Гемоглобины человека: иммунобиохимическая характеристика и медико-биологическое значение

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

ГЕМОГЛОБИНЫ ЧЕЛОВЕКА: ИММУНОБИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

03.00.04. - Биохимия

КРИВЕНЦЕВ ЮРИЙ АЛЕКСЕЕВИЧ

Москва - 2009

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Астраханская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию".

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор АГМА Никулина Дина Максимовна.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Терентьев Александр Александрович,

доктор медицинских наук, профессор Хватов Валерий Борисович,

доктор медицинских наук, профессор Сучков Сергей Викторович.

Ведущая организация: - ГОУ ВПО "Московский государственный медико-стоматологический университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию", Адрес: 127473, Москва, ул. Делегатская, д. 20/1.

Защита диссертации состоится 28 декабря 2009 г. в 15.00. часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.072.01 при ГОУ ВПО "Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1.

Автореферат разослан 15 сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор П.Х. Джанашия.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы повышается интерес к отдельным типам гемоглобина как диагностически значимым маркерам. Существует разнообразие патологических состояний красной крови (талассемии, онкопатология, гипоксии и др.), при которых важное диагностически-прогностическое значение имеет не только изменение количества общего гемоглобина крови, но и отдельных его типов. К наиболее физиологически и диагностически значимым типам гемоглобина человека относятся гемоглобины взрослого HbА ₁, HbА ₂, фетальный гемоглобин (HbF) и эмбриональный гемоглобин (HbP).

В современной клинической практике большинства стран для количественного анализа гемоглобинов в качестве стандартных применяются колориметрические циангемоглобиновые методы, рекомендованные комитетом по стандартизации Европейского и Международного Общества по Гематологии (Deutscher Normenausschuss, Normentwurf DIN 58931, 1964), основным из которых является унифицированный гемоглобинцианидный метод [Зорина, 1980; Делекторская Л.Н., 1992; Гаранина Е.Н., 1997]. Большинство колориметрических методов количественного определения гемоглобина не отличаются избирательностью: с их помощью определяется лишь общее количество гемоглобина крови, а не отдельных его типов. Даже в случае определения щелочеустойчивой фракции гемоглобина по Зингеру и Бетке регистрируются несколько типов гемоглобина, а не только фетальный [Betke K., 1958; Betke K., 1979]. Кроме того, методы Бетке и Зингера несовершенны при определении малых концентраций гемоглобина. Методика определения гемоглобинов путем электрофореза в геле крахмала, агарозы или ацетата целлюлозы при рН 8,4-8,6 [Huisman, T.H.J. 1996, Тиц Н.У. 1997, Fairbanks, V.P. 1999] является полуколичественной.

В современной медицинской лабораторной практике четко прослеживается тенденция перехода от определений фракций веществ к индикации каждого вещества фракции в отдельности, что, очевидно, повышает качество диагностики и оценки состояния пациента. Безусловно, современная медицина нуждается в появлении новой схемы тестирования гемоглобинового спектра человека, которая позволяла бы определять уровень каждого из основных типов гемоглобина. В последние годы появились единичные работы по изучению отдельных типов гемоглобина с помощью иммунохимических тест-систем [Никулина 2002; Токарев Ю.Н. 2003].

Огромным преимуществом иммунохимических методов является их высокая специфичность, которую обеспечивают интимные избирательные взаимодействия: антиген-антитело. Кроме того, к преимуществам иммунохимических методов можно отнести высокую чувствительность, позволяющую количественно определять белки в малых пробах, а также то, что эти методы позволяют исследовать сложные биологические смеси без какой-либо предварительной очистки и выделения исследуемого белка.

Таким образом, моделирование моноспецифических иммунохимических тест-систем на основные типы гемоглобина (HbА ₁, HbF, HbP и др.), разработка комплексной схемы оценки гемоглобинового спектра крови и их внедрение в клиническую практику актуально и целесообразно.

Цель исследования: оптимизация клинической оценки состояния красной крови путем пополнения фундаментальных сведений по основным типам гемоглобина и формирования комплексной иммунохимической схемы оценки гемоглобинового спектра.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительное иммунобиохимическое изучение физико-химических свойств HbА₁, HbА₂, HbF и HbP.

2. Разработать рациональные способы выделения и очистки основных типов гемоглобина.

3. Смоделировать моновалентные иммунохимические тест-системы на гемоглобины А₁, А₂, F и P.

4. Разработать способы количественного иммунохимического анализа основных типов гемоглобина.

5. Определить сроки начала и динамику продукции HbР и HbF на ранних этапах онтогенеза человека.

6. Создать комплексную схему оценки гемоглобинового спектра крови на основе иммунохимических тест-систем и установить ее клинико-диагностическое значение при патологии эритрона и заболеваниях, сопровождающихся гипоксией.

Научная новизна исследования. Пополнены фундаментальные данные по физико-химическим свойствам HbA₁, HbA₂, HbF, получены новые сведения по некоторым физико-химическим свойствам эмбрионального гемоглобина: относительной электрофоретической подвижности в полиакриламидном и агарозном гелях, изоэлектрической точке, степени щелочной резистентности и отношению к осаждающим агентам, на основании чего разработаны и апробированы оригинальные алгоритмы их выделения и очистки.

Сконструирована моновалентная иммунохимическая тест-система на эмбриональный гемоглобин. Смоделированы и успешно апробированы новые точные и надежные оптимальные алгоритмы количественного анализа по гемоглобинам A₁, A₂, F и P. Впервые разработана комплексная схема количественной оценки гемоглобинового спектра, отличающаяся точностью, специфичностью, надежностью и экономичностью.

Уточнены сроки начала продукции антенатальных гемоглобинов и проведен параллельный иммунохимический анализ динамики концентрации HbР и HbF в раннем эмбриогенезе.

Впервые выявлен HbР и отмечено повышение концентарции HbF в крови больных эритремией, сублейкемическим миелозом, острым и хроническим миелолейкозом, что доказывает значение этих белков как канцероэмбриональных антигенов в диагностике миелопролиферативных заболеваний.

Впервые показано появление HbР и достоверное изменение уровня HbF в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией, задержкой внутриутробного развития и глубокой недоношенностью, доказывающее диагностическую роль тестов на HbP и HbF при патологии новорожденных.

Впервые отмечено значительное превышение концентрации фетального гемоглобина в крови больных опийной наркоманией и алкоголизмом.

Практическая значимость работы. Предложенные оригинальные алгоритмы выделения и очистки гемоглобинов А ₁, А ₂, F и P, позволят экономить исходный биоматериал, реактивы, временные и финансовые ресурсы. Полученные белковые препараты могут быть использованы для научных исследований и для практического применения.

Разработаны и используются в клинической практике следующие тесты: способ количественного анализа HbF ракетным электрофорезом с додецилсульфатом натрия, способ полуколичественного анализа HbP путем трехэтапной иммунодиффузии по Оухтерлони, способ количественного анализа HbA₁ и HbA₂ радиальной иммунодиффузией по Манчини. Составлена инструкция по применению сформированного набора реагентов для иммунохимической индикации HbF, HbP, HbA₁ и HbA₂. Разработана и используется в клинической практике комплексная схема оценки гемоглобинового спектра, основанная на сочетании оптических и иммунохимических методов индикации гемоглобинов.

Результаты диссертационного исследования и предложенные рекомендации могут быть использованы в работе клинико-диагностических лабораторий, поликлинических, гематологических, педиатрических, неонатологических, наркологических, пульмонологических, кардиологических, онкологических и терапевтических лечебно-профилактических учреждений.

Внедрение результатов исследования позволит оптимизировать способы аналитической и препаративной работы с основными типами гемоглобина человека, осуществлять более точный и полный анализ гемоглобинового статуса и состояния красной крови, что будет способствовать улучшению диагностики, лечения и прогноза заболеваний, сопровождающихся изменением концентрации общего гемоглобина или отдельных его типов.

Внедрение результатов исследования в практику. Разработанные в диссертации методики и полученные результаты исследований внедрены в практическую деятельность КДЛ учебно-научно-диагностического центра ГОУ ВПО АГМА; МУЗ "Клинический родильный дом" г. Астрахань; ГУЗ Александро-Мариинской ОЦКБ, г. Астрахань; НУЗ Медико-санитарная часть, г. Астрахань; МУЗ клиническая больница №5, г. Астрахань. Теоретические положения используются в учебном процессе на биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики, патологической физиологии ГОУ ВПО АГМА Росздрава.

Материалы научных исследований используются в научных разработках и в педагогическом процессе на всех факультетах на кафедрах биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики и патологической физиологии Астраханской государственной медицинской академии.

Положения, выносимые на защиту:

1. При очистке основных типов гемоглобина наиболее эффективны методы фракционирования, основанные на разделении по изоэлектрической точке: ионообменная хроматография и препаративный электрофорез. При электрофоретическом разделении гемоглобинов оптимальным является диапазон рН рабочего буфера от 6,0 до 6,6. Значительное влияние на электрофоретическую подвижность HbA₁, HbA₂, HbF и HbP в агарозе и ПААГ оказывают додецилсульфат натрия, тритон, мочевина и бихромат калия. На ранних этапах выделения HbP следует использовать модифицированную методику щелочной денатурации с 40-секундной экспозицией в 1,2 н NaOH.

2. Оптимальными для количественного определения основных типов гемоглобина являются методы иммунохимического анализа. Разработаны точные алгоритмы селективного количественного анализа HbA₁, HbA₂, HbF и HbP, основанные на методах двойной иммунодиффузии, ракетного иммуноэлектрофореза и РИД по Манчини. Создана и внедрена в клиническую практику комплексная схема количественной оценки гемоглобинового спектра по основным типам гемоглобина, основанной на модифицированных иммунохимических методах.

3. Иммунохимическим путем проведен количественный анализ динамики концентраций HbР и HbF в раннем эмбриогенезе (с 4 по 12 нед гестации), и уточнены сроки начала продукции антенатальных гемоглобинов.

4. Доказано значение HbP и HbF как канцероэмбриональных антигенов в диагностике миелопролиферативных заболеваний, оценке степени тяжести и прогноза гипоксии новорожденных, ЗВУР и глубокой недоношенности. Впервые отмечено значение иммунохимического теста на HbF в оценке тяжести и эффективности лечения больных опийной наркоманией и алкогольной зависимостью.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на V научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" 2001; на III съезде биохимического общества РАН (Санкт-Петербург, 2002); на 2-й и 3-й научно-практической конференции и школе-семинаре для молодых ученых с международным участием "Белки-маркеры патологических состояний" (Астрахань-Москва, 2001, 2003); на научно-практической конференции с международным участием "Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины" (Астрахань-Москва, 2004), (Астрахань-Волгоград-Москва, 2006), (Астрахань-Москва 2008); на VIII Международной научной конференции "Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря" (Астрахань, 2005); на международной научной конференции, посвященной 450-летию г. Астрахани (Астрахань. 2007), на VI Всероссийской конференции молодых ученых "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии" (Москва. 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск. 2008), межрегиональной научно-практической конференции "Актуальные проблемы кардиологии детей и взрослых-2009" (Астрахань. 2009), Всероссийской научной конференции "Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении" (С.-Пб., 2009).

Материалы диссертации были представлены на выставке: "Инновационные достижения России" XI Петербургского международного экономического форума (С-Петербург. 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 41 научная работа, в том числе 12 в рецензируемых научных изданиях, рекомендуемых ВАК, 1 патент. кровь гемоглобин иммунохимический свойство

Структура и объем работы: Диссертация изложена на 264 страницах текста, иллюстрирована 34 таблицами, 39 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, главы методов исследования, 6 глав собственных экспериментальных и клинических исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций. Указатель литературы содержит 251 отечественных и 139 иностранных авторов.

Личное участие автора в получении результатов исследования. Основной материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором. Исследования проведены на кафедре биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики АГМА, КДЛ учебно-научно-диагностического центра ГОУ ВПО АГМА; МУЗ "Клинический родильный дом"; ГУЗ Александро-Мариинской ОЦКБ, НУЗ Медико-санитарная часть, МУЗ клиническая больница №5, г. Астрахань.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Исследование было проведено в период с 2003 по 2009 гг. на биологическом и клиническом материале общей численностью 1288 образцов. Объектом исследования являлись изучаемые гемоглобины типов А₁, А₂, F и P, источники получения которых приведены в табл. № 1.

Таблица 1. Перечень использованного в работе материала

Материал	Число образцов	Место получения биоматериала
Биоматериал:		г. Астрахань
Эмбриональный материал	170	Отделение гинекологии МУЗ КБ №5
Плоды	12	Отделение патанатомии ГУЗ АМ ОЦКБ
Пуповинная кровь здоровых новорожденных	62	МУЗ "Клинический родильный дом"
Кровь беременных	57
Кровь здоровых доноров	84	Станция переливания крови
Клинический материал:
Пуповинная кровь новорожденных	196	МУЗ "Клинический родильный дом"
Кровь кардиологических больных	49	НУЗ Медико-санитарная часть
Кровь наркологических больных	138	наркологический УНЛЦ АГМА
Кровь гематологических больных:
Гемобластозы	244	Отделение гематологии ГУЗ АМ ОЦКБ
Анемии	64	НУЗ Медико-санитарная часть
Здоровые доноры (группы контроля)	212	Станция переливания крови
ВСЕГО	1288

Биоматериал использовали как при изучении физико-химических свойств HbA₁, HbA₂, HbF и HbP, так и в разработке новых способов выделения и очистки названных белков. Исходным материалом для очистки HbA₁ и HbA₂ являлась кровь доноров и здоровых беременных женщин; для очистки фетального гемоглобина - пуповинная кровь здоровых новорожденных и ткани плодов; для очистки HbP - эмбриональный материал сроком гестации 5-9 нед.

Постановку и верификацию диагнозов в обследуемых группах проводили при участии квалифицированных специалистов. Исследованный клинический материал был разделен по нозологии на три группы:

1) Гепаринизированная кровь больных миелоприлиферативными заболеваниями. Всего было обследовано 244 образца крови (табл. 2). Т.к. в обследуемый спектр нозологии входили заболевания с редкой встречаемостью (эритремия, сублейкемический миелоз, эритроцитоз), если число вариант в выборке не превышало 20, применяли алгоритмы статистической обработки для малых групп.

Таблица 2. Перечень использованного в работе материала

Исследуемый материал (кровь больных)	Количество проб
Эритремия	36
Сублейкемический миелоз	34
Хронический миелолейкоз	76
Острый миелолейкоз	36
Острый и хронический лимфолейкоз	56
Эритроцитоз	6
ВСЕГО	244

2) Гепаринизированная пуповинная кровь новорожденных, в количестве 196 образцов (табл. 3).

3) Гепаринизированная периферическая кровь наркологических больных (табл. 1). Были обследованы образцы крови от 138 человек, из них: 52 образца от пациентов с алкогольной зависимостью; 44 - от больных опийной наркоманией и 42 пробы от здоровых взрослых (контрольная группа). Возраст больных составил от 18 до 43-х лет. Клинический статус обследуемых соответствовал острому абстинентному синдрому.

Таблица 3. Перечень использованного в работе материала

Исследуемый материал (пуповинная кровь новорожденных)	Количество проб
	Всего	Мальчики	Девочки
Здоровые дети (контрольная группа)	62	33	29
Дети с тяжелой внутриутробной гипоксией	52	27	25
Дети с тяжелой внутриутробной гипоксией и задержкой внутриутробного развития	43	21	22
Дети с тяжелой внутриутробной гипоксией и глубокой недоношенностю (масса тела не более 1000 г.)	39	18	21
ВСЕГО	196	99	97

Кровь брали пункцией кубитальной вены или пальца у взрослых людей, у новорожденных - из пуповины сразу после ее рассечения, у плодов - из сердца. Забор крови производили в пробирки с добавленным в них раствором гепарина. Эмбриональные ткани получали в ходе экстренных и запланированных медицинских абортов при участии квалифицированного врача-гинеколога, с письменного согласия пациенток. После получения материал упаковывали в стерильные, герметично закрытые емкости, которые тут же транспортировали в научную лабораторию кафедры биохимии с курсом КЛД в охлажденном состоянии. Хранили материал в морозильной камере при температуре -18⁰С.

При изучении физико-химических свойств HbA₁, HbA₂, HbF и HbP, и при разработке новых способов выделения и очистки названных белков применяли методы механически-термического гемолиза, комбинированной щелочной денатурации (поэтапная обработка гемолизата раствором сульфата аммония 50 % насыщенности и 1,2 М раствором едкого натра с последующей седиментацией при 8000 g), препаративного электрофореза в агаровом геле на 0,1 М цитратном буфере рН 6,0 (в авторской модификации), электрофореза в полиакриламидном геле, ионообменной и гель-проникающей хроматографии (Л.А. Зильбер, ред., 1968; Davis 1964; Ornstein 1964; Г. Детерман, 1970; Г. Маурер, 1971; Э. Руослахти, 1979; Л.А. Остерман, 1985; Э. Гааль и соавт., 1982; X. Фримель, ред., 1987; О. Микеш, ред., 1982; Р. Скоупс, 1985; А.М. Егоров и соавт., 1991). Идентификацию полученных препаратов проводили методами ИХА. Всего протестировано свыше 4500 образцов биоматериала.

Моновалентные антисыворотки на изучаемые типы гемоглобина получали самостоятельно методом иммунизации кроликов породы "шиншилл" дробными дозами чистого антигена с адъювантом Фрейнда по общепринятой схеме. При моделировании иммунохимических тест-систем применяли: выделение б-цепей пара-хлормеркурибензоатом, истощение антисывороток путем иммуноаффинной хроматографии на Bio Gel P-200, электрофорез в агаре, иммуноэлектрофорез по Грабару и Уильямсу (Grabar P. et al. 1958).

Для индикации белков в био- и клиническом материале использовали:

· оптические методы определения: унифицированный гемоглобинцианидный метод (по инструкции Департамента государственного контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ 17.06.2000), определение фетального гемоглобина по Зингеру в модификации Бетке (Betke, K. 1979); определение общего белка биуретовым методом (набор реагентов фирмы "Vital", экстинкцию измеряли на фотоэлектроколориметре "Spicol-11") или спектрофотометрически при 280 и 260 нм по Варбургу.

· иммунохимические методы: иммунодиффузионное титрование по Ouchterlony в модификации Н.И. Храмковой и Г.И. Абелева, РИД по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви (Fahey, J.L. 1965), ракетный электрофорез в агаровом геле в варианте Laurell C.B. и Merrill D в авторской модификации.

Для статистической обработки и анализа полученных результатов исследования, а также построения графиков был использован лицензионный пакет прикладных программ статистического анализа Excel-2003 (Microsoft), Statistica 6.0 (StatSoft. Inc.). Для каждой выборки вычисляли средние величины (М), среднее квадратичное отклонение (у), среднюю ошибки средней арифметической (m). Проводили дисперсионный анализ с подсчетом степеней свободы (н_меж и н_вну) и критерия дисперсии (F). С целью определения значимости Р различий сопоставляемых величин применялся критерий t Стьюдента и однофакторный дисперсионный анализ с вычислением критерия F Фишера. Различие считали достоверным при Р<0,05. Для оценки межгрупповой зависимости проводился линейный корреляционный анализ Пирсона (коэффициент корреляции - r). Корреляция считалась высокой при приближении модульной величины r к единице. Статистические взаимосвязи между показателями оценивались применением корреляционного, регрессионного анализа и методов многомерной статистики (Гланц С., 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительное изучение физико-химических свойств основных типов гемоглобина (HbA₁, HbA₂, HbF и HbP) показало, что все изучаемые типы являются водорастворимыми хромопротеидами с электрофоретической подвижностью в-глобулинов. Установлено, что все методы обратимого и необратимого осаждения, за исключением осаждения слабыми растворами кислот и щелочей, не позволяют разделять типы гемоглобина, однако могут быть использованы для очистки Hb от других белков и концентрирования препаратов гемоглобина. Показаны значительные отличия разных типов гемоглобина в способности осаждаться сульфатом аммония, что может быть использовано при их разделении. Установлено, что HbP резистентен к действию щелочей, но его устойчивость ниже, чем у HbF (табл. 4).

Экспериментально показано, что из четырех основных типов гемоглобина, как в ПААГ, так и в агарозном гелях максимальную электрофоретическую подвижность (как по альбумину, так и по гемоглобину А ₁) имеет эмбриональный гемоглобин, второй по скорости миграции - HbA₁. В агарозном геле минимальную подвижность среди названных протеинов имеет HbA₂, а в ПААГ - HbF (рис. 1). Степень корреляции относительной электрофоретической подвижности изучаемых протеинов, как по альбумину, так и по гемоглобину А ₁, оказалась положительной и высокой (в агарозе: r = 0,88; в ПААГ: r = 0,91).

Таблица 4. Сравнительный анализ физико-химических свойств гемоглобинов

Ф/х свойства	HbA1	HbA2	HbF	HbP
Растворимость в воде	+	+	+	+
Отношение к осаждающим реагентам: 0,5 % риванол этанол	осаждается обратимо*** осаждается обратимо***	осаждается обратимо*** осаждается обратимо***	осаждается обратимо*** осаждается обратимо***	осаждается обратимо*** осаждается обратимо***
Отнощение к сульфату аммония (в % насыщенности): оптимум осаждения диапазон осаждения	55* 30-65*	50* 30-65*	70* 40-80*	65* 35-80*
Относительная электрофоретическая подвижность по альбумину: в агарозе в ПААГ	0,258±0,009* 0,29-0,30** 0,610±0,022* 0,63-0,68**	0,206±0,007* -**** 0,537±0,020* 0,51-0,525**	0,217±0,008* 0,30-0,35** 0,512±0,019* 0,50-0,52**	0,309±0,010* -**** 0,679±0,024* -****
Изоэлектрическая точка	7,0±0,1* 6,95-7,18**	7,3±0,15* 7,4-7,6**	7,1±0,13* 6,9-7,15**	6,85±0,1* -****
Резистентность к действию щелочей	Неустойчив***	Неустойив***	Устойчив***	Относительно устойчив* Устойчив**
Пероксидазная и каталазная активность	Активен***	Активен***	Активен***	Активен***
Характеристические окраски: белки (амидочерный) общее железо (красная кровяная соль) на гемоглобины (бензидин, гваякол) гликопротеиды (Шифф) липопротеиды (судан)	+*** +*** +*** -*** -***	+*** +*** +*** -*** -***	+*** +*** +*** -*** -***	+*** +*** +*** -*** -***
Гомогенность	Гомогенен при э/ф в агарозе и ПААГ***	Гомогенен при э/ф в агарозе и ПААГ***	Гомогенен при э/ф в агарозе и ПААГ***	Гомогенен при э/ф в агарозе, гетерогенен при э/ф в ПААГ***

* - собственные данные

** - данные других авторов (Стародуб Н.Ф. (1987), Иржак Л.И. (1985))

*** - собственные и литературные данные совпадают

-**** - данные в литературе отсутствуют.

Рис. 1. Относительная электрофоретическая подвижность основных типов гемоглобина (по HbA1) при электрофорезе в агарозном геле (верхний рисунок) и в полиакриламидном геле (нижний рисунок)

Можно констатировать несовпадение литературных и полученных нами средних значений относительной электрофоретической подвижности по HbA₁ в ПААГ и агарозном геле и по HbF в агарозе. При этом полученные результаты заслуживают доверия в силу большой выборки количества проведенных идентичных экспериментов. Впервые получены статистически достоверные данные по относительной электрофоретической подвижности HbP в полиакриламидном и агарозном гелях и HbA₂ в агарозном геле и значению его изоэлектрической точки (t=3,29; Р<0,01).

Получены новые данные по действию некоторых детергентов на HbP. Отмечено, что действие тритонов различных видов снижает электрофоретическую подвижность HbP, мочевина и бихромат калия не изменяют электрофоретической подвижности HbP, но делают его фракцию гетерогенной. Впервые показано, что ДСН меняет вектор электрофоретической подвижности HbP на противоположный и увеличивает скорость движения этого белка.

Разработка новых способов выделения и очистки по каждому из изучаемых типов гемоглобина проводилась с учетом полученных на предыдущем этапе данных. Разработаны и апробированы оригинальные способы очистки по каждому из изучаемых типов гемоглобина. Новизна разработок состоит, прежде всего, в подборе оптимального методического сочетания и алгоритма выполнения способа получения чистого препарата по каждому белку.

Наиболее эффективным по большинству показателей является разработанный способ выделения и очистки фетального гемоглобина (рис. 2). Применение данного алгоритма приводит к получению белка наибольшей степени очистки с высоким его процентом в полученном препарате. Кроме того, данный способ оказывается наиболее экономным по биопродукту, выход которого довольно высок (табл. 5).



Рис. 2. Анализ чистоты полученных препаратов HbF и HbР методом электрофореза в ПААГ

Таблица. Анализ качества выделения HbF

Основные этапы выделения	Общий белок, мг/л	Кол-во продукта, мг|л	Целевой продукт, %	Степень очистки HbF	Выход HbF (%)
Исходный материал	240189±316,2	3751±68,0	1,56	1	100
Получение гемолизата	128163±293,9	3118±73,2	2,42	1,55	82,66
Щелочное осаждение	4651±188,5	2816±54,9	60,21	38,59	76,66
Ионообменная хроматография	2912±192,3	2542±46,5	85,58	54,86	67,73

у= 30,81. F = 5,3.

Способ выделения HbA₁ по эффективности и чистоте получаемого продукта практически не уступает способу очистки HbF, а по простоте и дешевизне превосходит его (табл. 6).

Таблица 6. Анализ качества выделения HbA₁

Основные этапы выделения	Общий белок, мг/л	Кол-во продукта, мг|л	Целевой продукт, %	Степень очистки HbA1	Выход HbA1 (%)
Исходный материал	215112±218,1	145039±172,9	67,44	1	100
Получение гемолизата	165128±221,5	138128±155,0	83,64	1,24	95,17
Препаративный электрофорез	53506±183,3	51640±129,3	95,52	1,42	35,62
Разведение	535±32,4	516,4±64,8	95,52	1,42	0,36

у= 68,17. F = 4,8.

Менее эффективными по характеристикам оказались предлагаемые способы получения HbA₂ и HbP (табл. 7 и 8; рис. 2). Это логично, учитывая, что HbA₂ является минорным, а HbP получают из "грязного" абортивного материала сложным и трудоемким способом. Тем не менее, чистота каждого из полученных препаратов оказалось достаточной для получения качественных моновалентных иммунохимических антисывороток.

Очищенные препараты использовали, в частности, для получения специфических антисывороток методом иммунизации кроликов.

Таблица 7. Анализ качества выделения HbP

Основные этапы выделения	Общий белок, мг/л	Кол-во продукта, мг|л	Целевой продукт, (%)	Степень очистки HbР	Выход HbР (%)
Исходный материал	165019±492,8	1851±64,9	1,12	1	100
Гомогенизация и экстрагирование	36113±378,5	961±85,3	2,66	2,38	51,89
Щелочное осаждение	5451±91,6	630±77,1	11,56	10,32	34,05
Ионообменная хроматография	1770±79,2	565±58,0	31,92	28,50	30,54

у=36,00. F = 6,1.

Таблица 8. Анализ качества выделения HbA₂

Основные этапы выделения	Общий белок, мг/л	Кол-во продукта, мг/л	Целевой продукт, (%)	Степень очистки HbA2	Выход HbA2 (%)
Исходный материал	221814±369,0	2951±155,8	1,33	1	100
Получение гемолизата	125603±294,5	2612±94,6	2,07	1,56	88,47
Препаративный электрофорез	26934±119,7	1931±89,7	7,17	5,39	65,42
Ионообменная хроматография	2361±128,6	834±39,6	35,32	26,564	28,26

у= 51,88. F =6,4.

Иммунохимическое сопоставление полученной антисыворотки на HbP с антигенными композитами (рис. 3) показало ее специфичность по отношению к экстракту тканей эмбриона и очищенному препарату HbP. Идентификация методом иммуноэлектрофореза с экстрактом тканей эмбриона (рис. 4) также регистрировала одну дугу в зоне подвижности гемоглобинов. Линии преципитации давали положительное окрашивание бензидиновым и гваяколовым методами. Параллельное титрование нативного экстракта эмбриональной ткани и того же препарата, подвергнутого щелочной денатурации, показало, что в обоих случаях тестируемая антисыворотка работала идентично до одинаковых разведений, что служило свидетельством специфичности, полученной антисыворотки к HbР.

Рис. 3. Контроль специфичности антисыворотки на HbP: 1 - антисыворотка на эмбриональный гемоглобин; 2 - антисыворотка на HbF; 3 - сыворотка крови кролика без антител на HbP; 4 - гемолизат пуповинной крови; 5 - очищенный препарат HbA2; 6 - экстракт тканей эмбриона 6-12 нед.; Э - очищенный препарат HbP; Sd - сыворотка крови взрослого донора; Г - гемолизат крови взрослого донора

Полученные антисыворотки на фетальный гемоглобин подвергались контролю качества по тому же алгоритму, что и антисыворотки на эмбриональный гемоглобин: ИДА, иммуноэлектрофорез, специфическое окрашивание и параллельное титрование нативного и подвергнутого щелочной денатурации препаратов HbF. По всем названным тестам показана полная моноспецифичность полученных антисывороток к HbF.

Рис. 4. Идентификация антисыворотки на HbР методом иммуноэлектрофореза: Sd - сыворотка крови взрослого донора; Эм - экстракт тканей эмбриона 6-12 нед.; 1 - полиспецифическая антисыворотка на белки плазмы донора; 2 - антисыворотка на HbР

Иммунохимический анализ антисывороток на гемоглобин A₂, как правило, выявлял дополнительную линию преципитации на HbA₁, которая исчезала после истощения антисыворотки, методом аффинной сорбциии с б-цепями гемоглобина (в авторской модификации). Контроль качества антисывороток на гемоглобины A₁ и A₂, проводимый методами иммунодиффузионного анализа, иммуноэлектрофореза и специфического окрашивания показал их полную специфичность.

В результате проведенной работы впервые разработана специфическая иммунохимическая тест-система на эмбриональный гемоглобин, в которой тест-антигеном является очищенный препарат HbР в рабочем разведении: 1/2 или экстракт тканей эмбриона (срок - 6-9 недель) в рабочем разведении 1/8-1/16. Порог чувствительности тест-системы 4,25±0,22 мг/л, (Р<0,01).

Смоделированы специфические иммунохимические тест-системы на: фетальный гемоглобин, в которой тест-антигеном является гемолизат пуповинной крови в рабочем разведении: 1/64-1/256, порог чувствительности 2,21±0,26 мг/л, (Р<0,005); гемоглобин А ₁, тест-антигеном является гемолизат крови взрослых доноров в рабочем разведении: 1/128-1/512, порог чувствительности 3,24±0,18 мг/л, (Р<0,01); гемоглобин А ₂, в которых тест-антигеном является очищенный препарат HbА ₂ в рабочем разведении: 1/32-1/64, порог чувствительности 4,42±0,19 мг/л, (Р<0,01).

Иммунохимические моновалентные антисыворотки были использованы для моделирования оптимальных способов индикации изучаемых типов гемоглобина.

Для количественного анализа фетального гемоглобина разработан способ ракетного электрофореза в агаровом геле в собственной модификации (патент №2310204. от 10.11.2007), основанный на полученных данных о повышении скорости электрофоретической миграции гемоглобинов, обработанных ДСН (рис. 5). Эмпирически подобраны оптимальные параметры проведения методики, построена стандартная калибровочная кривая.

Рис. 5. Определение HbF методом ракетного электрофореза: лунки 1-2 - образцы HbF, не обработанные ДСН; лунки 3-7 - образцы HbF, обработанные ДСН

Корреляционный анализ Пирсона показал высокую прямую линейную зависимость концентрации HbF в исследуемых образцах от квадрата диаметра кольца преципитации (r=0,96; P<0,001). Преимущества способа: селективность; упрощение способа; высокая чувствительность (порог чувствительности 1,7±0,29 мг/л); точность (максимальная погрешность ±2 %); достоверность определения, в том числе и при определении малых величин гемоглобина (Р<0,01; F=8,4); экономия временных трудозатрат (10-12 часов).

Предложен и успешно апробирован способ восходящей трехэтапной индикации HbP, включающий: РИД-тестирование в тест-системе с двойным наполнением лунки антисывороткой (порог чувствительности 2,13±0,19 мг/л); классическое РИД-тестирование (порог чувствительности 4,25±0,22 мг/л) и титрование в тест-системе в кратных разведениях антигена. В каждом последующем этапе тестировали только пробы, положительно прореагировавшие на предыдущем этапе.

Для определения HbP в материале с заведомо высокой концентрацией HbP разработан метод радиальной иммунодиффузии по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви. Сравнительный анализ качества предлагаемых методов определения эмбрионального гемоглобина (табл. 9) показал, что и полуколичесвенный анализ по Оухтерлони и количественный по Манчини, в равной степени, характеризуются высокой точностью, специфичностью, достоверностью и надежностью.

Таблица 9. Сравнительный анализ предлагаемых способов количественного определения HbP

Характеристика	Полуколичесвенный анализ по Оухтерлони	Количественный анализ по Манчини
Избирательность регистрации HbР	Специфичен	Специфичен
Чувствительность	Порог чувствительности 2,17±0,33 мг/л	Порог чувствительности 2,8±0,4 мг/л
Точность получаемых результатов	Максимальная погрешность ±2,7 %	Максимальная погрешность ±3,1 %
Достоверность определения	Достоверен, Р<0,01	Достоверен, Р<0,01
Время проведения	Около 12 часов	Около 36 часов

Разработаны и успешно апробированы способы количественного анализа HbА ₁ и HbA₂, основанные на методе радиальной иммунодиффузии по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви. Способы отличаются: специфичностью, чувствительностью (порог чувствительности от 2,1±0,32 до 2,9±0,41 мг/л; у=0,08); точностью (максимальная погрешность ±2,8 %); достоверностью определения, в том числе и при определении малых величин гемоглобина (Р<0,01; F=6,9); экономией трудозатрат за счет сокращения времени методики (не более 12 часов).

Создана новая комплексная схема количественной оценки гемоглобинового спектра по основным типам гемоглобина. Алгоритм предлагаемой схемы включает: определение общего Hb унифицированным гемоглобинцианидным методом; определение HbA₂, HbF и HbP (при необходимости) описанными методами иммунохимической индикации и определение уровня HbА ₁, как разности между количеством общего Hb и HbA₂, HbF, HbP.

Таблица 10. Показатели общего гемоглобина и его изоформ в исследуемой группе

Тип Hb	Методика определения	Концентрация (г/л)	у	% Hb
Общий Hb	Унифицированный гемоглобинцианидны метод	145,8±24,4	15,62	100
HbА 1	Радиальная иммунодиффузия по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви	137,5±19,7	13,09	94,3
HbA2	Радиальная иммунодиффузия по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви	3,07±0,12	0,10	2,1
HbF	Ракетный электрофорез в предлагаемой модификации	4,24±0,19	0,16	2,9

В рамках этой работы проведен сравнительный анализ HbА ₁ HbА ₂ и HbF описанными иммунохимическими способами, параллельно с определением общего Hb гемоглобинцианидным методом, в большой выборке доноров (табл. 10). Анализ показал, что средние значения концентрации HbА ₁ HbА ₂ и HbF, в пересчете на относительные единицы от общего Hb составляют 94,3 %, 2,1 % и 2,9 % соответственно.

Статистический анализ показал высокую положительную корреляцию между суммой концентраций HbА ₁, HbA₂ и HbF (в мг/л), определенных иммунохимически и концентрацией общего гемоглобина, определенной гемоглобинцианидным методом (r=0,98). Ошибка метода составляет 0,68 %.

Преимущества разработанной схемы: комплексность анализа по общему Hb и важнейшим его изоформам; специфичность; высокая чувствительность (порог чувствительности от 1,7±0,29 до 2,13±0,3 мг/л); точность (максимальная погрешность ±1,2 %); достоверность определения (р<0,001); экономия трудозатрат за счет исключения из общей схемы этапа иммунохимического определения HbА₁.

Разработанные на предыдущем этапе алгоритмы выявления HbF и HbP были успешно использованы для анализа продукции антенатальных типов гемоглобина (HbF и HbP) в раннем эмбриогенезе человека.

Настоящее исследование позволило иммунохимическим путем количественно определить динамику продукции HbР и HbF в раннем эмбриогенезе (рис. 6). Проведен полный анализ динамики концентраций HbР и HbF в доступном временном диапазоне гестационного возраста. Полученные данные являются достоверными и характеризуются малым разбросом и удовлетворительной дисперсией средних величин (F - от 5,6 до 6,3).

Иммунохимически определены сроки начала продукции антенатальных гемоглобинов: HbР - с 4-й недели ГВ, HbF - с 5-й недели. Показана высокая достоверная зависимость продукции антенатальных гемоглобинов от сроков гестации (в диапазоне с 4 по 12 неделю). Для эмбрионального гемоглобина эта корреляция является нелинейной отрицательной (r=-0,898); для фетального гемоглобина - положительной (r=0,936), т.е. динамика изменений количественных показателей HbР и HbF в эмбриогенезе носила разнонаправленный характер (r = -0,94).

В изучении клинико-диагностического значения иммунохимических тест-систем на гемоглобины типов А₁, А₂, F и P наибольшего внимания заслуживают результаты по трем нозологическим группам: миелоприлиферативные заболевания крови, патология новорожденных, сопровождающаяся хронической гипоксией и наркологическая патология. Данные по количественному анализу HbA₁ и HbA₂ во всех перечисленных группах заболеваний, не имели достоверных отличий от аналогичных репрезентативных показателей в группах здоровых лиц, следовательно, имели информативную ценность нулевой гипотезы. Сведения по антенатальным типам гемоглобина (HbF и HbP), напротив, отличались новизной и фундаментально-прикладной значимостью.

Рис. 6. Анализ концентраций эмбрионального и фетального типов гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека

При анализе гемоглобинового спектра в крови больных миелопролиферативными заболеваниями мы исходили из предположения, что названные формы патологии, связанные с понижением степени дифференцировки клеток миелоидного ростка (в т.ч. и эритроидных клеток) должны сопровождаться индукцией генов эмбриоспецифических белков, в частности, е-гена HbP и г-гена HbF.

Как и ожидалось, исходя из цитологической специфики данных опухолей эмбриональный гемоглобин не выявлен в контрольной группе и у больных острым и хроническим лимфолейкозом. Уровень фетального гемоглобина в крови больных острым и хроническим лимфолейкозами также не имел достоверных отклонений от такового в группе контроля (P>0,3).

Эмбриональный гемоглобин впервые выявлен в крови больных эритремией (частота выявления 67,78 %), сублейкемическим миелозом (49,41 %), острым (24,44 %) и хроническим миелолейкозом (и 20,53 %). Причем средние концентрации эмбрионального гемоглобина в выборках с положительным результатом были близки к порогу чувствительности разработанной тест-системы на HbP в классическом РИД-тестировании (4,25±0,22 мг/л). Средняя концентрация HbP у больных эритремией составила 4,07±0,23 мг/л; сублейкемическим миелозом - 3,89±0,25 мг/л; острым миелолейкозом - 3,71±0,20 мг/л; хроническим миелолейкозом - 3,27±0,19 мг/л. Математический анализ полученных результатов показал их статистическую значимость (Р<0,005; t>4,95; F>5,2) (рис. 7).

Отмечено значительное достоверное (t>4,66; Р<0,005) повышение концентарции фетального гемоглобина в крови больных эритремией (на 78,8 % выше референтных значений), сублейкемическим миелозом (на 42,7 %), острым (на 58,06 %) и хроническим (на 70,20 %) миелолейкозом.

Для максимальной верификации полученных результатов по HbF, в тех же выборках было проведено их конвертирование в относительные величины: процент от общего гемоглобина в каждой нозологической группе. Полученные данные (в %), в целом адекватно соотносились с результатами иммунохимического тестирования HbF (в мг/л) (рис. 8).

Рис. 7. Частота выявления HbP при некоторых гемобластозах

Рис. 8. Относительные величины HbF (в %) от общего Hb при миелопролиферативных заболеваниях

Полученные результаты свидетельствуют, что эмбриональный и фетальный гемоглобины могут рассматриваться как канцероэмбриональные антигены, иммунохомическая регистрация которых может повысить качество диагностики миелопролиферативных заболеваний. Следует отметить, что в силу дешевизны, простоты и доступности (для проведения тестов на HbP и HbF по предложенной схеме достаточно 0,1 мл крови из пальца), разработанные иммунохимические тесты на HbP и HbF могут применяться в скрининг-обследовании групп риска по данной нозологии.

Проведен широкий иммунохимический анализ гемоглобинового спектра у новорожденных с внутриутробной гипоксией и сопутствующей патологией (табл. 11). Показано значительное достоверное (t=5,52; Р<0,002; F>4,8) повышение уровня HbF в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией (на 30,08 % выше, чем в группе контроля), и, особенно, с задержкой внутриутробного развития в сочетании с тяжелой внутриутробной гипоксией (на 68,46 %). Концентрация HbF в крови новорожденных с массой тела менее 1000 г, наоборот, оказалась на 58,25 % ниже, чем в контрольной группе (t=7,3; Р<0,001; F=9,2).

Таблица 11. Результаты количественного определения HbF у новорожденных по клиническому диагнозу

Исследуемые группы	n	Концентрация HbF (мг/л)	Стандартное отклонение (у)
Здоровые дети (контрольная группа)	62	1096,7±64,1	45,3
Дети с тяжелой внутриутробной гипоксией	52	1426,6±73,5	52,1
Дети с тяжелой ВГ и задержкой внутриутробного развития	43	1847,7±98,2	69,7
Дети с тяжелой ВГ и глубокой недоношенностью (масса тела не более 1000 г.)	39	458,1±32,0	23,8
Всего	196

у по генеральной совокупности 4,95. F = 6,8.

Сравнительный иммунохимический анализ HbF у новорожденных по половому признаку впервые показал, что уровень фетального гемоглобина в крови новорожденных девочек достоверно (t=4,8; Р=0,001; F=7,1) превышает таковой у новорожденных мальчиков (рис. 9). И если в группе здоровых детей эта разница невелика, то в группе новорожденных с внутриутробной гипоксией уровень HbF в крови новорожденных девочек значительно выше, чем у мальчиков (t=7,2; Р<0,0005; F=6,7).

HbP не выявлялся иммунохимически в крови здоровых новорожденных и в крови новорожденных с различными формами внутриутробной гипоксии легкой и средней степени тяжести.

Рис. 9. Сравнительный анализ концентрации HbF в крови здоровых новорожденных мальчиков и девочек (левый рисунок) и новорожденных с внутриутробной гипоксией (правый рисунок)

Эмбриональный гемоглобин впервые выявлен в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией (33,82 % от общей выборки). Показано, что в крови новорожденных девочек с тяжелой степенью ВГ HbP выявлялся в два раза чаще (табл. 12), чем у новорожденных мальчиков с той же патологией (42,76 % и 23,85 % соответственно). Анализ статистической значимости полученных результатов показал высокую степень достоверности как по нозологическому (Р=0,001; F=8,6), так и по половому признаку (Р=0,003; F=6,4).

Определение концентрации HbP (полуколичественный анализ) проводилось только у пациентов с положительным тестом на этот белок. Средняя концентрация эмбрионального гемоглобина в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией с позитивной индикацией составила 3,81±0,21 мг/л; среди них, у девочек - 3,96±0,24 мг/л; у мальчиков - 3,65±0,18 мг/л.

Таблица 12. Частота выявления HbP у новорожденных с внутриутробной гипоксией тяжелой степени

Пол	Число обследованных	Среднее число положительных тестов на HbP	Частота выявления (в %)
Мальчики	26	6,2	23,85
Девочки	29	12,4	42,76
Всего	55	18,6	33,82

Повышение уровня HbF и появление HbP при гипоксии, очевидно, объясняется тем, что эти протеины имеет бульшее сродство к кислороду, чем гемоглобин взрослого, следовательно, увеличение уровня антенатальных гемоглобинов в крови способствует более оптимальному тканевому газообмену в условиях тканевой гипоксии. Значительный разброс средних концентраций HbF и частоты выявления HbP в крови новорожденных мальчиков и девочек с внутриутробной гипоксией можно объяснить более высокими компенсаторными возможностями женского организма в этом онтогенетическом периоде.

Иммунохимический анализ гемоглобинового спектра у наркологических больных с алкогольной зависимостью и опийной наркоманией дал ценные сведения по HbF. Впервые показно значительное превышение концентрации фетального гемоглобина в крови больных алкогольной зависимостью и опийной наркоманией почти в три раза, по сравнению с уровнем концентрации HbF в крови доноров контрольной группы (табл. 13). Анализ статистической значимости полученных результатов показал высокую степень достоверности как в группе больных опийной наркоманией (t=7,21; Р<0,001), так и в группе больных алкоголизмом (t=6,38; Р<0,001).

Таблица 13. Результаты количественного определения HbF в крови наркологических больных и здоровых доноров

Исследуемая группа	n	Концентрация HbF (мг/л)	Стандартное отклонение (у)	Процент HbF от общего Hb
Кровь больных алкоголизмом	44	1631±83	68,69	3,76
Кровь больных опийной ...

Подобные документы

• Полярография. Сущность метода. Применение в медико-биологических исследованиях

  Классификация физических и физико-химических методов количественного анализа, схема полярографической установки, прямая полярография и количественный анализ. Определение цинка в растворе методом стандарта и исследование реакций комплексообразования.
  
  реферат [174,2 K], добавлен 30.04.2012
  

• Химические методы анализа

  Понятие и назначение химических методов анализа проб, порядок их проведения и оценка эффективности. Классификация и разновидности данных методов, типы проводимых химических реакций. Прогнозирование и расчет физико-химических свойств разных материалов.
  
  лекция [20,3 K], добавлен 08.05.2010
  

• Медико-биологическое значение s, p, d элементов

  Знакомство с основными химическими элементами, представленными в периодической системе Д. Менделеева. Рассмотрение классификации биогенных элементов. Микроэлементы как биологически активные атомы центров ферментов. Характеристика свойств s-элементов.
  
  презентация [4,5 M], добавлен 00.00.0000
  

• Физико-химические методы анализа, их классификация и основные приёмы

  Использование в физико-химических методах анализа зависимости физических свойств веществ от их химического состава. Инструментальные методы анализа (физические) с использование приборов. Химический (классический) анализ (титриметрия и гравиметрия).
  
  реферат [28,7 K], добавлен 24.01.2009
  

• Расчет физико-химических свойств полимеров

  Получение, применение и свойства полиакрилонитрила. Расчет Ван-дер-ваальсовых объемов полимера, показатель преломления. Плотность энергии когезии и параметр растворимости Гильдебранда. Расчет физико-химических свойств замещенного полиакрилонитрила.
  
  курсовая работа [2,4 M], добавлен 12.01.2013
  

• Физико-химические методы анализа

  Классификация физико-химических методов анализа веществ и их краткая характеристика, определение эквивалентной точки титрования, изучение соотношений между составом и свойствами исследуемых систем. Метод низкочастотного кондуктометрического титрования.
  
  учебное пособие [845,9 K], добавлен 04.05.2010
  

• Получение, свойства и применение амидо-аммониевой соли малеопимаровой кислоты на основе малеинизированной канифоли

  Канифоль: химический состав и свойства различных ее видов. Получение и исследование физико-химических свойств синтезированных образцов солей. Оптимизация процесса получения амидо-аммониевой соли малеопимаровой кислоты на основе малеинизированной канифоли.
  
  курсовая работа [1,7 M], добавлен 19.11.2010
  

• Методы качественного и количественного анализа. Методика определения катиона Сu2+

  Рассмотрение пособов разделения смесей. Изучение особенностей качественного и количественного анализа. Описание выявления катиона Сu2+. Проведение анализа свойств веществ в предлагаемой смеси, выявление метода очистки и обнаружение предложенного катиона.
  
  курсовая работа [87,8 K], добавлен 01.03.2015
  

• Современные направления развития композитов на основе полимеров

  Общая характеристика современных направлений развития композитов на основе полимеров. Сущность и значение армирования полимеров. Особенности получения и свойства полимерных композиционных материалов. Анализ физико-химических аспектов упрочнения полимеров.
  
  реферат [28,1 K], добавлен 27.05.2010
  

• Медико-биологическое значение s, p, d-элементов

  Классификация химических элементов, их положение в периодической системе. Отличия элементов по степени заполнения различных электронных орбиталей (s, p, d, f) электронами. Биологическая роль исследуемых элементов и применение их соединений в медицине.
  
  презентация [355,5 K], добавлен 01.10.2014
  

• Производство хлорбензола

  Исследование основных физико-химических свойств сырья и готовой продукции, каталитического и окислительного процесса хлорирования, алкилирования и гидрирования бензола. Характеристика взаимодействия бензола с хлором, спиртами и неорганическими кислотами.
  
  курсовая работа [97,5 K], добавлен 24.10.2011
  

• Бром и его биологическое значение

  Характеристика свойств брома как химического элемента. История его открытия, уникальность воздействия этого металла на протекание биологических процессов в организме. Последствия недостатка брома в организме, его содержание в некоторых продуктах.
  
  презентация [321,0 K], добавлен 20.12.2012
  

• Кинетическое и термодинамическое исследование физико-химических процессов

  Кинетические методы анализа. Методы измерения скорости реакции. Термодинамический вывод диаграммы состояния. Термодинамический вывод диаграммы состояния системы с простой эвтектикой.
  
  курсовая работа [53,2 K], добавлен 04.01.2004
  

• Исследование физико-химических и прикладных свойств новых полимерных композиционных материалов на основе слоистых силикатов и полиэлектролитов

  Хемосорбционное модифицирование минералов. Свойства глинистых пород. Методика модификации бентонитовой глины месторождения "Герпегеж". Физико-химические способы исследования синтезированных соединений. Определение сорбционных характеристик бентонина.
  
  курсовая работа [9,2 M], добавлен 27.10.2010
  

• Физико-химические методы анализа веществ

  Необходимость идентификации вещества и измерение количественной оценки его содержания. Качественный анализ для химической идентификации атомов, молекул, простых или сложных веществ и фаз гетерогенной системы. Классификация методов количественного анализа.
  
  лекция [76,4 K], добавлен 16.01.2011
  

• Контрольный синтез Mg(NO3)2 – MgO – MgCl2

  Цепочка химического синтеза Mg(NO3)2-MgO-MgCl2. Физико-химические характеристики веществ, участвующих в химических реакциях при синтезе MgCl2 из Mg(NO3)2, их химические свойства и методы качественного и количественного анализа соединений магния.
  
  практическая работа [81,6 K], добавлен 22.05.2008
  

• Методы анализа аскорбиновой кислоты в растворе для инъекций и методы их валидации

  Анализ состояния методов стандартизации и контроля качества лекарственных свойств кислоты аскорбиновой; зарубежные фармакопеи. Выбор валидационной оценки методик установления подлинности и количественного определения кислоты аскорбиновой в растворе.
  
  дипломная работа [1,4 M], добавлен 23.07.2014
  

• Характеристика полиолефинов

  Структурная особенность полиолефинов. Сравнительная химическая стойкость полиолефинов в различных агрессивных середах. Изучение химических, физических, термических, механических, электрических свойств полиолефинов. Характеристика и структура полибутилена.
  
  курсовая работа [741,6 K], добавлен 14.01.2012
  

• Медико-биологическое значение соединений селена

  Биологическая роль химических элементов в организме. Открытие селена, распространенность и нахождение в природе. Суточная потребность в селене, его пищевые источники. Дефицит селена и связанные с ним заболевания. Коррекция дисбаланса селена в организме.
  
  реферат [113,6 K], добавлен 10.12.2013
  

• Исследование физико-химических и прикладных свойств новых полимерных композиционных материалов на основе слоистых силикатов и полиэлектролитов

  Закономерности трансформации состава, свойств бентонита в процессе модифицирования. Исследование сорбционной активности природных и модифицированных форм бентонита. Определение закономерностей модифицирования бентонита Кабардино-Балкарского месторождения.
  
  магистерская работа [9,2 M], добавлен 30.07.2010
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам