно описал, что при определенных условиях (если взять 50 г картофельного крахмала, растворить в 1 л воды при 100 °С и затем добавить в качестве затравки бактерии Bacillus aminobacter, после чего выдерживать в печи при 40 °С несколько дней) в результате брожения картофельного крахмала образуются декстрины (в будущем их станут называть циклодекстринами). Термин «декстрины» уже использовался в то время для обозначения продуктов разложения или промежуточных продуктов разложения крахмала. Таким образом, получение декстринов путем расщепления крахмала было открыто еще в 1821 году.

Вильерс впервые показал возможность применения данного вида бактерий для получения новых углеводов. Когда в крахмальную пасту добавляли бактерии, она начинала превращаться в слабокислую жидкость, выделяя характерный запах масляной кислоты. Впоследствии при более подробном изучении физико-химических свойств циклодекстринов, он отметил, что основная часть продуктов данной ферментативной реакции уже не поддавалась дальнейшему воздействию бактерий и что полученные кристаллы были устойчивы к действию воды и кислоты. После фракционирования продуктов реакции брожения выделенные декстрины обладали различными свойствами оптического вращения и не подвергались гидролизу. Йод окрашивал декстрины с высокой оптической активностью, причем интенсивность окраски падала с уменьшением оптической активности, а декстрины с низкой оптической активностью не окрашивались йодом совсем. Наконец, в своей новаторской статье Вильерс пришел к выводу, что путем масляного брожения крахмала можно получить декстрины непосредственно, без участия интермедиатов. Спустя несколько недель инкубации после бактериальной обработки крахмала Вильерс также обнаружил некоторые побочные продукты, в частности высококристаллическое вещество с химическим составом и физико-химическими показателями промежуточными между крахмалом и декстрином: после ферментативной обработки 1000 г крахмала образовалось 3 г нового углевода. Его кристаллы были получены в спирте, который использовался для осаждения новых декстринов.

Обладающий высокой научной любознательностью французский ученый сфокусировался на свойствах побочных продуктов. В июне 1891 г. во втором сборнике научных трудов Вильерс описал химический состав нового кристаллического углевода, и была представлена его простейшая формула [(C6H10O5)2Ч3H2O]. Вильерс отметил, что «белые кристаллы обладают слабым сладковатым вкусом», а также высокой степенью оптической активности, которая была гораздо выше, чем у большинства декстринов, формирующихся под действием масляного брожения. Растворимость в воде новых кристаллов была мала, но возрастала с увеличением температуры. При разных условиях эксперимента было получено два вида кристаллов, вероятнее всего это были б- декстрин (б-цикодекстрин) и в-декстрин (в-циклодекстрин).

Вильерс рассматривал эти новые соединения в качестве изомеров крахмала, которые практически не растворимы в воде, но растворимы в спирте, не подвергаются ферментации, устойчивы к действию кислоты, но могут превращаться в эфиры под действием хлорангидридов. Тогда он определил, что это были кристаллические углеводы и дал веществу название «целлюлозин».

Однако позже Вильерс пришел к выводу, что свойства этих новых декстринов очень отличаются от свойств всех других сахаров, известных на тот момент. Тем не менее, он не продолжил исследование новых соединений (циклодекстринов), а предпочел сосредоточиться на алкалоидах. Вероятнее всего, Вильерс использовал культуру Bacillus amylobacter, что являлось не отдельным штаммом бактерий, а бактериями совместного культивирования (Bacillus macerans), поэтому он получал смесь декстринов. Данная идея была высказана Робертом Кохом еще в 1891 г., и ее поддержал Франц Шардингер в начале XX века. Действительно, изолированный штамм бактерий, способный перерабатывать крахмал в циклодекстрины, без каких-либо побочных продуктов будет получен Шардингером спустя 20 лет.

В начале прошлого века в Вене австрийский химик и бактериолог Франц Шардингер, главный инспектор Untersuchungsanstalt fьr Lebensmittel изучал устойчивые к высокой температуре микроорганизмы, которые могут привести к пищевому отравлению. Одним из его многочисленных научно- исследовательских направлений было углубление понимания химии и расщепления крахмала. В 1903 г. он обнаружил, что штамм микроорганизмов, весьма устойчивый к высокой температуре и способный растворять крахмал, образует кристаллические побочные продукты, удивительно похожие на целлюлозин (декстрины Вильерса). Шардингер впервые стал называть циклодекстрины декстринами, ранее их называли целлюлозинами. Он опубликовал свои результаты в журнале Zeitschriftfu? r Untersuchung der Nahrungs and Genuвmittel. Шардингер отметил, что целлюлозины часто образуются в средах на основе крахмала, содержащих микроорганизмы. Ему удалось выделить штамм бактерий, ответственных за распад крахмала и образование кристаллических продуктов (он назвал их штамм II). Используя реакцию с йодом и простые колориметрические испытания, он различал два типа полисахаридов, которые назвал кристаллический декстрин А и кристаллический декстрин B. Форма B напоминала целлюлозин Вильерса. Шардингер получил максимальный выход 30 % кристаллических декстринов из крахмала, где основной формой был декстрин B. Однако, он отметил, что со временем активность штамма II уменьшается.

В 1904 г. Шардингер выделил новый микроорганизм, который назвал rottebazillus I из-за его воздействия на картофельный крахмал, а затем несколько месяцев спустя использовал латинскиое название Bacillus macerans. Он сообщил, что Bacillus были в состоянии дать те же кристаллические декстрины, что он раньше называл «кристаллические полисахариды». Используя характерную реакцию, которую дают производные крахмала с йодом, он предложил различие между кристаллической амилозой и кристаллическим амилодекстрином. Выходы, полученные в результате исследований Шардингера, в 10 раз превышали выходы, полученные Вильерсом. Для объяснения этого результата Шардингер черпал вдохновение из работ Роберта Коха (1843-1910 гг.), немецкого врача и бактериолога, специализирующегося на микроорганизмах (профессор Кох считается основателем современной бактериологии), который выдвинул идею, что в условиях стерилизации, описанных Вильерсом, применяемые штаммы не были чистыми.

Между 1905 и 1911 гг. Шардингер дал первое подробное описание приготовления, разделения и очистки двух целлюлозинов, впервые описанных Вильерсом. Он описал их поведение в присутствии спиртов, хлороформа, эфира, раствора йода и показал, что декстрины не восстанавливались медными реагентами и не ферментировались дрожжами. Шардингер также обнаружил, что декстрины могут быть синтезированы из нескольких источников крахмала (картофель, рис, пшеница) и бактерий (образование декстринов зависит от вида бактерий, расщепляющих крахмал). Он пришел к выводу, что около 30 % крахмала превращается в кристаллические декстрины в зависимости от этих параметров. Различие между двумя формами декстринов всегда делалась благодаря их способности образовывать комплексы разных цветов с йодом (эта реакция будет изучена снова другими исследователями, в том числе Эйлером в 1922 г. и Дубе в 1947 г.): серо-зелёный - для сухого б-декстрина (цвет изменяется на синий в присутствии воды) и красновато-фиолетовый (коричневатый) - для в-декстрина (в зависимости от процентного содержания воды).

В 1911 г. Шардингер считал, что номенклатура, которую он предложил в 1904 г., не была на самом деле соответствующей и решил назвать целлюлозины Вильерса «кристаллический б-декстрин» и «кристаллический в-декстрин». Шардингер был первым исследователем, которому удалось изучить и описать основные свойства декстринов. Также он открыл способность декстринов к образованию комплексов с оргaническими молекулами. В самом деле, Шардингер известен как «отец-основатель» химии циклодекстринов. Он также предположил, что загадочные кристаллические вещества являлись циклическими полисахаридами. К такому же выводу спустя 30 лет придет немецкий химик Фройденберг. Шардингеру на самом деле так и не удалось выяснить их структуру, так как только в конце 1940-х годов будет проведен первый рентгеноструктурный анализ кристаллов циклодекстринов, который подтвердит гипотезу циклического строения.

Глaвным результатом работы Шардингера было изолирование микрoорганизмов, способных синтезировать фермент, катализирующий расщепление крaхмала на циклодекстрины. Следует отметить, что наиболее часто используемым источником фермента для производства циклодекстринов даже сегодня остаются бактерии штамма Bacillus macerans. Термины «кристаллический б-декстрин» и «кристаллический в-декстрин» были впервые использованы Шардингером, поэтому в течение многих лет (почти до 1970-х годов) циклодекстрины называли декстринами Шардингера в его честь, хотя их открытие по-прежнему принадлежит профессору Антуану Вильерсу. Профессор Франц Шардингер решил прекратить свои исследования циклодекстринов в 1911 г. Свое решение Шардингер прокомментировал так: «Я понимаю, что еще многие вопросы декстринов остаются нерешенными; в ответ на это я должен оставить их другим исследователям, которые в силу более благоприятных обстоятельств смогут справиться с данной проблемой более успешно».

Примерно в 1910 г. немецкий химик и биохимик Ханс Прингсгейм университета Берлина стал важной фигурой в исследованиях циклодекстринов, или, как он предпочитал их называть, полиамилозы. С 1910 года Прингсгейм повторил эксперименты времен Шардингера: выделил чистые б- и в-декстрин и описал их основные свойства, подтвердив тем самым результаты Шардингера. Он также показал, что эти два декстрина хорошо растворимы в воде, но не растворимы в спирте, эфире и хлороформе. Во всех экспериментах, главным образом, получался кристаллический продукт - в-декстрин. Прингсгейм, как и Шардингер, предложил простой способ различать б- и в-декстрины по реакции с йодом: раствор б-декстрин давал желтовато-зеленое окрашивание, а в- декстрин - красновато-коричневый цвет [5].

1.2 Строение и физико-химические свойства циклодекстринов

Циклодекстрины представляют собой объемные структуры в виде усеченного конуса или «тора», полого внутри. Особенностью циклодекстринов является наличие двух наборов разных по природе и изолированных друг от друга в пространстве OH-групп: первичные гидроксильные группы, положений 6 глюкозных фрагментов, расположены по окружности меньшего основания «усеченного конуса», а вторичные гидроксильные группы, положений 2 и 3 глюкозных фрагментов, находятся на окружности большего основания конуса (рис. 2) и связаны между собой сильными водородными связями, что делает макроцикл более жестким [6]. Таким образом, внутри циклодекстрины гидрофобны (т.е. не имеют сродства к воде), а по «краям» ? гидрофильны.

Из-за большого количества гидроксильных групп циклодекстрины водорастворимы, причем растворимость б- и г-циклодекстринов составляет при обычных условиях 13.2 и 26.0 % (по весу), соответственно, и для в- циклодекстрина приблизительно 18.8 г/л или 16.6 мМ [7]. Существенно более низкая растворимость в-циклодекстрина, по сравнению с б-циклодекстрином, хотя первый и содержит большее количество ОН-групп, объясняется более прочными водородными связями вторичных гидроксильных групп в- циклодекстрина (по сравнению с таковыми у б-циклодекстрина), а также тем, что более симметричные б- и г-циклодекстрины (содержащие четное количество глюкозных фрагментов) лучше встраиваются в трехмерную решетку водородных связей воды. Метилирование и гидроксиалкилирование гидроксильных групп в-циклодекстрина способствует увеличению растворимости [8].

Из-за особого строения циклодекстрины способны легко образовывать соединения включения типа «гость-хозяин» с различными гидрофобными «гостями» (рис. 2), когда одна из молекул («хозяин») включает в свой состав другую молекулу («гость») [9].

Комплексообразующая, клатратообразующая способность и, соответственно, практическое применение циклодекстринов определяется строением их молекул и размером внутримолекулярной полости. Размер этой полости недостаточно большой для полного самовключения молекул циклодекстрина, но хорошо подходит для включения молекул меньших размеров или их частей, что и определяет их клатратообразующие свойства [10].

Рисунок 2 ? Структурное и схематическое изображения

Основные параметры молекул и физико-химические свойства циклодекстринов, важные в практическом применении, приведены в табл. 1.

Таблица 1 ? Основные свойства циклодекстринов

Все циклодекстрины представляют собой бесцветные кристаллические вещества, плавящиеся с разложением при температурах 200-300 °C. в-Циклодекстрин имеет более высокую температуру разложения в сравнении с другими циклодекстринами (табл. 1.). Существенно более низкая растворимость в-циклодекстрина в значительной мере определяет устойчивость его клатратов на воздухе вследствие меньшей скорости образования жидкой фазы водного раствора циклодекстрина в результате адсорбции паров воды. Именно у в-циклодекстрина наблюдается наибольший по сравнению с б- и г- циклодекстринами срок хранения клатратов [11].

Высота молекул циклодекстринов определяется «шириной» остатка глюкозы, поэтому, она постоянна и составляет 8 Е (табл. 1.) [12]. Диаметр внутренней полости (рис. 3) 5-8 Е хорошо соответствует размерам молекул большого множества субстратов, что и обусловило широкое применение всех трех циклодекстринов, однако размер полости в-циклодекстрина считается наиболее подходящим для большинства «гостей» и обусловливает большую прочность его комплексов в водных растворах [10].

Рисунок 3 - Схематическое изображение молекулы циклодекстрина

Открытый доступ к полости с двух сторон также облегчает проникновение молекулы «гостя» во внутреннюю полость и делает возможным образование комплексов не только состава 1:1, но и других составов, а также трёхкомпонентных комплексов [13].

Данная полость, образованная углеводородным окружением и гликозидными атомами кислорода, является малополярной и гидрофобной по сравнению с внешней поверхностью [14]. Ван Эттен показал, что по степени гидрофобности окружение внутренней полости б-циклодекстрина схоже с диоксаном [15].

1.3 Получение циклодекстринов

Производство циклодекстринов - сравнительно новое и активно развивающееся направление биотехнологии, основанное на микробиологических, химических и биохимических процессах. Биохимический синтез циклодекстринов (рис. 4) осуществляется из крахмала исключительно при помощи микробного фермента циклодекстринглюканотрансферазы (ЦГТазы).

Рисунок 4 - Схема получения циклодекстринов

ЦГТаза - фермент микробного происхождения, и получение этого фермента является ключевым этапом при производстве циклодекстринов. Поэтому актуальным является выделение продуцента ЦГТазы, который синтезирует фермент с высокой каталитической активностью и специфичностью.

К настоящему моменту ЦГТаза с различными свойствами обнаружена у почвенных микроорганизмов разных родов (Bacillus, Paenibacillus, Brevibacillus, Micrococcus, Thermoanaerobacter и др.) [16-18]. Эти продуценты ЦГТаз относятся к группам мезофильных, термофильных либо алкалофильных бактерий. В результате дальнейших исследований ЦГТаза впервые была идентифицирована у галофильных спорообразующих бацилл и термоактиномицетов [19]. Различают б-, в- и г-специфичные ЦГТазы, которые из крахмала синтезируют б-, в- и г-циклодекстрины. Каждая ЦГТаза обладает только ей присущими свойствами, которые могут быть похожими в рамках видовой специфичности микроорганизмов - продуцентов [20].

Для выделения и очистки каждого гомолога циклодекстринового ряда (б-, в-, г- и других ЦД) требуются различные подходы, но основные этапы получения ЦД схожи. К ним относятся:

– культивирование продуцентов ЦГТ-аз, выделение ферментов;

– получение препаратов ЦГТ-аз заданной степени очистки;

– предобработка субстрата (крахмала) ферментативным методом;

– ферментативный катализ с использованием ЦГТ-азы - реакция конверсии крахмала с образованием смеси ЦД;

– разделение, выделение и очистка одного из гомологов ЦД [21].

Для промышленного получения циклодекстринов используются два принципиально разных подхода: метод неконтролируемой конверсии, в ходе которого в биохимический реактор вводятся лишь ЦГТаза и раствор крахмала, и контролируемый, когда в реакционную смесь добавляются еще и комплексообразователи (сольвенты) - органические или неорганические соединения, селективно реагирующие с одним из циклических сахаров с образованием нерастворимых или слаборастворимых комплексов включения, которые сдвигают равновесия реакции в сторону одного из целевых продуктов, в результате чего возрастает его выход. В ряде случаев выход циклодекстринов возрастает, достигая 40-75 % (масс.), по отношению к субстрату, но число подобных сольвентов, нашедших промышленное применение в производстве циклодекстринов, ограничено. К известным сольвентам относится толуол, широко используемый в технологии получения в-ЦД, деканол-1 и циклогексадека-8-ен-1-он, активизирующие накопление б- и г- гомологов ЦД соответственно.

в-Циклодекстрин находит наибольшее практическое применение среди всех циклодекстринов [22], его производство составляет 10 тысяч тонн в год, а цена 5 долларов США за килограмм [23]. Основное производство и потребление ЦД сосредоточено в Японии, хотя технологиями по получению этих продуктов обладают фармацевтические фирмы Венгрии, Франции, Бельгии, а также США [5]. В настоящее время в России отсутствует производство ЦД.

в-Циклодекстрин зарегистрирован в качестве пищевой добавки с кодом E451 [24]. Способность образовывать сильные водородные связи влияет на его растворимость. Он наименее растворим, сравнительно недорогой и способен формировать комплексы включения с лекарственными веществами.

1.4 Соединения включения циклодекстринов

Соединения включения образуются в результате внедрения молекул одного вида в полости кристаллической решётки или молекул другого вида. Первые молекулы получили название «гостей», вторые - «хозяев». Способность вещества образовывать соединения включения определяется наличием в нём полостей молекулярных размеров. Молекулы включаемого вещества должны обладать конфигурацией, соответствующей форме полости. Включенные молекулы удерживаются в соединениях включения силами межмолекулярного взаимодействия. Целочисленного соотношения между включаемым и включающим веществами не существует, так как в соединениях включения связываются друг с другом группы молекул, а не отдельные молекулы.

Различают решётчатые соединения включений, полости которых возникают при образовании кристаллической решётки, иногда только в присутствии включаемого вещества. Такие соединения включения могут быть канальными (полости в форме канала) или клатратными. Молекулярные соединения включения образуются при наличии полостей в единичных молекулах («хозяевах») относительно небольшой молекулярной массы. Высокомолекулярные вещества позволяют получать соединения включения за счёт полостей между цепями макромолекул. Как правило, при смешении компонентов или при растирании, образуются соединения включения. Они нестойки, в растворах обычно распадаются на исходные вещества [25 ? 27].

Соединения включения иногда называют также клатратными, или просто клатратами. Слово «клатрат» (от лат. clathratus - замкнутый, окруженный со всех сторон, которое, в свою очередь, берет начало от греч. kleiqron, kleiz - замок, ключ) введено Пауэллом в 1948 г. для соединений гидрохинона, имеющего в кристаллическом каркасе полости в виде изометричных клеток, в которых и располагаются молекулы-гости. Первое время термин «клатрат» применялся только для клеточных соединений включения. По форме полости клатраты классифицируются на следующие типы [28]:

– криптато-клатраты - полость в форме клетки (krupton - скрытность),

– тубулато-клатраты - канальная полость (tubus - трубка),

– интеркалато-клатраты - слоистые соединения включения.

Циклодекстрины - природные и модифицированные макроциклические лиганды, обладающие способностью образовывать комплексы включения с различными органическими субстратами с высокой селективностью (избирательностью). Термодинамические характеристики взаимодействия циклодекстринов с различными молекулами имеют большое значение как для разработки теоретических аспектов супрамолекулярной химии, так и для решения ряда важных практических задач. Молекулы циклодекстринов можно рассматривать в качестве моделей центров реакционного связывания ферментов и веществ - каналообразователей, у которых избирательность комплексообразования определяет многие каталитические и биохимические процессы [29].

Как описывалось выше, форма молекул циклодекстринов представляет собой тор, также напоминающий полый усечённый конус. Данная форма стабилизирована водородными связями между OH-группами соседних гликозидных фрагментов, а также б-D-1,4-гликозидными связями. Все ОН- группы в циклодекстринах находятся на внешней поверхности молекулы, поэтому внутренняя полость циклодекстринов является гидрофобной и способна образовывать в водных растворах комплексы включения с другими молекулами органической и неорганической природы. В комплексах включения кольцо циклодекстрина является «молекулой-хозяином», включённое вещество называют «гостем» [3].

Циклодекстрины образуют комплексы включения с самыми разнообразными веществами ? от малых молекул газов и неорганических солей до относительно больших молекул органических красителей и стероидов. Включение не приводит к каким-либо существенным изменениям размера и формы полости молекулы ЦД, за исключением незначительной ее деформации. В то же время образование соединения включения влияет на физические и химические свойства молекулы «гостя»: таким путем можно стабилизировать соединения, чувствительные к действию света, тепла и кислорода воздуха, увеличить растворимость труднорастворимых веществ [4]. Проникновение и расположение органического субстрата внутри макроциклической полости реализуется в соответствии с принципами структурной и энергетической комплементарности и включает в себя следующие этапы:

1) изменение конформации ЦД;

2) высвобождение молекул воды, изначально располагавшихся в полости ЦД;

3) непосредственное проникновение гостя в полость хозяина и образование комплексов за счет ковалентных взаимодействий (вандерваальсовы, гидрофобные, электростатические, водородное связывание, стерические эффекты) [30].

Установлена идентичность комплексов в-циклодекстрина с бензолкарбоновыми кислотами, синтезированных в водных растворах и на поверхности высокодисперсного кремнезема. Доказано, что полученные комплексы относятся к соединениям включения типа «хозяин-гость» и имеют состав 1:1 [21]. Добавление в-циклодекстринов к водным растворам бензолкарбоновых кислот приводит к длинноволновому сдвигу обеих бензольных полос поглощения, что вызвано появлением у молекул кислот гидрофобного окружения. Аналогичная картина наблюдается для растворов бензолкарбоновых кислот в н-гексане. Гидрофобным окружением может быть только внутренняя полость молекулы в-циклодекстрина, так как внешняя ее поверхность гидрофильна [31].

Экспериментальные данные, полученные методом изомолярных серий, в координатах уравнения Бенеши-Гильдебранда хорошо ложатся на прямую линию для комплексов состава 1:1. Невысокие значения констант устойчивости Ks для обоих комплексов «в-циклодекстрин- бензолкарбоновые кислоты» свидетельствуют о том, что они, скорее всего, образуются посредством неспецифических межмолекулярных взаимодействий. Для бензолкарбоновых кислот возможно образование аксиальных комплексов типа «хозяин-гость» двух типов, карбоксильная группа в которых расположена либо в плоскости малого, либо в плоскости большого диаметра тора циклодекстрина. Однако наиболее вероятным и стабильным является комплекс, в котором карбоксильная группа бензолкарбоновых кислот расположена в плоскости широкого края молекулы в-циклодекстрина [21].

в-Циклодекстрин также образует соединения включения типа 1:2, где на одну молекулу «гостя» приходится две молекулы в-циклодекстрина, с такими соединениями, как, например, 2-(4-изобутилфенил)пропионовая кислота - действующее вещество препарата Ибупрофен, янтарная, адипиновая кислоты и др.

1.5 Применение циклодекстринов

Уникальное строение и свойства циклодекстринов определили в последнее время самое широкое их научное исследование и практическое применение [9]. Циклодекстрины используются в фармацевтической продукции, доставке лекарственных средств, химической промышленности, пищевой промышленности, а также сельском хозяйстве и инженерной защите окружающей среды. В таблице 2 приведено примерное распределение использования циклодекстринов по различным отраслям (по публикациям).

Циклодекстрины часто используются для «экстракции» какого-либо продукта из смеси. Наиболее широко известно применение циклодекстринов для удаления холестерина из животных продуктов, таких как яйца, молочные продукты, жиры (свиное сало, топленое сало). Для этого циклодекстрины добавляют к продуктам, из которых нужно удалить холестерин, и смешивают. В случае свиного и топленого сала водный раствор циклодекстрина смешивают при температуре достаточной для расплавления жира, но недостаточно высокой для разрушения комплекса. В процессе смешения циклодекстрин образует комплексы включения с холестерином, которые не растворимы в воде и жире. Комплекс удаляют фильтрованием или центрифугированием. Таким образом обеспечивается до 80 % удаления холестерина. Комплекс включения «циклодекстрин-холестерин» затем суспендируют в воде и нагревают. Нагрев в воде разрушает комплекс и холестерин всплывает на поверхности воды. Далее он может быть использован как отдельный готовый продукт, а водный раствор для дальнейшей экстракции холестерина.

Таблица 2 - Распределение использования циклодекстринов по отраслям

Фруктовые и овощные соки обрабатывают циклодекстрином для того, чтобы избавиться от соединений, которые вызывают коричневый цвет. Соки из винограда, персиков и сельдерея после обработки водонерастворимым производным циклодекстрина (на полимерном носителе) долгое время при стоянии не темнеют [9].

Циклодекстрины способны стабилизировать изменчивые или нестабильные составы и сокращать нежелательные ароматы [32].

Циклодекстрины отличаются хорошими свойствами стабилизации и сохранения свойства витаминов и ароматизаторов при включении их в состав продуктов. При использовании циклодекстринов при производстве шоколадных масс снижается вязкость продукта и добивается значительная экономия какао. С целью увеличения сроков хранения добавка Е459 используется при изготовлении печенья и бисквитов.

Кроме использования в пищевой промышленности, циклодекстрины также применяют в фармацевтической промышленности в качестве систем доставки лекарств и могут служить защитными агентами, которые предотвращают преждевременный метаболизм лекарств и допускают, таким образом, например, пероральное, а не внутривенное введение. Они могут изменять растворимость лекарства и особенности его биологического транспорта, увеличивая специфичность к мишени. Циклодекстрины могут увеличивать растворимость слаборастворимых лекарств, что исключает необходимость химического модифицирования самого лекарства введением гидрофильных остатков, способных вмешиваться в мембранный транспорт этого лекарства. Известно, наконец, что комплексообразование циклодекстринами уменьшает местное раздражение или повреждения, вызванные лекарством, а также маскирует неприятные или горькие привкусы.

Низкая токсичность ЦД и коммерческая доступность определяют широкое использование комплексов включения ЦД в фармацевтике при создании лекарственных препаратов нового поколения, в технологиях капсулирования пищевых продуктов и косметических средств, в биоорганической химии и нанохимии, в аналитических методиках по определению и разделению изомеров [30]. Комплексы циклодекстринов с биологически активными молекулами представляют собой одно из наиболее интенсивно изучаемых объектов химии соединений включения в последние годы. Главными результатами этих исследований являются открытые эффекты увеличения растворимости органических молекул в составе комплексов с циклодекстринами, повышение их стабильности в среде физиологических жидкостей и при хранении, улучшение вкусовых качеств, усиление фармакологической активности, пролонгирование терапевтического действия, снижение побочных эффектов и т.д. [30].

в-Циклодекстрин используется и в косметологии. В зубных пастах и ополаскивателях полости рта он применяется для усиления очищающего эффекта и поглощения неприятного запаха чеснока, лука, рыбы, а также табака и алкоголя. С этой же целью его кладут в жевательную резинку. в- Циклодекстрин запах поглощает, а не маскирует в отличие от ароматизаторов, поэтому в дезодорантах он используется для поглощения неприятного запаха пота. В матирующих кремах и лосьонах в-циклодекстрин поглощает кожный жир и снимает воспаления и раздражения. Он обладает способностью блокировать жирные кислоты, провоцирующие воспалительные процессы, которые провоцируют акне.

в-Циклодекстрин идеально подходит для доставки в кожу активных, но нестойких или раздражающих веществ. Например, витамин С под воздействием света, тепла, кислорода и щелочи разрушается и теряет активность. Как только вы открываете пакетик с витамином С, он сразу начинает терять свою активность. в-Циклодекстрин же делает аскорбиновую кислоту более стабильной и способствует ее проникновению в слой дермы, не вызывая раздражения на эпидермисе.

Для матирующего эффекта, увлажнения и защиты от влияния окружающей среды его добавляют к пудре и теням. в-Циклодекстрин используется также для липосомирования и изготовления наночастиц.

Другая большая область применения циклодекстринов - аналитическая химия, в особенности хроматографические методы такие, как тонкослойная и газовая хроматография, капиллярный электрофорез и высокоэффективная жидкостная хроматография (high-pressure liquid chromatography, HPLC). И снова циклодекстрины выполняют роль комплексообразователей для изучаемых гостей-аналитов. Наличие циклодекстринов (и их производных) либо в качестве добавок к подвижной фазе, либо в качестве добавок, химически связанных со страционарной фазой, может повысить эффективность разделения и скорость анализа, а также привести к разделению родственных соединений и изомеров, в частности энантиомеров [33].

Некоторые, наиболее известные продукты и препараты, обрабатываемые или модифицированные с помощью циклодекстринов приведены в таблице 3 [9].

Таблица 3 - Значение циклодекстринов в различных промышленных областях

1.6 Механизм реакции этерификации

Этерификация - это обратимый процесс образования сложных эфиров при взаимодействии органических кислот со спиртами.

(1)

Реакция (1) протекает в условиях кислотного катализа и проходит по механизму нуклеофильного присоединения-отщепления. Процесс включает несколько обратимых стадий.

1 стадия: активация карбоновой кислоты под действием катализатора с образованием карбокатиона. Роль катализатора - повышение положительного заряда на атоме углерода карбоксильной группы.

2 стадия (лимитирующая): нуклеофильное присоединение спирта к карбокатиону. Молекула спирта за счет неподеленной электронной пары атома кислорода гидроксильной группы взаимодействует с молекулой протонированной кислоты, образуя промежуточный продукт - алкилоксониевый ион. При этом положительный заряд с атома углерода кислоты переходит на атом кислорода гидроксильной группы спирта.

3 стадия: миграция протона и формирование уходящей группы - H2O. При перегруппировке положительный заряд также переходит на другой атом кислорода.

При отщеплении молекулы воды образуется карбокатион: положительный заряд переходит на атом углерода карбоксильной группы.

4 стадия: стабилизация карбокатиона выбросом протона (возвращение его в катализатор) с образованием сложного эфира (двойной связи C=O).

Использование метода «меченных атомов» дало возможность решить вопрос о месте разрыва связей при реакции этерификации. Оказалось, что обычно молекула воды образуется из гидроксила кислоты и водорода спирта. Следовательно, в молекуле кислоты разрывается связь между ацилом и гидроксидом, а в молекуле спирта - связь водорода с кислородом.

Реакция этерификации обратима: если добавить большое количество воды, то реакция сдвигается в сторону гидролиза сложных эфиров с образованием карбоновых кислот и спиртов. Скорость реакции зависит от строения карбоновых кислот и спиртов: при одной и той же кислоте скорость этерификации первичных спиртов в два раза выше, чем вторичных и во много раз выше, чем третичных, что зависит от пространственного расположения радикалов («пространственные затруднения»). Кроме того, скорость реакции падает при переходе от низших спиртов к высшим. Чем выше кислотные свойства кислоты и спирта, тем легче соединения вступают в реакцию этерификации.

Для повышения выхода сложного эфира используют либо избыток одного из реагентов (обычно спирта), либо отгонку образующейся при этерификации воды в виде азеотропной смеси с бензолом.

1.7 Катализаторы, применяемые в реакции этерификации

Этерификация является автокаталитическим процессом, то есть сама карбоновая кислота служит катализатором. Однако при проведении этерификации в отсутствие катализатора часто не достигается необходимой глубины превращения исходных соединений. Кроме того, требуется применение растворителя, большой избыток соответствующего оксисоединения и значительные энергетические затраты.

Применение катализатора ускоряет этерификацию, увеличивая положительный заряд на карбонильном атоме углерода карбоновой кислоты и сдвигая реакцию в сторону образования сложного эфира. В качестве катализаторов реакции этерификации карбоновых кислот оксисоединениями используются разнообразные химические соединения.

Традиционными катализаторами этерификации карбоновых кислот служат минеральные кислоты: серная, соляная, ортофосфорная, борная. Серная кислота была первым катализатором, примененным для ускорения реакции этерификации. До настоящего времени она остается одним из самых высокоэффективных и широко используемых катализаторов промышленного производства сложных эфиров.

К достоинствам серной кислоты как катализатора следует отнести значительную скорость этерификации при сравнительно невысоких температурах (80-150 °C). Недостатком серной кислоты является возможность дегидратации спиртов, сульфирование ненасыщенных соединений, присутствующих в исходных спиртах. Кроме того, не исключается возможность осмоления органических соединений, а также образование сложных эфиров сульфокислот.

В качестве катализаторов этерификации можно использовать алкилсульфокислоты (бензол- или п-толуолсулфокислоты), сульфаниловую и сульфамиловую кислоты, арилсульфохлорид, меркаптаны, гидросульфат натрия, фтористый водород, хлорангидриды органических и неорганических кислот (тионилхлорид, ацетилхлорид), хлороксид фосфора, кислоты трех- и пятивалентного фосфора (фосфорноватистая, фосфористая, фосфорная), а также элементы переменной валентности: тетраалкилтитанаты, цирконаты, алкоксикарбоксилаты олова, гафния и другие.

Практическое применение для этерификации нашли бензол- и п- толуолсульфокислоты. Однако эти соединения содержат значительное количество примесей, что осложняет их использование без предварительной очистки. Кроме того, бензол- и п-толуолсульфокислоты при температуре окружающей среды являются твердыми веществами. Это затрудняет их введение в реакцию, а также увеличивает энергоемкость процесса в виду необходимости предварительного плавления или растворения их в исходном сырье (обычно спирте).

Возможно использование в качестве катализатора этерификации соляной кислоты, однако активность ее ниже, чем серной кислоты. Помимо этого в присутствии соляной кислоты, протекают побочные реакции гидролиза сложного эфира, а сам процесс осложняется необходимостью нейтрализации катализатора и удаления его из сложного эфира путем водных промывок. При работе с соляной кислотой предъявляются повышенные требования к безопасному ведению процесса, так как возможно выделение газообразного хлористого водорода.

Аналогичные недостатки характерны для катализатора фтористого водорода и хлорангидридов органических и неорганических кислот (тионилхлорид, ацетилхлорид), хлороксид фосфора. В присутствии катализатора этерификации хлороксида фосфора образуются слабоокрашенные эфиры, не происходит осмолення органических веществ, но существует вероятность загрязнения спиртов, применяемых для этерификации, продуктами фосфорилирования ненасыщенных соединений.

При этерификации карбоновых кислот оксисоединениями, катализируемой неорганическими кислородсодержащими и органическими кислотами трех- и пятивалентного фосфора (фосфорноватистой, фосфористой, фосфорной) последние не выделяются из реакционной массы (так как они малолетучи), не вызывают осмоления органических веществ. Однако эти катализаторы имеют меньшую активность, чем серная кислота, и в основном им присущи те же недостатки.

Широко изучается в настоящее время катализ реакции этерификации карбоновых кислот органическими соединениями элементов переменной валентности: тетраалкилтитанатами, цирконатами, алкоксикарбоксилатами олова, гафния, полимерными конденсированными полититанатами, алкилтитанатами с ванадатами, комплексами алкилтитанатов и станнатов, алкилтитанатов и карбоксилата цинка, карбоксилата олова с алкилсульфокислотами. Следовательно, для катализа могут применяться не только индивидуальные органические соединения элементов переменной валентности, но и целые системы.

Недостатками этих катализаторов является необходимость применения большого избытка оксисоединения по сравнению с катализаторами кислотного типа и проведение реакции при повышенной температуре (180- 200°С вместо 130-140 °С). Это увеличивает энергетические расходы и уменьшает производительность стадии этерификации.

Достоинствами таких катализаторов амфотерного типа (и каталитических систем) являются высокая степень превращения карбоновой кислоты в сложный эфир, простота удаления катализатора путем высаждения из реакционной массы щелочным агентом, отсутствие побочных реакций с образованием олефинов и простых эфиров. Эти катализаторы являются нейтральными соединениями, поэтому упрощается очистка сложного эфира исключаются стадии нейтрализации и водных промывок, практически отсутствуют сточные воды. Благодаря таким достоинствам, несмотря на меньшую их активность по сравнению с алкилсульфокислотами, органические соединения элементов переменной валентности, особенно тетраалкилтитанаты, широко применяются в промышленности.

1.8 Амфифильные производные в-циклодекстрина, содержащие остатки высших жирных кислот

Соединения, способные растворяться как в гидрофильных, так и в гидрофобных растворителях, называются амфифильными (греч. бмцйцйлйб). Приставка бмцй означает «двойной», а корень цйлйб (дружить, любить) ? указывает на сродство таких молекул к различным типам растворителей. Сами молекулы амфифильных соединений состоят из длинного углеводородного хвоста (построенного обычно более чем из десяти метиленовых звеньев), обеспечивающего растворимость в неполярных средах, и полярной головы, ответственной за гидрофильные свойства. Таким образом, амфифильные соединения одновременно «любят» и воду (то есть являются гидрофильными), и неполярные растворители (проявляют гидрофобные свойства).

В зависимости от типа гидрофильной группы выделяют амфифильные соединения, несущие заряженную катионную (амины б+) или анионную ? функциональную группу, и амфифильные соединения с незаряженной функциональной группой (спирты ROH, тиолы RSH). Абсолютное большинство известных органических соединений несут более чем одну заряженную функциональную группу. Примером таких веществ являются макромолекулярные соединения ? белки, липопротеиды, блок-сополимеры и т.д. Наличие у молекул белка третичной структуры, образующейся в результате внутримолекулярных взаимодействий функциональных групп (полярных или неполярных) между собой, само по себе демонстрирует амфифильную природу этих соединений. Другим примером амфифильных соединений является большинство лекарственных средств, молекулы которых сочетают в себе набор определенных функциональных групп, необходимых для эффективного связывания с рецептором-мишенью.

Роль амфифильных соединений в получении наноматериалов и нанотехнологических продуктов сложно переоценить. Амфифильные соединения часто являются поверхностно-активными веществами. Их молекулы «самоорганизуются» (самособираются) на различных границах раздела, образуя тонкие пленки самособирающихся монослоев толщиной всего в одну молекулу, формируют «мицеллярные» системы.

Амфифильные соединения играют особую роль в живой природе. Ни одно животное или растение не может существовать без них. Именно из амфифильных молекул состоит мембрана клетки, которая отделяет живой организм от враждебной внешней среды. Именно такие молекулы составляют внутренние органнелы клетки, участвуют в процессе ее деления, задействованы в обмене веществ с окружающей средой. Амфифильные молекулы служат нам пищей и образуются в наших организмах, участвуют во внутренней регуляции и цикле желчных кислот. Наш организм содержит более 10 % амфифильных молекул. Именно поэтому синтетические поверхностно-активные вещества могут быть опасны для живых организмов и, например, способны растворить мембрану клетки и привести к ее гибели [34].

Хорошо известно, что циклодекстрины, благодаря способности образовывать соединения включения с подходящими гидрофобными гостями, нашли самое широкое применение в фармакологии как контейнеры различных лекарственных средств за счет образования комплексов типа «гость-хозяин». Такое инкапсулирование обычно способствует повышенной растворимости лекарственного средства и защищает его от биоразложения. Однако этот способ доставки лекарственных средств имеет ограничения и недостатки, связанные с тем, что комплексы включения циклодекстрина с лекарственным средством находятся в равновесии с «гостем» и «хозяином», степень ассоциации которых сложным образом зависит от величины константы устойчивости комплекса, природы растворителя, температуры и ряда других факторов. В медицинском аспекте желательно, чтобы комплекс распадался на свободный циклодекстрин и лекарство на месте адсорбции, и тогда лекарство в свободной форме вступает в системную циркуляцию. Однако, если комплекс включения «слабый», доставка лекарства затруднена, поскольку комплекс диссоциирует до момента достижения соответствующего органа или ткани, для которых он предназначен. Так, например, комплексы циклодекстринов неудобны для кишечно- специфической доставки лекарств: при оральном приеме комплекс часто распадается и не попадает в кишечник.

Поэтому в последнее время заметное внимание уделяется и ковалентному присоединению (конъюгированию) лекарственного средства к циклодекстрину, что в ряде случаев дает возможность получать лекарственные препараты более пролонгированного и целенаправленного действия. В развитие этого направления, с целью поиска новых фармакологических возможностей циклодекстринов, как эксипиентов лекарственных средств, в последние 10 лет особое внимание уделяется амфифильным производным циклодекстринов с гидрофобными фрагментами алкильными или ацетильными радикалами, ковалентно связанными с первичными гидроксильными группами циклодекстринового каркаса. На их основе получены многочисленные липосомы, везикулы, наносферы и нанокапсулы, представляющие интерес для направленной доставки лекарств, что отражено в ряде недавних статей и обзоров [35 ? 36]. Упомянутые молекулярные конструкции сочетают способность циклодекстринов к включению с транспортными свойствами организованных «самособирающихся» структур, таких как везикулы и мицеллы, особенно при введении амфифильных циклодекстринов в предорганизованные липидные матрицы - липосомы или их аналоги. Например, с целью создания фрагментов, близких по строению и природе находящейся в мембранах клетки липидной матрице, были получены первые представители нового класса амфифильных циклодекстринов - холестерин, ковалентно присоединенный к в-циклодекстину, и фосфолипидоциклодекстрины. Таким образом, конъюгированные циклодекстрины (пролекарства) могут применяться для точечной специфической доставки лекарства, а амфифильность циклодекстринов также приводить к повышенной способности проходить биологические барьеры, например, гемато- энцефалический [35].