Кинетика ферментативного гидролиза полипептидов и гидрофобные эффекты

CH(N+H3)COO-

-3.4±1.2

-1.3±0.5

-119±11

-1.6±.2

Коэффициенты корреляции индексов гидрофобности для шкал гидрофобности, предложенных к настоящему времени, невелики (порядка 0.5-0.6). Наша шкала, построенная по данным миллиметровой спектроскопии (шкала 1, таблица 9), и шкала, построенная по теплоемкостям гидратации аминокислот (шкала 2), коррелируют с гораздо более высоким коэффициентом (0.973). Объяснение заключается в том, что обе представленные шкалы гидрофобности основаны на измерениях динамических свойств воды, хотя и на различных уровнях - микроскопическом и макроскопическом.

Таблица 9. Коэффициенты корреляция шкал гидрофобности аминокислот.

В разделе 4.2 на примере циклодекстринов и ароматических аминокислот рассмотрена гидратация ассоциирующих молекул, образующих обратимые комплексы. При конечных концентрациях, используемых в определениях гидратации с помощью миллиметровой спектроскопии (2-100 г/л), перекрывание гидратных оболочек для ассоциирующих растворенных веществ или даже вытеснение воды из области взаимодействия функциональных групп является существенным фактором, изменяющим гидратационные параметры по сравнению с не ассоциирующими растворенными веществами.

Из гидратационных данных (таблица 10) следует, что ?-циклодекстрин связывается с Tyr и Phe, поскольку удельное число гидратации n₃' существенно меньше чем n₃. Доля связанного ?-циклодекстрина оказывается равной 0.17 для тирозина и 0.19 для фенилаланина. Эти значения согласуются с величинами, вычисленными из типичной величины константы связывания ?-циклодекстрина с ароматическими группами аминокислот. Таким образом, при увеличении концентрации растворенных веществ, склонных к ассоциации, измеренное число гидратации уменьшается.

Таблица 10. Удельные числа гидратации лигандов в системе аминокислота + лиганд и доли связанного лиганда.

В разделе 4.3 приведены данные по гидратации белков и изменению гидратации при ферментативном гидролизе. Зависимость N от площади доступной для воды поверхности глобулярных белков можно считать пропорциональной (рис. 14). Количество связанной воды, выраженной в г связанной воды на г белка, в среднем для изученных глобулярных белков можно оценить как 0.3.

Сопоставление экспериментальных и теоретических значений N для рибонуклеазы и лизоцима, вычисленных по представленным в таблице 8 вкладам в N неполярной группы СН₂ (2.6), усредненной полярной группы (около 0) и заряженной пары (-3.4), приведено в таблице 11. Как можно видеть, имеется неплохое согласие вычисленных и экспериментально полученных значений N.

Таблица 11. Вклад в гидратацию глобулярных белков функциональных групп, расположенных на поверхности белков.

^аВ скобках приведены числа функциональных групп на поверхности белков.

Рис. 14. Зависимость чисел гидратации глобулярных белков от площади доступной поверхности (Е²). Бычий сывороточный альбумин (1), яичный альбумин (2), пепсин (3), химотрипсиноген (4), ?-химотрипсин (5), трипсин (6), соевый ингибитор трипсина (7), ?-лактоглобулин (димер) (8), ?-лактальбумин (9), лизоцим (10), рибонуклеаза А (11).

Пример изменения гидратации при протеолизе представлен на рис. 15 для гидролиза трех субстратов трипсином. В начале процесса гидролиза как глобулярных белков (?-лактоглобулина и БСА), так и ?-казеина происходит заметное увеличение гидратации. При гидролизе трипсином БСА, ?-лактоглобулина и ?-казеина максимальное увеличение удельной гидратации составляет 36, 17 и 37% соответственно. При протеолизе глобулярных белков после гидролиза хотя бы одной пептидной связи происходит развертывание глобулы, внутренние пептидные связи становятся доступны воде, что и регистрируется при увеличении гидратации. Явление заметного увеличения гидратации при гидролизе ?-казеина согласуется с ролью демаскирования при протеолизе ?-казеина, которая была определена нами по кинетике образования продуктов гидролиза (раздел 2.1).

Рис. 15. Изменение удельных чисел гидратации (число гидратации на единицу массы растворенного вещества) при гидролизе трипсином БСА (^), ?-лактоглобулина (?) и ?-казеина (¦).

Как известно, при гидролизе всего одной пептидной связи Phe(105)-Met(106) в ?-казеине ренином казеиновая мицелла теряет стабильность, и происходит коагуляция. Однако, это слишком сложная система для одновременного количественного описания протеолиза и изменения гидратации. Для моделирования закономерностей гидратации при агрегации казеиновых мицелл мы использовали агрегацию мицелл, индуцированную медленным закислением глюконовой кислотой (раздел 4.4). Использовались казеиновые мицеллы, восстановленные из обезжиренного молока. Изучали две разновидности мицелл: немодифицированные мицеллы с изоэлектрической точкой около 4.9 и модифицированные мицелы с имобилизованными белками на поверхности. Они дают значение изоэлектрической точки порядка 5.2. При уменьшении pH ниже значения 4.8-4.9 (изоэлектрическая точка казеиновых фосфопептидов находится в интервале 4.3-4.2) казеиновые мицеллы в таких растворах агрегируют за счет гидрофобных взаимодействий, что приводит к образованию мягких вязкоупругих гелей. Медленное уменьшение рН вызывалось самопроизвольным гидролизом ?-глюконолактона с образованием D-глюконовой кислоты (рК_а =3.56):

На рис. 16 представлены зависимости динамического модуля упругости и связанной воды от времени гелеобразования для процессов, протекающих при различных скоростях уменьшения рН (различных концентрациях ?-глюконолактона). Чем больше концентрация ?-глюконолактона, тем раньше наступает начало гелеобразования. Взаимосвязано с G' ведет себя параметр гидратации, увеличиваясь в ходе гелеобразования.

Рис. 16. Зависимости модуля упругости G? (Па) и связанной воды (г Н₂О/г препарата·100%) от времени гелеобразования немодифицированных казеиновых мицелл (16%) для процессов, протекающих при различных скоростях уменьшения рН (различных концентрациях ?-глюконолактона). Концентрации ?-глюконолактона: 3.4% (_, ?); 3% (?, ^); 2.7% (?, ¦). Температура 43^оС. Частота измерений щ=1 рад с^-1.

С начала гидролиза глюконолактона рН снижается от значения 5.5, поэтому сначала образуются тяжи из модифицированных мицелл. В промежуточной области рН может происходить разрыв геля, образованного модифицированными мицеллами, и замещение его гелем, образованным немодифицированными мицеллами. Поэтому имели место наблюдаемые нами немонотонные зависимости на графиках увеличения модуля накопления при гелеобразовании.

Эффект стабилизации казеиновых мицелл при добавлении смеси полипептидов был продемонстрирован с помощью, описанной выше гелеобразующей системы, включающей агрегацию казеиновых мицелл при гидролизе ?-глюконолактона. Увеличение стабильности системы определялось по увеличению времени, требуемого до достижения точки гелеобразования при неизменной скорости уменьшения рН (рис. 17) или по величинам модуля упругости G и коэффициента вязкости з, полученных при анализе частотных зависимостей динамических модулей G'(?) и G''(?) в рамках модели Максвелла.

Рис. 17. Кинетика гелеобразования при добавлении к казеиновым мицеллам смеси полипептидов. Массовая доля полипептидов: 0 (?), 3.6% (_), 7.8% (?) и 10.4% (^). Концентрация ?-глюконолактона 3%, температура 43^оС.

Представленные на рис. 18 зависимости показывают, что гидратационные и реологические параметры изменяются согласованно, а их минимумы достигаются в одной и той же концентрационной области. Таким образом, максимум эффекта стабилизации казеиновых мицелл приходится на концентрацию добавленных пептидов порядка 6%.

Рис. 18. Зависимости реологических параметров 10^-2·G (?) и 10^-3·з (¦), а также зависимость количества связанной воды в конце выбранного временного интервала гелеобразования (^) от концентрации добавленных полипептидов (вес полипептидов/вес сухих веществ·100%).

В разделе 4.5 приведены данные по гидратации синтетических полимеров. Величины N, приходящиеся на мономерное звено, представлены на рис. 19 для полиакриламида (ПАМ), полэтиленгликоля (ПЭГ) и термочувствительного поли-N-изопропилакриламида (ПНИПАА):

Числа гидратации были интерпретированы как величины, зависящие только от числа неполярных групп и их доступности для воды. Измерения были сделаны при температурах ниже (30^оС) и выше (43^оС) температуры перехода клубок-глобула для макромолекулы ПНИПАА (около 32^оС). Было найдено, что гидратация ПНИПАА различна в чистой воде и в воде с додецилсульфатом натрия (ДСН, 0.375 г/л), что согласуется с данными о чувствительности перехода клубок-глобула к присутствию в растворе ионных детергентов. Выше температуры перехода клубок-глобула, величина N для ПНИПАА в присутствии ДСН была выше, чем для ПНИПАА в чистой воде (рис. 19).

Рис. 19. Зависимость числа гидратации от количества атомов углерода в неполярных группах (на звено) для ПЭГ (^), ПАМ(), ПНИПАА в воде (¦ 30^oC, ? 43^oC), и ПНИПАА с ДСН (? 30^oC, _ 43^oC). Прямая линия соответствует алифатическим спиртам. Стрелки соответствуют переходу клубок > глобула.

Другим примером применения миллиметровой спектроскопии к анализу конформационного состояния полимеров явилось изучение гидратации гидрофобно-модифицированных полиакриламидов и хитозанов, содержащих гидрофобные кластеры, но не способных образовывать глобулы.

Следующие гидрофобно-модифицированные полимеры были использованы в сравнительном анализе:

1. Гидрофобно-модифицированный хитозан (ГМХ) Babak V.G., Desbrieres J., Tikhonov V.E. // Colloids Surf. A. - 2005. -V.255. - P. 119.

2. Сополимер акриламида и додецилметакрилата (АМ/ДДМК)

[-CH₂-C(CONH₂)H-]_x-[-CH₂-C(CH₃)(COOC₁₂H₂₅]_y; Shashkina Y.A., Zaroslov Y.D., Smirnov V.A., Philipova O.E., Khokhlov A.R., Pryakhina T.A., Churochkina N.A. // Polymer. - 2003. - V.44. - P.2289.

3. Сополимер акриламида и нонилметакрилата (АМ/НМК)

[-CH₂-C(CONH₂)H-]_x-[-CH₂-C(CH₃)(COOC₉H₁₉]_y.

Для различных классов растворенных веществ с различными молекулярными массами и различной степенью доступности их неполярных групп для воды имеет смысл сравнивать удельные величины параметров гидратации n=N'/c_нп, где N'=N/?N(CH₂), ?N(CH₂) - вклад в гидратацию метиленовой группы, c_нп - число атомов углерода в неполярных группах.

Изменение n при вариации содержания гидрофобов обнаружено нами в следующих пределах (рис. 20): 0.29-0.21=0.08 (гидрофобно-модифицированные хитозаны), 0.72-0.53=0.19 (сополимеры АМ/НМК), 0.72-0.50=0.22 (сополимеры АМ/ДДМК). Для перехода клубок > глобула для ПНИПАА (стрелка на рис. 20) получаем больший диапазон изменения n (0.73-0.29=0.4). Для процесса экспонирования в водное окружение неполярных групп, содержащихся в БСА, получается еще большее значение n?0.7 (стрелка на рис. 20). Таким образом, методом миллиметровой спектроскопии показано, что гидрофобная модификация полиакриламидов и хитозанов приводит к меньшей вариации параметра удельной гидратации, чем кооперативные переходы, связанные с денатурацией белков и переходом клубок-глобула для термочувствительного ПНИПАА.

Рис. 20. Зависимость относительного числа гидратации Nґ от числа атомов углерода в неполярных группах в расчете на одно звено. ПАМ и гидрофобно-модифицированный ПАМ: АМ/НМК - ¦, АМ/ДДМК - ?; БСА - _; хитозан и гидрофобно-модифицированный хитозан - ?; ПНИПАА (клубок) - ^; ПНИПАА (глобула) - ?. Прямая линия соответствует алифатическим спиртам (¦).

Миллиметровая спектроскопия позволила дифференцировать также различные конформационные состояния сополимеров N-винилкапролактама и N-винилимидазола, полученные при сополимеризации в водной среде при температуре выше точки фазового расслоения полимерной системы.

Таким образом, в четвертой главе описан метод определения параметров гидратации различных соединений с использованием миллиметровой (микроволновой) спектроскопии по эффекту упорядочения структуры воды в гидратной оболочке растворенной молекулы. При протеолизе зарегистрировано увеличение удельной величины связанной воды, что логично, поскольку происходит разворачивание белковой глобулы и увеличение поверхности контакта функциональных групп с водой. Миллиметровая спектроскопия была применена для анализа слипания казеиновых мицелл и образования гелей при медленном самопроизвольном гидролизе ?-глюконолактона, приводящем к снижению рН. Показано, что реологические параметры и гидратационные параметры ведут себя согласованным образом. Показано, что миллиметровая спектроскопия позволяет контролировать конформацию термочувствительных синтетических полимеров и белковоподобных сополимеров. Таким образом, измерение гидратации является перспективным методом, способствующим пониманию физико-химических закономерностей процессов, протекающих с участием гидрофобных эффектов.

В пятой главе описаны детали оригинальных методик, которые были предложены и использованы специально для решения поставленных в диссертационной работе задач. Среди них: методика определения общей кинетики протеолиза по накоплению аминного азота, определяемого фотометрированием N-тринитрофенильных производных продуктов протеолиза; методика приготовления казеиновых гелей при одновременном определении динамических реологических модулей; методика определения параметров гидратации с помощью миллиметровой резонансной установки, работающей в диапазоне частот 26-37 ГГц. В разделе 5.2 в качестве примера приведены две подпрограммы, входящие в пакет программы PROTEOLYSIS.

Основные результаты и выводы

1. Впервые предложена общая физико-химическая модель протеолиза, позволяющая анализировать кинетику во всем диапазоне изменения степени гидролиза пептидных связей с помощью одних и тех же уравнений. Показано, что кинетика протеолиза в общем случае соответствует двухстадийной схеме, где первая кинетически значимая стадия представляет демаскирование пептидных связей, а вторая стадия соответствует собственно гидролизу пептидных связей.

2. С использованием ЖХВД на обращенной фазе определены кинетические кривые для отдельных пептидов, образованных гидролизом пептидных связей трипсином. Получены экспериментальные данные по константам скоростей гидролиза доступных и изначально маскированных пептидных связей ?-казеина трипсином дикого типа и мутированными формами трипсина.

3. Впервые детально исследовано демаскирование гидрофобного С-концевого участка при гидролизе ?-казеина трипсином дикого типа и мутированными трипсинами. Показано, что наличие кинетики накопления пептидов с лагом связаны с маскированностью пептидных связей. Предложен механизм демаскирования пептидных связей в кластере, образованном гидрофобными участками полипептидной цепи ?-казеина.

4. Изучена суммарная кинетика гидролиза всех пептидных связей по поглощению N-тринитрофенильных производных образующихся аминогрупп при гидролизе казеиновых полипептидов химотрипсином. Впервые показано, что немонотонные участки зависимости нарастания аминного азота от степени гидролиза связаны с демаскированием пептидных связей. Экспериментально и теоретически определены области степени гидролиза, где находятся локальные максимумы скорости.

5. Изучена кинетика гидролиза пептидов в реакторе открытого типа с непрерывным удалением низкомолекулярных продуктов гидролиза. Экспериментально определены константы скорости выхода отдельных аминокислотных остатков в составе низкомолекулярной фракции продуктов гидролиза. Распределение констант скорости было шире для более демаскированного субстрата, и уже - для более маскированного пептидного субстрата.

6. Количественным электрофорезом показано, что кинетика убывания исходной полипептидной цепи соответствует кинетике 1-го порядка по субстрату. Получена оценка для отношения констант скоростей демаскирования и гидролиза пептидных связей глобулярных белков молока.

7. Впервые создана компьютерная программа, осуществляющая численное интегрирование дифференциальных уравнений, описывающих демаскирование и гидролиз пептидных связей с учетом материального баланса по субстрату и ферменту.

8. Программа PPOTEOLYSIS удовлетворительно предсказывает места расщепления цепи (сайты) для протеолитических ферментов. Достоверность предсказания продуктов протеолиза увеличивается при учете сначала вторичной специфичности, а затем и маскирования связей.

9. Разработан метод определения параметров гидратации различных соединений с использованием миллиметровой (микроволновой) спектроскопии по эффекту упорядочения структуры воды в гидратной оболочке растворенной молекулы. Измеряемой величиной было число гидратации, которое показывает количество молекул воды, потерявших вращательную подвижность из-за взаимодействия с растворенной молекулой.

10. Поскольку метод миллиметровой спектроскопии имеет различную чувствительность к гидрофобной и гидрофильной типам гидратации, нами впервые построена шкала гидрофобности природных ?-аминокислот в цвиттерионной форме, т.е. аминокислоты ранжированы в порядке увеличения гидрофобности. Для чисел гидратации и теплоемкостей гидратации было проведено сравнение вкладов в гидратацию, соответствующих гидрофобной гидратации, гидрофильной неионной и гидрофильной ионной типов гидратации. При гидролизе полипептидов и белков зарегистрировано увеличение удельной величины связанной воды.

11. Показано, что для ассоциирующих молекул по данным миллиметровой спектроскопии функциональные группы контактируют, а гидратные оболочки перекрываются с исключением молекул воды. Количественные соотношения для связанной воды рассмотрены в работе на примере ассоциации циклодекстринов с ароматическими аминокислотами. Миллиметровая спектроскопия была применена для анализа слипания казеиновых мицелл и образования гелей при медленном самопроизвольном гидролизе ?-глюконолактона, приводящем к снижению рН. Показано, что реологические параметры в рамках модели Максвелла и гидратационные параметры ведут себя согласованным образом. При добавлении в небольших концентрациях полипептидов мицеллы становятся более стабильными. В этом же диапазоне концентраций добавленных полипептидов наблюдается уменьшение концентрации связанной воды.

12. Впервые показано, что миллиметровая спектроскопия позволяет контролировать конформацию термочувствительных синтетических полимеров и белковоподобных сополимеров. Гидратационные изменения при переходах клубок-глобула сравнивали с изменением гидратации при введении гидрофобных групп в гидрофобно-модифицированные полимеры (гидрофобно-модифицированные хитозаны и полиакриламиды). Введение гидрофобных групп в эти полимеры приводит к меньшему изменению связанной воды по сравнению с изменением гидратации при денатурации глобулярных белков (БСА) и переходе клубок-глобула термочувствительного поли-N-изопропилакриламида.

химический гидролиз аминокислотный ферментативный

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах

1. Vitt S.V., Vorob'ev M.M., Paskonova E.A., Saporovskaya M.B. HPLC separation and determination of N-trinitrophenil derivatives of amino acids and peptides // J. High Resolution Chromatog. & Chrom. Com. - 1983. - V.6, N3. - P. 158-159.

2. Витт С.В., Воробьев М.М., Пасконова Е.А., Сапоровская М.Б., Беликов В.М. Определение N-тринитрофенильных производных аминокислот и пептидов методом ЖХВД // Ж. Аналит. Химии. - 1983. - Т. 38, №8. - С. 1537-1540.

3. Пасконова Е.А., Воробьев М.М., Витт С.В., Беликов В.М. Установление аминокислотного состава N-тринитрофенильных производных пептидов // Ж. Аналит. Химии. - 1986. - Т. 41, №10. - С. 1895-1897.

4. Воробьев М.М., Пасконова Е.А., Витт С.В, Беликов В.М. Зависимость свойств хроматографических фракций протосубтилиновых гидролизатов казеина от условий протеолиза // Биотехнология. - 1986. - №4. С. 40-45.

5. Belikov V.M., Kudinova E.G., Vorob'ev M.M. Kinetic description of proteolysis. Part1. Peptic hydrolysis of proteins from chicken heart: Optimization in terms of time and substrate concentration // Nahrung. - 1986. - V. 30, N5. - P. 501-506.

6. Vorob'ev M.M., Paskonova E.A., Vitt S.V., Belikov V.M. Kinetic description of proteolysis. Part 2. Substrate regulation of peptide bond demasking and hydrolysis. Liquid chromatography of hydrolyzates // Nahrung. - 1986. - V. 30, N10. - P. 995-1001.

7. Vorob'ev M.M., Vitt S.V., Belikov V.M. Kinetic description of proteolysis. Part 3. Total kinetics of peptide bond hydrolysis in peptide mixtures // Nahrung. - 1987. - V. 31, N4. - P. 331-340.

8. Vorob'ev M.M., Slobodyanikova L.S., Vitt S.V., Latov V.K., Belikov V.M. Kinetic description of proteolysis. Part 4. Hydrolysis kinetics of partial protein hydrolyzates // Nahrung. - 1987. - V. 31, N8, - P. 777-782.

9. Воробьев М.М., Федорова Е.Б., Черноглазова Н.И., Витт С.В., Беликов В.М. Регулирование функциональных свойств белковых гидролизатов // Тезисы докладов всесоюзной конференции «Химия пищевых добавок». 25-27 апреля 1989 г. - Черновцы, 1989. - С.54.

10. Хургин Ю.И., Баранов А.А., Воробьев М.М. Гидрофобная гидратация алифатических аминокислот // Изв. АН. Сер. хим. - 1994. - №11. - С. 2031-2033.

11. Хургин Ю.И., Лебедев О.В., Максарева Е.Ю., Завизион В.А., Кудряшова В.А., Воробьев М.М., Орехова Г.А., Даниленко А.Н. Межмолекулярные взаимодействия в водных растворах мебикара // Изв. АН, Сер. хим. - 1995. - №6. - С. 1178-1179.

12. Воробьев М.М., Баранов А.А., Беликов В.М., Хургин Ю.И. Исследование гидратации ?-аминокислот методом абсорбционной миллиметровой спектроскопии // Изв. АН, Сер. хим., - 1996. - №3. - С. 618-622.

13. Vorob'ev Computer simulation of hydrolysis kinetics of polymer degradation // International symposium Computer assistance to chemical research, 17-18 December 1996. - Moscow, 1996. - P. 82.

14. Воробьев М.М., Даниленко А.Н. Оценка гидратации полярных групп ?-аминокислот методом дифференциальной сканирующей калориметрии // Изв. АН, Сер. хим. - 1996. - №9. - С. 2237-2242.

15. Воробьев М.М., Левичева И.Ю., Беликов В.М. Исследование начальной кинетики гидролиза белков молока химотрипсином // Прикл. биохим. микробиол. - 1996. - Т. 32, №2. - С. 237-241.

16. Vorob'ev M.M., Parent G., Savoie L. Quantitative comparison of casein and rapeseed proteolysis by pancreatin // Nahrung. - 1996. - V.40, N5. - P. 248-255.

17. Vorob'ev M.M. The hydrophobicity scale of amino acids as determined by absorption millimeter spectroscopy: Correlation with heat capacities of aqueous solutions // Z. Naturforschung. - 1997. - V. 52c. - P. 227-234.

18. Vorob'ev M.M. General kinetic model of proteolysis // Nahrung. - 1998. - V. 42, N3/4. - P. 173.

19. Vorob'ev M.M, Goncharov D.V. Quantitative study of different states of bound water molecules in the hydration shells of peptides and proteins // Nahrung. - 1998. - V.42, N3/4. - P. 177-178.

20. Vorob'ev M.M., Goncharova I.A. Computer simulation of proteolysis. Peptic hydrolysis of partially demasked ?-Lactoglobulin // Nahrung. - 1998. - V. 42, N2. - P. 60-66.

21. Vorob'ev M.M., Buckin V., Waghorne E. Evaluation of hydrophobicity of milk proteins by absorption millimeter spectroscopy // 13^th Conference of the European colloid and interface society, 12-17 September 1999. - Dublin, Ireland, 1999. - P.91.

22. Vorob'ev M.M., Dalgalarrondo M., Chobert J.-M., Haertle T. Kinetics of ?-casein hydrolysis by wild-type and engineered trypsin // Biopolymers. - 2000. - V. 54. - P. 355-364.

23. Vorob'ev M.M. Bound water measurements in aqueous systems // 9^th Symposium on Food colloids, biopolymers and materials, 14-17 April, 2002. - Wageningen, Netherlands, 2002. - P.37.

24. Vorob'ev M.M. Water mobility around kosmotropic and chaotropic solutes: Absorption spectroscopy in the millimeter range // Water science for food, health, agriculture and environment. Z.Berk, R.B. Leslie, P.J. Lillford, & S. Mizrahi (Eds.) Lancaster & Basel: Technomic Publishing, 2001. - P. 59-72.

25. Vorob'ev M. Bound water measurements for aqueous protein solutions and food gels // Colloids and Surfaces B. - 2003. - V. 31. - P. 133-140.

26. Vorob'ev M.M., Faleev N.G. Water ordering measurements in the aqueous polymer systems by waveguide dielectric resonance method // Mendeleev Commun. - 2005. - N6. - P. 259-261.

27. M.M. Vorob'ev. Free water/bound water measurements in aqueous polymer systems // European polymer congress, 27 June - 1 July 2005. - Moscow, Russia, 2005. - P.99.

28. Vorob'ev M.M. Monitoring of water ordering in aqueous protein systems // Food Hydrocolloids. - 2007. - V. 21. - P. 309-312.

29. Vorob'ev M.M. Quantitative comparison of the hydration of proteins with protein-like synthetic polymers by millimeter-wave spectroscopy // 12^th European conference on the spectroscopy of biological molecules, 1-6 September, 2007. - Bobigny, France, 2007. - P. 139.

30. Vorob'ev M., Churochkina N., Khokhlov A., Stepnova E. Hydration characterization of hydrophobically modified polymers by dielectric measurements in the millimeter range // Macromol. Bioscience. - 2007. - V.7. - P. 475-481.

31. Vorob'ev M.M. Microwave hydration measurements in aqueous systems of proteins and synthetic polymers // XXIX European congress on molecular spectroscopy, 31 August- 5 September, 2008. - Opatija, Croatia, 2008. - P. 187.

Размещено на Allbest.ru