Кинетика ферментативного гидролиза полипептидов и гидрофобные эффекты

Изучение химических закономерностей ферментативного гидролиза полимерных субстратов на примере протеолитических реакций. Исследование гидратационных эффектов в водных аминокислотно-пептидных растворах и коллоидных системах. Свойства белковых гидролизатов.

Рубрика Химия
Вид автореферат
Язык русский
Дата добавления 27.02.2018
Размер файла 647,9 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

32

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ПОЛИПЕПТИДОВ И ГИДРОФОБНЫЕ ЭФФЕКТЫ

Воробьев Михаил Михайлович

Москва-2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН.

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН,

доктор химических наук,

профессор

Варфоломеев Сергей Дмитриевич

доктор химических наук,

профессор

Ямсков Игорь Александрович

доктор биологических наук,

профессор

Валуева Татьяна Александровна

Ведущая организация: Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «____» ___________________2009 г. в _______ на заседании диссертационного совета Д 002.039.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.Э. Эмануэля РАН по адресу: 118334, г. Москва, ул. Косыгина, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН.

Автореферат разослан «____» ___________________2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

Кандидат химических наук М.А. Смотряева

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время методы физической химии все шире применяются к комплексным объектам природного происхождения и сложным биохимическим процессам. Один из таких процессов - ферментативный гидролиз полимерных цепей полипептидов и белков (протеолиз) лежит в основе ряда биологических явлений, проявляющихся в широком диапазоне степени гидролиза пептидных связей от ограниченного протеолиза при активации ферментов до глубокого гидролиза при пищеварении. Протеолизу принадлежит важная роль в процессах модификации пищевых белков и производстве белковых гидролизатов в пищевой промышленности. Получение биологически-активных пептидов протеолизом из неактивных белковых предшественников является перспективным методом получения биопептидов. Создание общей физико-химической модели протеолиза, включающей кинетическое описание процессов межцепочечных взаимодействий, приводящих к маскированию/демаскированию пептидных связей, и количественному выражению фермент-субстратного узнавания (специфичности) в отношении полимерного субстрата, является, таким образом, важнейшей задачей.

Гидрофобные явления играют ключевую роль в живой природе и в модельных полимерных водных системах, определяя гидрофобный коллапс полипептидных цепей в белках и переходы клубок-глобула в синтетических белковоподобных полимерах. Актуальной задачей является разработка методов анализа многокомпонентных водных смесей пептидов - в первую очередь с точки зрения количественного выражения гидрофобности пептидов и их склонности к гидрофобным взаимодействиям. Представляется перспективным определять параметры гидрофобности по упорядочению воды в гидратных оболочках неполярных групп, определяемому по поглощению электромагнитного излучения в миллиметровой части спектра.

Описание кинетики превращений смесей пептидных фрагментов требует компьютерного моделирования, которое должно учесть весь объем информации и представить результаты в форме, удобной для экспериментальной проверки. Понимание физико-химических закономерностей сложных процессов, таких как протеолиз, невозможно без создания компьютерных программ и комплексного экспериментального и теоретического подхода.

Все это делает исследование кинетики гидролиза полипептидов, компьютерное моделирование протеолиза и количественное изучение гидратации весьма актуальным.

Целью работы является изучение физико-химических закономерностей ферментативного гидролиза полимерных субстратов на примере протеолитических реакций, а также изучение гидратационных эффектов в водных аминокислотно-пептидных растворах и коллоидных системах.

В рамках этого в диссертации решались следующие задачи:

1. Разработать аналитические методы и подходы, позволяющие определять константы скорости гидролиза пептидных субстратов протеолитическими ферментами в кинетических экспериментах, анализирующих как суммарную кинетику гидролиза пептидных связей, так и индивидуальную кинетику изменения концентраций пептидов по данным разделительных методов (обращеннофазная ЖХВД, количественный электрофорез, аминокислотный анализ).

2. Разработать пакет компьютерных программ, позволяющих предсказывать кинетику протеолиза для пептидных цепей, имеющих произвольную аминокислотную последовательность, с базой данных кинетических параметров для ряда протеолитических ферментов.

3. Разработать количественный метод определения гидратации методом миллиметровой (микроволновой) спектроскопии, позволяющий изучать состояние воды в гидратных оболочках пептидов в различных водных системах и процессах, включая водные растворы глобулярных белков, протеолиз, взаимодействие полипептидов с казеиновыми мицеллами. Показать перспективность количественного изучения гидратации для определения шкал гидрофобности аминокислот, оценки стабильности полипептидных мицелл, оценки конформаций синтетических белковоподобных сополимеров.

Научная новизна работы заключается в следующем:

1. Впервые предложена общая физико-химическая модель протеолиза, позволяющая анализировать кинетику во всем диапазоне изменения степени гидролиза пептидных связей с помощью одних и тех же уравнений. Показано, что кинетика протеолиза в общем случае соответствует двухстадийной схеме, где первая кинетически значимая стадия представляет демаскирование пептидных связей, а вторая - гидролиз.

2. С использованием ЖХВД на обращенной фазе получены экспериментальные данные по константам скоростей гидролиза различных пептидных связей ?-казеина трипсином дикого типа и мутированными формами трипсина.

3. Впервые предложен механизм демаскирования гидрофобного С-концевого участка при гидролизе ?-казеина трипсином дикого типа и мутированными трипсинами.

4. Изучена суммарная кинетика гидролиза химотрипсином пептидных связей по поглощению N-тринитрофенильных производных образующихся аминогрупп. Впервые показано, что немонотонные участки нарастания аминного азота в ходе гидролиза связаны с маскированностью пептидных связей.

5. Изучена кинетика гидролиза панкреатином пептидов в реакторе открытого типа с удалением низкомолекулярных продуктов гидролиза. Экспериментально определены константы скорости выхода отдельных аминокислотных остатков в составе низкомолекулярных фракций.

6. Показано, что кинетика убывания исходной полипептидной цепи соответствует кинетике 1-го порядка. Получена оценка для отношения констант демаскирования и гидролиза глобулярных белков молока.

7. Впервые создана компьютерная программа PROTEOLYSIS, осуществляющая численное интегрирование дифференциальных уравнений, которые описывают демаскирование и гидролиз пептидных связей. Программа позволяет удовлетворительно предсказывать кинетику протеолиза с различными параметрами специфичности и маскированности, а также состав продуктов протеолиза (состав гидролизатов), полученных при различных кинетических условиях.

8. Разработан метод определения параметров гидратации с использованием миллиметровой (микроволновой) спектроскопии. Метод имеет различную чувствительность к гидрофобной и гидрофильной типам гидратации, что впервые позволило использовать его для построения шкалы гидрофобности аминокислот и оценки количества неполярных групп, участвующих в гидрофобной гидратации или исключенных за счет гидрофобного взаимодействия. Метод позволяет определять кинетику развертывания белковой глобулы в ходе протеолиза.

9. Миллиметровая спектроскопия наряду с реологическими методами позволяет контролировать взаимодействие пептидов с казеиновыми мицеллами, в частности определять концентрации пептидов, при которых имеет место увеличение стабильности мицелл.

10. С помощью миллиметровой спектроскопии впервые показано, что гидрофобная модификация синтетических полимеров, не являющихся термочувствительными, приводит к меньшему изменению гидратации по сравнению с переходом клубок - глобула в термочувствительных полимерах.

Практическая значимость.

Кинетические параметры представлены в работе для таких практически важных протеаз как трипсин, химотрипсин, и пепсин при протеолизе белковых субстратов, выделенных из молока. Представленная общая методология анализа кинетики протеолиза дает возможность применить наработанные методы к другим белковым субстратам и протеазам, представляющим практический интерес. В работе рассмотрено применение модельных представлений для анализа кинетики образования низкомолекулярных продуктов протеолиза в реакторе открытого типа, моделирующего in vitro панкреатическую стадию пищеварения. Эта часть работы имеет практическое значение для количественных оценок пищевой ценности белков.

Детальное изложение принципов построения программы PROTEOLYSIS может быть полезным при разработке других компьютерных программ, моделирующих сложные биохимические процессы. Применение компьютерного моделирования протеолиза может быть использовано для предсказания оптимальных кинетических условий получения белковых гидролизатов.

Использование метода количественного определения гидратации с помощью миллиметровой спектроскопии открывает новые аналитические возможности при исследовании различных амфифильных систем (белковых и полимерных). Количественные измерения гидратации позволяют контролировать гидролиз пищевых белков и образование казеиновых гелей, что может быть использовано в пищевой промышленности.

Защищаемые положения.

1. Расщепление пептидных связей в полипептидах происходит в две стадии: на первой осуществляется физический процесс конформационной перестройки пептидной цепи (демаскирование); на второй происходит собственно химический процесс - гидролиз пептидных связей.

2. Стадия демаскрования дает немонотонные участки увеличения аминного азота в ходе гидролиза и обеспечивает наличие кинетики накопления некоторых пептидов с лагом.

3. Отношение констант скоростей демаскирования и гидролиза является важным параметром при количественном описании протеолиза.

4. Компьютерное моделирование протеолиза дает возможность предсказывать состав (главные компоненты) гидролизатов для различных гипотетических механизмов протеолиза.

5. Количество связанной воды растет с увеличением доступной для воды поверхности молекул, в частности, в начальной стадии протеолизе.

6. Метод миллиметровой (микроволновой) спектроскопии имеет различную чувствительность к гидрофобной и гидрофильной типам гидратации.

7. Взаимодействие пептидов в небольшой концентрации с казеиновыми мицеллами приводит к увеличению стабильности мицелл, что определяется реологически и по изменению гидратации.

8. Гидратационные измерения позволяют дифференцировать конформационные состояния клубка и глобулы для синтетических белковоподобных полимеров.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в формировании направления исследований, разработке зкспериментальных и теоретических подходов, проведении исследований и обобщении полученных результатов.

Апробация работы.

Результаты работы докладывались и обсуждались на Международном симпозиуме по компьютерным вычислениям в химических исследованиях (Москва, Россия, 1996 г.); на V Симпозиуме по пищевым белкам (Потсдам, Германия, 1997 г.); на XIII Конференции Европейского коллоидного и поверхностного общества (Дублин, Ирландия, 1999 г.); на IX Симпозиуме по пищевым коллоидным системам, биополимерам и материалам (Вагенинген, Голландия, 2002 г.); на VIII (Хельсинки, Финляндия, 1998 г.), IX (Зихрон Яков, Израиль, 2000 г.) Международных симпозиумах по свойствам воды; на Европейском полимерном конгрессе (Москва, Россия, 2005); на XII Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Бобини, Франция, 2007 г.); на XXIX Европейском конгрессе по спектроскопии молекул (Опатия, Хорватия, 2008 г.); на семинаре в научно-исследовательском центре фирмы «Нестле» (Лозанна, Швейцария, 1996 г.), на семинаре в Немецком федеральном центре по исследованиям в молочной промышленности (Киль, Германия, 1994 г.); на семинарах в Университете Лаваля (Квебек, Канада, 1992), Университетского колледжа Дублина (Дублин, Ирландия, 2002); на семинарах лаборатории физической химии полимеров ИНЭОС РАН.

Работа была выполнена при поддержке ряда проектов РФФИ, в том числе под руководством диссертанта: 98-03-32230 (Количественное изучение гидратации амфифильных молекул) и 07-03-00131 (Количественное изучение гидратации ферментоподобных сополимеров с цвиттерионными группировками).

Публикации. Материалы диссертации изложены в 24 статьях, а также в 7 тезисах, указанных выше конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения и выводов, а также списка цитируемой литературы из 291 наименования. Объем диссертации 273 страницы, включая 62 рисунка и 27 таблиц.

2. Краткое содержание диссертации

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и задачи работы, приведены основные положения, выносимые на защиту, обсуждены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе рассмотрены литературные данные по кинетике ферментативного гидролиза полипептидов и белков, а также по экспериментальным методам определения гидратации и количественного выражения гидрофобных эффектов. Анализируются физико-химические предпосылки количественного описания гидролиза полипептидов с использованием методов химической кинетики.

Обосновано приближение, согласно которому эффективную константу скорости расщепления j-ой связи (индекс j обозначает различный тип гидролизуемых пептидных связей, СО группа которых входят в аминокислотный остаток -NHCH(Rj)CO-) можно представить в виде:

, (1)

где kj - константа гидролиза демаскированной связи j, определяемая аминокислотными остатками, расположенными около гидролизуемой связи и взаимодействующими с активным центром фермента, Pdj -вероятность того, что j-я связь демаскирована, т.е. доступна действию фермента. Pdj - определяется гидролизом других связей (не j -ой).

Проанализированы публикации по экспериментальному определению параметров гидрофобности (или в более широком смысле - гидратации) для аминокислот, пептидов и белков. Рассмотрены предпосылки разработки метода определения гидратации с помощью миллиметровой спектроскопии. Рассмотрены гидрофобные эффекты с участием пептидов, в частности гидрофобный коллапс небольших белков и пептидов, который имеет значение для протеолиза.

Во второй главе описываются наши экспериментальные результаты по кинетике гидролиза различных полимерных пептидных субстратов различными протеолитическими ферментами в закрытых и открытых реакторах при изучении суммарной кинетики гидролиза пептидных связей и индивидуальной кинетики для отдельных компонентов.

Ферментативный гидролиз пептидных связей R1-CONH-R2 + H2O R1COOH + NH2R2 был рассмотрен на примере ряда субстратов с различными аминокислотными последовательностями. Субстратами являлись природные полипептиды и белки, состоящие из природных аминокислотных остатков (таблица 1). Нас интересовали такие общие кинетические закономерности, которые бы не зависели от конкретного расположения аминокислотных остатков в последовательности, а были бы справедливы для любого полипептидного субстрата. В таблице 1 приведены значения гидрофобности аминокислот, полученные методом миллиметровой спектроскопии. Особенное внимание к гидрофобности обусловлено тем, что кластеры гидрофобных аминокислотных остатков могут обеспечивать маскирование пептидных связей, и таким образом замедлять протеолиз.

В разделе 2.1 приводятся экспериментальные данные по кинетике гидролиза ?-казеина трипсином дикого типа и мутированными трипсинами. Интерес к продуктам протеолиза ?-казеина, например, пептидам, образующимся из гидрофобного С-конца цепи, обусловлен их физиологической активностью, в частности, способностью ингибировать ангиотензин-превращающий фермент (АПФ).

?-Казеин (вариант А1) в соответствующем буфере (pH от 7 до 10) был подвергнут гидролизу трипсином дикого типа или мутированными ферментами K188H, K188F, K188Y, K188W или K188D/D189K при 37оС. Отношения фермент/субстрат были 0.005, 0.005, 0.01, 0.02, 0.02 и 0.01 (в/в) для трипсина дикого типа и мутированных ферментов K188H, K188F, K188Y, K188W, K188D/D189K, соответственно. Пробы отбирались через 30 мин, 1, 2, 4, 8, 24 и 48 ч после начала реакции, затем закислялись чтобы остановить реакцию. Образующиеся в ходе протеолиза пептиды анализировались ЖХВД на обращенной фазе. Были обнаружены кинетические кривые двух сортов: при гидролизе доступных пептидных связей получаются кривые, описываемые простыми экспоненциальными функциями. Для маскированных пептидных связей получаются кривые другого вида, - наблюдается кинетика с временной задержкой.

Таблица 1. Боковые радикалы и числа гидратации ?-аминокислот (H3N+CHRCOO-).

Аминокислота

Боковой радикал R

Gly

H

-1.3

Ala

Me

1.9

Val

CH(Me)2

6.2

Leu

CH2CH(Me)2

7.4

Ile

CH(Me)Et

8.2

Asp

CH2COOH

1.4

Ser

CH2OH

0.8

Trp

7.1

Phe

CH2Ph

6.5

Asn

CH2CONH2

0.8

Arg

(CH2)3NHC(=NH)NH2

2.5

His

1.9

Gln

CH2CH2CONH2

1.9

Glu

CH2CH2COOH

1.4

Lys

(CH2)4NH2

3.4

Met

CH2CH2SMe

3.9

Proб

2.2

Thr

CH(OH)CH3

2.2

Tyr

CH2C6H4OH-p

5.4

a Числа гидратации цвиттерионов аминокислот определены методом миллиметровой спектроскопии.

б Приведена формула для всей аминокислоты.

Пример хроматограммы трипсинового гидролизата ?-казеина представлен на рис. 1. В финальных гидролизатах были найдены следующие 12 моноблочных пептидов: A (Arg1-Arg25), B (Ile26-Lys28), C (Lys29-Lys32), D (Phe33-Lys48), E (Ile49-Lys97), F (Glu100-Lys105), H (Glu108-Lys113), I (Tyr114-Lys169), J (Val 170-Lys176), K (Ala177-Arg183), L (Asp184-Arg202), N (Gly203-Val209); четырех диблочных пептида: D-E (Phe33-Lys97), G-H (His106-Lys113), Val-Lys-F (Val98-Lys105), L-N (Asp184-Val209) и один триблочный пептид G-H-I (His106-Lys169). Образование пептидов A и L-N определяется гидролизом связей Arg-X (Arg25-Ile26 и Arg183-Asp184). Образование пептидов D, E, H, C, F, I, J определяется гидролизом связей Lys-X.

Рис. 1. Обращеннофазная ЖХВД трипсинового гидролизата ?-казеина. Расположение образующихся пептидов в аминокислотной последовательности ?-казеина показано латинскими буквами. Пептиды были разделены на колонке Nucleosil C18 (4.6 mm x 25 cm, SFCC, France) c линейным градиентом растворителя А (0.11% трифторуксусной кислоты ) к 100% растворителя B (60% ацетонитрил, 40% H2O, 0.09% трифторуксусной кислоты) за 62.5 мин.

При мутациях 188 остаток лизина, находящийся вне активного центра трипсина, менялся на другой остаток (например, Phe в мутированном ферменте K188F). Поэтому первичная специфичность трипсина сохранялась, - гидролизовались связи, образованные аргинином и лизином. Отношение констант скоростей гидролиза второго порядка для субстратов, содержащих остатки Arg и Lys в позиции P1, отражают первичную специфичность фермента. Эти отношения представлены в таблице 2 для гидролиза доступных связей ?-казеина в сравнении с синтетическими амидными субстратами.

Таблица 2. Преимущество скоростей гидролиза субстратов, содержащих остаток Arg, над субстратами, содержащими остаток Lys.

Фермент

pH

Субстрат

п-нитроанилид тетрапептидаа

пептиды из ?-казеинаб

трипсин

7

22

7.4

дикого

8

7.0

8.0

типа

9

4.2

5.1

10

4.3

3.7

K188H

7

-

1.3

8

8.7

1.5

9

-

1.4

10

-

3.8

K188F

7

8.7

1.1

8

8.2

1.2

9

6.3

1.2

10

6.0

0.7

K188Y

7

10

7.3

8

5.2

14

9

7.7

11

10

8.8

10

K188W

7

8.8

4.3

8

10

13

9

15

11

10

-

-

K188D/D189K

7

-

12

8

22.5

13

9

-

11

10

-

6.6

a Субстрат: Suc-Ala-Ala-Pro-X-pNA (X=Arg, Lys).

бkLys(max) является средней константой скорости гидролиза связей Lys28-Lys29, Lys32-Phe33, Lys99-Glu100, Lys105-His106, Lys113-Tyr114, Lys169-Val170, Lys176-Ala177.

В случае синтетических субстратов для всех изученных мутированных трипсинов было найдено существенное преимущество гидролиза субстратов, содержащих остаток Arg, над субстратами, содержащими остаток Lys. Для ?-казеина такого преимущества не было найдено для ферментов K188H и K188F. По-видимому, изменение аминокислотного остатка вне активного центра может приводить к изменениям специфичности в рамках первичной специфичности за счет дополнительного связывания фермента с длинными пептидными субстратами.

Накопление пептида Gly203-Val209 (пептид N) при гидролизе связи Arg202-Gly203, происходит с временной задержкой (кинетика с лагом). Существенно, что это наблюдается для всех мутированных ферментов и трипсина дикого типа. Таким образом, мы приходим к необходимости привлечения понятия маскированности, определяющейся строением субстрата вне зависимости от специфичности фермента.

Рис. 2 показывает принципиально различную кинетику накопления N-, C-концевых пептидов, образующихся соответственно из гидрофильного и гидрофобного конца полипептидной цепи ?-казеина. Согласно данным миллиметровой спектроскопии средняя гидрофобность участков цепи ?-казеина составляет 2.96 (участок 1-46), 3.53 (участок 44-92), 3.13 (участок 93-135), 3.61 (участок 136-178), 3.06 (участок 179-189) и 4.20 (участок 190-209). Приведены средние числа гидратации для смесей аминокислот, эквивалентных по аминокислотному составу соответствующим участкам цепи. Гидрофобные участки 44-92, 136-178 и 190-209 могут взаимодействовать, образуя гидрофобный кластер. Гидролиз связи Lys-X (например, Lys105-His106) или связи Arg183-Asp184 может приводить к разрыву полипептидной цепи, связывающей один из этих гидрофобных участков с остальными. В результате следует ожидать увеличения конформационной подвижности и запуска механизма демаскирования пептидной связи Arg202-Gly203.

Образование С-концевого пептида было описано нами двухстадийной схемой. На первой стадии изначально недоступные для ферментативной атаки маскированные пептидные связи Bm превращаются в демаскированные связи Bd. На второй стадии эти связи гидролизуются в соответствии со специфичностью, определяемой аминокислотной последовательностью:

(Схема 1)

где kd - константа скорости демаскирования, kh - константа скорости гидролиза демаскированных связей, N - аминный азот.

Согласно схеме 1, время задержки ? при гидролизе связи Arg202 равно:

(2)

где kd и kh - константы скоростей демаскирования и гидролиза связи Arg202.

Рис.2. Гидрофобный кластер, маскирующий С-концевой фрагмент полипептидной цепи ?-казеина. Образование доступного для фермента N-концевого пептида описывается простым уравнением A(t)=A0(1-e-kt). Образование С-концевого пептида Gly203-Val209 (пептид N) происходит по схеме 1, где пептидная связь Arg202-Gly203 является изначально недоступной (маскированной).

Эта формула была использована для вычисления констант скорости демаскирования по измеренным временам ? для трипсина дикого типа и мутированных ферментов.

Нами предложено использовать отношение констант скоростей гидролиза и демаскирования для выявления той пептидной связи в расщепляемой полипептидной цепи, гидролиз которой запускает демаскирование (таблица 3). Для такой связи константа скорости гидролиза должна быть близка к константе демаскирования. Как показывает таблица 3, гидролиз одной из связей Lys-X может запустить процесс демаскирования для всех ферментов кроме K188F. Для K188F лимитирующей стадией может быть гидролиз связи Arg183-Asp184.

Из приведенных в разделе 2.1 кинетических данных следуют следующие отношения констант скоростей демаскирования и гидролиза (kd/kh) для пептидной связи Gly203-Val209: 11.5 (трипсин дикого типа); 20.5 (K188H); 3.8 (K188F); 9.5 (K188Y) и 10.5 (K188D/D189K). То есть, для гидрофобного C конца ?-казеина параметр демаскирования в среднем равен 10, в то время как для демаскированных пептидных связей kd/kh>>1.

Таблица 3. Отношение константы скорости гидролиза к константе скорости демаскирования kd.

Фермент

pH

Константа скорости / константа демаскирования

k(Arg25-Ile26)/kd

kLys-X/kd

k(Arg183-Asp184)/kd

трипсин

7

6.2

0.8

2.7

дикого

8

7.5

1.0

2.0

типа

9

5.0

1.0

2.0

10

2.7

0.7

0.7

K188H

7

1.0

-

1.9

8

1.4

0.9

4.6

9

1.4

1.0

2.2

K188F

10

3.6

1.0

3.0

7

1.8

1.7

0.4

8

4.2

3.6

0.8

9

3.6

3.0

0.5

10

1.8

2.6

0.4

K188Y

7

1.0

1.3

1.1

8

8.9

0.7

2.1

9

11.0

1.0

2.3

10

11.6

1.2

2.6

K188D/D189K

7

9.5

0.7

3.1

8

10.7

0.8

2.9

9

10.1

0.9

3.6

10

5.9

0.9

-

В разделе 2.2 описываются протеолитические эксперименты с описанием кинетики по изменению концентрации суммы аминогрупп, образующихся при гидролизе пептидных связей. Определение суммарной кинетики проводили по поглощению N-тринитрофенильных производных всех продуктов гидролиза H2NR, получаемых с использованием тринитробензосульфокислоты:

Накопление аминного азота N при протеолизе суммарного казеина химотрипсином представляет немонотонную функцию (рис.3).

Для объяснения причин возникновения немонотонных зависимостей N(t) (локальных максимумов скорости dN/dt) был использован оригинальный подход. Константу скорости второго порядка <kcat/KM> и обратную величину эффективной константы Михаэлиса <1/KM> считали функциями степени гидролиза d=N/S0 (<…> - знак усреднения по всем разновидностям пептидных связей). Тогда выражение для скорости гидролиза пептидных связей принимает вид:

Рис. 3. Кинетические кривые N(t) для протеолиза суммарного казеина химотрипсином. Концентрация субстрата 0.05 г/л (?) и 0.2 г/л (¦).

, (3)

где N - концентрация аминного азота, B - концентрация пептидных связей, S0=B+N - общая концентрация всех аминокислотных остатков, - E0 - общая концентрация фермента, P(S0) - вероятность демаскирования субстрата (межмолекулярный процесс). <k> - усредненная величина по всей совокупности индивидуальных констант :

, (4)

где Bj - концентрация пептидных связей сорта j во всей совокупности пептидных связей, Pj - вероятность демаскирования пептидных связей сорта j (внутримолекулярный процесс). Член <k>, представляющий сумму произведений индивидуальных констант гидролиза на долю демаскированных связей, определяет изменение в ходе протеолиза вклада демаскирования в суммарную скорость процесса. По форме уравнение (3) имеет вид уравнения Михаэлиса-Ментен, но вместо постоянных величин (константы второго порядка и константы Михаэлиса), в него входят функции. Например, константа второго порядка является усредненной величиной по ансамблю демаскированных пептидных связей (уравнение 4). Описание протеолиза сводится, таким образом, к определению функциональных зависимостей усредненных величин.

Зависимость <k> от DH (DH=d100%), измеренная по экспериментально определенной зависимости скорости V(DH), представлена на рис. 4 для протеолиза суммарного казеина химотрипсином при концентрациях субстрата 0.4, 0.2, 0.1 г/л. Функция <k>, зависящая от индивидуальных констант гидролиза и процесса демаскирования, имеет локальный максимум в области 2-4% степени гидролиза. Таким образом, показано, что наблюдаемые немонотонные особенности суммарных кинетических кривых (рис. 3) связаны с демаскированием.

Примеры изменения в ходе протеолиза V(DH) для индивидуальных казеинов представлены на Рис. 5, показывающем различные зависимости для ? и ? казеинов. Для ?-казеина имеет место убывающая монотонная зависимость, а для ?-казеина зависимость V(DH) имеет локальный максимум. По зависимостям скорости гидролиза от степени гидролиза в экспериментах, выполненных при низких концентрациях субстрата (<0.01%), можно качественно определить уровень маскирования при гидролизе данного субстрата. Сравнение зависимостей для ?- и ?-казеинов показывает, что пептидные связи в ?-казеине маскированы больше.

Рис. 4. Зависимость <k> от DH для протеолиза суммарного казеина химотрипсином при концентрациях субстрата 0.4, 0.2, и 0.1 г/л. E0=6.6·10-8M.

В разделах 2.3 и 2.4 рассмотрены другие количественные методы определения кинетических параметров протеолиза, связанные с использованием электрофореза в ацетатцеллюлозных пленках и аминокислотного анализа низкомолекулярных фракций гидролизатов.

В разделе 2.3 показано, что логарифм концентрации исходного полипептида (белка) убывает линейно со временем протеолиза, т.е. формально наблюдается кинетика 1-го порядка.

Из таблицы 4 видно, что для обеих температур константы второго порядка скоростей гидролиза для казеинов больше, чем для глобулярных белков примерно на два-три порядка. В глобулярных белках, гидролиз лимитируется маскированием пептидных связей, связанным с упаковкой полипептидной цепи в белковой глобуле.

Таблица 4. Константы скоростей деградации полипептидных субстратов под действием химотрипсина.

Субстрат

T,oC

Eo, мкг/мл

kI, мин-1Ч10-2

kII=kI/Eo,М-1с-1

?-казеин

35

0.2

9.2

2.9Ч105

?-казеин

35

0.2

16.8

5.3Ч105

?-ЛГ

35

100

25

1.6Ч103

БСА

35

12

2.3

1.2Ч103

?-ЛА

35

12

0.44

0.23Ч103

?-казеин

25

0.6

3.6

0.38Ч105

?-казеин

25

0.6

7.4

0.78Ч105

?-ЛГ

25

95

3.3

2.2Ч102

БСА

25

7.5

0.21

1.75Ч102

?-ЛА

25

7.5

0.036

0.3Ч102

В качестве верхней оценки отношения константы скорости демаскирования глобулы к средней константе скорости гидролиза одной доступной пептидной связи получаем kd/kh ? kII(сыв.)/kII(каз.)Чn = 0.0035Ч10 = 0.035 ? 0.04 (где n=10 - оценка числа доступных специфичных пептидных связей в казеинах, гидролизуемых без временной задержки). Оценку n мы смогли выполнить только приближенно. Например, для гидролиза ?-казеина трипсином, рассмотренного в разделе 2.1, такими связями являются Arg25-Ile26, Arg183-Asp184, Lys28-Lys29, Lys32-Phe33, Lys99-Glu100, Lys105-His106, Lys113-Tyr114, Lys169-Val170, Lys176-Ala177 (n=9).

Отдельная группа экспериментов (раздел 2.4) посвящена гидролизу в реакторе открытого типа, моделирующем in vitro панкреатическую стадию пищеварения. В диализном мешке в качестве субстрата находилась смесь пептидов, полученная пепсиновым гидролизом пищевого белка, и панкреатин. Экспериментальная установка по гидролизу панкреатическими ферментами была предложена Савуа и Гаутье (Университет Лаваля, Квебек, Канада) Savoie L., Gauthier S.F. // J. Food Sci. - 1986. - V.51. - P. 494. . Отобранные пробы представляли собой продукты гидролиза с молекулярной массой меньше 1000, вымытые из диализного мешка потоком буфера в разные моменты времени. После полного кислотного гидролиза проводили аминокислотный анализ отобранных проб. Накопление каждой аминокислоты i (1?i<16, число анализируемых аминокислот) в составе низкомолекулярной фракции продуктов гидролиза определялось по нарастанию величины Di=(содержание i -ой аминокислоты в диализате) / (содержание той же аминокислоты в белке). Показано, что выход из реактора специфичных для трипсина и химотрипсина аргининовых, лизиновых, тирозиновых и фенилаланиновых остатков опережал выход других аминокислотных остатков. Относительная константа скорости ki, характеризующая обогащение низкомолекулярной фракции аминокислотными остатками i, определялась с помощью выражения:

,(5)

где D=?Diwi, а wi -молярная доля аминокислотных остатков i в белковом субстрате.

Сравнительный анализ проводился для пепсиновых гидролизатов суммарного казеина (СК) и относительно более маскированного изолята белков рапса (ИБР). Статистический анализ был применен ко всему массиву экспериментальных данных, полученных с различными отношениями E/S и временами отбора проб.

Для более маскированного субстрата наблюдалось более узкое распределение функции распределения вероятности для констант ki (Рис.6). Для демаскированного субстрата СК специфичные связи гидролизуются с максимально возможной скоростью, отсюда и широкое распределение P(ki) для казеинового субстрата. С этим согласуются данные по разности констант обогащения низкомолекулярных фракций специфичными (Arg, Lys, Tyr, Phe) и неспецифичными аминокислотными остатками.

Кроме субстратов СК и ИБР анализ кинетики протеолиза панкреатином в реакторе открытого типа был выполнен для пепсиновых гидролизатов нативного ?-лактоглобулина, препарата сывороточных белков молока и препарата термически обработанных сывороточных белков молока.

Таким образом, в главе 2 предложена общая физико-химическая модель протеолиза, позволяющая анализировать кинетику во всем диапазоне изменения степени гидролиза пептидных связей с помощью одних и тех же уравнений для произвольных фермент-субстратных пар. Показано, что кинетика протеолиза в случае суммарной кинетики и кинетики образования индивидуальных продуктов соответствует двухстадийной схеме, где первая кинетически значимая стадия представляет демаскирование пептидной связи, а вторя стадия соответствует гидролизу. Таким образом, перспективной представляется модель согласно которой имеется «резервуар» пептидных связей, которые демаскируются в ходе протеолиза и поступают в сферу реакции. Эта модель оказалась подходящей для описания протеолиза как глобулярных белков, так и относительно подвижных казеиновых полипептидных цепей.

Глава 3 посвящена описанию принципов компьютерного моделирования, заложенных нами при разработке пакета компьютерных программ, а также описанию результатов моделирования конкретных примеров протеолиза, описанных в главе 2.

В разделе 3.1 описывается пакет компьютерных программ, и демонстрируются его возможности.

Уравнения, описывающие гидролиз пептидных связей, имеют вид:

Здесь N(i, j) - концентрация фрагментов (i, j), имеющих i-ый номер N-конца (N - конец фрагмента образован гидролизом i-ой пептидной связи) и длиной j аминокислотных остатков (i изменяется от 0 до N-1, j изменяется от 1, причем i+j?N), k0(i, j, l) - обозначает константу скорости второго порядка гидролиза пептидной связи, имеющей номер l, в фрагменте (i, j), E - концентрация свободного фермента, N - число аминокислотных остатков в исходной полипептидной цепи.

Матрица констант скоростей была представлена в виде:

,(7)

где kh(i,l,s) - константа, вычисляемая по инкрементам специфичности f(Rj-4, Rj-3, Rj-2, Rj-1, Rj, Rj+1, Rj+2, Rj+3, Rj+4, Rj+5)=f(Rj-4) f(Rj-3) f(Rj-2) f(Rj-1) f(Rj) f(Rj+1) f(Rj+2) f(Rj+3) f(Rj+4) f(Rj+5), Pd(s) - вероятность того, что атакуемая пептидная связь является демаскированной, L(i,j,s) - концевая функция, уменьшающая константу скорости для пептидных связей, находящихся близко к концам цепи, i - номер пептидной связи, гидролиз которой образовал N-конец фрагмента длиной l, s - номер атакуемой пептидной связи.

Уравнение, описывающее демаскирование, имеет вид:

,(8)

где Bm - концентрация маскированных пептидных связей (связей во всей цепи или части цепи), kd - константа скорости демаскирования.

Уравнениями материального баланса являются (небольшие концентрации субстрата):

Субстрат:, (9)

Фермент:,(10)

где Ео - общая концентрация фермента, KM(d) - константа Михаэлиса, которая представляется в виде функциональной зависимости степени гидролиза пептидных связей; So - общая концентрация субстрата (суммарная концентрация всех аминокислотных остатков во всех компонентах гидролизата).

Алгоритм вычисления кинетических констант гидролиза пептидных связей в пептиде с произвольной последовательностью аминокислотных остатков по соответствующим инкрементам для аминокислотных остатков был задан по аналогии с подходом, разработанным В.К. Антоновым, А.А. Зинченко и Л.Д. Румшем для пепсина Зинченко А.А., Румш Л.Д., Антонов В.К. // Биоорган. химия. - 1997.-Т.3, №12. - С.1663. , Зинченко А.А., Румш Л.Д., Антонов В.К. // Биоорган. химия. -1976.- Т.2, №6. - С. 803.. Специфичность фермента по отношению к атакованной пептидной связи является аддитивной функцией вкладов аминокислотных остатков (максимум 10 остатков), взаимодействующих с сайтами фермента.

Рис.7. Блок-схема компьютерной программы PROTEOLYSIS.

База данных, включающая инкременты для наиболее изученных протеолитических ферментов, входит в программу PROTEOLYSIS. Когда учитывается весь массив информации, константа гидролиза kh вычисляется по 10 переменным:

,(11)

где f( ) - функциональная зависимость, определенная по экспериментальным данным гидролиза относительно коротких пептидов. Гипотетическое уменьшение размера активного центра фермента было промоделировано путем уменьшения размерности массива данных (например, с 10 до 5).

Главное меню программы PROTEOLYSIS включает следующие опции: HELP, PROTEIN, ENZYME, KINETIC CONDITIONS, SIMULATION, RESULTS, QUIT. На рис. 7 показана блок-схема компьютерной программы PROTEOLYSIS. Пользователь задает фермент из списка, предлагаемого программой, и субстрат (определяет аминокислотную последовательность с помощью специальной процедуры, рис. 7, пункты 2 и 3). Кроме того, пользователь задает начальные концентрации субстрата и фермента, а также время протеолиза (пункт 1). Поскольку параметр демаскирования не определяется автоматически, пользователь должен выбрать то приближение, в котором проводится компьютерное моделирование.

Рис. 8. Главное меню и процедура вычислений при помощи программы PROTEOLYSIS (пункт меню SIMULATION/RUN).

На рис. 8 показана процедура вычислений (пункт меню SIMULATION), следующая после определения условий протеолиза (пункт меню KINETIC CONDITIONS). Перед началом счета необходимо определить приближение, в рамках которого представляется специфичность фермента (первичная или вторичная специфичность, пункт меню SIMULATION / SPECIFICITY). При моделировании в рамках первичной специфичности учитываются только аминокислотные остатки, находящиеся в позиции Р+1. Этот режим компьютерного моделирования, требующий наименьшего времени вычислений, применяется для грубой оценки результатов протеолиза. В приближении вторичной специфичности учитывается массив данных специфичности согласно уравнению (11).

После численного интегрирования дифференциальных уравнений (6) - (8) с использованием процедуры Рунге - Кутта (рис. 7, пункт 4, SIMULATION / RUN), программа представляет выходные данные в графической форме (рис. 7, пункт 5, RESULTS). Программа также осуществляет поиск главных компонент гидролизатов в любой момент времени и выводит их список (рис. 7, пункт 6, RESULTS). Предусмотрена возможность файлового способа хранения результатов вычислений и создание библиотеки данных компьютерного моделирования протеолиза. Программа PROTEOLYSIS написана нами на языке С.

В разделе 3.2 приводятся результаты моделирования гидролиза пепсином - протеолитическим ферментом с хорошо выраженной вторичной специфичностью. Примеры результатов моделирования представлены на рис. 9 и 10 для пепсинолиза частично демаскированной цепи ?-ЛГ. Увеличение степени гидролиза по ходу протеолиза (рис.9) представлено при двух значениях отношения константы скорости демаскирования к константе скорости гидролиза.

В таблице 5 проведено сравнение сайтов расщепления, определенных экспериментально и предсказанных компьютерным моделированием. Восемь экспериментально определенных сайтов представляют собой сайты, которые были определены в экспериментах по гидролизу пепсином ?-лактоглобулина, демаскированного высоким давлением и действием этанола. Эффективность предсказания 50% (четыре из восьми) существенно превышала вероятность угадывания (20/161х100%=12%).

Таблица 5. Влияние размерности активного центра пепсина на результат компьютерного моделирования расщепления пептидных связей ?-лактоглобулина.

Сайты расщепления*

Вторичная структура

Результаты компьютерного предсказания при размерности активного центра 3, 5, 10 аминокислотных остатков

3

5

10

Asp(11)-Ile(12)

+

Trp(19)-Tyr(20)

Leu(31)-Leu(32)

+

+

+

Leu(54)-Glu(55)

?

Phe(82)-Lys(83)

?

+

+

Ala(132)-Leu(133)

?

+

+

Leu(147)-Ser(148)

?

Leu(156)-Glu(157)

+

+

* Совпадающие сайты, найденные в экспериментах по пепсиновому гидролизу, частично денатурированного высоким давлением и действием этанола.

В разделе 3.3 приведены данные по компьютерному моделированию протеолиза трипсином и химотрипсином, т.е. ферментами, обладающими в основном первичной специфичностью. Компьютерная программа PROTEOLYSIS была использована для предсказания гидролиза ?-казеина трипсином дикого типа при различных предположениях относительно его субстратной специфичности. Было исследовано образование 17 основных пептидов в зависимости от степени гидролиза пептидных связей (таблица 6). Наборы кинетических констант менялись в зависимости от принятых предположений, относительно специфичности фермента. Данные таблицы 6 позволяют проследить, как увеличивается эффективность предсказания при учете более полной информации о специфичности (неспецифичный гидролиз > только первичная специфичность > первичная + вторичная специфичность > демаскирование + первичная + вторичная специфичность).

Таблица 6. Предсказание основных продуктов протеолиза Я-казеина трипсином с помощью программы PROTEOLYSIS при различных моделях протекания протеолиза.

*Использованы константы скоростей для вторичной специфичности из базы данных программы PROTEOLYSIS.

**Вероятность демаскирования считалась обратно пропорциональной средней гидрофобности 6 аминокислотных остатков, ближайших к расщепляемой связи.

Число основных компонентов - 17. Моноблочные продукты (A, B, C, F, D, J, E, H, K, N, I, L), диблочные продукты (L-N, D-E, G-H, E-F) и триблочный продукт G-H-I были определены экспериментально (выделены жирным шрифтом, рис.1).

DH - степень гидролиза (число гидролизованных связей / число аминокислотных остатков ·100%).

DM -процент моноблочных пептидов в гидролизате.

EP - эффективность предсказания (отношение суммы правильно предсказанных диблочных и высших продуктов к общему количеству предсказанных диблочных и высших продуктов.

Из содержания таблицы 6 можно сделать вывод, что набор главных компонентов меняется в ходе протеолиза (от степени гидролиза пептидных связей). Наибольшее количество предсказанных продуктов протеолиза было когда учитывалась вторичная специфичность и эффект демаскирования пептидных связей. Эффективность предсказания увеличивалась до 67% от уровня 20%.

В аналитическом виде была рассмотрена кинетика демаскирования маскированных пептидных связей и кинетика гидролиза демаскированных связей (индекс j обозначает различный тип пептидных связей, СО группа которых входит в аминокислотный остаток -NHCH(Rj)CO-):

,(12)

где kj - константа скорости гидролиза пептидных связей типа j, kd - константа скорости демаскирования, которая считается одинаковой для всех пептидных связей. Зависимость только от одного типа бокового радикала Rj (1?j?20) показывает, что наше рассмотрение применимо к протеазам, обладающим первичной специфичностью.

Несколько характерных случаев гидролиза химотрипсином были рассмотрены и результаты представлены в виде зависимостей <k> от d (Рис. 11 и 12). В расчетах учтены кинетически значимые различия связей, образованных специфичными остатками Trp, Tyr, Phe и менее специфичными Leu, Met, Asn и Gln. Для прочих связей считалось, что kj=0. Варьировались параметр m, выражающий начальную степень маскирования, индивидуальные константы и константа демаскирования kd. Величина kd выбиралась с таким расчетом, чтобы параметр демаскирования kd/<kh> был порядка 10, что соответствует экспериментально найденному значению этого параметра для демаскирования гидрофобного С-конца ?-казеина при протеолизе трипсином.

Протеолиз ?-казеина (рис. 5) близок к случаю, когда большинство пептидных связей изначально демаскировано (рис.11). Протеолиз суммарного казеина (рис. 4) близок к случаю, изображенному на рис. 12, когда начальные концентрации маскированных и демаскированных связей были соизмеримы (m=0.6). При этом наблюдается заметное замедление, а затем увеличение скорости (вплоть до образования экстремумов) в районе d=2-4%, что было подтверждено экспериментально (рис.4).

Таким образом, в третьей главе описаны принципы компьютерного моделирования протеолиза. Описана программа PROTEOLYSIS, осуществляющая численное интегрирование дифференциальных уравнений, описывающих демаскирование и гидролиз пептидных связей с учетом материального баланса по субстрату и ферменту. Программа позволяет предсказывать кинетику гидролиза с различными параметрами специфичности и маскированности, что позволяет проверять механизмы протеолиза. Программа удовлетворительно предсказывает места расщепления цепи (сайты) и состав гидролизатов.

Рис. 11. Зависимость усредненной константы скорости гидролиза от d для m=0.05 и kd=1.1. Отношение kd/kh=32.5(?), 23.8(¦), 13.1 (^).

Рис. 12. Зависимость усредненной константы скорости гидролиза от d для m=0.6 и набора индивидуальных констант kTrp=10, kTyr=0.5, kPhe=0.5, kLeu,Met,Asn,Gln=0.003. Отношение kd/kh=3.3(), 6.6(?), 12.1(^), 22(?), 55 (¦).

В четвертой главе описываются наши эксперименты по определению гидратации водных растворов аминокислот, белковых гидролизатов, казеиновых мицелл и синтетических белковоподобных полимеров с помощью метода миллиметровой спектроскопии. Метод миллиметровой спектроскопии сравнивается с методом дифференциальной сканирующей калориметрии, позволяющей оценивать гидратацию по теплоемкостям гидратации.

В разделе 4.1 рассмотрен вариант метода миллиметровой (микроволновой) спектроскопии, основанный на резонансном эффекте. При помощи миллиметровой спектроскопии возможно определить фракцию свободной воды - фракцию молекул H2O, обладающих вращательной подвижностью в соответствии с моделью «ожиданий и перескакиваний». Вращательные движения возможны из-за понижения активационного барьера вращений благодаря взаимодействию молекулы воды с дополнительной молекулой воды, т.е. с пятой соседней молекулой H2O в тетраэдрической сетке водородных связей. Параметры гидратации были определены по дефициту поглощения (в терминологии Ю.И. Хургина) Khurgin Y.I., Kudryashova V.A., Zavizion V.A., Betski O.V. // Advances in Chemical Physics Series, W. Coffey (Ed.). - V. 87. - New York: Wiley, 1994. - P. 483., т. е. разнице в поглощении невозмущенной воды и воды в растворе. Этот дефицит приписывался уменьшению подвижности воды вследствие присутствия растворенной молекулы. Число гидратации N, число связанных молекул воды, было вычислено согласно следующей формуле:

, (13)

где С1 - молярная концентрация водной компоненты, C1f - молярная концентрация свободной воды по данным поглощения миллиметрового излучения, С2 - молярная концентрация растворенного вещества.

Числа гидратации природных ?-аминокислот (кроме цистеина), находящихся в форме цвиттерионов H3N+CHRCOO-, были определены методом миллиметровой спектроскопии при частоте излучения 31ГГц и малой мощности излучения (1мВт), обеспечивающей нетепловой режим измерений (рис. 13). Для аминокислот, известных как гидрофобные (Leu, Ile, Trp, Phe), получаются относительно большие величины N. Это согласуется с фактом, что гидрофобная гидратация сопровождается стабилизацией сетки Н-связей воды в первом гидратном слое гидрофобных групп. Таким образом, микроволновой метод позволял количественно выражать гидрофобность аминокислот, и были все основания полагать, что он мог быть эффективным для регистрации процессов, происходящих при изменении количества неполярных групп, экспонированных в сторону водного окружения.

Рис. 13. Зависимость чисел гидратации N от площади доступной поверхности неполярных групп (Е2) для цвиттерионов природных ?-аминокислот.

Шкала гидрофобности аминокислот по данным миллиметровой спектроскопии устанавливает следующий порядок уменьшения гидрофобности: Ile(8.2), Leu(7.4), Trp(7.1), Phe(6.5), Val(6.2), Tyr(5.4), Met(3.9), Lys(3.4), Arg(2.5), Thr(2.2), Pro(2.2), Ala(1.9), Gln(1.9), His(1.9), Asp(1.4),...


Подобные документы

  • Основные особенности гидролиза, который приводит к образованию слабого электролита. Характеристика гидролиза солей в водном растворе. Значение гидролиза в химическом преобразовании земной коры. Развитие гидролиза в народном хозяйстве и в жизни человека.

    конспект урока [124,7 K], добавлен 20.11.2011

  • Расчетные методы определения рН. Примеры уравнений реакций гидролиза солей. Понятие и формулы расчета константы и степени гидролиза. Cмещение равновесия (вправо, влево) гидролиза. Диссоциация малорастворимых веществ и константа равновесия этого процесса.

    лекция [21,7 K], добавлен 22.04.2013

  • Белки как высокомолекулярные природные соединения, состоящие из остатков аминокислот, которые соединены пептидной связью. Качественный состав белков, их структура и функции. Процессы гидролиза (кислотно-основного, ферментативного) и денатурация белков.

    презентация [212,1 K], добавлен 11.02.2015

  • Физико-химические свойства аминокислот. Получение аминокислот в ходе гидролиза белков или как результат химических реакций. Ряд веществ, способных выполнять некоторые биологические функции аминокислот. Способность аминокислоты к поликонденсации.

    презентация [454,9 K], добавлен 22.05.2012

  • Рассмотрение превращения энергии (выделение, поглощение), тепловых эффектов, скорости протекания химических гомогенных и гетерогенных реакций. Определение зависимости скорости взаимодействия веществ (молекул, ионов) от их концентрации и температуры.

    реферат [26,7 K], добавлен 27.02.2010

  • Понятие гидролиза как реакции обменного разложения веществ водой; его роль в народном хозяйстве, повседневной жизни. Классификация солей в зависимости от основания и кислоты. Условия смещения реакций обратимого гидролиза согласно принципу Ле Шателье.

    презентация [411,8 K], добавлен 02.05.2014

  • Сущность и виды окисления - химических реакций присоединения кислорода или отнятия водорода. Ознакомление с методами восстановления металлов в водных и соляных растворах. Изучение основных положений теории окислительно-восстановительных реакций.

    реферат [130,1 K], добавлен 03.10.2011

  • Характеристика гидролиза солей. Виды реакций нейтрализации между слабыми и сильными кислотами и основаниями. Почвенный гидролиз солей и его значение в сельском хозяйстве. Буферная способность почвы: обмен катионов и анионов в процессе минерализации.

    контрольная работа [56,1 K], добавлен 22.07.2009

  • Понятие биологических катализаторов, действие ферментов в живых системах и их классификация. Факторы, влияющие на активность биологических катализаторов. Вещества, называющиеся коферментами. Кинетика ферментативного катализа, уравнение Михаэлиса-Ментена.

    презентация [943,7 K], добавлен 03.04.2014

  • Основные понятия и законы химической кинетики. Кинетическая классификация простых гомогенных химических реакций. Способы определения порядка реакции. Влияние температуры на скорость химических реакций. Сущность процесса катализа, сферы его использования.

    реферат [48,6 K], добавлен 16.11.2009

  • Химическая кинетика и ее значение в управлении химическими процессами. Классификация реакций по средам протекания, их отличительные черты. Скорость химических реакций, зависимость ее от температуры среды и наличия света. Принцип действия катализаторов.

    реферат [152,7 K], добавлен 29.05.2009

  • Гидролиз соли слабой кислоты и сильного основания, сильной кислоты и слабого основания, слабой кислоты и слабого основания. Количественные характеристики гидролиза. Подавление и усиление гидролиза солей. Факторы, влияющие на степень гидролиза.

    реферат [73,9 K], добавлен 25.05.2016

  • Понятие и расчет скорости химических реакций, ее научное и практическое значение и применение. Формулировка закона действующих масс. Факторы, влияющие на скорость химических реакций. Примеры реакций, протекающих в гомогенных и гетерогенных системах.

    презентация [1,6 M], добавлен 30.04.2012

  • Определение и классификация солей, уравнения реакций их получения. Основные химические свойства солей, четыре варианта гидролиза. Качественные реакции на катионы и анионы. Сущность процесса диссоциации. Устойчивость некоторых солей к нагреванию.

    реферат [12,9 K], добавлен 25.02.2009

  • Тепловые эффекты химических реакций, а также основные факторы, влияющие на их динамику. Закон Гесса: понятие и содержание, сферы практического применения. Энтропия системы и анализ уравнения Больцмана. Направления химических реакций и энергия Гиббса.

    лекция [34,1 K], добавлен 13.02.2015

  • Реакции, протекающие между ионами в растворах. Порядок составления ионных уравнений реакций. Формулы в ионных уравнениях. Обратимые и необратимые реакции обмена в водных растворах электролитов. Реакции с образованием малодиссоциирующих веществ.

    презентация [1,6 M], добавлен 28.02.2012

  • Простейшая молекулярная модель жидкостей. Особенности и закономерности протекания реакций в растворах. Классификация органических реакций жидкостей по конечному результату, а также механизму разрыва связей, их разновидности и главные этапы реализации.

    курсовая работа [446,0 K], добавлен 20.11.2013

  • Изучение влияния веществ на процесс разложения пероксида водорода в водных растворах. Воздействие различных химических катализаторов на скорость разложения пероксида водорода. Действие твина-80 на разложение пероксида водорода при различных температурах.

    реферат [562,1 K], добавлен 18.01.2011

  • Предмет термохимии, изучение тепловых эффектов химических реакций. Типы процессов химической кинетики и катализа. Энтальпия (тепловой эффект) реакции. Скорость реакции, закон действующих масс. Константа химического равновесия, влияние катализатора.

    презентация [2,2 M], добавлен 19.10.2014

  • Исследование динамики полимерных цепей в растворе, которая является чувствительным тестом внутримакромолекулярного структурообразования и химических превращений с участием макромолекул, а также фактором, влияющим на протекание реакций в цепях полимера.

    статья [259,7 K], добавлен 18.03.2010

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.