Продукты ферментативной модификации соевой муки: научные и практические аспекты получения и применения в пищевых технологиях

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

Продукты ферментативной модификации соевой муки: научные и практические аспекты получения и применения в пищевых технологиях

05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов

и биологических активных веществ

доктора технических наук

Милорадова Елена Васильевна

Москва 2010

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

Научный консультант: доктор технических наук, профессор Траубенберг Светлана Евгеньевна

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор Колпакова Валентина Васильевна

доктор технических наук, профессор, член-корреспондент РАСХН, заслуженный деятель науки РФ, Римарева Любовь Вячеславовна

доктор технических наук Савенкова Татьяна Валентиновна

Ведущая организация: НОУ ДПО «Международная промышленная академия»

Защита состоится « » июня 2010 г. в _____часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.03 при ГОУВПО «Московский государственный университет пищевых производств» по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе,11, ауд.302, корпус А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПП.

Отзывы на автореферат, заверенные печатью учреждения, просим направлять ученому секретарю Совета.

Автореферат разослан « ____ » ______ 2010г.

Ученый секретарь Совета к.т.н. Белявская И.Г.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Проблема обеспечения человечества продовольствием и, в частности, полноценным пищевым белком сохраняет свою актуальность и в 3-ем тысячелетии.

Общепризнанным путем в ликвидации дефицита белка, устранения его качественной неполноценности и улучшения пищевой ценности продуктов питания является использование новых его источников.

Среди всех сельскохозяйственных культур первое место в мире в общей массе белка занимает пшеница, дающая 71 миллион тонн белка, соя занимает второе место, с производством белка 62,7 миллиона тонн. Однако пшеничный белок для пищевых целей используется на 74%, а соевый белок, по оценкам ФАО не более, чем на 10%, поэтому основным резервом белкового питания населения в мире признана соя.

Соевые белки отличаются уникальным аминокислотным составом, практически не уступающим белкам животного происхождения, что отмечено в документах Всемирной Организации Здравоохранения.

Пищевое использование сои высокими темпами растёт во всех ведущих странах мира и составляет по 5-8% в год. Ежегодно 85% от урожая семян сои перерабатывается для получения двух основных продуктов: соевого масла и соевого шрота. В условиях повышенного интереса общества к вопросам питательности пищевых продуктов белок сои получает все большее признание как высокопитательный, функциональный и рентабельный пищевой ингредиент, позволяющий дополнять и улучшать пищевую ценность готовой продукции, одновременно снизить ее себестоимость. По данным специалистов Института питания РАМН недостаточное поступление легкоусвояемых форм белка в рационах питания приводит к нарушению иммунной устойчивости организма.

В настоящее время соевый рынок также активно развивается и в России. Однако, объемы отечественного производства семян сои явно недостаточны для удовлетворения растущих потребностей промышленности и населения в продуктах их переработки.

Большой вклад в развитие российских технологий по применению растительного сырья в пищевых продуктах, создавших теоретические и практические основы выделения пищевых белков внесли работы ученых:

Диановой В.Т., Доморощенковой М.Л., Дубцовой Г.Н., Браудо Е.Е., Высоцкого В.Г., Красильникова В.Н., Колпаковой В.В., Неклюдова А.Д, Римаревой Л.В., Румянцевой Г.Н., Страшненко Е.С., Толстогузова В.Б., Телишевской Е.Я., Цыгановой Т.Б. и др..

Применение соевых белковых продуктов в пищевой промышленности России распространяется в основном на производство мясных и молочных продуктов (по данным консалтингового агентства Market Advice 85% соевого белкового сырья), и только 15% приходится на другие отрасли пищевой промышленности (хлебопекарную, кондитерскую).

В свете этого актуальной является проблема обогащения соевым белком других категорий пищевых продуктов и повышения эффективности использования соевого сырья, в первую очередь соевой муки, которая является вторичным продуктом производства соевого масла, содержит в своем составе до 50% полноценного белка, и которая гораздо дешевле, чем соевые белковые изоляты и концентраты.

Для решения этой проблемы необходим комплексный подход к разработке технологических решений для той или иной отрасли пищевой промышленности который должен основываться, с одной стороны, на разработке научных и практических основ модификации соевой муки с целью повышения пищевой ценности, с другой, на характеристике ее функциональных свойств, имеющих важное значение для обеспечения гарантированного качества пищевых продуктов по физико-химическим и органолептическим показателям.

Одним из наиболее перспективных путей для расширения области применения соевой муки в пищевой промышленности является использование направленного биокатализа на основе протеолитических ферментных препаратов различного происхождения, обеспечивающего наиболее полное извлечение белка, получение продуктов ферментативной модификации соевой муки с прогнозируемыми изменениями химического состава и технологических функциональных свойств. Решению этой проблемы и посвящена данная работа.

Об актуальности направления говорит и то, что работа проводилась в рамках следующих программ: инновационной научно-технической программы Министерства общего и профессионального образования РФ «Создание современных технологических систем для производства пищевых и кормовых продуктов» (1997-1999г.); «Прецизионные технологии и системы» (1999г.), «Экспертные технологии и международное научное сотрудничество» (1999г.), «Научные исследования высшей школы по технологии живых систем» (2000-2002г.), «Научное и научно-методическое, материально-техническое и информационное обеспечение системы образования» (2002г.), межведомственной аналитической целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы » (2006-2010г.) Рособразования РФ. ферментативный гидролиз мука пищевой

Целью настоящей работы является решение комплекса научно-практических задач, связанных с разработкой подходов к получению продуктов ферментативной модификации соевой муки на основе направленного биокатализа, обеспечивающего более полное и рациональное использование соевого сырья в пищевой промышленности.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

· разработать научные основы технологии получения продуктов ферментативной модификации соевой муки с использованием протеолитических ферментных препаратов различного происхождения и мультэнзимных композиций (МЭК);

· выбрать способ сушки и обосновать режимы получения продуктов ферментативной модификации соевой муки в виде порошков различной цветовой гаммы;

· дать биохимическую характеристику продуктов ферментативной модификации соевой муки как основы целесообразности их применения для создания продуктов повышенной пищевой ценности;

· исследовать функциональные свойства продуктов ферментативного гидролиза соевой муки для выбора области их применения в рецептурах пищевых продуктах. Провести исследования по созданию нового ассортимента продуктов для пищеконцентратной, молочной, хлебопекарной, крндитерской промышленностей, производства соусов, напитков на основе соков;

· разработать технологические решения для применения продуктов ферментативной модификации соевой муки в технологии пищевых продуктов и кормов;

· разработать техническую документацию и рекомендации по получению продуктов ферментативного гидролиза соевой муки и их применению для создания новых видов пищевых изделий.

Основные положения, представляемые к защите:

· научно обоснованная технология применения направленного биокатализа для получения продуктов ферментативной модификации соевой муки, обеспечивающая расширение области применения соевого сырья в пищевой промышленности;

· научно-методологический подход к выбору ферментных препаратов, формированию МЭК и мониторингу эффективности их действия при ферментативной обработке соевой муки;

· совокупность данных по характеристике химического состава продуктов ферментативной обработки соевой муки с позиций пищевой ценности и их функциональных свойств, являющаяся обоснованием целесообразности их применения в пищевых технологиях для создания нового ассортимента продуктов и интенсификации технологических процессов их производства;

· научно-обоснованные технологические решения по созданию новых продуктов питания повышенной пищевой ценности на основе использования в их рецептурах продуктов ферментативной модификации соевой муки.

Научная новизна. Научно обоснованы технологические решения для получения и применения в пищевых технологиях продуктов ферментативной модификации соевой муки.

Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена технология переработки соевой муки на основе направленного биокатализа, обеспечивающего регулирование химического состава и функциональных свойств полученных продуктов ферментативной модификации соевой муки для применения в пищевой индустрии.

Экспериментально установлено влияние процесса ограниченного биокатализа на функциональные свойства (мутность, эмульгирующую и пенообразующую способности, стабильность пены) полученных продуктов. Получены математические зависимости, характеризующие взаимосвязь между составом МЭК и технологическими функциональными свойствами, позволяющие получать продукты ферментативной модификации соевой муки, обладающие заданными технологическими характеристиками с ориентацией на применение в соответствующих отраслях пищевой промышленности.

Получены зависимости, характеризующие влияние ряда факторов на накопление продуктов ферментативного гидролиза соевой муки (растворимого белка, аминного азота, свободных аминокислот), анализ которых позволил обосновать и разработать режимы модификации соевой муки для получения продуктов, имеющих повышенную пищевую и биологическую ценность по сравнению с исходной соевой мукой.

Расширены представления о каталитических свойствах и эффективности действия отдельных ферментов и их композиций на модельных и природных субстратах и оценена роль каждого из ферментов в процессах биокатализа.

Обоснован подход к формированию мультэнзимных композиций на основе ферментных препаратов протеолитического действия различного происхождения для получения продуктов модификации соевой муки, имеющих различную биологическую ценность и отличающиеся по функциональным свойствам.

Дана биохимическая характеристика продуктов ферментативного гидролиза соевой муки (фракционный состав белков, состав и содержание свободных аминокислот, углеводов, изофлавонов, состояние липидного компонента, в.т.ч. состав и содержание фосфолипидов и жирных кислот) с позиции целесообразности их использования в рецептурах пищевых продуктов.

Методом SE-HPLC и гель-хроматографии выявлены различия в распределении белка по молекулярной массе в продуктах ферментативного гидролиза, полученных при действии ферментных препаратов различного происхождения и МЭК на модельный и природный субстрат.

Впервые получены данные и зависимости, характеризующие состояние липидного компонента соевой муки и продуктов ее ферментативной модификации в процессе хранения.

Получены данные и зависимости, характеризующие влияние способа и условий сушки ферментативного соевого гидролизата на состав, физико-химические и органолептические свойства сухих продуктов, анализ которых, позволил обосновать выбор способа сушки.

Новизна научных концепций ряда технических решений подтверждена авторским свидетельством и 2 патентами.

Практическая значимость. Разработана технология применения направленного биокатализа для получения продуктов ферментативной модификации соевой муки различного химического состава, обладающих повышенной пищевой ценностью по сравнению с исходной соевой мукой и определенными функциональными свойствами (такими как пенообразующая способность, стабильность пены, эмульгирующая способность), что обеспечивает расширение области применения соевого сырья в пищевой промышленности.

Разработана принципиальная технологическая схема производства продуктов ферментативной модификации соевой муки. Определены условия проведения основных стадий технологического процесса. Разработаны рекомендации по его реализации в условиях как маслоэкстракционных заводов, так и других пищевых предприятий (пищеконцентратных, хлебозаводов и т.д.).

Разработана техническая документация на производство продуктов ферментативной модификации соевой муки. Проведена промышленная апробация и выпуск опытной партии продуктов ферментативной модификации соевой муки в условиях АО «Колосс», Лобинского маслоэкстракционного завода и ООО «Ростагрокомплекс».

Показана целесообразность применения продуктов ферментативной модификации соевой муки для создания новых продуктов питания повышенной пищевой ценности. Разработано 14 новых видов пищевых продуктов с использованием продуктов ферментативной обработки и кормовая добавка на основе соевой пасты - вторичного продукта ферментативной обработки соевой муки. Разработанные технологические решения прошли промышленную апробацию на 5 пищевых предприятиях. Разработана техническая документация на новые виды пищевых изделий.

Показана целесообразность и разработаны технологические решения для применения продуктов ферментативной обработки соевой муки при производстве кексов и вафель для полной замены дорогостоящего и скоропортящегося сырья - меланжа. Установлено, что применение разработанной рецептуры при производстве этих мучных кондитерских изделий способствует интенсификации технологического процесса и удлинению сроков хранения при гарантированном качестве и высоких потребительских свойствах по органолептическим и физико-химическим показателям.

В результате производственных испытаний и дегустационной оценки в условиях АО «Колосс», АО «Моспищекомбинат», ООО «Ростагрокомплекс», НПФ«Росма», НПФ«Новтэкс» показана целесообразность применения ферментативных соевых гидролизатов в рецептуре деликатесных соусов и приправ, майонезов, экструдированные продукты, супы и даны рекомендации по внедрению.

Разработаны рецептуры и предложены технологические решения для получения инстант- напитков массового применения (на основе соков) и для специализированных групп населения (фитнес- напитки ), а также низкожирного йогуртового напитка, имеющего повышенную пищевую ценность.

Разработаны технологические рекомендации по использованию вторичного продукта ферментативной модификации соевой муки (соевой пасты) в составе питательных сред для производства кормовых дрожжей.

Результаты исследований используются в учебном процессе при подготовке инженеров по направлениям: «Производство продуктов питания из растительного сырья», и «Технология пищевых продуктов функционального и специализированного назначения», «Биотехнология», бакалавров и магистров по направлению «Технология продуктов питания» (в курсах «Пищевая химия», «Общие принципы переработки растительного сырья», «Технология отрасли», при выполнении курсовых и выпускных квалификационных работ).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на: международных и республиканских научно-технических конференциях, симпозиумах, форумах: «Разработка и внедрение высокоэффективных ресурсосберегающих технологий, оборудования и новых видов пищевых продуктов в пищевую и перерабатывающую отрасли АПК» (Киев, 1991г.); «Научно-технический прогресс в перерабатывающих отраслях АПК»

(Москва, 1995г.); «Прикладная биотехнология на пороге ХХ века» (Москва, 1995г.); «Пищевая промышленность на пороге ХХ1 века» (Москва, 1996г.); «Пищевая промышленность- 2000» (Казань, 1996); «Энергоресурсосберегающие технологии переработки сельскохозяйственного сырья» (Минск, 1996г.); «Технологии и продукты здорового питания» (Москва, 2007г.); «Высокоэффективные пищевые технологи, методы и средства для их реализации» (Москва, 2006г.); «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства их реализации: эффективное использование ресурсов отрасли» (Москва, 2008г.); «Биотехнология. Вода и пищевые продукты», в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2008г.); молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика» (Москва, 2008г.); «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты» (Москва, 2009г.); межрегиональных научно-практических конференциях: «Пищевая промышленность 2000» (Казань, 1996г.); всероссийских научно- практических конференциях: «Перспективы развития пищевой промышленности России» (Оренбург, 2005г.); молодых ученых и Ш школы им. Академика Н.М.Эмануэля по проблеме «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты» (Москва, 2008г.) «Инновационные технологии в пищевой промышленности» (Самара, 2009г.); научно-практических семинарах, юбилейных конференциях МГУПП: «Применение современных физико-химических и биотехнологических методов при производстве пищевых продуктов» (2001, 2005 г.).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликована 41 работа, в том числе 13 публикаций в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 2 - в зарубежных книжных изданиях (монографиях) и 23 статьи в материалах конференций, конгрессов, форумов, семинаров, научных трудах институтов; в 3 патентах и авторских свидетельствах.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, основные результаты исследований, выводы, список цитированных источников (482 наименования), объем 385 страниц основного текста, содержит 88 таблиц, 83 рисунка; приложения.

Личное участие автора - непосредственное участие на всех этапах постановки задач, проведения экспериментов, теоретического анализа, обобщения результатов, формулирования выводов и положений, а также апробации разработанной продукции.

Основное содержание работы

Введение. Изложена актуальность выбранного научного направления, сформулирована сущность решаемой научной проблемы, раскрыта научная новизна работы и ее практическая значимость.

Глава 1. Научные и технологические аспекты использования сои в качестве дополнительного сырьевого ресурса для создания пищевых продуктов, обладающих повышенной пищевой ценностью.

На основании опубликованных в литературе данных проведен анализ современного состояния в области переработки сои и технологических аспектов модификации соевого сырья для повышения эффективности его применения при производстве пищевых продуктов. Рассмотрен состав сои и роль ее основных компонентов с позиции оценки пищевой ценности. Обобщены результаты исследований отечественных и зарубежных авторов, характеризующие сою как перспективный источник растительного сырья для создания новых видов пищевых продуктов. Проведен сравнительный анализ исследований в области применения различных методов обработки соевого сырья (химических, физических, ферментативных) для получения продуктов модификации с целью применения при производстве пищевых продуктов.

Глава 2. Обоснование целесообразности применения направленного биокатализа для получения продуктов модификации соевой муки, ориентированных на применение в конкретных отраслях пищевой промышленности.

С учетом несбалансированного пищевого рациона для подавляющей части населения нашей страны в последние годы наблюдается тенденция расширения использования нетрадиционных видов сырья в технологии традиционных продуктов питания массового спроса. С точки зрения повышения пищевой и биологической ценности использование соевых белковых продуктов в пищевой промышленности оправданно и целесообразно для создания нового ассортимента продуктов поскольку, с одной стороны, соевый белок по аминокислотному составу близок к животному белку, а, с другой стороны, он не содержит холестерина в отличие от сырья животного происхождения. Применение соевых белков целесообразно и с точки зрения его невысокой стоимости. Термин «соевые белки» в настоящее время обычно используют при характеристике потенциально пригодных в пищу сухих соевых продуктов, полученных в результате фракционирования из семян сои.

Среди соевых белков самым дешевым продуктом является соевая мука (обезжиренная, полуобезжиренная), которая может быть получена путем переработки соевого шрота или жмыха, являющихся побочными продуктами, получаемыми после извлечения масла из семян сои или непосредственно измельчением белого лепестка.

Широкое применение соевой муки в большинстве отраслей пищевой промышленности сдерживается наличием в ней специфического вкуса, а также тем, что введение ее в рецептуры часто является невозможным из-за неблагоприятного влияния на технологический процесс, потребительские свойства и качество конечного продукта по органолептическим и физико-химическим показателям. Это может быть устранено путем использования направленного биокатализа для получения продуктов ферментативной модификации соевой муки различного состава и различного целевого назначения.

Для этого необходимо использовать такие ферментные препараты и сформировать такие МЭК использование которых позволит проводить расщепление белковой молекулы с образованием свободных аминокислот и пептидов различной молекулярной массы и получать продукт с большей или меньшей степенью растворимости белка, а также с необходимой степенью гидролиза присутствующих в соевой муке крахмала и некрахмальных полисахаридов, с ориентацией на определенные отрасли промышленности - производство пищеконцентратов, мучных кондитерских изделий, напитков, сухих завтраков, молочных продуктов, майонезов и т.д..

В зависимости от отрасли применения можно ориентировать процесс получения продуктов модификации с учетом дальнейшего использования либо собственно гидролизата (растворимая часть), либо гидролизованной муки (высушивание продукта без отделения растворимой части). При этом необходимо учитывать, что для их применения с целью создания нового ассортимента продуктов повышенной пищевой ценности, необходимо знать, какую роль могут играть продукты ферментативной модификации соевой муки в технологическом процессе, что в конечном итоге будет определять качество продукта и его потребительские свойства. Для этого необходимо подбирать такие ферментные препараты и такие МЭК, чтобы получать продукты модификации, обладающие определенными функциональными свойствами. Не менее важно и то, что продукты ферментативного гидролиза крахмала и некрахмальных полисахаридов будут придавать вкусовые качества и вместе с продуктами гидролиза белка будут в дальнейшем участвовать в реакции образования ароматических веществ и меланоидиновых пигментов в процессе сушки. Поэтому необходима разработка режимов сушки для их получения что позволит регулировать цвет продуктов модификации (от золотистого до коричневого) в зависимости от области применения.

Достоинством технологии получения продуктов модификации соевой муки с использованием направленного биокатализа является возможность получать продукты с прогнозируемым составом и функциональными свойствами, ориентированные на применение в конкретных отраслях пищевой промышленности, а также простота реализации технологических решений без особых дополнительных затрат, которые могут быть реализованы как в условиях маслоэкстракционных заводов, так и в рамках существующих пищевых предприятий.

На рис.1 представлена общая структурная схема проведения эксперимента, которая иллюстрирует взаимосвязь этапов работы, начиная с анализа состояния вопроса и заканчивая разработкой конкретных технологий.

Глава 3. Объекты и методы исследования. В работе использовали соевую дезодорированную обезжиренную и полуобезжиренную муку, полученную от различных производителей, характеристика которой представлена в табл.1,

Таблица 1. Характеристика соевой муки

Компоненты	Содержание, массовая доля, %
	Проба 1	Проба 2	Проба 3	Проба 4	Проба 5
Белок	43,6-44,6	43,5-44,2	44,5-45,0	46,4-47.0	51,4-52,0
Углеводы, в т.ч.:	33,3-35,5	36,6-37,7	38,6-38,9	34,8	26,5-32,3
Зола	4,4-4,9	4,8-4,5	4.5-5.0	5,1-5,5	5,5-6,5
Липиды	8,0-9,0	3,6-3,7	2,0-2,5	3,0-4,0	1,0-2,0
Влага	9,0-9,2	9,2- 9,5	9,0-9,5	9,0-9,5	8,0-9,0

ферментные препараты фирмы «Erbsloeh»: Бирзим Чилл и Бирзим П7; фирмы Novo Nordisk, Дания: Нейтраза, Флавозим, Вискозим L; Вышневолоцкого завода ферментных препаратов: Протосубтилин Г10х, Г 20х, Амилоризин П10х; Пектофоетидин П10х, Ксилоглюканофоетидин П10х, предоставленные лабораторией «промышленного биокатализа» АО «Биотехнология»; протеолитическую активность ферментных препаратов определяли по методу Ансона в модификации Рухлядевой, амилолитическую - по методу Рухлядевой. Общий белок определяли методом Къельдаля, растворимый белок - методами Лоури и биуретовым, фракционный состав белка - методом гель-фильтрации. Фракционирование проводили на колонке (2,2x35), заполненной гелем Toyopearl gel HW-55F, аминокислотный состав анализировали на аминокислотном анализаторе модели 835 фирмы Hitachi, белково-полипептидный состав полученных гидролизатов анализировали методом SE-HPLC на жидкостном

Рис.1.Структурная схема исследований

хроматографе «Стайер-SYSTEM» фирмы «Аквилон» (Россия), содержание свободных аминокислот в продуктах гидролиза соевой муки проводили методом ВЭЖХ на хроматографе Agilent 1100.Общий сахар определяли дихроматным методом, редуцирующие сахара - методом Шорля, содержание общих углеводов и растворимых углеводов - антроновым методом. Состав углеводов в гидролизатах анализировали по ГОСТ Р 4.1.1672-03 с использованием метода ВЭЖХ. Определение микробиологических показателей проводили по стандартным методикам, которые применяются в микробиологических исследованиях в соответствии с правилами и нормами СанПиН 2.3.2. 1078-01.

Выделение общих липидов из исследуемых объектов осуществляли методом Блайя и Дайера, содержание вторичных продуктов окисления оценивали по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой. Определение состава ФЛ проводили

методом ТСХ, стеринов - спектрофотометрически, пероксидов - йодометрически, жирнокислотный состав липидов проводили методом газовой капиллярной хроматографии по ГОСТ Р 51483-99.

Функциональные свойства продуктов ферментативной модификации соевой муки определяли по следующим методикам: растворимость по Calderon 2000, мутность оценивали по методу Deeslie и Cheryan, пенообразующую способность и стойкость пены по Johnson&Brekke, эмульгирующие свойства по Pearce &Kinnsella.

Качество готовых изделий оценивали по общепринятым для промышленности показателям.

Обработку экспериментальных данных выполняли с использованием методов математической статистики. Все опыты проводили не менее, чем в трех повторностях. Математическое планирование и обработку экспериментальных данных осуществляли методом центрального униформ - рототабельного планирования с последующей графической интерпретацией параметров оптимизации с помощью программ Excel, MatStat и Statistica.

Глава 4. Научно-практические аспекты ферментативной модификации белков соевой муки с использованием протеолитических ферментных препаратов различного происхождения. На основании изучения химического состава соевой муки (обезжиренной, полуобезжиренной), полученной от различных производителей, установлено, что содержание в ней ценного белка составляет 43,5-52,0% (табл.1).

Проведение ферментативного гидролиза белка соевой муки будет способствовать повышению пищевой и биологической ценности продукта за счет увеличения содержания в растворимой части (гидролизате) свободных аминокислот и полипептидов различной молекулярной массы. Известно, что характер распада белков зависит от природы субстрата, происхождения ферментных препаратов и условий проведения ферментативного гидролиза.

В этой связи для ферментативной модификации были выбраны ферментные препараты, бактериального (Протосубтилин Г10х, Г20х, Бирзим П7, Нейтраза), растительного (Бирзим Чилл,) и грибного (Флавозим) происхождения, которые различаются, субстратной специфичностью и эффективностью ферментативного гидролиза. Еще одним фактором для выбора ферментных препаратов была их доступность на российском рынке.

В результате исследования кинетики действия ферментных препаратов на модельном субстрате в условиях изолированного соевого белка (ИСБ) установлено, что все могут быть использованы с достаточной степенью эффективности для гидролиза соевого белка.

Однако, в условиях реального субстрата, а именно соевой муки, ферментные препараты могут вести себя по-другому, так как при протеолизе мучной суспензии атакуемость белков может быть снижена в силу наличия ингибирующих факторов (липидов, полисахаридов, остаточных количеств ингибиторов белковой природы и др.), и имеющей место компартментализации белков. В этой связи была изучена кинетика действия ферментных препаратов при использовании в качестве субстрата- соевой муки (проба1).

Исследование условий гидролиза белков соевой муки ферментными препаратами Бирзим П7, Бирзим Чилл, Нейтраза, Флавозим. Для выбора оптимальной дозировки ферментных препаратов и концентрации субстрата была исследована зависимость скорости реакции гидролиза муки от количества вносимых ферментных препаратов и субстрата. (рис.2).

Рис. 2. Зависимость начальной скорости реакции гидролиза от концентрации субстрата под действием: а) Бирзим П7; б) Бирзим Чилл.

Результаты кинетических исследований позволили выбрать оптимальные условия действия ферментных препаратов Бирзим П7 и Бирзим Чилл при гидролизе белков соевой муки: для Бирзим П7- концентрация 0,5 ед.ПС/г муки, концентрация субстрата 100 мг/мл; для Бирзим Чилл- концентрация 0,3 ед.ПС/г, муки, концентрация субстрата 100-130 мг/мл.

Известно, что каталитические свойства многих ферментов можно описать в рамках модели Михаэлиса - Ментен, связывающей начальную скорость реакции, максимальную скорость реакции и исходную концентрацию субстрата.

Применение уравнения Михаэлиса-Ментен позволяет количественно характеризовать эффективность действия ферментов, сравнить их действие на одинаковый субстрат. Значение К_m с определенными оговорками позволяет оценить сродство различных ферментов к субстратам. Однако, принимая во внимание, что выбранные ферментные препараты являются не высокоочищенными, а субстрат соевая мука является сложным многокомпонентным субстратом, рассчитанные кинетические параметры - константу Михаэлиса и максимальную скорость начальной реакции мы называли «кажущимися»- K_m(каж), V_max(каж).

Для расчета K_m(каж) и V_max(каж) исследованных ферментных препаратов использовали экспериментальные кинетические зависимости и известные математические методы преобразования уравнения Михаэлиса-Ментен (Лайнуивера - Берка, Эди - Хофсти, Вульфа - Августинсона).

Таким образом, несмотря на принятые допущения, полученные при проведении экспериментальных и расчетно-графических работ, «кажущиеся» константы Михаэлиса и V_max(табл.2) могут косвенно свидетельствовать о различном сродстве изучаемых ферментных препаратов к субстрату, что позволяет сделать предположение о целесообразности совместного применения данных ферментных препаратов для эффективного гидролиза соевой муки.

Таблица 2. Кинетические параметры Km и Vmax для ферментных препаратов Бирзим П7 и Бирзим Чилл, полученные различными математическими методами преобразования уравнения Михаэлиса-Ментен

№ п/п	Методы преобразования	Ферментный препарат
		Бирзим П7	Бирзим Чилл
		Кm, мг/мл	Vmax, мг/мл·мин	Кm, мг/мл	Vmax, мг/мл·мин
1	Лайнуивера - Берка	200	0,02	133	0,01
2	Эди - Хофсти	258	0,022	142	0,01
3	Вульфа -Августинсона	250	0,02	150	0,01
4	Средние значения кинетических параметров	236	0,021	142	0,01

При формировании МЭК-1, концентрации ферментных препаратов Бирзим П7 и Бирзим Чилл уменьшали по дозировке протеолитической активности в 2 раза, по сравнению с той концентрацией, которая имела место в случае применения индивидуального ферментного препарата.

Гидролиз вели в течении 10 часов, при температуре 50°С, рН=8, концентрация муки в суспензии составляла 100 мг/мл. Ферментные препараты вносили одновременно в начале гидролиза. Из рис. 3 видно, что эффект от применения МЭК-1 оказался более позитивным, чем от применения одного ферментного препарата. Так, через 8-10 часов гидролиза содержание аминного азота в гидролизате, полученном под действием МЭК составляло 1,100 мг/мл, что на 57% и 10% выше, чем при применении соответственно ферментных препаратов Бирзим Чилл и Бирзим П7 при их отдельном внесении в дозировке вдвое большей, чем в составе МЭК, что свидетельствует об их синергизме при их действии на белок соевой муки.

Рис.3. Динамика накопления аминного азота при использовании: а) Бирзим Чилл, б) Бирзим П7, в) МЭК-1 (Бирзим Чилл+ Бирзим П7).

Таким образом, полученные экспериментальные данные показывают, что применение МЭК-1 при гидролизе дает возможность получить выход продуктов ферментативной реакции по накоплению аминного азота при уменьшении в 2 раза дозировок ферментных препаратов в МЭК на 15-50% больше, чем при раздельном применении ферментов и почти на 35% больше ожидаемого эффекта.

На основании кинетических исследований выбраны оптимальные условия действия ферментных препаратов Нейтраза и Флавозим при гидролизе белков соевой муки (проба5). Установлено, что максимальная скорость гидролиза наблюдается при концентрации ферментного препарата Нейтраза 0,6 ед. ПС/г муки и концентрации субстрата 100 мг/мл, ферментного препарата Флавозим - 1,0 ед. ПС/г муки и концентрации субстрата 100 мг/мл.

С применением расчетно-графических методов получено, что средние кажущиеся К_m и V_max для выбранных ферментных препаратов составили: для Нейтразы - K_m(каж) и = 225,0 мг/мл; V_max(каж) = 37,8 . 10³ мг/мл·мин; для Флавозима - K_m(каж) = 196,0 мг/мл; V_max(каж)= 19,3 . 10³ мг/мл·мин.

Оценка средних численных значений кинетических параметров для данных ферментных препаратов позволяет прийти к заключению, что они с достаточной эффективностью могут быть использованы для гидролиза белков соевой муки как отдельно, так и в составе МЭК.

С учетом различного характера действия ферментных препаратов, включая различную селективность к пептидным связям и разное сродство к субстрату, с целью повышения степени биоконверсии белка, методом математического планирования на основе униформ-рототабельных планов проводили оптимизацию состава мультэнзимных композиций (МЭК), состоящих из ферментных препаратов Нейтраза и Флавозим (МЭК-2), и для Бирзим П7 и Флавозим (МЭК-3).

Критерием для оценки эффективности гидролиза белка соевой муки под действием МЭК-2,3 являлось количество аминного азота и накопление растворимого белка в гидролизатах. В качестве факторов, были выбраны: х₁ - дозировка ферментного препарата Нейтраза или Бирзим (ед. ПС/г муки), х₂ - время внесения ферментного препарата Флавозим, х₃ - дозировка ферментного препарата Флавозим (ед. ПС/г муки).

На основании полученных результатов эксперимента с помощью программы STATISTICA 6,0 была построена поверхность отклика зависимости накопления аминного азота от исследуемых факторов (рис.4,6) и контурная диаграмма накопления растворимого белка от исследуемых факторов (рис.5,7).

Рис. 4. Накопление аминного азота при ферментативной модификации соевой муки МЭК-2.

Рис.5. Накопление растворимого белка при ферментативной модификации МЭК-2.

Анализ полученныз зависимостей показывает, что при внесении Нейтразы и Флавозима при гидролизе белков соевой муки происходит непрерывное нарастание аминного азота и растворимого белка (рис.4,5). Такой характер зависимости может быть обусловлен характером действия используемых ферментных препаратов и имеющимися у них дополнительными активностями, вызывающими высвобождение белков из белково-полисахаридных комплексов.

При гидролизе соевой муки ферментными препаратами Бирзим П7 и Флавозим (рис.6) получено, что аминный азот нарастает в ходе гидролиза, а затем снижается, а растворимый белок (рис.7) начинает снижаться уже при малых дозировках ферментных препаратов, что свидетельствует об ином характере действия ферментного препарата Бирзима П7, по сравнению с Нейтразой в составе МЭК -2.

Рис.6. Накопление аминного азота при ферментативной модификации соевой муки МЭК-3.

Рис.7. Накопление растворимого белка при ферментативной модификации соевой муки МЭК-3.

Такой характер, вероятно, обусловлен наличием побочных активностей у ферментного препарата Бирзим П7, которые вызывают гидролиз белково-полисахаридных комплексов.

На основании проведенных исследований обоснованы следующие МЭК для проведения ферментативного гидролиза: МЭК-1 ( Бирзим П7 и Бирзим Чилл), МЭК-2 ( Нейтраза и Флавозим) и МЭК-3 (Бирзим П7 и Флавозим).

Исследование условий ферментативного гидролиза соевой обезжиренной муки ферментным препаратом Протосубтилин Г10х. Из производимых в России ферментных препаратов протеолитического действия был выбран Протосубтилин Г10х. Установлено, что соевая обезжиренная мука (проба 2) представляет собой сырье сложного состава, в нее, помимо белка, входят высокомолекулярные полисахариды (12% крахмал, 5,% гемицеллюлоза, и др.). Присутствие последних в субстрате вероятнее всего оказывало влияние на процесс ферментативного гидролиза белков под действием протеаз. Внесение ферментных препаратов амилолитического, ксиланазного действия может повысить степень ферментативного гидролиза белков за счет их высвобождения из связанного состояния и будет способствовать повышению пищевой ценности.

Установлено, что комплексное применение ферментных препаратов Протосубтилин Г10х и Амилоризин П10х (МЭК-4) приводит к повышению эффективности гидролиза, по сравнению с действием каждого ферментного препарата в отдельности, а совместное применение ферментных препаратов Протосубтилин Г10х и Ксилоглюканофоетидин П10х (МЭК-5) не приводит к интенсификации процесса гидролиза белков соевой муки (проба 3). Установлено, что за 6-8 часов гидролиза соевой муки МЭК происходит накопление редуцирующих веществ, что с одной стороны, способствует приданию вкуса готовым гидролизатам, а с другой стороны, при получении сухого продукта, будут определять цвет и аромат продукта вследствие реакции меланоидинообразования.

Различный характер действия протеолитических ферментных препаратов и их МЭК позволит получать продукты ферментативной модификации различного состава с заведомо заданными характеристиками для их использования в различных отраслях пищевой промышленности.

Результаты проведенных исследований, представленные в главе 4, легли в основу разработки технологии получения продуктов ферментативной модификации соевой муки для их применения в пищевой промышленности.

Глава 5. Биохимическая характеристика продуктов ферментативной модификации соевой муки как основа целесообразности их применения для создания продуктов повышенной пищевой ценности.

Исследование фракционного состава белков продуктов ферментативного гидролиза соевой муки с использованием метода гель-хроматографии. Для оценки степени протеолиза белка и характеристики его фракций использовали метод гель-хроматографии. Модификацию белков полуобезжиренной соевой муки проводили ферментными препаратами Бирзим Чилл, Бирзим П7 и МЭК-1 в течение 8 часов при ранее выбранных условиях.

Анализ распределения водорастворимых белков соевой муки по фракциям показывает, что белки исследуемого образца соевой муки разделяются на три основные фракции (табл. 3).

При фракционировании белков соевой муки (проба 1), подвергнутой модификации ферментным препаратом Бирзим Чилл, обнаруживается 6 фракций, ферментным препаратом Бирзим П7 - 7 фракций, а, как видно из рис.8, при использовании МЭК-1 - 8 фракций.

Таблица 3. Молекулярная масса белков соевой муки

Фракции	Объем элюата, см3	Молекулярная масса, Да	% от общего количества
I пик	32 - 60	Больше 700000 (выход декстрана синего)	30,77
II пик	84 - 108	55000 - 8000	47,25
III пик	128 - 156	Низкомолекулярные азотные соединения	21,98

Рис. 8. Гель-хроматограмма белков соевой муки после гидролиза МЭК-1

Таким образом, анализ распределения водорастворимых белков полуобезжиренной соевой дезодорированной муки и муки, подвергнутой ферментативному гидролизу ферментными препаратами Бирзим П7, Бирзим Чилл и их МЭК по фракциям, показывает, что под действием ферментных препаратов протеолитического действия происходит глубокий гидролиз белков соевой муки, при этом фермент активно гидролизует как высокомолекулярные белки, переводя их из нерастворимого в растворимое состояние, так и средне- и низкомолекулярные белки, а также пептиды с накоплением значительного количества промежуточных продуктов гидролиза и низкомолекулярных азотистых соединений.

Исследование продуктов ферментативной модификации соевой муки методом SE-HPLC. Для оценки эффективности действия ферментных препаратов Бирзим П7, Нейтраза, Флавозим и их МЭК на ИСБ и белок соевой муки (проба 5) проводили сравнительную оценку молекулярно-массовых распределений белка, полученных методом SE-HPLC.

Данные по молекулярному распределению белков в ферментативных гидролизатах (табл.4) показывают, что за 8 часов гидролиза образуются пептиды и олигопептиды различной молекулярной массы и аминокислоты в различном соотношении. Ферментный препарат Бирзим П7 медленнее расщепляет высокомолекулярные белки сои, а Флавозим, обладая эндо- и экзопептидазными активностями, осуществляет достаточно глубокий гидролиз белков соевой муки.

Увеличение продолжительности гидролиза до 17 часов позволяет получать гидролизаты, содержащие в основном пептиды, олигопептиды и аминокислоты, имеющие молекулярную массу менее 45 КДа.

Существенные отличия наблюдаются и в ферментативных гидролизатах, полученных под действием МЭК-2,3.

Таблица 4. Фракционный состав белков соевой муки и ее гидролизатов, полученных с помощью протеолитических препаратов за 8 и 17 ч гидролиза

Время удерживаниям ин	Молекулярная масса, кДа	Соевая мука	Продукты ферментативного гидролиза, полученные под действием
			Нейтраза	Бирзим	Флавозим	МЭК-2 Нейтраза + Флавозим	МЭК-3 Бирзим + Флавозим
			8,0	17,0	8,0	17,0	8,0	17,0	8,0	17,0	8,0	17,0
5,8	Более 130	14,1	4,9	2,9	16,4	12,7	23,6	21,7	12,2	2,7	8,9	8,5
7,5	45-130	41,2	27,7	2,3	12,9	3,6	14,8	12,2	1,7	0,0	9,7	9,2
10,8	25-45	23,5	18,4	51,1	27,4	37,5	27,7	23,4	30,4	49,7	28,6	29,9
12,2	15-25	11,7	40,8	36,2	37,1	39,9	25,5	34,2	45,8	36,8	42,3	41,6
16,8	5-15	9,4	8,2	7,5	6,1	6,2	5,5	6,1	7,8	10,7	7,7	8,2
20,2	Менее 1,5	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	2,7	2,3	1,9	0,0	2,7	2,5

Так, в гидролизате, полученном при действии МЭК-2, преобладают белки и пептиды с молекулярной массой 25-45 кДа (30,4%) и 15-25 кДа (45,8%). В течение следующих 9 ч продолжают накапливаться белки и пептиды с молекулярной массой 25-45 кДа (49,7%) и 15-25 кДа (36,8%), а также короткие олигопептиды с молекулярной массой 5-15 кДа. А при действии МЭК-2,3 наблюдается другое соотношение белков этих фракций :25-45 кДа (28,6%) и 15-25 кДа (42,3%). Через 9 ч гидролиза сохраняется достигнутое соотношение фракций.

Методом SE-HPLC показан различный характер действия исследуемых ферментов Нейтраза, Бирзим и Флавозим и мультэнзимных композиций на их основе на изолированный соевый белок и белки соевой муки. Более глубокий гидролиз высокомолекулярных белков осуществляется с участием ферментного препарата Нейтраза и МЭК-2.

Таким образом, в результате проведенных исследований можно констатировать, что разработанные условия и режимы получения белковых гидролизатов ИСБ и соевой муки позволяют получить гидролизаты существенно различающиеся фракционным составом, что в свою очередь, обусловливает в дальнейшем их различные функциональные свойства (растворимость, пенообразующую, эмульгирующую способность и другие) в условиях технологического процесса производства различных продуктов питания.

Изучение аминокислотного состава продуктов ферментативного гидролиза соевой муки. Для более полной характеристики белковой части продуктов гидролиза соевой муки под действием ферментных препаратов Бирзим П7, Бирзим Чилл, МЭК-1, Нейтраза и Флавозим исследовали состав свободных аминокислот. В результате проведенных исследований установлено, что все образцы муки (проба 1), подвергнутые ферментативному воздействию, содержат широкий набор аминокислот, однако их распределение в образцах различно.

Установлено, что при сравнении аминокислотного состава гидролизатов, полученных при действии отдельных ферментных препаратов Бирзим П7 и Бирзим Чилл, наблюдается значительная разница, обусловленная их действием на различные виды пептидной связи в молекуле белка соевой муки, что является подтверждением различной субстратной специфичности ферментных препаратов Бирзим П7 и Бирзим Чилл по отношению к пептидным связям белка сои и является обоснованием их совместного применения для получения соевых ферментативных гидролизатов. Так, содержание гистидина, треонина, аланина, триптофана и изолейцина в гидролизате, полученном под действием МЭК-1 выше в 1,6 - 3,2 раза по сравнению с содержанием этих аминокислот в гидролизатах, полученных с использованием отдельных ферментных препаратов.

Данные по содержанию свободных аминокислот в гидролизатах, полученных под действием ферментных препаратов Бирзим П7, Нейтраза и Флавозим показывают, что доля незаменимых аминокислот от их общего количества наибольшая у гидролизата, полученного с помощью ферментного препарата Нейтраза и составляет 81%, в то время как для Флавозим и Бирзим П7 - 67,5 и 77,7% соответственно.

Установлено, что содержание валина, лейцина и изолейцина, которые являются наиболее важными аминокислотами, входящими в состав напитков для лиц, занимающихся спортом, наибольшее в гидролизате, полученном с использованием ферментного препарата Нейтраза составляет 54,4%.

Принимая во внимание, что ферментные препараты Бирзим П7 имеют ряд побочных активностей и могут вызывать деградацию крахмала и некрахмальных полисахаридов, содержащихся в соевой муке проводили анализ углеводного состава продуктов ферментативной модификации соевой муки. Установлено, что за 8 часов гидролиза белков соевой муки (проба 1) ферментными препаратами Бирзим П7 и Бирзим Чилл происходит накопление содержания РВ по сравнению с мукой в 1,2-1,3 раза, и это является положительным моментом, так как, известно, что редуцирующие вещества играют важную роль в технологических процессах, способствуют приданию вкуса готового гидролизата, а кроме того, при получении сухого продукта, вследствие реакции меланоидинообразования будут определять цвет и аромат продукта.

Для более полной характеристики продуктов модификации соевой муки (проба 4) определяли содержание некоторых углеводов. Методом ВЭЖХ установлено, что в гидролизате содержится фруктоза, глюкоза, сахароза, мальтоза, стахиоза в следующих количествах соответственно: 1,20%, 0,34%; 13,06%; 0,58%; 11,14% .

Поскольку большая доля углеводов приходится на стахиозу, которую относят к олигосахаридам сои с бифидогенным действием, поэтому продукты ферментативной модификации соевой муки можно отнести к категории функциональных продуктов. И это очень важно, с точки зрения, расширения области применения соевого сырья при производстве функциональных пищевых продуктов. Кроме того, многие диетологи все большее внимание уделяют положительному влиянию соевых олигосахаридов для профилактики ряда заболеваний.

На основании исследования химического состава в соевой муки (проба 1) установлено, что массовая доля липидов в ней составляет 8-9%. В этой связи для более полной характеристики химического состава ПФМСМ с точки зрения пищевой ценности исследовали состав и содержание фосфолипидов и жирных кислот.

Установлено, что в гидролизованной муке массовая доля ФЛ от общего количества липидов составляет 24,8%±1,3%, а в гидролизате 12,4±1,4%.

При исследовании количественного соотношения фракций ФЛ, рассчитанных на неорганический фосфор (Р), было отмечено, что во всех анализируемых образцах было обнаружено 9 фракций фосфолипидов (табл.5).

Таблица 5. Состав фосфолипидов

Фракция, % Р	Соевая полуобезжиренная мука (n*=15)	Гидролизованная мука (n*=29)	Ферментативный гидролизат (n*=21)
ЛФХ СМ ФХ ФС ФИ ФЭ ФГ КЛ+ФК	3,9±0,6 4,25±0,65 31,4±1,2 15,3±0,95 5,2±0,85 24,45±1,45 3,6±0,4 12,0±1,8	3,55±0,50 3,8±0,45 36,3±0,9 14,1±0,6 5,65±0,45 23,6±0,85 3,5±0,3 6,35±0,8	6,60±1,85 11,85±0,9 25,1±1,45 7,40±0,65 6,3±0,70 19,15±1,65 4,8±0,8 13,55±1,8

Методом газовой капиллярной хроматографии изучен жирнокислотный состав гидролизованной соевой муки (проба 4). Установлено, что она содержит широкий спектр насыщенных и ненасыщенных жирных кислот. Особенно важным является то, что содержание линолевой кислоты, которая является незаменимой и не синтезируется в организме человека, составляет 48%.

Говоря о применении продуктов переработки соевого сырья в пищевой промышленности, немаловажное значение имеет то, что семена сои являются одним из редких продуктов, содержащих изофлавоны, которые сконцентрированы в гипокотиле сои и отсутствуют в масле, в связи с этим исследовали содержание изофлавонов в продуктах ферментативного гидролиза соевой муки методом ВЭЖХ. На рис.9. представлена хроматограмма изофлавонов соевого гидролизата.



Рис.9. ВЭЖХ хроматография гидролизата обезжиренной соевой муки, полученного обработкой в течение 4 ч МЭК-2.

...