Идентификация метаболитов каннабимиметика FUB-PB-22 в моче

Размещено на http://www.allbest.ru/

Идентификация метаболитов каннабимиметика FUB-PB-22 в моче

Катаев Сергей Сергеевич

Судебно-химическое отделение, ГКУЗОТ «Пермское краевое

бюро судебно-медицинской экспертизы»

Дворская Оксана Николаевна

Кафедра токсикологической химии, ГБОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения Российской Федерации

Аннотация

Рассмотрен метаболизм каннабимиметика хинолин-8-ил-1-[(4-фторфенил)метил]-1H-индол-3-карбоксилат (FUB-PB-22). Выполнена идентификация метаболитов FUB-PB-22 в моче потребителей курительных смесей. Описаны газохроматографические и масс-спектрометрические характеристики некоторых производных метаболитов FUB-PB-22. Сделан вывод об аналитической значимости метаболитов FUB-PB-22, имеющих значение в экспертной практике.

Ключевые слова: FUB-PB-22, каннабимиметики, метаболизм, ферментативный гидролиз, твердофазная экстракция, газовая хроматография, масс-спектрометрия.

Введение

Во второй половине 2013 года среди компонентов курительных смесей получил распространение синтетический каннабимиметик хинолин-8-ил-1-[(4-фторфенил)метил]-1H-ин-дол-3-карбоксилат (FUB-PB-22).

FUB-PB-22 является синтетическим каннабимиметиком на основе алкилиндола и пред-ставляет собой модификацию структуры РВ-22, полученную путем варьирования заместителя у атома азота 1 в индазольном фрагменте.

Синтетический каннабимиметик PB-22 и его производные относится к списку I наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров, оборот которых в Российской Федерации запрещен согласно Постановлению правительства РФ №580 от 10.07.2013 [1].

Синтетический каннабимиметик FUB-PB-22 на сегодняшний день не является контролируемым законодательством РФ веществом.

Метаболизм описанных ранее производных алкилиндола (JWH-018, JWH-250, JWH-203 и другие) протекает по пути гидроксилирования с последующим образованием конъюгатов с глюкуроновой кислотой [2].

Каннабимиметики PB-22 и PB-22F, содержащие в своей структуре сложноэфирную связь, подвергаются биотрансформации, главным образом, путем гидролиза эфирной связи с образованием карбоксильных метаболитов. Последние предложены в качестве маркеров для целей выявления случаев употребления каннабимиметиков PB-22 и PB-22F [3].

Фармакология каннабимиметика FUB-PB-22 является неисследованной. В связи с этим изучение метаболизма нового каннабимиметика представляется весьма актуальной задачей для практики химико-токсикологических и судебно-химических лабораторий.

Цель нашей работы - идентификация метаболитов синтетического каннабимиметика FUB-PB-22 в моче потребителей курительных смесей с применением твердофазной экстракции (ТФЭ) и газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС).

Экспериментальная часть

Оборудование. Газовый хроматограф Agilent 7820, массселективный детектор Agilent 5975 Agilent, США, колонка капиллярная НР-5MS, внутренний диаметр 0.25 мм, длина 30 м, толщина пленки 0.25 мкм. Для твердофазной экстракции применяли систему с вакуумной камерой на 12 позиций Supelco, насос низкого вакуума AIR CADET, США. Термоблок ПЭ-4030, одноканальный испаритель ПЭ-2300, микровстряхиватель ПЭ-2 (ОАО Экрос, Россия). Полуавтоматические пипетки-дозаторы, позволяющие отбирать объемы жидкостей 4-40, 40-200 мкл и 0.2-1, 1-5 мл. В качестве источника микроволнового излучения применяли бытовую микроволновую печь Rolsen MS1770SA Россия.

Материалы. В исследовании применялись патроны для ТФЭ SampliQ EVIDEX - 200 мг-3 мл Agilent, США. Бис-триметилсилил-трифторацетамид BSTFA, содержащий 1% триметилхлорсилана; в-глю-куронидаза, Type HP-2, From Helix Pomatia, 101400 ЕД/мл Sigma-ALDRICH CHEMI, Германия. Все используемые растворители и реактивы градации «х.ч.». Пробы мочи до исследования хранились при + 4 ^оС.

Подготовка проб. К пробам мочи объемом по 0.5 мл прибавляли по 50 мкл спиртовых растворов внутренних стандартов: этилморфина гидрохлорида (0.02 мг/мл), N-этилбензиламина (0.01 мг/мл) и гексенала (0.2 мг/мл). Далее проводили предварительную подготовку образцов с применением ферментативного гидролиза. К пробе мочи прибавляли 250 мкл 1/15М фосфатного буфера pH 6 и 25 мкл в-глюкуронидазы, флакон укупоривали и выдерживали при 45 ^оС в течение 2 часов.

К образцам мочи без гидролиза и после гидролиза прибавляли 2 мл 1/15 М фосфатного буфера (рН 4.8). Содержимое флаконов центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут, центрифугат отделяли от осадка.

Для экстракции использовали патроны для ТФЭ SampliQ EVIDEX (200 мг/3 мл) со смешанной фазой. Кондиционирование сорбента осуществляли путем последовательного пропускания через картридж 2 мл 95% этанола и 2 мл 1/15 М фосфатного буфера (рН 4.8). Далее загружали образец со скоростью 1 мл/мин. Промывку проводили последовательно: 1 мл 1/15 М фосфатного буфера (рН 4.8) и 1 мл 10% этанола. Сушку патрона производили под вакуумом в течение 10-15 минут. Элюат I получали двукратным пропусканием через патрон смеси н-гексан-этилацетат (3:1) по 2 мл. Элюат II - двукратным пропусканием через патрон смеси дихлорметан-изопропанол - 25% аммиак (4:1:0.1) по 2 мл. Элюаты I и II испаряли в токе азота при 40 ^оС.

Получение производных проводили по одному из вариантов, указанных ниже.

Ш Метилирование. К сухому остатку элюата I прибавляли 500 мкл безводного ацетона, 40 мкл йодистого метила и 20-25 мг безводного карбоната калия, герметично закрывали и нагревали при 60 ^оС в течение 60 минут в термоблоке. Флакон охлаждали, отбирали жидкую фракцию реакционной смеси, переносили в чистую виалу и испаряли в токе азота при 40 ^оС. Сухой остаток растворяли в 100 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводили в испаритель ХМС.

Ш Ацетилирование. К сухому остатку элюата II прибавляли 40 мкл безводного пиридина и 60 мкл уксусного ангидрида (замывая стенки виалы), виалу плотно укупоривали и обрабатывали микроволновым излучением в СВЧ - печи с мощностью 560 Вт в течение 5 минут. После охлаждения флакон вскрывали и выпаривали избыток реагентов в токе азота (не выше 40 ^оС). Сухой остаток растворяли в 100 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводили в испаритель ХМС.

Ш Получение триметилсилиловых эфиров. К сухому остатку элюата I или II прибавляли 100 мкл BSTFA, содержащего 1% триметилхлорсилана, герметично закрывали, перемешивали на микровстряхивателе и нагревали при 80 ^оС в течение 60 минут в термоблоке. Виалу охлаждали и 2 мкл вводили в инжектор хромато-масс-спектрометра.

Режим работы газового хроматографа с масс-селективным детектором. Скорость потока газа-носителя (гелий) через колонку 1.5 мл/мин, режим работы split/splitless (деление потока 15:1, с задержкой включения 1 мин после ввода пробы). Температура испарителя хроматографа и интерфейса детектора задавалась 250 и 280 ^оС. Температура колонки: начальная 70 ^оС в течение 2 мин и прогрев до 280 ^оС со скоростью программирования 20 град/мин, выдержка при конечной температуре 8 мин.

Напряжение на умножителе масс-селективного детектора устанавливали равной величине автоматической настройки детектора. Регистрация масс-спектров для ацетильных и метильных производных в режиме полного сканирования ионов в интервале масс 42-450 а.е. Регистрация масс-спектров триметилсилильных производных в режиме полного сканирования ионов в интервале масс 100-700 а.е.

Обработку хроматограмм с целью идентификации компонентов проб проводили с использованием программ ChemStation G1701DA и AMDIS (The Automatic Mass Spectral Deconvolution and Identification System, NIST). Степень конъюгирования метаболитов FUB-PB-22 определяли для их метиловых эфиров по отношению площади пиков иона с величиной: для М1 и М2 m/z 109 и площади пика иона m/z 235 для N-метилгексенала (внутренний стандарт) в элюате I мочи без гидролиза и с гидролизом. Аналогично степень коньюгирования 8-гидроксихинолина устанавливали для ацетильного производного с использованием отношения площади пика иона с величиной m/z 145 и площади пика иона m/z 355 для ацетилированного этилморфина (внутренний стандарт) в элюате II.

Результаты расчетов физико-химических констант (LogP, K_OC) получены с использованием пакета программ ACD/Labs v6.0 (Advanced Chemistry Development Inc., Toronto, Canada).

Результаты и их обсуждение

метаболит каннабимиметик хинолин моча

Общая химическая структура каннабимиметика FUB-PB-22 и его метаболитов, идентифицированных при исследовании образцов мочи лиц, употреблявших курительные смеси, представлена на рис. 1.

Рис. 1. Химическая структура каннабимиметика FUB-PB-22 и его идентифицированных метаболитов (8-ОХ - 8-гидроксихинолин)

Структуры метаболитов определяли на основании масс-фрагментации выявленных пиков на хроматограммах, полученных при исследовании проб мочи. При анализе учитывали известные сведения о пути метаболизма синтетических каннабимиметиков алкилиндольного ряда [2], а так же PB-22 и PB-22F [3, 4].

Для установления свойств функциональных групп применяли различные виды дериватизации, а также последовательное их сочетание.

На рис. 2-8 приведены структуры, масс-спектры и индексы удерживания некоторых производных метаболитов FUB-PB-22.

Рис. 2. Масс-спектр, индекс удерживания и структура метилового эфира метаболита М1

Для всех приведенных соединений в масс-спектрах наблюдается молекулярный ион-радикал, соответствующий молекулярной массе соединения.

Имеются общие направления фрагментации, характерные для эфиров, образованных карбоксильной группой метаболитов: для метиловых эфиров такие как [М-31]⁺, для триметилсилильных дериватов - [М-89]⁺.

Также наблюдается ион, обусловленный фрагментацией фторбензильного радикала в положении 1 индольного цикла для метаболитов М1 и М2 с величиной m/z 109. Локализация на 4-фторбензольном фрагменте положительного заряда даёт стабильный ион с величиной m/z 109, который имеет в спектре интенсивность 100%.

Масс-фрагментация триметилсилилового эфира 1-[(4-фторфенил)метил]-1H-индол-3-карбоновой кислоты под действием электронного удара приведена на рис. 9.

Рис. 3. Масс-спектр, индекс удерживания и структура метилового эфира метаболита М2

Рис. 4. Масс-спектр, индекс удерживания и структура диметилового эфира метаболита М2

Рис. 5. Масс-спектр, индекс удерживания и структура триметилсилилового эфира метаболита М1

Использование при пробоподготовке ТФЭ позволило провести фракционирование веществ на вещества кислотного и основного характера.

Идентифицированные метаболиты М1 и М2 каннабимиметика FUB-PB-22 были обнаружены в элюате I. В элюате II выявлялся 8-гидроксихинолин.

Производные 8-гидроксиксихинолина идентифицировали по коммерческим библиотекам масс-спектров (NIST'11, DesDrug_2011.L) и с использованием аналитического стандарта.

Рис. 6. Масс-спектр, индекс удерживания и структура бис-триметилсилилового эфира метаболита М2

Рис. 7. Масс-спектр, индекс удерживания и структура ацетилированного 8-гидроксихинолина

Рис. 8. Масс-спектр, индекс удерживания и структура триметилсилилового эфира 8-гидроксихинолина

Расчеты физико-химических констант логарифма коэффициента распределения октанол-вода (LogP) и коэффициента адсорбции (K_OC) показывают, что каннабимиметик FUB-PB-22 и и его метаболиты М1-М2 являются высоколипофильными веществами, а 8-гидроксихинолин (8-ОХ) - низколипофильным.

Результаты расчетов и полученных нами данных представлены в таблице.

Таблица. Характеристика каннабимиметика FUB-PB-22 и его основных метаболитов

* Н.д. - не детектируется.

Рис. 9. Масс-фрагментация триметилсилилового эфира 1-[(4-фторфенил)метил]-1H-индол-3-карбоновой кислоты

Следствием значительной липофильности метаболитов FUB-PB-22 является высокий процент их конъюгирования в организме человека.

Исследование пяти образцов мочи потребителей каннабимиметика FUB-PB-22 показало, что основные метаболиты выводятся в конъюгированном виде от 65 до 100%.

Таким образом, основными метаболитами каннабимиметика FUB-PB-22, определяющимися в моче, являются 1-[(4-фторфенил)метил]-1H-индол-3-карбоновая кислота, ее гидрокси-производное М2 и 8-гидроксихинолин.

В силу выраженного характера метаболита М1 в сочетании с 8-гидроксихинолином в исследованных объектах, они могут использоваться в качестве маркеров употребления каннабимиметика FUB-PB-22 у потребителей курительных смесей.

Выводы

1. Описаны метаболиты синтетического каннабимиметика хинолин-8-ил-1-[(4-фторфенил)-метил]-1H-индол-3-карбоксилата (FUB-PB-22), идентифицированные в моче лиц, употреблявших курительные смеси.

2. Приведены газохроматографические и масс-спектрометрические характеристики некоторых производных основных метаболитов FUB-PB-22, которые могут быть использованы для целей судебно-химического и химико-токсикологического анализа.

3. Установлено, что идентифицированные метаболиты FUB-PB-22, выводятся из организма человека с мочой в конъюгированном виде.

4. Показана возможность выявления основных метаболитов синтетического каннабимиметика FUB-PB-22 в процедуре скрининга мочи на наркотические и лекарственные вещества с применением методов твердофазной экстракции и газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

Литература

1. О внесении изменений в некоторые акты правительства Российской Федерации в связи с совершенствованием контроля за оборотом наркотических средств, прекурсоров наркотических средств и психотропных веществ [Электронный ресурс]: Постановление Правительства РФ №580 от 10.07.2013. Консультант Плюс: Правовые акты по здравоохранению. [2013]. (Технология проф).

2. Савчук С.А., Григорьев А.М. Хромато-масс-спектрометрический анализ в наркологической и токсикологической практике. М.: ЛЕНАНД. 2013. 224с.

3. Катаев С.С., Зеленина Н.Б., Дворская О.Н. Идентификация маркеров каннабимиметиков PB-22 и PB-22F в моче методом ГХ-МС. Бутлеровские сообщения. 2013. Т.34. №4. С.116-122.

4. Катаев С.С., Мелентьев А.Б., Дворская О.Н. Идентификация метаболитов каннабимиметика PB-22 в моче. Бутлеровские сообщения. 2013. Т.36. №10. С.29-36.

Размещено на Allbest.ru