Теоретическое обоснование совершенствования промышленно-ценных свойств стартовых культур и их практическое применение в технологии мясных продуктов

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

теоретическое обоснование совершенствования промышленно-ценных свойств стартовых культур и их практическое применение в технологии мясных продуктов

Специальность 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов (перерабатывающие отрасли АПК)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

МАШЕНЦЕВА НАТАЛЬЯ ГЕННАДЬЕВНА

Москва - 2008

Работа выполнена на кафедре «Технология мяса и мясных продуктов» Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» (ГОУ ВПО МГУПБ)

Научный консультант:

Доктор технических наук, профессор В.В. Хорольский

Официальные оппоненты:

Доктор технических наук, профессор В.И. Ганина

Доктор биологических наук, профессор Ю.Д. Цыганков

Доктор технических наук Ю.И. Ковалев

Ведущая организация:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита диссертации состоится «___» _________2008 г. в ______часов на заседании Диссертационного совета Д 212.149.01. при ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПБ.

Автореферат разослан «___» ________ 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат технических наук, профессор А.Г. Забашта

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В настоящее время производственные процессы, основанные на жизнедеятельности микроорганизмов, приобрели огромное значение. Современная биотехнология прямо или косвенно связана с генной инженерией - созданием новых форм микроорганизмов путем непосредственного изменения их генетической системы для получения высокоэффективных полезных штаммов, что влечет за собой увеличение разнообразия биотехнологической продукции. XXI век объявлен Организацией объединенных наций веком биотехнологии. Достижение превосходства в биотехнологии - одна из важных задач в экономической политике промышленных государств. Возможно, что в XXI веке биотехнология окажет решающее воздействие на решение таких важных проблем, как охрана здоровья, обеспечение человека продовольствием, охрана окружающей природы и энергообеспечение.

Тенденцией сегодняшнего дня является создание функциональных продуктов питания с целью улучшения здоровья потребителя. Чаще всего в этой роли выступают кисломолочные продукты, в состав которых входят живые пробиотические культуры. Эффективность и безопасность этих микроорганизмов для здоровья доказаны за долгие годы их применения (http://www.effca.com). Сухие колбасы и другие ферментированные мясные продукты также могут быть «курьерами» для доставки пробиотиков в желудочно-кишечный тракт человека.

Одним из основных аспектов биотехнологии является обеспечение безопасности мясных продуктов, поэтому для гарантии безопасности Институт питания РАМН обязательно рекомендует в технологиях производства мясопродуктов, не подвергающихся тепловой обработке, предусматривать добавление в рецептуру эффективных в отношении санитарно-показательной микрофлоры стартовых культур (Шевелева С.А., 2007).

Микробная биотехнология предлагает новые подходы к переработке нетрадиционных видов сельскохозяйственного сырья, появлению безотходных и усовершенствованию классических технологий мясопродуктов, и созданию широкого спектра полноценных высококачественных продуктов питания.

Фундаментальные основы промышленной биотехнологии микроорганизмов, направленной на получение продуктов питания нового поколения, заложены в трудах Ганиной В.И., Костенко Ю.Г., Липатова Н.Н. (мл), Митасевой Л.Ф., Рогова И.А., Семенихиной В.Ф., Соловьева В.И., Титова Е.И., Токаева Э.С., Хорольского В.В., Bover-Cid S., De Vuyst L., Eerola S., Klaenhammer T.R., Leroy F., Madsen S.M., Niinivaara F., Tanous C., Vandamme E.J. и др.

В пищевой промышленности до последнего времени использовали штаммы микроорганизмов, выделенные из природы. В других промышленных технологиях применяются оптимизированные штаммы, создание которых является важной частью микробиологического синтеза.

Вопросами совершенствования промышленных микроорганизмов традиционно занимаются микробиологи-селекционеры. Для микроорганизмов, недостаточно изученных с точки зрения генетики, единственным инструментом их улучшения является индуцированный мутагенез и ступенчатый отбор лучших вариантов штаммов-продуцентов. Такой метод чрезвычайно трудоемок, и селекционные работы могут занимать многие годы. Развитие методологии генной инженерии, позволяющей выделять и изменять отдельные гены, значительно расширило возможности перестройки геномов микроорганизмов. Сегодня селекция микроорганизмов-продуцентов проводится с помощью методов генной инженерии. Так, если раньше сначала искали активный штамм микроорганизма и только затем разрабатывали процесс получения продукта, то теперь можно взять приспособленный к условиям производства штамм и ввести в него генную конструкцию, которая обеспечит эффективный синтез необходимого продукта.

Конструирование высокопродуктивных штаммов микроорганизмов с заданными свойствами позволит собрать в одном штамме все полезные свойства и элиминировать вредные.

Цель работы - теоретически обосновать и разработать научные принципы совершенствования свойств стартовых культур, позволяющих управлять биотехнологической переработкой сельскохозяйственного сырья, гарантирующей качество и безопасность мясных продуктов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

ь провести направленный отбор и идентификацию стартовых культур с применением классических фенотипических методов в сочетании с генетическими методами в соответствии с рекомендациями ФАО/ВОЗ (Аргентина, 2001; Канада, 2002);

ь расшифровать механизмы формирования качественных характеристик мясопродуктов за счет внесения стартовых культур, и определить основные критерии отбора промышленно-ценных микроорганизмов;

ь определить генетические детерминанты, ответственные за проявление основных технологических свойств у стартовых культур;

ь предложить принцип конструирования высокопродуктивных штаммов микроорганизмов с заданными свойствами;

ь разработать генетическую систему трансформации, экспрессии и селекции перспективных штаммов, и создать штамм-суперпродуцент необходимого технологически-ценного метаболита;

ь создать коллекцию промышленных микроорганизмов, в том числе штаммов-суперпродуцентов с активностями, направленными на обеспечение качества и безопасности мясных продуктов;

ь научно и экспериментально обосновать методологию создания бактериальных препаратов (б/п) на основе стартовых культур по совокупности функциональных свойств микроорганизмов, обладающих взаимной совместимостью;

ь разработать структуру, пользовательские функции и программную оболочку информационного ресурса стартовых культур;

ь провести оценку эффективности влияния стартовых культур на качество и функциональные свойства модельных мясных систем и готовых мясных продуктов;

ь разработать и утвердить техническую документацию на бактериальные препараты и новые виды мясопродуктов.

Научная новизна. Теоретически обоснована и предложена схема направленного отбора молочнокислых бактерий, денитрифицирующих стафилококков, дрожжей и мицелиальных грибов. Проведена идентификация молочнокислых бактерий с применением классических фенотипических методов в сочетании с генетическими методами в соответствии с рекомендациями ФАО/ВОЗ. Проведена идентификация дрожжей и мицелиальных грибов по совокупности микро- и макроморфологических свойств. У выделенных штаммов мицелиальных грибов вида Penicillium camembertii были исследованы вторичные метаболиты. Результаты показали, что ни один из штаммов P. camembertii не продуцирует характерные для данного вида микотоксины, а именно циклопиазоновую кислоту (ЦПК) и ругуловазины А и В.

Обоснована возможность использования энтерококков в качестве стартовых культур. Исследования на тестовых питательных средах (тесты на протеолитическое разжижение желатина, ДНКазу и гемолизин) показали отсутствие факторов вирулентности у штаммов Enterococcus faecalis. Поиск генов, отвечающих за признаки патогенности энтерококков: прикрепление бактерий к поверхности эукариотической клетки (agg), синтез токсина, обеспечивающего гемолиз эритроцитов, (gelE), cylA - активация цитолизина и esp - внеклеточный поверхностный протеин, необходимый E. faecalis для колонизации мочевыводящих путей и образования биопленок, показал присутствие генов agg и gelE в геномах исследуемых штаммов E. faecalis, хотя и не проявляющих свою активность фенотипически.

Изучена проблема распространения антибиотикоустойчивости у промышленных микроорганизмов. Определено отношение к антибиотикам различных групп стартовых культур, проведен анализ природы антибиотикоустойчивости с оценкой ее потенциальной опасности в плане горизонтального переноса.

Разработан системный подход направленного отбора и оптимизации свойств бактерий, позволяющий управлять технологическими процессами производства мясных продуктов, и схемы конструирования штаммов с заданными свойствами: «Схема получения суперэкспрессии гена Y» и «Схема получения делеции участка ДНК, кодирующего ген Y».

Изучена генетическая природа бактериальной денитрификации. Проведено сравнение нитритредуктазной активности штаммов S. carnosus и S. xylosus коллекций МГУПБ и ВКПМ. Сконструирован термочувствительный челночный вектор pBTmcs для репликации в грамположительных бактериях. Получен мутантный штамм S. carnosus (thyA-) на основе штамма S. carnosus B-8953. Клонирован и использован селективный маркер - ген, кодирующий фермент тимидилат синтетазу. Сконструирована экспрессионная плазмида для грамположительных бактерий, включающая сильный промотор гена, кодирующего фермент глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу. С помощью генетических преобразований путем замены промоторной области гена nirR на сильный промотор гена gap на основе штамма S. carnosus (thyA-) получен штамм-суперпродуцент фермента нитритредуктазы S. carnosus LIA-96 (ВКПМ В-9518). Определена значимость наличия всех белковых продуктов нитритредуктазного оперона штамма S. carnosus для активного восстановления нитрита.

Выявлены причины образования биогенных аминов (БА) в мясных продуктах и их влияние на организм человека. Проведен скрининг штаммов с низкой декарбоксилазной активностью или с полным ее отсутствием. Определены генетические детерминанты - tdc гены декарбоксилаз аминокислот у ряда штаммов L. sakei, образующих биогенные амины выше допустимого уровня. Предложен подход к созданию методами генной инженерии штаммов с выключенной декарбоксилазной активностью делецией участка хромосомы с геном tdc. Выбраны штаммы с аминоксидазной активностью, снижающие содержание биогенных аминов в мясных продуктах.

Систематизирована информация о классификации бактериоцинов, механизмах их действия, влиянии условий культивирования штаммов-продуцентов на синтез бактериоцинов стартовыми культурами и методов их определения. Проведен поиск продуцентов бактериоцинов с применением экспресс-метода с нейтрализацией молочной кислоты. Изучена генетика продуцирования бактериоцинов, и определена локализация генетических детерминантов синтеза бактериоцинов у педиококков. Предложены пути к повышению синтеза бактериоцинов стартовыми культурами.

Объяснен механизм ароматообразования в мясных продуктах за счет использования стартовых культур, и определены критерии отбора ароматобразующих микроорганизмов. Проведен скрининг ароматобразующих штаммов с глутаматдегидрогеназной активностью, и изучено их влияние на образование ароматических соединений. Определены генетические детерминанты - гены gdh, кодирующие фермент глутаматдегидрогеназу. Предложен подход к созданию методами генной инженерии штаммов с суперэкспрессией гена gdh.

У стартовых культур определены супероксиддисмутазная (СОД), каталазная, пероксидазная активности и способность связывать ионы металлов переменной валентности Fe2+ и Cu2+, способствующие инактивации производных форм кислорода. Определены генетические детерминанты фермента супероксиддисмутазы - sodA гены у микроорганизмов различных таксонов. Предложен подход к созданию методами генной инженерии штаммов с суперэкспрессией гена sodA.

Предложены научные и практические основы создания бактериальных препаратов, содержащих стартовые культуры различных таксонов, обладающие взаимной совместимостью.

Практическая значимость и реализация результатов. Создана коллекция стартовых культур для мясной промышленности, содержащая микроорганизмы следующих видов: Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus claussenii, Macrococcus caseolyticus, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus, Debaryomyces vanriji, Debaryomyces polymorphus, Debaryomyces hansenii, Candida famata, Penicillium camembertii.

Предложены пути предотвращения распространения детерминантов антибиотикоустойчивости промышленными микроорганизмами.

Предложен подход к изучению и отбору непатогенных стартовых культур энтерококков.

Разработаны экспресс-методы отбора штаммов с аминоксидазной активностью, ароматобразующих штаммов с глутаматдегидрогеназной и трансаминазной активностью с помощью ТСХ.

Создана программа с базой данных основных функциональных свойств микроорганизмов, входящих в коллекцию МГУПБ, позволяющая проектировать состав бактериальных препаратов комплексной направленности для мясных продуктов.

Проведена паспортизация промышленно-ценных штаммов с помощью ДНК-фингерпринта (геномной дактилоскопии) методом ПЦР с использованием штаммоспецифических праймеров. Проведено депонирование штаммов стартовых культур в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, ряд штаммов поставлен на национальное патентное депонирование.

На основе природных штаммов разработаны бактериальные препараты: «Лактомикс», предназначенный для биотрансформации мясного сырья и производства ферментированных мясопродуктов; «Аромалакт» - для цвето- и ароматообразования ферментированных мясопродуктов и биотрансформированного мясного сырья; «Биосейф» - для снижения уровня биогенных аминов в ферментированных мясопродуктах и биотрансформированном мясном сырье, ТУ 9229-045-02068640-07; «Дебарс плюс» - для производства ферментированных мясных изделий, ТУ 9229-046-02068640-07.

На основе штамма S. carnosus LIA-96 разработан бактериальный препарат «Биоцвет», предназначенный для производства термически обработанных предварительно ферментированных мясных изделий, ТУ 9229-047-02068640-07 (на стадии согласования с органами Роспотребнадзора по договору № С-77НЛ/06 от 18.12.2006 г.).

Молекулярно-генетическая экспертиза, проведенная ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, установила, что штамм S. carnosus LIA-96 не является генетически модифицированным, так как был получен путем перестройки собственного генетического материала без включения в его состав чужеродной ДНК. Показана фенотипическая и генотипическая стабильность данного штамма. Проведено молекулярно-генетическое исследование, подтверждающее отсутствие в геноме штамма S. carnosus LIA-96 генов, кодирующих белки-токсины.

Проведены клинические исследования штамма S. carnosus LIA-96 in vivo на белых линейных мышах, в результате которых штамм признан безопасным по показателям безвредности, токсичности, токсигенности и вирулентности.

Разработаны рецептуры и технологии новых видов комбинированных и традиционных мясопродуктов: Мясные продукты в форме первого сорта с добавлением биотрансформированного легкого, ТУ 9213-002-51611136-03, Паштеты в оболочке с добавлением биотрансформированной селезенки, ТУ 9213-002-00423769-03, Полуфабрикаты мясные рубленые с бактериальным препаратом «Лактомикс», ТУ 9214-350-23476484-08, Колбасы сырокопченые, ТУ 9213-007-224-68-005-08, Колбасы сыровяленые, ТУ 9213-008-224-68-005-08, Продукты из свинины деликатесные, ТУ 9213-007-02068315-08. Промышленная апробация разработанных технологий проводилась в условиях Черкизовского МПЗ, ЗАО «Микояновский мясокомбинат», ОАО «Царицыно», ООО МПЗ «Рублевский», ОАО «ИКМА», ООО «АНСЕЙ ВМК», Ростовского и Новочеркасского мясокомбинатов, ЗАО «Агрофирма «Мясо», ООО «Гиперглобус».

Результаты работы нашли применение в учебном процессе МГУПБ на кафедре «Технология мяса и мясопродуктов», при проведении специализации инженеров-технологов мясной промышленности, при выполнении дипломных и диссертационных работ. Новизна решений защищена патентами, справками о депонировании стартовых культур в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика. Практическая значимость работы подтверждена соответствующими документами.

Апробация работы. В диссертации обобщены результаты исследований, проведенных лично автором, при его непосредственном участии и под его руководством.

Основные результаты работы были предметом докладов и обсуждений на Международных и Российских научных конференциях, семинарах: «Проблемы экологической безопасности Северо-Кавказского региона», Ставрополь, 2000; «Пищевой белок и экология», Москва, 2000; «Экологические, технологические и экономические аспекты производства продуктов питания», Семипалатинск, 2000; «Пища, экология, человек», Москва, 2001; «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования», Москва, 2002; «Технологические аспекты комплексной переработки сельскохозяйственного сырья при производстве экологически безопасных пищевых продуктов общего и специального назначения», Углич, 2002; «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2002, 2003, 2005, 2007, 2008; «Живые системы и биологическая безопасность населения», Москва, 2002; «Современные технологии переработки животноводческого сырья в обеспечении здорового питания: наука, образование и производство», «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы», Москва, 2004; «Значение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем», Калининград, 2005; «Живые системы и биологическая безопасность населения», Москва, 2005; Выездной пленум НОГР клинико-патогенические аспекты желудочно-кишечного дисбиоза при заболеваниях органов пищеварения: диагностика, лечение и профилактика, 2005; Биология наука XXI века: 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Пущинского научного центра РАН, Пущино, 2006; «Успехи медицинской микологии», 2006; «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2006; «Живые биосистемы 2007», Москва, 2007.

Результаты работы удостоены дипломами, грамотами и медалями конференций «Биотехнология: состояние и перспективы развития», «Биотехнология. Вода и пищевые продукты», «Биотехнология и медицина», «Технологии живых систем», «Живые системы и биологическая безопасность населения», биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2007». Исследования выполнялись в рамках научных тематик МГУПБ, их результаты регулярно рассматривались на научно-техническом и ученом советах. По материалам диссертации опубликовано: 101 работа (в т.ч. статей в журналах, рекомендованных ВАК - 17, в других изданиях - 37); монография, патенты, два лабораторных практикума и методические указания для студентов специальностей 270900, 250301, 240901, 240902 и магистров направления 260100.

Структура и объем работы. Диссертационная работа включает введение, 9 глав, выводы и приложения, изложена на 363 страницах основного текста, содержит 76 таблиц и 133 рисунка. Список литературы состоит из 288 источников.

На защиту выносятся следующие основные положения:

- научные принципы совершенствования свойств стартовых культур, основанные на внутренней перестройке генома клеток и создании условий, побуждающих включение генов в жизнедеятельность клетки;

- системный подход к направленному отбору и идентификации стартовых культур;

- обоснование необходимости определения устойчивости к антибиотикам промышленных микроорганизмов и выбора штаммов, свободных от мобильных генетических факторов устойчивости;

- результаты исследований ферментативных активностей микроорганизмов, влияющих на цвето-, ароматообразование, снижение уровня биогенных аминов, замедление окислительной порчи липидов мясного сырья, подавление жизнедеятельности санитарно-показательной микрофлоры за счет синтеза бактериоцинов, и их взаимосвязь с генетическими детерминантами;

- способ конструирования штамма суперпродуцента фермента нитритредуктазы путем перестройки собственного генетического материала, позволяющего значительно снижать или полностью исключать наличие остаточного нитрита натрия в мясных продуктах;

- обоснование принципов подбора промышленно-ценных штаммов, обладающих взаимной совместимостью, при использовании компьютерной программы с базой данных функциональных свойств стартовых культур в методологии создания функциональных бактериальных препаратов;

- биотехнология ферментированных мясных продуктов, в том числе с использованием нетрадиционного сельскохозяйственного сырья;

- оценка эффективности влияния разработанных бактериальных препаратов на качественные показатели и безопасность мясного сырья и готовых мясных продуктов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении кратко изложено состояние проблемы на данный период времени, обоснована актуальность выбранного направления, поставлена цель, определены задачи исследований и сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну, показана практическая значимость и степень апробации работы.

В первой главе «Литературный обзор» приводится обзор информации относительно роли микроорганизмов в современной биотехнологии мясных продуктов.

В главе 2 «Методика постановки эксперимента и частные методы исследований» даны краткие характеристики объектов исследований, представлена схема эксперимента (рис. 1), обоснован комплекс исследуемых показателей и изложены методики их определения.

Объектами исследований служили спонтанно ферментированные мясные продукты, молочнокислые бактерии видов Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus claussenii, денитрифицирующие кокки Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus, Macrococcus caseolyticus, энтерококки Enterococcus faecalis, дрожжи Debaryomyces vanriji, Debaryomyces polymorphus, Debaryomyces hansenii, Candida famata, мицелиальные грибы Penicillium camembertii из коллекции стартовых культур МГУПБ. Штамм-суперпродуцент фермента нитритредуктазы Staphylococcus carnosus LIA-96 (В-9518).

Штамм Micrococcus sp. В-3087, обладающий гистидиндекарбоксилазной активностью, типовые штаммы P. pentosaceus В-7511, P acidilactici В-7509, L. plantarum В-6758 и D. hansenii Y-1682, тест-культуры патогенных и условно-патогенных штаммов Salmonella typhymurium LT2 (B-3533), Proteus vulgaris ATCC 13315 (B-1667), E. coli K-12 C 600 (B-1010), Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P (В-6646), S. epidermidis B-8933, S. epidermidis В-8940, E. faecalis В-4610, Staphylococcus aureus subsp. aureus 6538Р, Staphylococcus epidermidis 14990, Staphylococcus saprophiticus 15305, Escherichia coli 157, Salmonella typhimurium 5715, Shigella sonnae 5063, Proteus vulgaris 14, Proteus mirabilis 47 были предоставлены ВКПМ ГосНИИгенетики и ГКПМ ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Стартовые культуры, входящие в состав бактериальных препаратов фирм WIBERG/Австрия, Gewьrzmьller/Германия, Chr.Hansen/Дания, Texel/Франция. Бактериальные препараты «Лактомикс», «Аромалакт», «Биосейф», «Биоцвет», «Дебарс плюс», модельные мясные системы и вновь разработанные мясные продукты.

В процессе лабораторных исследований и опытно-промышленных выработок были использованы классические микробиологические, физиолого-биохимические, молекулярно-генетические, физико-химические, органолептические методы, их модификация, а также вновь разработанные методы. Генетические методы, используемые в работе (выделение плазмиды из грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, выделение хромосомной ДНК, электропорация, блоттинг по Саузерну, гибридизация по Саузерну, лигирование ДНК, рестрикция ДНК, ПЦР и др.), являются модификацией известных методов (Маниатис Т., 1984).

Определение устойчивости к антибиотикам проводилось диско-диффузионным методом, антагонистической активности - методом перпендикулярных штрихов. Определение глутаматдегидрогеназной, трансаминазной, аминоксидазной активностей и микотоксинов - методом ТСХ. Определение декарбоксилаз аминокислот - с использованием основы бульона Мюллера и методом ВЭЖХ. Определение белка в клеточных экстрактах микроорганизмов - методом Брэдфорд. НАД и НАДФ-зависимые глутаматдегидрогеназные (ГДГ) активности были измерены в свежих клеточных экстрактах, используя тест, основанный на колориметрическом определении L-глутаминовой кислоты в пищевых продуктах (Boehringer Mannheim, Германия). Способность связывать ионы металлов переменной валентности Cu2+ и Fe2+, каталазная, пероксидазная, супероксиддисмутазная активности определялись спектрофотометрически. Определение денитрифицирующей активности - методом Грисса. Определение бактериоцинов осуществлялось экспресс-методом с нейтрализацией молочной кислоты. Бактериологическое исследование проводили согласно ГОСТ 9958.

Определение органических кислот проводилось методом ВЭЖХ на хроматографе «Alliance» (Separations Module Waters 2695, Photodiode Array detector Waters 2996); колонка ReproSil-Pur C18-AQ, 5 мкм, 250Ч4,0 мм, температура колонки 30 °С, инжекция 5 мкл.

Для проведения газохроматографических исследований использовали капиллярный газовый хроматограф фирмы Hewlett Packard (США) HP 5730 с пламенно-ионизационным детектором и кварцевой капиллярной колонкой SPB-1 (50 м Ч 0,32 мм, слой фазы 0,25 мкм). Аминокислотный анализ проводили с использованием хроматографии на сульфо-полистирольном ионообменнике с элюцией ступенчатым градиентом Na-цитратных буферных растворов на аминокислотном анализаторе Hitachi 835 (Япония).

Клинические испытания in vivo проводились в соответствии с санитарными правилами СП 3.3.2.561-96 «Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунологических препаратов» в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Молекулярно-генетическая экспертиза проводилась в соответствии с МУ 2.3.2.1830-04 «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов».

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили по стандартным программам и общепринятым алгоритмам с использованием регрессионного анализа и оптимизации.

Рис. 1. Схема проведения эксперимента

Глава 3. Направленный отбор и идентификация стартовых культур

Молочнокислые бактерии и денитрифицирующие стафилококки

В работе было проведено выделение микроорганизмов из высококачественных спонтанно ферментированных мясных изделий, были изучены культуральные, физиолого-биохимические, технологические, пробиотические свойства. Для того чтобы отобрать отечественные конкурентоспособные штаммы, параллельно проводилась работа по изучению технологически-ценных свойств стартовых культур импортных бактериальных препаратов.

Идентификацию на уровне штамма (генетическое типирование) проводили методом ПЦР с анализом полиморфизма случайно амплифицированных последовательностей ДНК. Таксономический статус микроорганизма устанавливали на основании фенотипических свойств в сочетании с генетической идентификацией, используя такие методы, как ДНК-ДНК гибридизация, сиквенс 16S рРНК, RAPD-ПЦР и др. При проведении анализа нуклеотидных последовательностей вариабельный участков 16S рРНК продукты амплификации участка 16S рРНК после проведения электрофореза в агарозном геле визуализировали в УФ-свете на приборе УФ-трансиллюминатора УВТ-1 при помощи программы BioTest. Нуклеотидная последовательность амплифицированных участков 16S рРНК была получена в результате секвенирования на автоматическом секвенаторе CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, США). Для подтверждения идентичности штамма тем микроорганизмам, таксономический статус которых уже установлен, были использованы молекулярно-биологические базы данных http://rdp.cme.msu.edu/. В результате были отобраны и идентифицированы бактерии, отнесенные к 11 видам, депонированные в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика.

Дрожжи и мицелиальные грибы

Идентификация дрожжей проводилась по совокупности микро- и макроморфологических свойств. В результате было отобрано шесть штаммов дрожжей. По совокупности определенных признаков при использовании определителя дрожжей (Nakase T., 1998) полученные штаммы были идентифицированы как Debaryomyces vanriji Dji, D. hansenii Dhi, D. polymorphus Dps, Candida famata КФ-1, КФ-2, КФ-3. Штаммы находятся на национальном патентном депонировании в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика под номерами Y-3140, Y-3139, Y-3138, Y-3129, Y-3130, Y-3128 соответственно, что подтверждается справками о депонировании.

Идентификацию грибов проводили путем культивирования на различных питательных средах (агар Чапека с дрожжевым экстрактом, сусло-агар, нитратный агар с глицерином) и определения их культуральных и морфологических признаков.

Для того чтобы исключить риск использования в пищевой промышленности микроорганизмов, способных синтезировать микотоксины, у выделенных штаммов мицелиальных грибов вида P. camembertii были исследованы вторичные метаболиты, и проведен среди них поиск микотоксинов: ЦПК и ругуловазинов А и В. Полученные в результате ТСХ данные показали, что ни один из штаммов P. camembertii ПК-1, ПК-2, ПК-3, ПК-4, ПК-5, ПК-7 не продуцирует характерные для данного вида мицелиальных грибов микотоксины, а именно ЦПК и ругуловазины А и В, о чем свидетельствует приведенная хроматографическая пластина (рис. 2). По итогам проведенной работы были отобраны шесть штаммов мицелиальных грибов, относящихся к виду Penicillium camembertii ПК-1, ПК-2, ПК-3, ПК-4, ПК-5, ПК-7, которые находятся в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика под номерами F-905, F-885, F-906, F-907, F-908, F-884 соответственно, что подтверждается справками о национальном патентном депонировании.

бактерия стафилококк стартовый культура



Рис. 2. Определение ругуловазинов А и В, и ЦПК в условиях глубинного культивирования на среде Абе

Обозначения: 1 - ПК-1 (6 сут), 2 - ПК-1 (12 сут); 3 - ПК-2 (6 сут), 4 - ПК-2 (12 сут); 5 - ПК-3 (6 сут), 6 - ПК-3 (12 сут); 7 - С-47 (контроль ругуловазинов А и В); 8 - F-3088 (контроль ЦПК); 9 - ПК-4 (6 сут), 10 - ПК-4 (12 сут); 11 - ПК-5 (6 сут), 12 - ПК-5 (12 сут); 13 - ПК-7 (6 сут), 14 - ПК-7 (12 сут)

Неправильная идентификация микроорганизмов не только не позволит получить продукт с заданными свойствами и характеристиками, но и может нести угрозу безопасности ферментированных продуктов, поэтому для идентификации должен быть использован комплекс всех доступных фенотипических и генотипических методов.

Глава 4. Определение безопасности стартовых культур

Антибиотикоустойчивость промышленных культур и пути предотвращения распространения ее детерминантов

В последнее время, в связи с глобальным распространением явления антибиотикоустойчивости у микробов, влекущего за собой рост неблагоприятных последствий для человека (снижение эффективности лечения различных широко распространенных заболеваний, повышение тяжести инфекций, вызванных антибиотикорезистентными возбудителями, усиление агрессивных свойств возбудителей и т.д.), в мире стало уделяться повышенное внимание такому важному критерию отбора микроорганизмов для промышленных целей как отсутствие антибиотикоустойчивости, связанной с эффективно распространяющимися путем горизонтального переноса генетическими факторами. Такие генетические факторы могут, в частности, передаваться с высокой частотой от лактобактерий к патогенным микроорганизмам и наоборот.

Возможность горизонтального переноса генов устойчивости к антибиотикам повышается при локализации этих генов в составе плазмид и транспозонов. Следует учитывать, что плазмиды широко распространенны среди всех видов молочнокислых бактерий, и ряд плазмид кодирует важные технологические свойства. Наличие плазмид у стартовых культур и пробиотиков может не представлять опасности, если штаммы не содержат трансмиссивных генов устойчивости к антибиотикам.

Устойчивость к антибиотикам штаммов промышленных микроорганизмов сама по себе не является вредным фактором. В некоторых случаях природная устойчивость может быть полезной для стабилизации микрофлоры кишечника при проведении антибиотикотерапии. В то же время, при рекомендации к использованию в пищевой промышленности штаммов молочнокислых микроорганизмов необходимо учитывать опасность переноса генов антибиотикоустойчивости от молочнокислых бактерий к патогенным микроорганизмам.

Проведение анализа проблемы распространения антибиотикоустойчивости позволило определить пути предотвращения распространения детерминантов антибиотикоустойчивости молочнокислыми бактериями. Для этого необходимо:

O обязательно оценивать культуры стандартизованными методами на устойчивость к антибиотикам;

O развивать критерии и методологию контроля промышленных микроорганизмов в сырье и пищевых продуктах при их допуске в производство и находящихся в обороте;

O создать информативную базу минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибиотиков и пограничных значений МПК природной устойчивости;

O создать базу данных генетических элементов, определяющих антибиотикоустойчивость бактериальной клетки, способных с высокой частотой распространяться горизонтальным путем;

O проводить поиск новых промышленных штаммов, не содержащих генов приобретенной устойчивости к антибиотикам.

Выполнение данных положений имеет большое значение для отбора безопасных стартовых культур и пробиотиков, не несущих трансмиссивных генов антибиотикоустойчивости. У выделенных и идентифицированных микроорганизмов была определена устойчивость к антибиотикам различных групп, включая ингибиторы синтеза клеточной стенки, белка, нуклеиновых кислот и ингибиторы функции цитоплазматических мембран.

Таблица 1

Определение устойчивости к антибиотикам лактобактерий

АНТИБИОТИКИ	L. sakei 105	L. curvatus 1	L. curvatus 102	L. sakei 104	L. casei 10	L. curvatus 2	L. sakei 35	L. sakei 45
Ингибиторы синтеза клеточной стенки
ПЕНИЦИЛЛИНЫ
Метициллин М 5 мкг	29 S	21 S	21 S	24 S	21 S	36 S	21 S	19 S
Пенициллин G Р 10 ед	38 S	36 S	40 S	35 S	33 S	40 S	35 S	30 S
ЦЕФАЛОСПОРИНЫ
Цефалоридин Cr 30 мкг	32 S	15 I	19 S	18 S	10 R	29 S	6 R	6 R
Ингибиторы синтеза белка
АМИНОГЛИКОЗИДЫ
Канамицин К 30 мкг	11 R	17 I	18 S	14 I	6 R	24 S	6 R	6 R
Тобрамицин Tb 10 мкг	17 S	18 S	17 S	15 S	6 R	22 S	6 R	6 R
ЛИНКОЗАМИДЫ
Линкомицин L 2 мкг	35 S	38 S	39 S	28 S	20 I	38 S	23 S	32 S
МАКРОЛИДЫ
Олеандомицин Ol 15 мкг	23 S	22 S	24 S	20 S	17 I	28 S	18 S	16 S
Ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот
ХИНОЛОНЫ
Норфлоксацин Nx 10 мкг	18 I	22 S	25 S	16 I	10 R	34 S	6 R	6 R

Обозначения: R - устойчивый, I - умеренно устойчивый, S - чувствительный.

Цифры обозначают диаметры задержки роста штаммов вокруг дисков с антибиотиками, мм.

Как видно из табл. 1, все штаммы оказались чувствительными к пенициллину G, метициллину. Вариабельность была зафиксирована в отношении цефалоридина, норфлоксацина и аминогликозидов. Устойчивость к этим антибиотикам является природной. Умеренная устойчивость в отношении линкомицина (группа линкозамиды) и олеандомицина (группа макролиды) была характерна только для L. casei 10. В данном случае прослеживается перекрестная умеренная устойчивость к линкозамиду и макролиду.

По результатам работы были выбраны микроорганизмы, не способные к распространению генов антибиотикоустойчивости. Это позволит предотвратить опасность переноса генов антибиотикоустойчивости от молочнокислых бактерий к патогенным микроорганизмам.

Определение факторов вирулентности у штаммов вида Enterococcus faecalis

Штаммы молочнокислых энтерококков в последнее время все чаще предлагается использовать в качестве пробиотиков для улучшения микробного баланса тонкого кишечника. Неоднозначное отношение к энтерококкам связано с тем, что, будучи частью нормальной микрофлоры, они являются и одним из важнейших возбудителей госпитальных инфекций, и отсутствие факторов патогенности - главный и обязательный критерий при оценке возможности использования бактерий рода Enterococcus в пищевой промышленности, а также в качестве пробиотиков. Во многих случаях патогенность не является видовым признаком микроорганизма.

Разработанные на сегодняшний день тесты, в том числе генетические, позволяют выявить степень безопасности энтерококковых штаммов. Исследования проводились со штаммами E. faecalis 31, E. faecalis 55, E. faecalis 59. Для сравнения были взяты штаммы Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P, S. epidermidis В-8940, типовой штамм E. faecalis В-4610, у которого ранее были обнаружены гены патогенности: agg (прикрепление бактерий к поверхности эукариотической клетки), gelE (синтез токсина, обеспечивающего гемолиз эритроцитов) и cylМВA (синтез цитолизина, где cylM - посттрансляционная модификация цитолизина; cylB - транспорт цитолизина; cylA - активация цитолизина). Проведение исследований на тестовых питательных средах (тесты на протеолитическое разжижение желатина, ДНКазу и гемолизин) показали отсутствие факторов вирулентности, поэтому следующим этапом было проведение ПЦР-генотипирования штаммов.



а) б)

Рис. 3. Электрофорез фрагментов генов: а - agg, б - gelE

Обозначения: М1 - маркер GeneRulerтм 100 bp DNA Ladder, Fermentas; М2 - маркер DNA Ladder, Mix, Fermentas; 1 - E. faecalis 31; 2 - E. faecalis 59; 3 - E. faecalis 55; 4 - E. faecalis B-4610

Результаты показали присутствие генов вирулентности agg и gelE в геномах исследуемых штаммов E. faecalis (рис. 3), что не позволяет их использовать в качестве стартовых культур и пробиотиков. Применение данного подхода к изучению и отбору энтерококков позволит создавать качественные и безопасные отечественные бактериальные препараты.

Обеспечение безопасности ферментированных мясопродуктов амино-негативными стартовыми культурами

Выбор стартовых культур является основой для гарантии качества готового продукта в отношении содержания биогенных аминов. Поэтому, неспособность к образованию БА в течение всего технологического цикла и в процессе хранения должна быть одним из основных критериев для выбора стартовых культур при производстве ферментированных мясопродуктов. Уровень декарбоксилазной активности in vitro у микроорганизмов, вызывающих существенное повышение концентрации БА (свыше 100 мг/кг продукта), составляет 350 мг/л скрининговой среды. Микроорганизмы, образующие в скрининговой среде БА в количестве, меньшем, чем 350 мг/л, считаются амино-негативными (Bover-Cid S., 1999).

Так как основной задачей было определить штаммы с уровнем активности ниже критического, на первом этапе отбирались штаммы, не имеющие вообще декарбоксилазной активности (на тестовой среде), а на втором этапе были определены уровни активности образования БА среди остальных микроорганизмов методом ВЭЖХ.

Были получены следующие результаты: из 48 исследованных штаммов только 3 имеют декарбоксилазную активность по отношению к гистидину, 18 - к тирозину, 29 - к лизину и 36 - к тирозину. Штаммы P. claussenii 9, L. casei 10, L. sakei 19, P. pentosaceus 25, L. sakei 45 не обладают декарбоксилазной активностью в отношении выбранных аминокислот, а штамм P. pentosaceus 106 имеет декарбоксилазную активность по отношению ко всем аминокислотам. На рис. 4 представлены хроматограммы образцов гистамин-негативного штамма P. pentosaceus 106 и тирамин-позитивного микроорганизма L. sakei 105.

а) б)

Рис. 4. Хроматограммы а) гистамин-негативного штамма Pediococcus pentosaceus 106 и б) тирамин-позитивного штамма Lactobacillus sakei 105

По оси Х указано время анализа, мин; по осу Y - сигнал детектора, AU.

Результаты исследования показали, что уровень образования гистамина был низким для P. pentosaceus 106 - 4,32 мг/л, L. curvatus CDN - 6,61 мг/л, S. xylosus 45 - 5,65 мг/мл. Путресцин продуцировали 77% штаммов, но в незначительном количестве (в пределах 0,117-10,65 мг/л). S. xylosus P-1, стартовая культура, входящая в состав коммерческого импортного бактериального препарата, в культуральном бульоне накапливала путресцин в количестве 63,35 мг/л. Независимо от их видовой принадлежности, продуцировали кадаверин (от 0,192 до 11,13 мг/л) 40% штаммов. Три штамма L. sakei 101, 103, 105 были определены как амино-позитивные, так как продуцировали тирамин выше обозначенного уровня 350 мг/л (468,19, 477,75 и 581,18 мг/л, соответственно). В данном случае можно говорить, что высокая активность тирозиндекарбоксилазы характерна для вида L. sakei. Количество тирамина, образуемого остальными штаммами, не превышало 2 мг/л. В результате были отобраны отечественные штаммы, низкая декарбоксилазная активность которых (или полное ее отсутствие) позволит использовать их в мясной промышленности в качестве стартовых культур.

По результатам исследований была создана Коллекция стартовых культур МГУПБ, в которую вошли технологичные штаммы с отсутствием патогенности и токсигенности, а также трансмиссивной антибиотикоустойчивости. Штаммы депонированы в ВКПМ ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов и хранятся в лиофилизированном виде, что подтверждается справками о депонировании, в том числе национальном патентном депонировании. На каждый штамм оформлен паспорт, в котором отражена информация об его точной таксономической идентификации, источнике выделения, характере устойчивости к антибиотикам с оценкой ее потенциальной опасности в плане переноса, перечислены основные фенотипические, генотипические и промышленно-ценные свойства.

Глава 5. Изучение промышленно-ценных свойств стартовых культур

Определение аминоксидазной активности у стартовых культур

Потенциальная роль микроорганизмов, имеющих аминоксидазную активность, используемых в ферментации продуктов питания, заключается в прекращении образования или снижении аккумулирования БА в продуктах питания. Аминоксидазы участвуют также в обезвреживании аминов, образующихся в кишечнике под влиянием гнилостных бактерий. Поэтому аминоксидазная активность должна рассматриваться как важная характеристика при селекции стартовых культур, а также пробиотиков.

Аминоксидазная активность у исследуемых микроорганизмов определялась по способности снижать содержание БА (гистамина, тирамина, кадаверина, путресцина). На первом этапе методом ТСХ были выбраны штаммы, при инкубировании с которыми количество биогенных аминов в пробах снижалось. Уровни активности ферментов аминоксидаз были определены с помощью ВЭЖХ.

Амины обнаруживались на хроматографической пластинке в виде фиолетовых пятен (например, рис. 5). По разности размеров и интенсивности окраски пятен, соответствующих контрольному образцу и анализируемой пробе, определяли, имело ли место снижение концентрации амина, т.е. проявление аминоксидазной активности.

Рис. 5. Картина тонкослойной хроматографии путресцина

0 - начальная концентрация амина, 1 - P. acidilactici 33, 2 - P. acidilactici 34, 3 - P. pentosaceus 23, 4 - P. acidilactici 27, 5 - P. pentosaceus 106, 6 - P. acidilactici 3, 7 - P. pentosaceus 28, 8 - P. pentosaceus 39, 9 - S. carnosus 108, 10 - P. acidilactici 25, 11 - L. sakei 104, 12 - P. pentosaceus 31, 13 - P. acidilactici 38

По результатам ТСХ для дальнейшего количественного анализа были выбраны следующие штаммы, показавшие наибольшую аминоксидазную активность: L. plantarum 22/2, 32, L. curvatus 102, 2, L. sakei 104, 35; L. casei 10; P. acidilactici 3, 25, 27, 33, 38; S. carnosus 108. Количественное определение снижения уровня биогенных аминов было проведено методом ВЭЖХ (табл. 2).

Таблица 2

Количественная оценка способности микроорганизмов разрушать биогенные амины

Название микроорганизма	Биогенные амины
	Гистамин	Тирамин	Кадаверин	Путресцин
	Начальное количество БА в образце, мг/л
	737,11±31,29	265,63±12,16	128,93±5,33	89,30±3,45
	Количество БА в образце через 96 ч инкубации, мг/л
Lactobacillus curvatus 2	-	3,13±0,15	0,332±0,015	0,830±0,04
Lactobacillus curvatus 102	0,719±0,035	-	-	1,66±0,31
Lactobacillus sakei 35	-	-	0,128±0,001	-
Lactobacillus sakei 104	-	62,39±3,23	-	-
Lactobacillus casei 10	386,28±15,34	207,27±9,35	-	0,480±0,022
Lactobacillus plantarum 32	60,558±0,98	52,412±3,31	0,958±0,036	-
Lactobacillus plantarum 22/2	-	-	0,186±0,008	0,674±0,033
Pediococcus acidilactici 3	163,81±7,18	-	0,093±0,004	-
Pediococcus acidilactici 25	131,76±6,23	259,94±9,92	-	0,293±0,015
Pediococcus acidilactici 27	129,16±5,44	-	0,121±0,006	-
Pediococcus acidilactici 38	151,81±7,17	-	-	-
Pediococcus acidilactici 33	184,40±8,36	270,62±13,45	0,314±0,013	-
Staphylococcus carnosus 108	561,03±23,07	-	-	0,686±0,031

Установлено, что активность фермента аминоксидазы зависит скорее от штамма, а не от вида микроорганизма, т.е. является штаммоспецифичным признаком. Проведенный скрининг позволил охарактеризовать микроорганизмы по уровню их аминоксидазной активности и рекомендовать ряд штаммов для использования в мясной промышленности в качестве стартовых культур, повышающих безопасность и качество продуктов.

Стартовые культуры - продуценты бактериоцинов

Один из важнейших эффектов стартовых культур - это продление срока годности мясных продуктов. Считается, что молочнокислые микроорганизмы подавляют жизнедеятельность посторонней микрофлоры за счет выделения органических кислот и, следовательно, снижения рН. Это неоспоримый факт, и снижение рН является частью комплексного действия молочнокислых микроорганизмов, что позволяет использовать их в качестве биоконсервантов. Однако проведенные научные исследования доказывают, что ингибирование роста условно-патогенной микрофлоры происходит в ряде случаев именно за счет антибактериальных белковых веществ - бактериоцинов. Это особенно важно при использовании бактериоцинов в чистом виде после предварительного выделения и очистки для тех мясных продуктов, при производстве которых понижение рН нежелательно.

Так как бактериоцины играют большую роль в природных бактериальных сообществах, синтез этих веществ имеет значение для конкуренции внутри популяции и между ними. У бактериоциногенных популяций защитная активность проявляется в ингибировании развития других бактерий, обладающих сходными пищевыми потребностями, поэтому это свойство очень ценно для использования в мясных системах при подавлении жизнедеятельности нежелательной микрофлоры. Полученные результаты показали, что среди проверенных штаммов есть микроорганизмы, как с разным уровнем синтеза бактериоцинов, так и с разным спектром ингибирования санитарно-показательной микрофлоры, и подтверждают данные других авторов, что способность синтезировать бактериоцины не является видовой характеристикой микроорганизмов и относится к штаммоспецифическому признаку (табл. 3).

Таблица 3

Способность молочнокислых микроорганизмов продуцировать бактериоцины

<...

Название микроорганизма	Номер ВКПМ	Киллерная активность микроорганизмов, %
		Salmonella typhymurium LT2	Proteus vulgaris ATCC 13315	Escherichia coli K-12 C 600	Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P
Lactobacillus curvatus 1	В-8889	1	0	0	0
Lactobacillus curvatus 2	В-8906	0	0	27	34
Lactobacillus curvatus 102	В-8900	21	30	34	44
Lactobacillus curvatus 301-1	В-8954	0	0	0	0
Lactobacillus curvatus CDN	В-8948	25	0	0	0
Lactobacillus sakei 35	В-8886	21	7	0	9
Lactobacillus sakei 45	В-8896	0	0	0	27
Lactobacillus sakei 101	B-8939	0	47	39	30
Lactobacillus sakei 103	В-8932	33	35	35	50,1
Lactobacillus sakei 104	В-8936	26	10	30	64,8
Lactobacillus sakei 105	В-8905	62	17	56	13
Lactobacillus sakei 306-1	В-8949	0	0	0	0
Lactobacillus sakei 111-1	В-8952	0	28	0	72
Lactobacillus casei 10	В-8890	0	0	0	15
Lactobacillus plantarum 19	В-8907	0	8	27	35
Lactobacillus plantarum 21	B-8654	0,2	0	20	53
Lactobacillus plantarum 100	В-8899	40	20	34	31
Lactobacillus plantarum 7К	В-2663	0	57	28	30
Lactobacillus plantarum 22/2	В-1615	34	0	0	19
Lactobacillus plantarum 2П	В-1616	0	27	0	57
Lactobacillus plantarum 31	В-1617	48	13	21	17
Lactobacillus plantarum 32	В-1618	0	0	37	49
Pediococcus acidilactici 3	В-8891	62	0	33	29
Pediococcus acidilactici 8	В-8897	72	0	38	51
Pediococcus acidilactici 15	В-8895	24	0	0	0
Pediococcus acidilactici 25	В-8892	0	0	27	44
Pediococcus acidilactici 27	В-8893	61	0	34	67
Pediococcus acidilactici 33	В-8903	24	5	0	0
Pediococcus acidilactici 34	В-8887	0	0	0	0
Pediococcus acidilactici 38	В-8902	58	27	50	22
Pediococcus pentosaceus 23	В-8894	96	2	32	54
Pediococcus pentosaceus 28	В-8888	58	65	39	65
Pediococcus pentosaceus 31	В-8901	8	0	0	3
Pediococcus pentosaceus 39	В-8898	0	52	34	30
Pediococcus pentosaceus 55	В-8955	78	75

автореферат "Теоретическое обоснование совершенствования промышленно-ценных свойств стартовых культур и их практическое применение в технологии мясных продуктов" скачать

Подобные документы

• Молочнокислое брожение

  Характеристика и химизм молочнокислого брожения, его виды. Возбудители брожения, типичные и нетипичные молочнокислые бактерии, виды лактобактерий. Практическое применение молочнокислого брожения в народном хозяйстве, производство пищевых продуктов.
  
  реферат [73,9 K], добавлен 04.03.2012
  

• Технология производства сырокопченых колбас

  Технологическая схема производства сырокопченых колбас. Подготовка сырья, его посол, приготовление фарша. Наполнение оболочек фаршем, осадка, копчение. Упаковывание, маркировка и хранение. Применение стартовых культур для производства сырокопченых колбас.
  
  контрольная работа [1,8 M], добавлен 11.04.2013
  

• Определение сроков хранения и разработка рецептуры мясных консервов с добавлением растительного компонента

  Комбинированные пищевые продукты: общие принципы разработки продуктов питания с заданным соотношением составных частей. Разработка технологии производства комбинированных мясных продуктов с добавлением растительных компонентов (технологическая схема).
  
  курсовая работа [55,8 K], добавлен 19.03.2011
  

• Применение процессов брожения в народном хозяйстве

  Анаэробный метаболический распад молекул питательных веществ. Использование брожения с применением определенных видов и штаммов микроорганизмов. Молочнокислые бактерии в квашеной капусте. Приготовление сыра путём плавления различных молочных продуктов.
  
  презентация [4,1 M], добавлен 25.12.2013
  

• Применение методов оптической атомной спектроскопии в контроле качества и безопасности пищевых продуктов

  Краткая характеристика мясных консервов для детского питания и технологии их производства. Обоснование необходимости контроля свинца. Физико-химические основы и аппаратурное оснащение метода. Особенности метода атомно-абсорбционной спектрометрии.
  
  курсовая работа [61,0 K], добавлен 23.04.2014
  

• Критерии и оценки безопасности пищевых продуктов

  Характеристика основных требований к безопасности пищевых продуктов: консервов, молочных, мучных, зерновых, мясных, рыбных, яичных продуктов. Санитарные и гигиенические требования к кулинарной обработке пищевых продуктов. Болезни пищевого происхождения.
  
  курсовая работа [193,6 K], добавлен 20.12.2010
  

• Витаминизация мясных продуктов

  Потребность человеческого организма в витаминах. Обеспеченность витаминами населения. Источники ликвидации дефицита витаминов в организме. Использование растительного сырья как витаминизирующего компонента в технологии производства мясных продуктов.
  
  реферат [41,3 K], добавлен 20.02.2014
  

• Развитие технологии мясных производств

  Классификация мясных консервов. Генезис технологии пищевых производств. Ученые, внесшие вклад в развитие мясных производств. Технологический процесс приготовления паштета, характеристика используемого сырья и обоснование добавления инулина в рецептуру.
  
  курсовая работа [49,8 K], добавлен 03.12.2013
  

• Характеристика традиционного ассортимента мясных товаров и пути его совершенствования (использование наполнителей, обогатителей, стабилизаторов, антиокислителей и т.д.)

  Изучение химического состава и определение пищевой ценности мясных товаров. Товароведная характеристика традиционного ассортимента мясных товаров и пути его совершенствования. Формирование рынка мясной продукции и организация контроля её качества.
  
  курсовая работа [47,9 K], добавлен 14.06.2014
  

• Особенности турецкой кухни

  Исследование национальных особенностей турецкой кухни, популярных пищевых продуктов, обработки и хранения пищи. Изучение технологии приготовления овощных салатов, мясных и овощных супов, вторых блюд из мясных продуктов, десертов и традиционных напитков.
  
  реферат [25,8 K], добавлен 09.10.2012
  

• Программа и методы определения массовой доли жира и крахмала в полуфабрикатах мясных рубленных (котлетах)

  Технологический процесс производства, маркировка, правила хранения и транспортирования полуфабрикатов мясных рубленных котлет. Контроль и приемка сырья и материалов. Проведение химического анализа на определение массовой доли жира и крахмала в продукте.
  
  курсовая работа [273,7 K], добавлен 22.04.2015
  

• Сертификация мясных продуктов

  Развитие и укрепление контроля за качеством и безопасностью продуктов питания. Пищевая ценность и биологическая роль жиров. Сертификация мяса, мясных продуктов и птичьих яиц. Сертификаты соответствия и ветеринарные свидетельства гигиеническое заключение.
  
  реферат [20,9 K], добавлен 23.03.2011
  

• Пищевые красители мясной промышленности

  Общая характеристика использования красителей пищевых продуктов. Рассмотрение проблемы безопасности мясных продуктов. Анализ законодательной базы в сфере пищевых добавок. Изучение вопроса о сокращении производства синтетических и "проблемных" красителей.
  
  реферат [19,8 K], добавлен 13.11.2015
  

• Технология использования пробиотических микроорганизмов в производстве кисломолочных продуктов

  Изучение свойств комбинированных заквасок, состоящих из культур Pr. shermanii и L. acidophilus. Влияние соотношения заквасочных микроорганизмов на биохимическую активность комбинаций. Содержание жизнеспособной микрофлоры в различных соотношениях образцов.
  
  реферат [2,1 M], добавлен 23.08.2013
  

• Свойства, обработка, хранение мясных и рыбных продуктов

  Ассортимент копченых рыбных товаров. Исследование особенностей состава и пищевой ценности. Классификация способов холодильной обработки мяса. Проведение экспертизы продукции из группы мясных товаров при приемке на реализацию или в процессе хранения.
  
  контрольная работа [25,4 K], добавлен 21.02.2013
  

• Анализ работы столовой "Антарктида"

  Характеристика столовой как учреждения общественного питания. Особенности механической кулинарной обработки овощей, грибов, рыбы, мяса, мясных продуктов. Технология приготовления супов, соусов, мясных продуктов. Характеристика механического оборудования.
  
  отчет по практике [74,6 K], добавлен 29.01.2011
  

• Обеспечение экологической безопасности продуктов пищевого назначения

  Проблемы безопасности пищевых продуктов. Модификация, денатурализация продуктов питания. Нитраты в сырье для пищевых продуктов. Характеристика токсичных элементов в сырье и готовых продуктах. Требования к санитарному состоянию сырья и пищевых производств.
  
  курсовая работа [87,0 K], добавлен 17.10.2014
  

• Производство мясных и молочных продуктов

  Технология производства мясных изделий из свинины (корейка копчено-вареная, грудинка копчено-запеченная). Состав, питательные свойства и технология производства мороженого. Изготовление продуктов из пахты, их структурно-механические характеристики.
  
  контрольная работа [34,2 K], добавлен 29.06.2015
  

• Оценка качества мясных продуктов по содержанию в них креатина

  Мясо, состав и пищевая ценность. Определение концентрации пикриновой кислоты. Подготовка пробы к анализу. Определение содержания креатина и креатинина в образцах сырого мяса животных. Зависимость абсорбционности креатинин-пикратного комплекса от времени.
  
  дипломная работа [1,2 M], добавлен 18.10.2013
  

• Технологии продукции общественного питания и мясопродуктов

  Обработка крахмалосодержащих продуктов, их изменение в процессе приготовления кулинарных изделий. Производство полуфабрикатов из рубленного мяса. Ассортимент, требования к качеству. Приготовление супов-пюре из овощей, круп, бобовых и мясных продуктов.
  
  контрольная работа [408,5 K], добавлен 27.10.2009
  

Другие документы, подобные "Теоретическое обоснование совершенствования промышленно-ценных свойств стартовых культур и их практическое применение в технологии мясных продуктов"

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам