Разработка методов синтеза наночастиц селена со стабилизацией поверхности при помощи TWEEN 80

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство Сельского хозяйства Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования

«Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»

Факультет ветеринарной медицины, пищевых и биотехнологий

Кафедра микробиологии, биотехнологии и химии

ДОПУЩЕНО к защите:

Зав. кафедрой____________ О.С. Ларионова

«____»_________________ 2020 г.

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА

Магистерская диссертация на тему:

«Разработка методов синтеза наночастиц селена со стабилизацией поверхности при помощи TWEEN 80»

Направление подготовки

19.04.01 Биотехнология

Направленность (профиль)

Биотехнология

Обучающийся:

Артюх Юлия Михайловна

Саратов 2020



Содержание

Введение

Раздел 1. Аналитический обзор научно-технической информации по теме исследования

1.1 Селен

1.2 Наночастицы селена

1.3 Определение структуры материалов, содержащих наночастицы

1.3.1 Рентгенофазовый анализ

1.3.2 ТЕМ

1.3.3 EXAFS - спектроскопия

1.4 Тонкослойная хроматография. Экспресс метод анализа химических соединений

1.5 Поверхностно-активные вещества

Раздел 2. Объекты, материалы и методы исследования

2.1 Характеристика оборудования и исходных веществ

2.1.1 TWEEN-80

2.1.2 25%-й раствор аммиака в воде

2.1.3 Водорода пероксид

2.1.4 Диацетофенонилселенид

2.2 Синтез наночастиц селена из диацетофенонилселенида при температуре 25 ^оС в среде C₁₂H₂₂O₁₁ под воздействием аммиака

2.3 Синтез наночастиц селена из диацетофенонилселенида при температуре 25 ^оС в среде TWEEN 80 под воздействием перекиси водорода

2.4 Синтез наночастиц селена из диацетофенонилселенида при температуре 17 ^оС в среде TWEEN 80 под воздействием перекиси водорода

2.5 Синтез наночастиц селена из диацетофенонилселенида при температуре 25 ^оС в среде TWEEN 80 под воздействием аммиака

2.6 Синтез наночастиц селена из диацетофенонилселенида при температуре 17 ^оС в среде TWEEN 80 под воздействием аммиака

2.7 Синтез наночастиц селена из диацетофенонилселенида при температуре 25^оС в среде TWEEN 80 под воздействием высокой концентрации аммиака

2.8 Синтез наночастиц селена из диацетофенонилселенида при температуре 50 ^оС в среде TWEEN 80 под воздействием аммиака

2.9 Синтез наночастиц селена при повышенной концентрации диацетофенонилселенида при температуре 50 ^оС в среде TWEEN 80 под воздействием аммиака

2.10 Синтез наночастиц селена при повышенной концентрации диацетофенонилселенида при температуре 25 ^оС в среде TWEEN 80 под воздействием аммиака

2.11 Определение нано- и микрочастиц электронным микроскопом

Раздел 3. Обсуждение результатов

3.1 Синтез наночастиц селена из диацетофенонилселенида в среде C₁₂ H₂₂ O₁₁ под воздействием аммиака

3.2 Результату проведения ТСХ анализа наночастиц селена из диацетофенонилселенида в среде C₁₂ H₂₂ O₁₁ под воздействием аммиака

3.3 Стерилизация наночастиц селена из диацетофенонилселенида в среде

C₁₂ H₂₂ O₁₁ под воздействием аммиака

3.4 Синтез наночастиц селена из диацетофенонилселенида в среде

TWEEN 80 под воздействием перекиси водорода

3.5 Синтез наночастиц селена из диацетофенонилселенида в среде

TWEEN 80 при температуре 50 ^оС

3.6 Синтез наночастиц селена из диацетофенонилселенида в среде

TWEEN 80 при температуре 25 ^о С

3.7 Синтез наночастиц селена из диацетофенонилселенида в среде

TWEEN 80 при температуре 17 ^оС

3.8 Синтез наночастиц селена из диацетофенонилселенида в среде TWEEN 80 при повышенной концентрации 25%-й раствор аммиака в воде

3.9 Результаты электронной микроскопии

3.10 Оптимальные условия для получения наночастиц селена из диацетофенонилселенида

Заключение

Практическое предложение производству

Список сокращений

Список используемой литературы



Введение

Для нормальной жизнедеятельности организма, кроме органических веществ - жиров, углеводов и белков, большое значение имеют неорганические вещества - минеральные соли и вода. Минеральные вещества активно участвуют во всех биохимических и межклеточных процессах происходящих внутри животного и человека. На текущий день таблица Менделеева насчитывает почти 120 химических элементов. Более 80-ти из них играют важную роль в процессах обмена и входят в состав всех органов и тканей организма. Из них около 20-ти макро- и микроэлементов необходимы для нормальной жизнедеятельности животного и человека [6].

Для нормального роста и развития организм должен получать с пищей достаточное количество минеральных веществ, в том числе МЭ. МЭ влияют на рост и развитие животных и человека. Они повышают их продуктивность, плодовитость и устойчивость к различным заболеваниям. Селен является одним из наиболее дефицитных МЭ, играющим в организме весьма важную биологическую роль. Селен является незаменимым микроэлементом в жизнедеятельности животных и человека, поэтому поиск новых форм его доставки в организм является актуальной задачей. Селен является эссенциальным микроэлементом для человека, животных и растений, основной функцией которого является защита организма от оксидантного стресса. Он обеспечивает активность многих окислительно-восстановительных ферментов, витаминов. [11].

Селен является биологически активный микроэлемент, незаменимый для жизнедеятельности человека и животных, входящий в состав большинства гормонов и ферментов. Дефицит селена ведет к развитию различных процессов поражения клетки, лежащих в основе возникновения многих патологических состояний. Учитывая достижения науки в последние десятилетия, а особенно развитие нанонауки, стоит отметить, что получение селена в наноразмерном состоянии приведет к получению материалов с новым уровнем физико-химических характеристик. Именно с этим связано разнообразие новых методов получения наноразмерного селена. Сконструированные НЧ обладают уникальными физико-химическими свойствами, которые делают их чрезвычайно привлекательными для применения в различных сферах жизнедеятельности человека, в том числе медицине, сельском хозяйстве, пищевой и парфюмерно-косметической промышленности. При выборе химической формы селена следует обращать внимание на эффективность и безопасность, а также учитывать тот факт, что биохимический маршрут органической и неорганических форм селена схожий. Наиболее перспективным является применение наночастиц селена (размер 20-70 нм), основное преимущество которого, по сравнению с другими формами, заключается в его более низкой токсичности, что позволяет применять его в дозах значительно превышающих суточную потребность. Кроме этого, наноселен обладает так называемым размерным эффектом, проявляющимся тем, что частицы являются биологически более активными и лучше накапливаются в тканях.

Последствиями недостатка селена в организме могут стать: заболевания сердца, ожирение, нарушение зрения, атеросклероз, замедление метаболизма, нарушение функции печени, рассеянный склероз, болезни поджелудочной железы, бесплодие. У животных к числу обусловленных дефицитом заболеваний, в которых может играть определенную роль селен, относятся мышечная дистрофия у овец и коров, экссудативный диатез у цыплят и некроз печени у свиней и крыс. При селеновой недостаточности снижается репродуктивная функция, замедляется рост животных. При недостатке селена в организме нарушаются липидный, углеводный и жировой обмен [7, 8, 21].

Установлено, если в организме содержание селена не достаточно, то это может привести к возникновению и размножению атипичных клеток и онкологии. Если в организм ввести достаточное количество селена, то ферменты успевают эту атипичную клетку вычислить и уничтожить. То есть, они не только препятствуют образованию этих клеток, но и уничтожают уже образовавшиеся. Такое положительное воздействие селен оказывает при всех опухолевых процессах, в том числе при заболеваниях крови и различных доброкачественных новообразованиях [36, 14].

Для обеспечения физиологических потребностей человека перспективно использование элементарного (нульвалентного) селена в наноразмерном состоянии [9]. При переходе в наноразмерное состояние изменяется ряд фундаментальных характеристик вещества. [16, 28]. Наночастицы селена проявляют цитотоксическое воздействие на опухолевые клетки и рассматриваются также в качестве эффективных носителей для адресной доставки in vivo лекарств, генетических материалов, белков и т.п. Хорошо «настраиваемые» поливалентные структуры поверхности селеновых наночастиц обеспечивают удобную платформу для интеграции нескольких терапевтических препаратов или биомакромолекул с ковалентным или нековалентным конъюгированием.

Наночастицы имеют множество положительных свойств: их можно легко транспортировать, присоединять к их поверхности терапевтические и диагностические вещества, а также иммуноактивные биомолекулы. Эти уникальные свойства наночастиц делают их пригодными как для диагностики, так и для терапевтического применения при лечении различных заболеваний [27].

На основе принципиально новых свойств наночастиц создаются такие наноматериалы и нанокомпозиции, которые способны коренным образом изменить диагностику и лечение заболеваний и таким образом открыть новую ступень в развитии медицинских технологий, которую уже общепризнанно называют наномедициной. Поэтому разработка новых методов синтеза наночастиц селена является актуальной задачей и представляет интерес, как с прикладной, так и фундаментальной точки зрения.

Основная проблема получения наночастиц в растворах - это агломерация. Ее решение возможно двумя основными путями: введением поверхностно-активного вещества и быстрым извлечением частиц из раствора. Стабилизировать коллоидную систему необходимо начиная с самых ранних этапов синтеза наночастиц. [34, 58]. Для частиц наноразмеров 20--50 нм из-за их высокой поверхностной энергии не существует инертной среды, поскольку в любой среде на поверхности отдельно взятой наночастицы всегда имеются продукты взаимодействия со средой, оказывающие существенное влияние на свойства наночастиц. Наноразмерные частицы довольно подвижны и при столкновении слипаются, тогда требуется каким-либо способом подавить их агрегацию. Чтобы получить устойчивые системы, в них вводятся ПАВ. Снижается энергии поверхностного натяжения на границе раздела фаз и ПАВ покрывает поверхность наиочастицы и препятствует их агрегированию. Следует заметить, что химическая природа этого слоя оказывает существенное влияние на свойства наночастицы.

Цель выпускной квалификационной работы:

1. изучить влияние наночастиц селена на организм животного и человека;

2. разработать метод синтеза наночастиц селена со стабилизацией поверхности;

3. установить наиболее эффективную для синтеза концентрацию диацетофенонилселенида;

4. подобрать оптимальное соотношение окислителя и восстановителя для синтеза наночастиц селена;

5. установить оптимальные условия и сроки хранения наночастиц селена.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи: 1. разработка метода синтеза наночастиц селена из диацетофенонилселенида с использованием окислителей и восстановителей при применении стабилизатора;

2. установление условий и времени хранения наночастиц селена.



Раздел 1. Аналитический обзор научно-технической информации по теме исследования

1.1 Селен

Селен является одним из наиболее недостающих МЭ, представляющий в организме животного и человека весьма важную биологическую роль. При этом необходим критический анализ известных путей коррекции недостатка селена в питании, среди которых наиболее предпочтительным следует признать биомодификацию неорганических форм селена в органические путем включения в метаболические пути макро- и макроорганизмов [18, 49].

Выявлено, что селен является одним из ключевых МЭ, который необходим для нормального функционирования животных и человека. Селен участвует в регуляции проницаемости клеточных мембран, предотвращения миопатии желудка и сердца, фиброзной дегенерации поджелудочной железы. Однако ввод селена в рационы требует строгого нормирования. Суточная норма потребления селена для женщины -- 55 мкг в сутки; для мужчины -- 70 мкг в сутки. Недостаток селена приводит к снижению прироста живой массы, ухудшению состояния оперения у птиц, мышечной дистрофии, развитию экссудативного диатеза [53]. Селен важен для организма в том, что он поддерживает работы сердечно - сосудистой и иммунной системы, препятствует образованию тромбов и способствует очищению сосудов от холестериновых бляшек. Значительную роль играет селен в координации действия ионов меди, йода, железа и других микроэлементов, что содействует активизации метаболизма ферментов и энергетического обмена. Также, селен важен и в том, что он препятствует разрушению организма алкоголю, никотину и канцерогенным веществам, которые попадают в организм из окружающей среды. Кроме того, селен увеличивает способность лейкоцитов различать патогенные микроорганизмы, что повышает продукцию интерлейкинов, что улучшает иммунную защиту. Употребление человеком продукты содержащие селен ведет к нормализации аппетита. Также, поднимается настроение, улучшается сон, прекращаются головокружение и головные боли. Селен защищает организм от отравлений свинцом, кадмием, ртутью, табачным дымом и выхлопными газами. Он предотвращает разрушение и некроз печени, способствуя выведению из организма тяжелых металлов. Аллергические заболевания и риск развития бронхиальной астмы тесно связаны с обменом селена [11, 24, 49,].

Селен улучшает сопротивляемость организма вирусам и бактериям, стимулирует образование интерферона, препятствует образованию свободных радикалов, которые разрушают клетки организма. Он способствует выработке лейкоцитов, которые осуществляют активное участие в борьбе с инфекциями и воспалениями. Также, селен улучшает выработку эритроцитов, в составе которых присутствует железо - переносчик кислорода в организме. Селен входит в состав многих белков, где также выполняет определенные функции. Так, например, селен в белке печени предотвращает развитие опухоли. Вместе с витаминами Е и С предупреждает окислению клеток организма. Таким образом, селен является сильным антиоксидантом [41].

Без селена не происходит синтез глутатионпероксидазы - фермента предупреждающего окисление клетки. Также он предохраняет нуклеиновые кислоты от повреждений. Вместе с другими микроэлементами, такими как кобальт и магний, селен контролирует нормальное деление клеток, защищает структуру ДНК, восстанавливает поврежденные клетки, предупреждает развитие новообразований. Селен разрушает афлатоксины - ядовитые выделения хлебных плесневых грибов, которые в организме человека разрушают печень. Селен оказывает большое влияние на здоровье сердца и сердечной мышцы, так как участвует в выработке кофермента Q_-10. Этот микроэлемент содержится в сетчатке глаза, что прямым образом влияет на остроту зрения. Также, селен входит в состав тестостерона - мужского полового гормона. МЭ селен входит в состав более 200 гомонов и ферментов, которые регулируют деятельность органов человека и животного [42].

Многие специалисты рассматривают селен как необходимый компонент благополучного лечения и профилактики заболеваний щитовидной железы, в том числе связанных с дефицитом йода. Вместе с йодом селен обеспечивает нормальную работу щитовидной железы [22].

Нехватка селена в организме проявляется в значительном снижении иммунитета, плохо заживают раны, травмы, повышается риск сердечнососудистых и онкологических заболеваний. В организме перестает вырабатываться пероксидаза - очень сильный антиокислительный фермент. Нехватка селена способствует замедлению обмена веществ, что приводит к лишней полноте. Дефицит селена может возникнуть из-за приема некоторых лекарственных препаратов - парацетамол, препараты против малярии, фенацетин [43].

Именно поэтому селен, в небольших дозах (от 50 мкг до 75 мкг) нужен каждому человеку. В природе этот элемент встречается достаточно редко, в небольших количествах в виде примесей к молибдену, сернистым металлам, к самородной сере. Чаще всего он встречается в местах, где есть вулканы. В хорошо аэрируемых почвах этот элемент присутствует в виде селенатов. Соединения селена с железом часто встречаются на заболоченных и кислых почвах [49].

Дефицит селена может привести к развитию атипичных клеток, которые образуются в результате накопления недоокисленных продуктов распада [43, 65]. Такие продукты распада вызывают токсический эффект внутри клеток, что в конечном итоге приводит к образованию атипичных (раковых) клеток. При нормальном (достаточном) количестве селена происходит выработка ферментов, которые способны обнаружить и уничтожить атипичную клетку [65]. Защитная роль Se в отношении химически индуцированных опухолевых клеток была установлена в 1949 г. [58].

Спустя 20 лет появилось первое сообщение о связи между содержанием Se в растениях и смертностью от некоторых злокачественных опухолей [74]. Установлено, что смертность от онкологических заболеваний у лиц, проживающих в районах США с высокой концентрацией Se в кормовых культурах, значительно ниже, чем в районах с низким содержанием этого микроэлемента [75]. Многочисленные исследования в различных странах подтвердили увеличение частоты развития рака предстательной, щитовидной, молочной железы, легкого, шейки матки, полости рта, пищеварительного тракта, прямой кишки при дефиците Se в организме [68].

Установлено, что повышение содержания Se в рационе животных может стимулировать репарацию поврежденных ДНК, вызываемую канцерогеном [68]. Доказано, что Se может обладать эффективными профилактическими противоопухолевыми качествами. По данным ряда авторов, дополнительный прием Se снижал частоту развития опухолей более чем на 35% [62]. Клинические испытания в США показали, что у пожилых людей потребление Se уменьшало риск развития онкологических заболеваний на 65% [68].

С действием ферментов, содержащих Se, связывают многообразные возможности противоракового воздействия: влияние на оксидантный стресс, детоксикацию и метаболизм канцерогенов, индукцию апоптоза и пролиферацию клеток, метилирование и восстановление ДНК, контроль клеточного деления и воспаления, продукцию гормонов, иммунную функцию [62, 63]. Se оказывает антимутагенное действие, подавляет экспрессию онкогенов, ингибирует активность протеинкиназы С, тормозит ангиогенез, повышает активность противоопухолевых клонов естественных киллеров, стимулируя продукцию интерлейкина-1 и интерлейкина-2 [64].

Согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения, норма суточного потребления селена составляет 50-200 мкг, однако оптимальной для поддержания стабильной активности селеноэнзимов является доза 50-70 мкг (70 мкг для взрослых мужчин и 55 мкг для взрослых женщин) [19]. Проблемы дефицита Se возникают при дозе менее 11 мкг/сут. Для организма жителей Европы считается приемлемым поступление Se в количестве 50 мкг/сут, в США -- 70 мкг/сут для взрослых мужчин и 55 мкг/сут для взрослых женщин, такие же дозы рекомендованы Институтом питания РАМН [20]. Фармакологическая доза Se в 200--300 мкг/сут, по мнению многих авторов, обеспечивает профилактику некоторых видов рака, включая колоректальный рак, рак легкого и РПЖ [51, 61]. Не отмечено токсических осложнений при использовании Se в дозе 600--800 мкг/сут [51]. Клинические проявления селеноза (токсические эффекты) выявлены при использовании Se в дозах от 1540--1600 мкг/сут, а повреждение ДНК -- в дозах 3200--5000 мкг/сутки [45].

В настоящее время в ветеринарии и медицине для компенсации дефицита селена в организме животного и человека в основном используются его неорганические соединения или препараты, полученные биотехнологическим методом из микроорганизмов. В России используются менее токсичные синтетические селеноорганические соединения. Представлены «Селенобелом» и «СеленАктивом», активная часть которых относится соответственно к трициклическому халькоген-1,5-дикетону и селеноксантену. В кормах применяют обширный спектр препаратов селена и селенсодержащих кормовых добавок. Известны неорганические формы селена, такие как селенит и селенат натрия, органические формы, например, селенометионин, селеноцистеин (селенсодержащие аминокислоты), препараты на основе дрожжей, включающие биодоступный селен, препарат ДАФС 25К, включающий селен в форме диацетофенонилселенида. В исследованиях на животных было показано, что биологическая доступность селена из органических соединений выше, чем из неорганических [32].



1.2 Наночастицы селена

Нанотехнология на сегодняшний день занимает важное место в поле современных исследований, которые занимаются конструированием, синтезом и манипулированием структурами частиц в интервале от 1-100 нм. Одним из главных направлений в исследованиях нанотехнологии, является синтез НЧ отличающихся по химическому составу, размеру и морфологии.

Изучение наноструктур интенсивно началось двадцать лет назад, и уже активно используется в повседневной практике. Хотя слово нанотехнология является относительно новым, устройства и структуры нанометровых размеров не новы. На самом деле они существуют на Земле столько же, сколько существует сама жизнь [48]. При таком размере частиц, измеряемых в нанометрах (1 нанометр = 10^-9 метра), физико-химические свойства материалов существенно изменяются, или даже приобретаются абсолютно новые уникальные качества - это может касаться электрических, механических, магнитных, температурных, оптических и иных свойств материала. На основе новых свойств наночастиц создаются такие нанокомпозиции и наноматериалы, которые способны изменить диагностику и лечение заболеваний и таким образом открыть новую ступень в развитии медицинских технологий, которую уже общепризнанно называют наномедициной [55].

В последние годы значительно повысился научный и практический интерес к исследованию процессов получения и свойств наночастиц, относящихся к числу перспективных наноматериалов, спектр применений которых расширяется. В настоящее время наиболее широкое распространение получили ферромагнитные и лекарственные наносуспензии. Лекарственные наносуспензии благодаря высокой дисперсности содержащихся в них частиц лекарственных веществ, обладают повышенной биоактивностью и степенью усвоения (всасывания) организмом, что значительно увеличивает терапевтическое действие суспензий и делает их особенно эффективными для внутреннего применения, в частности, для внутривенной инъекции [23, 26].

Бесспорно, наночастицы имеют множество положительных свойств: их можно легко транспортировать, присоединять к их поверхности диагностические и терапевтические вещества, а также иммуноактивные биомолекулы. Эти поистине уникальные свойства наночастиц делают их пригодными как для диагностики, так и для терапевтического применения при лечении различных заболеваний. Наночастицы обладают пониженной токсичностью и малым временем для высвобождения лекарственного средства в системе кровообращения из-за их специфической и целевой характеристики [35, 47].

На основе новых свойств наночастиц создаются такие наноматериалы и нанокомпозиции, которые способны коренным образом изменить диагностику и лечение заболеваний и таким образом открыть новую ступень в развитии медицинских технологий, которую уже общепризнанно называют наномедициной.

Основное фармакологическое применение существующих в настоящее время наночастиц состоит в использовании их как носителей лекарств [67, 71]. Именно наночастицы делают реальностью мечту многих поколений исследователей и врачей о прицельной доставке лекарств к месту патологического процесса с возможностью их контролируемого высвобождения. При этом применение наночастиц как носителей лекарств может облегчить всасывание и прохождение их через биологичекие мембраны, защитить от метаболизма, улучшить профиль тканевого распределения и усилить проницаемость в клетку. Вследствие этого существенно повышается безопасность применения лекарств, уменьшаются их токсичность и риск развития побочных эффектов [60]. Это особенно важно при лечении опухолевых процессов, малярии, нозокомиальных инфекций, когда приходится использовать довольно токсичные для здоровых тканей препараты. Таким образом, внедрение наночастиц в фармакологию ведет к поистине революционным изменениям в направленности действия биологически активных веществ [70, 71]. Профилактическое и лечебное применение нано-Se улучшает морфофункциональное состояние печени. Метаболическая гетерогенность, которая наблюдается при зональных повреждениях печени при токсическом воздействии углеводородов слабо выражается или вовсе не выражается после добавления наночастиц селена [16].

Особый интерес представляют наночастицы селена, поскольку этот химический элемент имеет уникальные фотоэлектрические, полупроводниковые, каталитические и биологические свойства. Наночастицы селена, в отличие от антибиотиков, способны оказывать свое действие постоянно [16, 28].

Использование неорганических форм селена (селенит- и селенат-ионов) может вызывать негативные явления, связанные с их высокой токсичностью, что предопределяет поиск других производных селена. В отличие от ионных форм наноразмерный селен менее токсичен и обладает повышенной биодоступностью, причем он не только предотвращает, но и приостанавливает развитие злокачественных опухолей. Установлено, что селен участвует в реакциях образования хлорофилла, синтезе трикарбоновых кислот, а также в метаболизме высокомолекулярных жирных кислот. Он присутствует в ряде окислительно-восстановительных ферментов вместе с железом и молибденом или один в качестве кофактора [15].

Исследованиями последних лет показана важная роль селена в регуляции жизнедеятельности растений [33]. Наиболее перспективным является применение в растениеводстве нанопрепаратов [29]. Наночастицы воздействуют на биологические объекты на клеточном уровне, внося свою избыточную энергию, повышающую эффективность протекающих в растениях процессов, т.е. являются биоактивными. Они генерируют ионы и электроны, которые быстро включаются в биохимические процессы в момент их образования [46, 27]. Таким образом, в отличие от ионных форм наночастицы обладают пролонгированным действием, что способствует повышению поглощения минеральных веществ, углеводного обмена, фотосинтеза и дыхания клеток.

В токсикологическом отношении наиболее вероятным путем попадания наночастиц в организм является ингаляционный. Поступающие ингаляционным путем наночастицы с легкостью всасываются в кровь и далее могут быть доставлены во все органы и ткани. Появление в крови меченных углеродных наночастиц было зафиксировано уже через одну минуту после их ингаляции подопытным животным [52].

Другим очевидным путем возможого попадания наночастиц в организм является желудочно-кишечный тракт. Продукты питания, вода, лекарственные препараты, косметические средства - все они могут содержать наночастицы, которые так же, как и в случае ингаляционного пути, не испытывают никаких проблем для всасывания и попадания в кровь [52].

1.3 Определение структуры материалов, содержащих наночастицы

Наноматериалы - относительно новый объект для структурных исследований. Не существует единственного метода, способного решить все структурные проблемы, существующие в этой области; как правило, используют комплекс методов, чаще всего - РФА, ТЕМ, EXAFS и ряд других.

1.3.1 Рентгенофазовый анализ

Достаточно редко рентгенофазовый анализ (рисунок 1.1) даёт картину, содержащую набор острых пиков, достаточный для идентификации состава исследуемой наночастицы с одной из известных фаз. Обычно, на рентгенограммах из всего набора пиков, характерных для данной фазы, наблюдаются один - два уширенных пика. Это, как правило, характерно для свежеполученных образцов, содержащих наночастицы диаметром меньше 5-ти нм. Для более крупных наночастиц при получении достаточно информативной рентгенограммы часто удаётся не только определить фазовый состав частицы, но и по уширению пиков оценить размеры областей когерентного рассеяния рентгеновских лучей, соответствующие средним размерам кристаллитов (наночастиц). Обычно удаётся идентифицировать достаточно тонкие структурные эффекты. Было выявлено, что в большинстве экспериментов при получении наночастиц при умеренных температурах всегда образуется высокотемпературная фаза [57]. Более того, нагревание и охлаждение до 28 К не приводит к фазовым изменениям. В работе [76] было предпринято специальное исследование возможности получения наночастиц. Установлено, что частицы, содержащие разные фазы, образуются при увеличении давления инертного газа вплоть до PAr = 0,45 Torr; при этом средние размеры частиц также увеличиваются с 15 до 45 нм. Обсуждаются возможные причины устойчивости наночастиц, движущие силы и возможный механизм трансформации фаз. Важно отметить, что по наблюдению авторов [76] длительное (более 7 суток) пребывание образцов наночастиц на воздухе не меняет существенно их РФА - картину. Доказанно, что даже в тонких слоях, перемещающихся с более толстыми слоями, сохраняется структура фазы.

1.3.2 ТЕМ

Наиболее распространённым методом определения размеров наночастиц служит просвечивающая электронная микроскопия. Сведения о составе наночастиц часто извлекают из одновременно получающихся электронограмм.



Рисунок 1.1- Принцип действия рентгенофазового анализа

Просвечивающий (трансмиссионный) электронный микроскоп (ПЭМ, англ, TEM - Transmission electron microscopy) -- устройство для получения изображения ультратонкого образца путём пропускания через него пучка электронов. Образец толщиной порядка 0,1 мкм считается ультратонким. Прошедший через образец пучок электронов и провзаимодействовавший с ним увеличивается магнитными линзами (объективом) и регистрируется на флуоресцентном экране, сенсорном приборе с зарядовой связью (на ПЗС-матрице) или фотоплёнке (рисунок 1.3) [73].

ПЭМ (рисунок 1.2) состоит из электронной пушки - устройства для получения пучка быстрых электронов и системы электромагнитных линз. Электронная пушка и система электромагнитных линз размещены в колонне микроскопа, в которой в процессе работы микроскопа поддерживается вакуум 10^-2-10^-3Па.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 1.2 - Просвечивающий электронный микроскоп

Рисунок 1.3 - Снимки полученные ПЭМ

1.3.3 EXAFS - спектроскопия

EXAFS -- Extended X-Ray Absorption Fine Structure (спектроскопия протяжённой тонкой структуры рентгеновского поглощения). Съемка спектров "на прохождение" является наиболее распространенным методом получения рентгеновских спектров поглощения. Большинство авторов используют для проведения экспериментов СИ, возникающее при ускорении релятивистских электронов в поле магнита, поворачивающего на малый угол пучок в электронном накопителе. СИ является жестким рентгеновским излучением непрерывного спектра, которое сосредоточено в узком телесном угле вокруг направления движения электронного пучка. Монохроматор используется для выделения из непрерывного спектра СИ монохроматической компоненты, состоящий из двух параллельных кристаллов. Излучение с длиной волны, удовлетворяющей условию Вульфа-Брэгга, отражается последовательно от обоих кристаллов и продолжает распространяться в том же направлении, что и первичный пучок. Совместным поворотом кристаллов обеспечивается непрерывное изменение частоты прошедшего излучения. Исследуемый образец изготовляют в виде однородной пленки, которую ориентируют перпендикулярно падающему пучку [40].

Преимущество метода EXAFS заключается в его избирательности, которая позволяет получать кривую радиального распределения атомов для локального окружения, выбранного химического элемента в образце. Также, метод даёт значения координационных чисел и межатомных расстояний, которые затем могут быть сравнены с рассчитанными из известных структурных данных для определённой фазы.

Другие физические методы исследования строения наночастиц используются эпизодически. Как правило, в большинстве работ используется комплекс методов, позволяющих достаточно надёжно установить строение наночастиц. Значительные трудности возникают при установлении строения таких новых объектов, какими являются core-shell наночастицы [40].



1.4 Тонкослойная хроматография. Экспресс метод анализа химических соединений

При решении аналитических задач, связанных с определением неорганических и органических соединений в сложной многокомпонентной матрице, возникает необходимость в привлечении методов быстрой полуколичественной или качественной оценки состава образца. Желательно также, чтобы этот метод мог сочетаться с инструментальным количественным определением. В этом отношении наиболее перспективным является метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), предложенный в 1938 году российскими учеными М.С. Шрайбер и Н.А. Измайловым. ТСХ является одним из вариантов плоскостной жидкостной хроматографии (ЖХ), в котором разделение веществ происходит на открытом слое сорбента. Это определяет простоту, низкую стоимость оборудования в ТСХ и легкость проведения хроматографического эксперимента[32].

Метод тонкослойной хроматографии - важный аналитический, микропрепаративный и физико-химический метод, который отличается простотой, высокой экономичностью и универсальностью. Основным в ТСХ является процесс независимого движения компонентов разделяемой смеси в потоке элюента вдоль пластины с постепенным размыванием хроматографических зон, форма которых существенно зависит от изотермы адсорбции. Тонкослойная (планарная) хроматография - оперативный метод хроматографии для анализа всех классов химических соединений, приобрела значение в качестве экспресс-метода анализа и широко используется в науке, промышленности, фармации, медицине, ветеринарии, в контроле загрязнений окружающей среды [32].

ТСХ используют не только как аналитический, но и препаративный метод, который обеспечивает разделение вещества в пределах от 10 -³ - 10^-12 г.

Анализ методом ТСХ включает следующие стадии: подготовку пробы, подготовку пластины, нанесение образца, подготовку хроматографической камеры, элюирование разделяемых веществ, удаление элюента с пластины, детектирование компонентов, их идентификацию и полуколичественный анализ. Каждая из перечисленных операций имеет самостоятельное значение и влияет на результат анализа.

Кроме того, поскольку разделение в ТСХ происходит в открытой хроматографической системе, результаты анализа существенно зависят и от внешних факторов. Так, относительная влажность в камере влияет на состояние гидрофильных слоев сорбента. Сорбент также способен улавливать загрязняющие вещества из воздуха, а сами компоненты могут изменяться под влиянием кислорода или света. Таким образом, отсутствие контроля за большим числом внешних параметров может быть причиной невоспроизводимости и искажения результатов анализа[32].

1.5 Поверхностно-активные вещества

При получении наночастиц любым методом проявляется их склонность к образованию объединений. Такие объединения называют агрегатами и агломератами. Вследствие чего, при определении размеров наночастиц, необходимо различать размеры объединений частиц и размеры отдельных частиц (кристаллитов).

На данный момент времени перспективным является стабилизация наночастиц с помощью поверхностно-активных веществ (ПАВ), которые защищают их от окисления в течение определенного интервала времени и препятствуют агломерации наночастиц. Основным преимуществом синтеза в мицеллах является то, что наночастицы формируются в ограниченном объеме, ядре мицеллы, вследствие процесса солюбилизации. В данном случае оболочка мицеллы является определенным ограничителем роста этих агрегатов [39].

Начиная с самых ранних этапов синтеза, необходимо достичь не только заданного распределения размеров частиц, но и стабилизировать коллоидную систему. Добиться этого можно за счет уменьшения энергии поверхностного натяжения на границе раздела фаз, что ведет к необходимости присутствия в системе кроме дисперсионной среды растворителя и дисперсной фазы полупроводниковых частиц еще одного компонента - молекул поверхностно-активного вещества [58, 34].

Адсорбируясь на границе раздела фаз, они пассивируют поверхностные энергетические состояния нанокристаллов и создают барьер, препятствующий агрегации частиц, что снижает вероятность процессов безызлучательной рекомбинации и повышает квантовый выход люминесценции частиц. Лиганды влияют на скорость роста, морфологию, пути протекания реакции и распределение частиц по размеру [54].

Если в раствор наночастиц ввести молекулы полимера, то они будут взаимодействовать с поверхностью частиц. В зависимости от типа взаимодействия между молекулой полимера и твердой поверхностью, полимеры можно разделить на три группы [31]:

1. Прививающиеся (прикрепляющиеся) полимеры, которые, как правило, необратимо химически связываются одним концом с поверхностью твердого тела и, как правило, образуют сетку отдельных молекул;

2. Адсорбирующиеся полимеры, которые слабо адсорбируются на поверхности твердого тела. Взаимодействие происходит между поверхностью твердого тела и случайным местом цепи полимера;

3. Не адсорбирующиеся полимеры, которые не взаимодействуют с поверхностью твердого тела и не могут быть использованы для стабилизации поверхности.

Таким образом, две частицы, покрытые полимером, отталкиваются друг от друга и расстояние между молекулами должно быть больше или равно удвоенному расстоянию полимерного слоя [50].

Если степень заполнения поверхности твердой частицы молекулами полимера близка к 100%, взаимопроникновение полимерных слоев друг в друга полностью исключено. При сближении частиц будет происходить сжатие полимерных слоев, аналогичное скручиванию молекул в клубки. Общая энергия Гиббса при этом будет возрастать, и поэтому частицы будут отталкиваться [50].

Полимерная стабилизация широко используется для стабилизации систем наночастиц. Ее преимущества по сравнению с электростатической стабилизацией состоят в следующем [17]:

1. Всегда возможен обратный процесс диспергирования сухих наночастиц, так как это метод термодинамической стабилизации;

2. Могут быть получены высококонцентрированные дисперсии, и дисперсионная среда даже может быть полностью удалена;

3. Система не чувствительна к электролитам;

4. Пригодна для многофазных систем.

Молекулы ПАВ обычно характеризуются дифильным строением. Две части молекулы ПАВ - гидрофильная и олеофильная обусловливают их специфическое поведение в растворах. По отношению к способности диссоциировать на ионы при растворении в воде ПАВ делятся на неионогенные и ионогенные. В свою очередь, ионогенные ПАВ в зависимости от природы остатка делятся на катионные, анионные и амфотерные. К анионным ПАВ относятся карбоновые кислоты и их соли RCOOMe (R = C ₁₅ -C ₁₇), алкилсульфаты ROSO₃Me и т. п. Катионные ПАВ - это обычно соли алкиламмония [RR'R''R'''N]⁺Cl^- или соли алифатических аминов. Амфотерные ПАВ содержат две ионогенных группы. К ним относятся, например, аминокислоты и их производные [30, 44].

Одним из наиболее распространенных ПАВ является TWEEN 80.

Для получения контрастных электронно-микроскопических изображений использованный при синтезе ПАВ необходимо удалить, но предварительно наночастицы должны быть стабилизированы [66].

Необходимо стабилизировать коллоидную систему, начиная с самых ранних этапов синтеза. Этого можно добиться за счет уменьшения энергии поверхностного натяжения на границе раздела фаз, что ведет к необходимости присутствия в системе молекул поверхностно-активного вещества [56, 38].

TWEEN 80 - полиоксиэтилен (80) сорбитан моноолеат (М.м. 1308 Да; 20 оксиэтиленовых групп; ГЛБ 15,0) относится к классу биоразлагаемых и малотоксичных ПАВ.

TWEEN 80 уже нашло применение в пищевой и фармацевтической промышленности, оно также перспективно для получения микроэмульсий, пригодных для селективного извлечения белков [37], для получения наносфер заданного размера, которые можно использовать в качестве носителей лекарственных средств [72]. Получают из сорбита и жирных кислот оливкового масла химическим способом. Синонимами названия являются: полисорбат-80, пищевая добавка Е433 [38]. Химическая формула -- C₆₄H₂₆O₁₂₄. С точки зрения химии -- оксиэтилированный сложный моноэфир ангидрогексавитов жирных кислот.

TWEEN 80 -- это жидкое вещество, маслянистое и слегка вязкое (рисунок 1.4). Цвет вещества может быть от светло-желтого до ярко-янтарного. Запах -- не сильный, характерный. Главное качество TWEEN 80 -- водорастворимость и растворимость в маслах растительного и животного происхождения. Также он хорошо растворяется в изопропиловом и этиловом спирте, бензоле. В минеральных маслах не растворяется [38].



Рисунок 1.4 - ТWEEN 80

TWEEN 80 считается нетоксичным и совершенно безопасном в продуктах питания при соблюдении предельно допустимых доз: не более 25 мг на 1 кг продукта. Дозы, которые применяются в фармацевтических препаратах, в тысячи раз меньше предельно допустимых. В редких случаях TWEEN 80 может вызывать аллергические реакции [38, 72].

Сравнение поверхностно-активных свойств препаратов группы ТWEEN показало, что они близки. Молекулы этих ПАВ имеют одинаковую полярную часть, а неполярные части молекул отличаются количеством атомов углерода (С₁₁ для TWEEN 20 и С₁₇ для TWEEN 80), кроме того, неполярная часть TWEEN 80 содержит двойную связь [38].

Солюбилизирующая способность препарата ТWEEN 80 выше (приблизительно в 1,5-1,7 раза в зависимости от концентраций), чем препарата ТWEEN 20. Частицы, стабилизированные ТWEEN 80, проявляют наиболее длительную устойчивость в физиологическом растворе [37].



Раздел 2 Объекты, материалы и методы исследования

2.1 Характеристика оборудования и исходных веществ

Для проведения эксперимента было задействовано: вытяжной шкаф, лабораторный стол и необходимое оборудование в соответствии с СТО 26880895-0001-2007 [1].

Для взвешивания применяли весы электронные AL104 фирмы «Mettler Toledo» (рисунок 2.1).

Рисунок 2.1 - Весы лабораторные электронные AL104

При проведении лабораторных исследований использовали магнитную мешалку ПЭ - 6110 (рисунок 2.2).



Рисунок 2.2 - Магнитная мешалка ПЭ - 6110

Из химической посуды задействованы колбы плоскодонные тип П ГОСТ 25336-82 [2], вместимостью 50 мл и 250 мл (рисунок 2.3). Также, задействован дозатор переменного объема (1-10) мл (рисунок 2.4).

Рисунок 2.3 - Колба плоскодонные тип П ГОСТ 25336-82



Рисунок 2.4 - Дозатор переменного объема (1-10) мл

2.1.1 TWEEN 80

TWEEN 80 - маслянистая жидкость, цвет - от янтарного до желтого.

CAS NO.: 9005-65-6 [3].

Молекулярная формула: C₆₄H₁₂₄O_26.

Квалификация - импортировано

Растворимость в воде - растворяется полностью.

РН - 5-8.

Точка возгорания - от 110^оС.

Плотность(25/4) - 1,06-1,09.

TWEEN 80 необходимо хранить в проветриваемом помещении, предохраняя от негативного воздействия влаги и высоких температур. TWEEN-80 является маслянистой жидкостью, имеющей свойства соблюбилизатора и эмульгатора. TWEEN 80 или полисорбат 80 - это растворимая в воде вязкая жидкость. TWEEN 80 сложный оксиэтилированный моноэфир ангидрогексавитов жирных кислот, поверхностно-активное неионное вещество. В смоченном состоянии сохраняется на поверхности.

2.1.2 25%-й раствор аммиака в воде

25%-й раствор аммиака (ГОСТ 6221-90) в воде.

CAS №: 1336-21-6 [4].

Молекулярная формула: NH₃·H₂O

Класс опасности: 4

Плотность (г/дм³) при 20 ⁰С: 0,901-0,9164

Внешний вид: прозрачная бесцветная жидкость.

Водный аммиак - прозрачная жидкость, представляющая собой раствор аммиака в воде, имеющая очень резкий запах нашатыря. Препарат хранят в закрытой таре в крытых складских помещениях. Хранение должно осуществляться в сухом проветриваемом помещении, в дали от источников тепла, возгорания и солнечных лучей. Гарантийный срок хранения Ї 1 год.

2.1.3 Водорода пероксид

Водорода пероксид ГОСТ 177-88 [5] - (старое название - перекись водорода), соединение водорода и кислорода, содержащее рекордное количество кислорода - 94% по массе.

Молекулярная формула: Н₂О₂

Степень токсичности: 2

Температура кипения: 150,2 °C

Бесцветная прозрачная негорючая жидкость. Водорода пероксид является сильным окислителем, он способен самопроизвольно разлагаться на воду и кислород, смешивается в любых соотношениях с водой. Коррозионный для большинства металлов. Во избежание разложения не допускается воздействие прямого солнечного света, загрязнение растворов посторонними примесями, а также применение при работе с ним аппаратуры и тары из нелегированных и низколегированных сталей, чугуна, меди, латуни, бронзы и материалов, являющимися катализаторами разложения перекиси водорода.

Допускается хранение в помещениях, исключающих попадание прямых солнечных лучей, в складским емкостях с изотермическим устройством, обеспечивающим температуру продукта не выше 30°С и не ниже минус 30°С.



2.1.4 Диацетофенонилселенид

Диацетофенонилселенид - ДАФС-25К - кормовая добавка, используемая для восполнения недостатка селена в рационах сельскохозяйственных животных, разработанное и производимое в России. ДAФC-25К содержит действующее вещество диацетофенонилселенид не менее 95% с массовой долей селена в диацетофенонилселениде 25%, сульфит натрия и хлорид натрия не более 1%, связанную воду не более 4%. Отличительное достоинство данного соединения селена перед селенитом и селенатом натрия, используемым во всех других селеновых препаратах, - низкая токсичность.

Препарат способствует поддержанию необходимого уровня жизненно важного витамина Е в организме животного путем защиты его от разрушения в побочных процессах с радикалами и окислителями.

ДАФС-25К - сыпучий порошок. Цвет вещества от белого до светло-желтого цвета со слабым специфическим запахом, не растворим в воде, растворим в растительном масле.

Применять ДАФС-25К лучше через премикс, но возможно давать ДАФС-25К растворенным в растительном масле. Для этого берется растительное масло (без консервантов), нагревается до 70°С и растворяется в дозе: 1 г ДАФС-25К на 70 мл масла. После остывания масла, если выпал осадок белого цвета, то надо увеличить количество масла. Если выпал осадок красного цвета, значит масло было нагрето более 100°С и такой раствор к употреблению не пригоден. Готовый раствор ДАФС-25К можно легко разводить обычным маслом в любой пропорции. Хранить раствор ДАФС-25К в масле долго нельзя (1 неделю), т. к. масло будет прогоркать, образуя перекиси, с которыми ДАФС-25К взаимодействует, нейтрализуя их, и сам в этом случае разрушается.



2.2 Синтез наночастиц селена из диацетофенонилселенида при температуре 25 ^оС в среде C₁₂H₂₂O₁₁ под воздействием аммиака

Таблица 2.1 - Данные для получения наночастиц селена из диацетофенонилселенида при температуре 25 ^оС в среде C₁₂H₂₂O₁₁ под воздействием аммиака

№ синтеза	№ 1	№ 2	№ 3
ВОДА, мл	100	100	100
ДАФС-25К, г	0,02	0,05	0,02
C12H22O11, г	5	5	1
АММИАК, мл	10	5	5

В плоскодонную колбу объемом 250 мл при постоянном перемешивании на магнитной мешалке и при комнатной температуре 25 ^оС помещают 100 мл воды и размешиваем C₁₂H₂₂O₁₁ до полного растворения. После растворения добавляем ДАФС-25К, перемешиваем 30 мин, далее при постоянном перемешивании добавляем по капле 25% аммиака и непрерывно перемешиваем, далее колбу поместили в шкаф, во избежание попадания прямых солнечных лучей при комнатной температуре.

В подтверждении предположения образования наночастиц селена из диацетофенонилселенида в среде C₁₂H₂₂O₁₁ под воздействием аммиака, провели ТСХ анализ. Также провели стерилизацию данных образцов в автоклаве.

2.3 Синтез наночастиц селена из диацетофенонилселенида при температуре 25^оС в среде TWEEN 80 под воздействием перекиси водорода

При постоянном перемешивании на магнитной мешалке при температуре 25^оС в плоскодонную колбу объемом 50 мл отмерили дозатором 15 мл TWEEN 80, после добавили 0,2г диацетофенонилселенида. После полного растворения при постоянном перемешивании постепенно добавили 1 мл водорода пероксид и перемешали на протяжении 30 минут. Далее, колбу поместили в темное место при температуре +25^оС на протяжении недели.

Диацетофенонилселенид (0,2г) + TWEEN 80 (15мл) + H₂O₂ (1мл)

2.4 Синтез наночастиц селена из диацетофенонилселенида при температуре 17^оС в среде TWEEN 80 под воздействием перекиси водорода

В плоскодонную колбу объемом 50 мл при постоянном перемешивании на магнитной мешалке и водяной бане при температуре 17^оС в 15 мл TWEEN 80 добавили 0,4 г диацетофенонилселенида. После полного растворения при постоянном перемешивании добавили 1 мл перекиси водорода и перемешали на протяжении 30 минут. Далее, колбу поместили в темное место при температуре +3⁰С на протяжении недели.

Диацетофенонилселенид (0,4г) + TWEEN 80 (15мл) + H₂O₂ (1мл)

2.5 Синтез наночастиц селена из диацетофенонилселенида при температуре 25^оС в среде TWEEN 80 под воздействием аммиака

В качестве среды для получения наночастиц селена был взят TWEEN 80, как поверхностно активное вещество, чтобы снизить поверхностное натяжение на границе раздела фаз. В 15 мл TWEEN 80 растворили 0,2г диацетофенонилселенида, перемешивая на магнитной мешалке при температуре 25^оС. При полном растворении с помощью дозатора постепенно добавили 25%-й раствор аммиака в воде. В течение 30 минут непрерывно продолжили перемешивать. После поместили вещество в темное сухое место.

Диацетофенонилселенид (0,2 г) + TWEEN 80 (15 мл) + NH₃*H₂O (1 мл)



2.6 Синтез наночастиц селена из диацетофенонилселенида при температуре 17^оС в среде TWEEN 80 под воздействием аммиака

В плоскодонную колбу объемом 50 мл при постоянном перемешивании на магнитной мешалке и водяной бане при температуре 17^оС поместили 15 мл TWEEN 80 и 0,2 г диацетофенонилселенида. Перемешали до полного растворения (30 мин). Далее, при постоянном перемешивании добавили 1 мл 25%-й раствор аммиака в воде и перемешали на протяжении 30 минут. После колбу поместили в холодильник при температуре +3⁰С на протяжении недели.

Диацетофенонилселенид (0,2 г) + TWEEN 80 (15мл) + NH₃*H₂O (1мл)

...