Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Разработка технологии хондроитинсульфат-белкового комплекса из хрящевых тканей рыб

Специальность: 05.18.04 - Технология мясных, молочных, рыбных продуктов и холодильных производств

На правах рукописи

Сорокоумов Иван Михайлович

Москва - 2010

Работа выполнена в лаборатории биохимии и технологии рыб, беспозвоночных и водорослей ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии» (ФГУП «ВНИРО»).

Научный руководитель: доктор технических наук, доцент Немцев Сергей Владимирович

Официальные оппоненты: доктор технических наук, доцент Боева Нэля Петровна

доктор химических наук, профессор Варламов Валерий Петрович

Ведущая организация: ОАО «Гипрорыбфлот»

Защита состоится « 12 » мая 2010 года в _14__ ч _00__ мин. на заседании диссертационного совета Д 307.004.03 при ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии» Федерального агентства по рыболовству по адресу: 107140, г Москва, ул. Верхняя Красносельская, д. 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ВНИРО».

Автореферат разослан 09 апреля 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат технических наук В.А. Татарников

Актуальность

Рыбная отрасль Российской Федерации ставит такие задачи, как разработка технологий глубокой переработки гидробионтов с целью получения пищевых продуктов, биологически активных веществ нового поколения и кормовых продуктов из недоиспользуемых водных биологических ресурсов.

Исследования по комплексной переработке гидробионтов, поиску и выделению биологически активных веществ постоянно ведутся отечественными и зарубежными учеными: Албулов А.И., Боева Н.П., Варламов В.П., Мукатова М.Д., Немцев С.В., Пивненко Т.Н., Подкорытова А.В., Сафронова Т.М., Слуцкая Т.Н., Суховерхова Г.Ю., Эпштейн Л.М., Abdel F., Apinya A., Cho J., Larger L., Lee A., Prudden J., Folkman J., Sittiwat L. и др.

Для получения биологически активных продуктов перспективными представляются костно-хрящевые ткани, являющиеся отходами при разделке рыбы и в настоящее время используемые на получение кормовой муки. Аргументом в пользу привлечения рыбных отходов для получения биологически активных веществ является их значительный объем и высокое содержание биологически активных веществ, особенно хондроитинсульфата в отходах хрящевых рыб. Хондроитинсульфат - это высокомолекулярный полисахарид, принимающий ключевое участие в построении основного вещества костной и хрящевой ткани, а также тормозящее дегенеративные процессы последней и имеющий большое значение при разработке БАД хондропротекторного действия.

В связи с этим разработка технологии биоактивных препаратов из вторичного рыбного сырья, содержащего хондроитинсульфат в биокомплексе с сопутствующими природными компонентами (коллаген, аминокислоты, гексозамины, минеральные вещества и др.), является актуальной проблемой.

Разработанные технологии и выпуск продукции на их основе будут способствовать решению важных социальных задач, направленных на улучшение здоровья людей и животных.

Цель диссертационной работы: Разработка безотходной технологии переработки отходов от разделки рыб с высоким содержанием хрящевой ткани для получения хондритинсульфат-белкового комплекса.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать химический состав хрящевой ткани акулы катрана, бестера аквакультуры, ската звездчатого и отходов их переработки.

2. Обосновать рациональные параметры ферментативного гидролиза хрящевой ткани с применением коллагеназы и протосубтилина и рассчитать математическую модель процесса ферментолиза.

3. Разработать технологический процесс получения хондроитинсульфат-белкового комплекса.

4. Исследовать состав и качество хондроитинсульфат-белкового комплекса для установления возможности его применения в качестве компонента БАД;

5. Разработать рецептуру и технологию получения БАД к пище.

6. Исследовать возможность применения хондроитинсульфат-белкового комплекса в качестве компонента пленок ранозаживляющего действия.

7. Разработать способ получения и применения пленок ранозаживляющего действия.

8. Разработать проекты технической документации (ТУ и ТИ) на хондроитинсульфат-белковый комплекс.

9. Рассчитать экономическую эффективность от внедрения разработанной технологии получения БАД.

Научная новизна работы.

1. Впервые применен способ обезжиривания хрящевой ткани в процессе получения хондроитинсульфат-белкового комплекса термообработкой в воде с поверхностно-активным веществом.

2. Обоснован способ снижения содержания высокомолекулярного белка в хондроитинсульфат-белковом комплексе методом его осаждения хитозаном.

3. Впервые созданы хитозан-хондроитинсульфат-белковые ранозаживляющие пленки для лечения кожных поражений культивируемых рыб.

Практическая значимость работы.

Определены перспективные источники сырья для получения хондроитинсульфат-белкового комплекса. Разработана технология ферментативных гидролизатов из отходов переработки хрящевых рыб. Результаты экспериментальных исследований апробированы в производственных условиях ЗАО «Биопрогресс» Щелковского района МО, пос. Биокомбинат. Разработана технология изготовления пленок на основе природного аминополисахарида хитозана и хондроитинсульфат-белкового комплекса. Разработан и апробирован в условиях аквакультуры способ лечения кожных поражений рыб. Разработаны проекты технической документации на хондроитинсульфат-белковый комплекс из хрящевой ткани рыб (ТУ № 9289-063-00472124-09 и ТИ) и на биологически активную добавку к пище «Хондроитинсульфат-белковый комплекс» (ТУ № 9283-117-00472124-10 и ТИ). Новизна технического решения подтверждена патентом РФ № 2361429.

На защиту выносятся следующие положения:

· Принцип выбора сырья (отходы переработки акул, скатов и осетровых рыб) по химическому составу, определяющему направленность технологического процесса получения хонроитинсульфат-белкового комплекса с заданным составом и свойствами.

· Технология хонроитинсульфат-белкового комплекса с обоснованием рациональных режимов и параметров ферментативного гидролиза хрящевых тканей рыб.

· Полифункциональность хондроитинсульфат-белкового комплекса, содержащего биологически активные вещества гексозамины, хондроитинсульфаты, коллаген, неколлагеновые белки, микроэлементы и возможность его использования в качестве компонента БАД и ранозаживляющих пленок.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на первой международной научно-практической конференции «Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов» (Москва, 2006); научно-практическом форуме «Здоровое питание - здоровье нации» (Москва, 2007); первой международной научно-практической конференции «Биотехнологические процессы и продукты переработки биоресурсов водных и наземных экосистем» (Астрахань, 2008); девятой международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Ставрополь, 2008); второй международной научно-практической конференции «Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов» (Москва, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития пищевой промышленности и общественного питания» (Челябинск, 2008); The XV seminar and workshop «New aspects of the chemistry and application of chitin and its derivatives» (Poland, Torun, 2009).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 9 печатных работах, в том числе, 3 статьи в журнале перечня ВАК РФ, 6 печатных трудов в материалах конференций, получен 1 патент, оформлена 1 заявка на изобретение.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 113 страницах, включает введение, обзор литературы, методическую часть, результаты исследований и их обсуждение, практическую реализацию результатов исследований, выводы и список литературы, содержащий 173 источника (в том числе 60 зарубежных). Работа содержит 23 таблицы, 22 рисунка и 8 приложений на 52 страницах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность, научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе «Обзор литературы» проведен анализ отечественной и иностранной литературы о способах извлечения и применения биологически активных веществ хрящевой ткани гидробионтов и сельскохозяйственных животных. Проанализирован состав хрящевой ткани гидробионтов и отходов их переработки. Изучены методы применения аминополисахаридов из гидробионтов и современные БАД хондропротекторного действия. Установлено, что отходы от разделки хрящевых рыб содержат значительное количество хрящевой ткани и биологически активных веществ и могут быть использованы в качестве перспективного источника для получения биопрепаратов и различных материалов, обладающих хондропротекторным и противовоспалительным действием. Сформулированы цели и задачи исследования.

Во второй главе «Материалы и методы исследований» представлена программно-целевая модель исследований (рис. 1), приведены материалы и методы исследований.

Материалы исследований. Для выделения хрящевой ткани использовали головы и плавники хрящевых рыб: акулы катран Squalus acanthias, ската звездчатого Raja clavata, бестера Huso buso acipenser rutbenus, а также русского осетра Acipenser guldenstadti, заготовленные на месте промысла и в экспериментальном рыбоводческом комплексе ВНИРО, хранившиеся при температуре -18 °С до 6 месяцев. При заготовке хрящевой ткани головы акул, скатов и осетровых рыб рубили на куски предельной массой 0,1 кг, удаляли жаберные крышки и жабры, срезали кожный покров и чешую; удаляли глаза и содержимое мозговой капсулы, отделяя хрящевую ткань. Позвоночные кости и плавники рубили на куски предельной массой 0,1 кг и зачищали хрящевую ткань от прирезей мяса.

Для выделения высокомолекулярных фракций белка из гидролизата и получения пленок использовали хитозаны: хитозан пищевой (ТУ 9289-067-00472124-03), хитозан пищевой низкомолекулярный (ТУ 9289-002-11418234-99), а также хитозаны, полученные в лаборатории ВНИРО из панцирь содержащих отходов краба и омара по ТИ к ТУ 9289-067-00472124-03.

Для проведения ферментативного гидролиза использовали ферментные препараты: коллагеназа из гепатопанкреаса камчатского краба (ТУ 9281-004-11734126-00), протосубтилин Г20Х (ТУ 64-13-16-88).

В качестве стандартов для калибровки спектрофотометра APEL (Япония) использовали фармпрепараты: «Хонсурид» (Россия), «Глюкозамин» (Россия).

Методики. Общую протеолитическую активность ферментов определяли по ГОСТ 20264.2-88, коллагенолитическую - по методу, описанному Пивненко Т.Н. (1998). Аминокислотный состав определяли на жидкостном хроматографе модель L-8800 фирмы «Hitachi» (Япония), анализ проводили в стандартном режиме анализа белковых гидролизатов. Накопление аминного азота - по ГОСТ 7636-85. Содержание общего и небелкового азота определяли по Кьельдалю на автоанализаторе Kjeltec Foss 2300 (Швеция), содержание жира по методу Сокслета в автоматическом экстракторе Сокслета фирмы VELP SER 148/6 (Италия). Определение влаги и минеральных веществ по ГОСТ 7636-85, содержание хондроитинсульфата- спектрофотометрически, согласно методике фармакопейной статьи № 42-1286-99. Молекулярную массу хитозана определяли при помощи капиллярного вискозиметра Уббелоде и рассчитывали по уравнению Марка-Хаувинка. Деформационно-прочностные характеристики пленок определяли на универсальной разрывной машине AGS-10 KNG «Hmodzu» (Япония) и атомно-силовом микроскопе фирмы НТ-МДТ на базе платформы «ИНТЕГРА Прима».

Рис. 1. Программно-целевая модель исследований

белковый хрящевой ткань акула

Биологические испытания раневых покрытий на основе смеси хитозана и хондроитинсульфат-белкового комплекса проводились на базе экспериментального рыбоводческого комплекса ВНИРО, Московская область, г. Дзержинский.

Показатели безопасности хондроитинсульфат-белкового комплекса определяли по токсичности и микробиологическим показателям, которые анализировали согласно существующим ГОСТам и в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01.

Моделирование и оптимизацию технологических процессов осуществляли методом планирования эксперимента с применением ортогонального центрального композиционного плана (ОЦКП) второго порядка для двух факторов.

При статистической обработке данных результатов исследований и построения графических зависимостей использовали программы MathCAD 2001i Professional, Origin 6.1 и Microsoft Office (Word, Excel).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение техно-химических характеристик сырья для получения хондроитинсульфат-белкового комплекса

Проведена оценка выхода хрящевых и костно-хрящевых отходов, образующихся при разделке гидробионтов. Отходы в виде плавников для хрящевых рыб составляют до 6,1%, осетровых - 4,0%, лососевых - 3,3%; на головы для хрящевых рыб приходится 29,1%, осетровых - 22,3%, лососевых 18,7%. Установленный нами выход собственно хрящевой ткани для хрящевых рыб составляет до 8,7%, осетровых - до 10,4%, лососевых - до 4,2%.

Для получения биологически активных веществ из отходов переработки гидробионтов ключевое значение имеет содержание в них непосредственно хрящевой ткани, а также ее соотношение с другими тканями, которые могут служить дополнительным источником биологически активных веществ и оказывать существенное воздействие на технологический процесс их получения. Исследования массового состава отходов переработки рыбы, содержащих хрящевую ткань, показали (табл. 1), что ее содержание в некоторых видах отходов доходит до 50%, содержание кожи достигает 40%, это является положительным фактором, так как кожа содержит большое количество коллагенподобных белков, что способствует повышению содержания активных компонентов в конечном продукте - БАД.

Ввиду большого содержания хрящевой ткани в отходах переработки рыб, целесообразно использовать их целиком, что значительно упрощает технологический процесс и приводит к получению полноценной композиции биологически активных веществ.

Одним из критериев оценки качества сырья для получения биологически активных веществ было содержание гексозаминов. Установлено, что наибольшее содержание гексозаминов характерно для хрящевой ткани акулы катран, ската звездчатого, бестера и составляет 2,5 - 2,8 % от массы хрящевой ткани и более низкое (порядка 1%) - в костно-хрящевой ткани лососевых рыб.

Таблица 1. Массовый состав отходов содержащих хрящевую ткань, % от массы сырья

Объект	Вид отходов	Кожа	Жабры	Мясо	Хрящи
Катран	Голова	16,1-24,2	12,1-16,3	24,5-31,2	21,2-29,2
	Плавники	Спинной	33,2-49,2	-	20,1-30,2	11,5-18,2
		Грудные, анальный	29,1-47,1	-	25,5-40,6	18,5-27,0
		Хвостовой плавник	-	-	-	18,3-23,7
Осетр	Голова	16,5-24,1	8,2-13,1	7,6-12,3	25,9-33,1
Скат	Голова	17,0-25,1	8,5-12,4	9,1-14,7	20,1-27,0
	Плавники (крылья)	35,0-47,2	-	5,1-8,6	40,3-50,3
Лосось	Голова	19,3-25,6	10,9-14,7	28,3-38,1	4,3-4,7

Из полученных данных сделан вывод, что наиболее перспективным сырьем для выделения биологически активных веществ (хондроитинсульфата, гиалуроновой кислоты, аминокислот и др.) являются головы и плавники акулы катран, ската звездчатого и головы бестера, содержание хрящевой ткани в них, в среднем, в 4-5 раз больше, чем в лососевых рыбах.

Разработка технологии БАД «Хондроитинсульфат-белковый комплекс».

В хрящевой ткани гексозамины содержатся в виде слаборастворимых протеогликановых комплексов. Следовательно, для получения комплексного препарата из хрящевых тканей гидробионтов необходимо разработать технологию, которая позволяла бы максимально извлечь естественный комплекс компонентов хрящевой ткани, перевести их максимальное количество в растворимое состояние и сохранить активность.

Для получения более качественного продукта и предотвращения его порчи необходимо удалить жир из исходного сырья, так как его содержание в некоторых видах отходов доходит до 15%. Для удаления жира нами были выбраны методы экстракции растворителями и варка в воде с присутствием поверхностно-активного вещества (ПАВ).

Результаты по эффективности обезжиривания отходов от разделки хрящевых рыб и хрящевой ткани различными способами представлены в таблице 2.

Таблица 2. Содержание липидов в хрящевой ткани до и после обезжиривания, % к общей массе сырья

Сырье	До обезжиривания	После обезжиривания
		спирт этиловый	спирт изопропиловый	варка	варка с ПАВ
Осетр	8,5	3,5	2,7	2,1	1,5
Акула	2,5	1,4	1,1	0,9	0,4

Из приведенных данных видно, что наиболее эффективно проводить обезжиривание хрящевой ткани рыб в процессе варки в воде при температуре 100°С и продолжительности 5 мин с добавлением 1-2% ПАВ, содержание жира при этом снижается до 1,5 - 0,5 %. Данный способ обезжиривания не требует применения химических реактивов, которые необходимо отправлять на регенерацию, а также использования специального оборудования. При этом образуется побочный продукт в виде бульона, который рекомендовано направлять на концентрирование и сушку для получения кормового концентрата белка и микро-, макроэлементов.

Для деструкции хрящевой ткани нами были выбраны два способа гидролиза - щелочной и ферментативный. В ходе опытов по деструкции хрящевой ткани при помощи NaOH с конц. 1 - 7% установлено, что выход гидролизата растет с увеличением концентрации щелочи. При использовании щелочей с концентрацией больше 3% происходит деструкция активных компонентов и уменьшение содержания хондроитинсульфата (ХС), что отрицательно сказывается на качестве конечного продукта. Однако, повышение температуры реакции гидролиза до 50°С не оказывает отрицательного воздействия на выход хондроитинсульфата. Таким образом, продолжительность щелочного гидролиза хрящевой ткани в течение 4 ч при температуре 50?С и концентрации NaOH 3% являются наиболее предпочтительными. Серьезным недостатком щелочного гидролиза является образование большого количества соли (от 10 до 30%), образующейся при нейтрализации гидролизата и применение в связи с этим диализа.

Поэтому нами были разработаны рациональные параметры ферментативного гидролиза хрящевой ткани.

Ферментативный гидролиз приводит к дезинтеграции структуры хрящевой ткани гидробионтов за счет разрушения связей между белками и углеводами, при этом сохраняется структура биологически активных компонентов и их противовоспалительная активность. Поскольку основным белком хрящевой ткани является коллаген II типа, нами были выбраны два фермента: коллагеназа из гепатопанкреаса камчатского краба, так как хорошо известна его активность по отношению к коллагену, и протосубтилин Г20Х из-за его широкого применения, доступности и дешевизны. Мы проследили влияние предобработки хрящевой ткани путем варки с целью удаления избыточного жира на процесс гидролиза. В таблице 3 представлены данные о накоплении аминного азота в процессе гидролиза хрящевой ткани акулы катран до и после термообработки.

Таблица 3. Накопление аминного азота в ходе гидролиза в зависимости от типа обработки, мг/100г

Объект	Фермент
	Коллагеназа	Протосубтилин
Хрящевая ткань	349	150
Хрящевая ткань после термообработки	497	204

Из таблицы видно, что после термообработки хрящевая ткань подвергается более глубокому гидролизу по сравнению с исходной. Накопление продуктов гидролиза при ферментолизе хрящевой ткани после термообработки увеличивается в 1,5 раза из-за увеличения доступности белков для гидролиза.

Оценку эффективности гидролиза хрящевой ткани определяли по накоплению свободного аминного азота в гидролизатах (рис. 2).

а б

Рис. 2. Влияние продолжительности гидролиза и концентрации ферментных препаратов на уровень накопления аминного азота в ходе гидролиза: хрящевая ткань хрящевых рыб (акулы катран, ската звездчатого) коллагеназой - (а), протосубтилином - (б)

Установлено, что накопление аминного азота в процессе гидролиза хрящевой ткани рыб прекращается спустя 8 ч. Определено, что степень гидролиза зависит от субстратной специфичности ферментного препарата. При гидролизе коллагеназой степень гидролиза в 2 -2,5 раза выше, чем при использовании протосубтилина.

Установлены и обоснованы рациональные параметры ферментативного гидролиза хрящевой ткани рыб, позволяющие получить выход сухого гидролизата - 10%: фермент коллагеназа (активность 773 ЕД/мг) - концентрация 0,2% к массе суспензии; время обезжиривания с 1%-ным ПАВ - 8 мин; рН - 7,2; температура - 42 °C; время - 8ч.

Установление оптимальных параметров процесса гидролиза хрящевой ткани бестера, основываясь на ранее полученных данных для хрящевых рыб (акулы катран, ската звездчатого), осуществляли путем планирования эксперимента с применением ОЦКП. В качестве частных факторов, подлежащих варьированию и оптимизации, использовали продолжительность ферментации ?, (ч) и количество фермента С, (% массы суспензии). Параметром оптимизации математической модели была выбрана совокупная безразмерная характеристика y, объединяющая четыре различных по физическому смыслу частных отклика - выход продукта (Мпр) содержание ХС (Мхс), количество образующегося аминного азота в полуфабрикатах после ферментации (МN).

Реализация плана эксперимента и обработка его данных позволили получить уравнение, адекватно связывающее качество полуфабриката с изменяемыми факторами: y=0,6190+0,0593x1+0,0603x2-0,0107x1x2-0,0409x12-0,0318x22

Графическая интерпретация полученной модели (рис. 3) наглядно отражает влияние изменяемых факторов в интервалах их варьирования в области искомого оптимума. Оптимальные значения факторов: продолжительность ферментации - 8,9 ч; количество фермента - 0,28 % к массе суспензии.



Рис. 3. Графическое представление математической модели исследуемого процесса ферментного гидролиза хрящевой ткани бестера

Гидролизаты из хрящевой ткани характеризуются большим разнообразием веществ с различной молекулярной массой. Из литературных данных известно, что содержание высокомолекулярных белковых фракций может доходить до 30 %, но ввиду того, что в состав полученных гидролизатов хрящевой ткани входит в основном коллаген, то они не представляют высокой биологической ценности, так как в организме человека отсутствует фермент, гидролизующий их. Для повышения содержания гексозаминов в ферментативном гидролизате хрящевой ткани белок осаждали при рН 3-3,5 с помощью соляной кислоты с последующим отделением белкового осадка. Для ускорения процесса осаждения белка в качестве флокулянта использовали высокомолекулярный хитозан со степенью деацетилирования 85%.

Из данных рисунка 4 видно, что добавление 1%-го раствора хитозана в 0,2 М растворе соляной кислоты в количестве 10% от объема гидролизата является рациональным, так как при дальнейшем увеличении концентрации хитозана в гидролизате количество осажденного белка практически не увеличивается. Было отмечено, что при осаждении хитозаном белок выпадает в виде крупных хлопьев. Его осаждение происходит в 2 - 2,5 раза быстрее, чем осаждение белка без хитозана. Полученный осадок после отделения может быть использован в качестве кормовой добавки.

Рис. 4. Зависимость количества выделенного белка от количества хитозана в ферментном гидролизате хряща акулы

После осаждения белка ферментативный гидролизат отправляли на распылительную или лиофильную сушку и получали сухой хондроитинсульфат-белковый комплекс (ХНБК).

Изучение состава хондроитинсульфат-белкового комплекса из хрящевой ткани рыб.

Хондроитинсульфат-белковый комплекс из хрящевой ткани рыб характеризуется по содержанию гексозаминов, хондроитинсульфатов, гиалуроновой кислоты, коллагена и неколлагеновых белков, аминокислот и минеральных веществ.

В таблице 5 представлены основные показатели химического состава ХНБК из хрящевой ткани рыб.

Таблица 5. Состав хондроитинсульфат-белкового комплекса из хрящевой ткани рыб, % от воздушно-сухого гидролизата

Компоненты	Хондроитинсульфат-белковый комплекс из:
	Катран	Скат	Осетр
Гексозамины	6,1	6,2	6,8
Хондроитинсульфаты	8,5	8,7	8,1
Коллаген	27,1	26,2	25,6
Неколлагеновые белки	22,9	23,1	25,3
Сумма свободных аминокислот	18,8	19.0	17,0
Минеральные вещества	5,5	5,4	6,1
Вода	8,8	9,3	9,2

Данные таблицы 5 показывают, что хондроитинсульфат-белковый комплекс содержит значительное количество хондроитинсульфатов до 8,7% и гексозаминов-до 6,8% и может быть использован в качестве источника восполнения недостатка в рационе биологически активных веществ (аминосахаров, коллагена, аминокислот), в форме БАД к пище, компонента кормов, а также при составлении композитов на его основе.

Был исследован аминокислотный состав хрящевой ткани катрана и хондротинсульфат-белкового комплекса из хрящевой ткани катрана. Аминокислотный состав хондроитинсульфат-белкового комплекса аналогичен хрящевой ткани, что указывает на сохранение природной сбалансированности и на гидролиз всех белков с одинаковой интенсивностью. В гидролизатах содержатся все заменимые и незаменимые аминокислоты. Сумма незаменимых аминокислот составляет 34 г/100г сухого гидролизата. В ХНБК содержание аммиака в 3 раза выше, чем в хрящевой ткани, что связано с большим содержанием аминополисахаридов в гидролизате.

Содержание минеральных веществ в исследуемом хондроитинсульфат-белковом комплексе из хрящевой ткани гидробионтов не превышает 5 - 8% и отличается природной сбалансированностью. Содержание тяжелых металлов в ХНБК из хрящевой ткани исследованных видов гидробионтов не превышает предельно допустимые концентрации и соответствует нормам СанПиН № 2.3.2.1078-01.

На основании проведенных исследований разработана технология хондроитинсульфат-белкового комплекса из отходов разделки хрящевых рыб и хрящевой ткани рыб, предлагаемых в качестве основы БАД, содержащей углеводные и белковые компоненты хрящевой ткани, обладающей противовоспалительной активностью и способствующей регенерации хрящевой ткани. Схема технологического процесса получения хондроитинсульфат-белкового комплекса представлена на рисунке 5.

В результате сравнительных исследований состава ХНБК из хрящевой ткани гидробионтов показано, что хондроитинсульфат-белковый комплекс, полученный по разработанному нами способу, является многокомпонентным и содержит такие биологически активные вещества как гексозамины, хондроитинсульфаты, коллаген, неколлагеновые белки, микроэлементы, а также аминокислоты.

На основе хондроитинсульфат-белкового комплекса была разработана рецептура (табл. 6) и технология БАД «ХНБК» (рис. 6).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 5. Технологическая схема получения хондроитинсульфат-белкового комплекса

Аскорбиновая кислота используется для предотвращения окислительной порчи. В комплексе с солями кальция, например глюконатом кальция и хитозаном с молекулярной массой до 49 кДа, хондроитинсульфат стимулирует срастание костей при различного рода травмах и переломах, устраняет воспалительные заболевания суставов, способствует регенерации хрящевой ткани, обеспечивает снижение уровня холестерина в крови.

Разработанная нами технология БАД «ХНБК» и ее рецептурный состав запатентованы (патент РФ №2361429).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 6. Технологическая схема получения БАД «Хондроитинсульфат-белковый комплекс»

Разработка композиций на основе аминополисахаридов из гидробионтов.

Болезни, вызываемые миксобактериями, широко распространены среди пресноводных и морских рыб. Вспышке заболеваний кожных покровов рыб способствуют высокие плотности посадки, низкая проточность воды, а также травмы рыб. Для профилактики кожных болезней рыб используют различные ванны и применяют антибиотики, красители, фосфорорганические соединения, растворы солей, однако эти процедуры сложны и могут вызывать побочные действия, например ожоги жабер.

Нами разработаны композиции для изготовления пленок, состоящие из хитозана различной молекулярной массы и ХНБК, взятых в соотношении 70-80% к 20-30% соответственно, и крахмала. Характеристика пленок на основе хитозана и хондроитинсульфат-белкового комплекса (ХитХНБК) представляет интерес с предполагаемым использованием их в качестве пленочных раневых покрытий. Толщина пленок составляет 50-60 мкм. Пленки обладают достаточной прочностью (? ~ 19 МПа) и хорошей эластичностью (? ~ 60%) для использования их в качестве раневых покрытий.

Поверхность пленок ХитХНБК была исследована методом атомно-силовой микроскопии. Исследования показали, что для хитозановой пленки характерна очень гладкая поверхность без наличия четкой структуры при данном разрешении. Поверхность пленок ХитХНБК характеризуется наличием значительно более крупных структурных элементов, что наглядно видно на трехмерном изображении. Этим и объясняется лучшая адгезионная способность пленок.

При исследовании поверхности сканирующей зондовой микроскопией появляется возможность оценить ее жесткость по силе прижатия зонда к исследуемой поверхности (глубине его погружения) и высоте рефлекса на получаемом трехмерном изображении. Чем светлее изображение поверхности и больше высота пиков, выраженная в единицах силы тока, тем большей жесткостью обладает поверхность. При сравнении данных рисунка 7 видно, что пленки ХитХНБК (б) значительно менее жесткие, чем пленки из ацетата хитозана (а). Пленки с меньшей жесткостью лучше прилегают к поверхности кожи рыбы, увеличивая тем самым площадь контакта пленки с пораженным участком.

а б

Рис. 7. Характеристика жесткости поверхности пленок из ацетата хитозана (а) и ХитХНБК (б)

Ранозаживляющая способность пленок ХитХНБК была исследована на кожных поражениях осетров, содержащихся в условиях аквакультуры. На рисунке 8 представлены фотографии кожных поражений рыб до и после использования пленок.

До После

До После

Рис. 8. Изменение раны на спине (1) и голове (2) бестера до и после нанесения пленки ХитХНБК

Из рисунка 8 видно, что при нанесении пленок достигается положительный эффект. Рана затягивается, опухоли спадают, на месте пораженной кожи начинается активная регенерация новой кожи. Данный способ легкоосуществим, не требует применения агрессивных лекарственных средств, дезинфицирующих ванн и сложного оборудования.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Полученные экспериментальные данные положены в основу следующей разработанной нормативно-технической документации:

- ТУ 9289-063-00472124-09 и ТИ Хондроитинсульфат-белковый комплекс из хрящевой ткани рыб;

- ТУ 9283-117-00472124-10 и ТИ Биологически активная добавка к пище «Хондроитинсульфат-белковый комплекс»;

Разработанные ТУ 9289-063-00472124-09 и ТИ были апробированы на опытном участке ЗАО «Биопрогресс».

На основе хондроитинсульфат-белкового комплекса разработана рецептура БАД к пище «ХНБК», обладающая повышенной эффективностью в отношении профилактики ревматоидных заболеваний. Новизна технического решения подтверждена патентом РФ №2361429.

Разработана технология получения ранозаживляющих пленок ХитХНБК на основе хитозана и хондроитинсульфат-белкового комплекса, лечебный эффект которых апробирован при поражении кожных покровов у осетровых рыб на базе Экспериментальной модульной установки для выращивания осетровых ФГУП «ВНИРО». Пленки ХитХНБК рекомендованы в качестве ранозаживляющих покрытий для лечения рыб в аквакультуре. На данное техническое решение подана заявка № 2010104510 (10.02.2010) на патент РФ «Способ получения раневого покрытия для рыб, выращиваемых в искусственных условиях».

Произведен расчет технико-экономических показателей производства БАД «ХНБК», который показал, что рентабельность производства может составить 40 % при сроке окупаемости инвестиционных средств в течение 1 года.

ВЫВОДЫ

1. Обоснована и разработана технология безотходной переработки отходов от разделки рыб (акулы катран, ската звездчатого, бестера) с высоким содержанием хрящевой ткани для получения хондроитинсульфат-белкового комплекса и БАД на его основе.

2. На основании совокупных данных: массовой доли хрящевой ткани (4 - 10 % к общей массе сырья), содержания гексозаминов (2,3 - 2,8 г/100 г сырья) - выделены наиболее перспективные виды сырья (акула катран, скат звездчатый, бестер) для получения хондроитинсульфат-белкового комплекса.

3. Обоснованы рациональные параметры деполимеризации хрящевой ткани рыб, включающие основные стадии: варку в течение 5 мин с 1% ПАВ при 100 ?С для эффективного удаления жировой фракции, последующий ферментативный гидролиз коллагеназой и протосубтилином Г20Х, при концентрации фермента 0,2% и 0,5%, соответственно и продолжительности 8 ч.

4. Процесс ферментации хрящевой ткани описан математической моделью, адекватно связывающей технологические параметры и качество продукта на основе гидролизата хрящевой ткани с определяющими факторами ее биодеструкции. Решение математической модели позволило установить влияние и оптимальные значения продолжительности процесса и концентрации фермента (8,9 ч и 0,28 % к массе суспензии).

5. Установлены рациональные параметры процесса осаждения высокомолекулярных фракций белка 1%-ным раствором хитозана в 0,2 М HCl в количестве 10% к суспензии.

6. Установлено, что состав хондроитинсульфат-белкового комплекса, содержащий хондроитинсульфаты (4 - 10 %), коллаген (16-30 %), а также свободные аминокислоты (10 - 20 %) соответствует требованиям к БАД хондропротекторного действия.

7. Разработана рецептура и технология получения БАД к пище «ХНБК», предусматривающая последовательное смешивание компонентов, входящих в состав БАД, что обеспечивает получение функционального препарата хондропротекторного действия, содержащего хондроитинсульфат-белковый комплекс (84 %), хитозан (10 %), глюконат кальция (4 %) и аскорбиновую кислоту (2 %).

8. Обоснована и разработана технология получения нового ранозаживляющего средства (покрытия) в виде пленки для лечения рыб на основе ХНБК и хитозана, взятых в соотношении 70-80 % к 20-30 %, соответственно. Определены механо-прочностные и поверхностные свойства пленок: прочность 19 МПа, разрывное удлинение 61 %.

9. Проведены биологические испытания ранозаживляющего средства ХитХНБК на бестерах аквакультуры, показавшие 100 % эффективность при лечении кожных поражений различной этиологии.

10. Разработан проект технической документации (ТУ №9289-063-00472124-09 и ТИ) на «Хондроитинсульфат-белковый комплекс из хрящевой ткани рыб».

11. Расчет экономической эффективности технологии получения хондроитинсульфат-белкового комплекса и БАД «ХНБК» показал, что рентабельность производства может составить 40 % при сроке окупаемости инвестиционных средств в течение 1 года.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

Публикации в изданиях перечня ВАК РФ

1. Сорокоумов И.М., Ежова Е.А., Быкова В.М., Немцев С.В., Шмидт Е.А., Албулов А.И. Хондроитинсульфат из хрящей рыб // РЫБПРОМ. - 2007. - № 3. - С. 18 - 20.

2. Немцев С.В., Ковачева Н.П., Загорская Д.С., Сорокоумов И.М., Панов К.Н. Панцирь акклиматизированного камчатского краба в разных линочных стадиях, как источник получения хитина и белковых продуктов // Рыбное хозяйство. - 2009. - №2. - С. 107-111.

3. Сорокоумов И.М., Строкова Н.Г., Немцев С.В. Хондроитинсульфат-белковый комплекс из хрящевой ткани рыб и ранозаживляющие покрытия на его основе // РЫБПРОМ. - 2010. - № 1. - С. 72 - 75.

Материалы конференций:

4. Быкова В.М., Ежова Е.А., Сорокоумов И.М., Немцев С.В. Перспективы использования мелких акул // Материалы первой международной научно-практической конференции «Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов». - М.: ВНИРО, 2006. - С. 176 - 178.

5. Немцев С.В., Быкова В.М., Ежова Е.А., Сорокоумов И.М. Биологически активные добавки к пище на основе аминополисахаридов из водных биоресурсов // Материалы научно-практического форума «Здоровое питание -здоровье нации» - М.: 2007. - Т. 2. - Ч. 1. - С. 107-109.

6. Немцев С.В., Сорокоумов И.М., Быкова В.М. Хондроитинсульфат из хрящей рыб. Перспективы получения биологически активных аминополисахаридов из объектов отечественного промысла // Материалы первой международной научно-практической конференции «Биотехнологические процессы и продукты переработки биоресурсов водных и наземных экосистем». - Астрахань: АГТУ, 2008.- С. 111-115.

7. Сорокоумов И.М., Строкова Н.Г., Немцев С.В. Современное состояние разработок пищевых пленок и покрытий на основе хитозана // Материалы девятой международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана».- М.: ВНИРО, 2008.- С.230-233.

8. Сорокоумов И.М., Немцев С.В., Семикова Н.В., Звездова Т.А., Албулов А.И., Шмидт Е.В. Перспективы получения хондроитинсульфат-белкового комплекса из хрящей рыб и БАД на его основе // Материалы второй международной научно-практической конференции «Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов». - М.: ВНИРО, 2008. - С. 279-281.

9. Немцев С.В., Быкова В.М., Сорокоумов И.М., Панов К.Н. Биологически активные добавки к пище на основе аминополисахаридов из водных биоресурсов // Материалы всероссийской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития пищевой промышленности и общественного питания».- Челябинск: Издательство Южно-Уральского ГТУ, 2008.- C. 25-27.

Патенты:

10. Патент 2361429 РФ Биологически активная добавка для профилактики ревматоидных заболеваний (20.07.2009 Бюл. №20).

11. Заявка на изобретение №2010104510 (006317) Способ получения раневого покрытия для рыб, выращиваемых в искусственных условиях (10.02.2010).

Размещено на Allbest.ru

...