Биохимический подход к оценке окружающей среды

Размещено на http://www.allbest.ru/

Биохимический подход к оценке окружающей среды

Биохимические тест

Биохимические тест - системы и перспективы их использования для нормирования загрязнения окружающей среды.

Стрессовое воздействие среды можно оценивать по эффективности биохимических реакций, уровню ферментативной активности и накоплению определенных продуктов обмена. Изменения содержания в организме определенных биохимических соединений, показателей базовых биохимических процессов и структуры ДНК в результате биохимических реакций могул обеспечить необходимую информацию о реакции организма в ответ на стрессовое воздействие.

Изменение адаптационного стресса. Каждый физиологический процесс требует определенных затрат энергии, поэтому любое изменение физиологического состояния немедленно сказывается на энергетическом обмене. Биоэнергетические показатели живых систем позволяют выявлять последствия стрессового воздействия среды до наступления необратимых изменений в организме.

Количество энергии, необходимое организму в единицу времени для обеспечения всех физиологических процессов, характеризует интенсивность энергетического обмена. На реализацию одного и того же физиологического процесса в неблагоприятных условиях организму требуется больше энергии, чем в оптимальных, из - за необходимости компенсации неблагоприятных воздействий среды.

В процессе жизнедеятельности всех аэробных организмов в ходе нормальных реакций кислородного метаболизма образуются свободные радикалы супероксид и другие формы активного кислорода. В норме уровень СР регулируется системой антиоксидантной защиты клетки, так как эти радикалы и продукты их превращения представляют серьезную угрозу: подавляют активность ферментов, разрушают нуклеиновые кислоты, вызывают деградацию биополимеров, изменяют проницаемость мембран. Высокий уровень образования супероксидных радикалов токсичен и может вызвать гибель организма. Уровень их образования, слегка превышающий базовый, может стимулировать рост клеток и играет важную роль в процессе канцерогенеза. Одним из универсальных механизмов стресса является развитие окислительных СР - реакций. Под действием окислительного стресса может происходить повреждение ДНК. Один из механизмов такого повреждения включает прямое окисление нуклеиновых кислот, другой - переваривание ДНК. Образование супероксидных радикалов увеличивается при разных видах облучений, изменении парциального давления кислорода под влиянием ксенобиотиков и при других воздействиях.

Метаболические свободные радикалы - это обширная группа высокоактивных интермедиатов, играющих важную роль в окислительно - восстановительных биохимических реакциях. В клетках животных общепризнано участие СР - реакций при действии окислительных ферментов в системах цитохромов и других гемопротеидов, НАД, фловопротеидов, убихинона, осуществляемых с помощью коферментов - переносчиков электронов. Свободнорадикальные состояния возникают также в процессах аутоокисления биологически важных соединений, в особенности липидов. В последнем случае чаще всего имеет место образование липидных гидроперекисей, распад которых также приводит к образованию активных радикалов. Особенно подвержены такому аутоокислению ненасыщенные жирные кислоты - компоненты липидов биологических мембран. Появление СР - состояний в липидых клеточной мембраны приводит к модификации ее физико - химического состояния и активности мембранно - связанных ферментов. При повреждающих воздействиях на клетки процессы перекисного окисления липидов развиваются тем более активно, чем выше степень повреждения клетки. При этом перекисные радикалы могут взаимодействовать с молекулами белков или нуклеиновых кислот, связанными с мембраной, изменяя биологические свойства этих молекул и клетки в целом.

Стрессовая реакция биотестов может быть измерена по изменению а них уровня свободных радикалов по сравнению с контролем. Известно, что быстрые изменения интенсивности СР - реакций в живых объектах типичны для начальных стадий разных патологических состояний, в том числе для первичных процессов лучевого поражения. В значительной мере это зависит от развития перекисного окисления липидов мембран и определяет неспецифический окислительный стресс клетки. При этом нарушается гомеостатическое равновесие, клетки выходят в неустойчивое состояние, повышается их реактивность.

Исследование ферментативной активности почвенного микроценоза. Различные виды антропогенного воздействия на почву могут изменять условия существования почвенных микроорганизмов, нарушать нормальное протекание в почвах процессов микробной трансформации и, следовательно, отражаются на процессах трансформации веществ в биосфере. Почвенные микроорганизмы участвуют в циклах жизненно - важных элементов, таких как N, P, S, Fe, Mn и др. Им принадлежит уникальная роль в очистке биосферы от загрязнений, так как именно микроорганизмы обладают высокой способностью к адаптации и могут быстро трансформировать загрязняющие вещества, как естественные для биосферы, так и чужеродные.

Изучение сукцессий и особенностей функционирования микробных комплексов в техногенных экосистемах представляет большой научный и практический интерес. Такие экосистемы могут служить моделью для исследования скорости и направления микробиологических и биохимических процессов.

Методы энзимологии широко применяются при решении экологических задач. Они позволяют оценить биохимическую активность почвенного микроценоза. Ферменты, выделяемые микроорганизмами в результате их жизнедеятельности, способны иммобилизоваться и накапливаться в почве в активном состоянии и в соответствующих уловиях проявлять специфические биокаталитические функции.

К настоящему времени разработаны методы определения активности большого количества ферментов, учавствующих в ранообразных почвенных биохимических процессах.

Примеры лабораторных работ по биохимическим методам.

Оценка качества среды биохимическими методами биотестирования

биохимический окружающая среда загрязнение

Работа: лизоцимный микробиологический метод оценки состояния водных биоценозов.

Микроценозы - структурная единица экосистемы и информативная диагностическая компонента биоты, которая в силу высокой адаптации быстро реагирует на смену экологических условий, меняя свою функциональную активность по количественным и качественным параметрам, что важно для оценки состояния водных биоценозов.

В водной среде регистрируется широкий спектр организмов, обладающих лизоцимной активностью и играющих значительную роль в самоочищении водоема.

Однако при поступлении промышленно - бытовых стоков в оду происходит селективный отбор штаммов, обладающих антилизоцимным признаком, обеспечивающим им преимущество в заполнении экологических ниш в водоеме. Микроорганизмы, формирующие водные биоценозы, образуют функциональную систему «лизоцим - антилизоцим».

В биоиндикации антропогенного загрязнения водоема широкое распространение получили микробиологические методы, основанные на учете числа сапрофитных бактерий, выращенных на МПА, а так же с помощью весьма распространенного метода оценки на основании коли- титра и коли - индекса. Наиболее надежно качество воды и состояние водного биоценоза характеризуется оценкой их с гидробиологических позиций, то есть оценкой «откликов» на антропогенные воздействия всех компонентов биоты: фито- , зоопланктона и бентоса. Однако все предлагаемые методы не лишены целого ряда недостатков. Это в первую очередь длительность и трудоемкость обработки взятых проб, а значит, низкая оперативность в регистрации антропогенного воздействия, а также регистрация уже состоявшегося изменения в биоценозе, а не предсказание его начала.

В основу принципа метода, предлагаемого в лабораторной работе, положена система «лизоцим - антилизоцим» микроорганизмов, которая образует функциональную систему «лизоцим (ЛА) - антилизоцим (АЛА)» в биоценозе : ЛА бактерии - АЛА бактерии.

Исследования показали, что такая система четко реагирует на антропогенные воздействия и может быть использована для биоиндикации ранних изменений в водоеме. Исходя из сказанного, в основу метода взято определение микробиологического индекса «Л», основанное на изучении количественных и качественных различий микроорганизмов, обладающих лизоцимным и антилизоцимным признаками. Полученный показатель позволяет выявлять ранние нарушения в состоянии водных биоценозов. При условии Л > 1, прогнозируется хорошее состояние биоценозов, при Л < 1 оно ухудшается.

Правила отбора проб для анализа следующие:

1. Пробы отбирают в любой точке обследуемого водоема. Однако для полной биологической оценки водоема рекомендуется отбирать пробы в каждой точке батометром Молчанова с трех горизонтов: поверхность, середина и дно. Пробы сливают по 50 мл в одну стерильную колбу, тщательно перемешивают, в результате чего получается интегрированная проба воды, которую используют для анализа.

2. При мониторинге рек отбот проб производят в трех точках одного створа (поперечного сечения реки): на правом берегу, левом и в середине реки.

Работа: метод привитой сополимеризации с использованием в качестве тест - объекта Дафнии Магна.

В данной лабораторной работе предлагается освоить метод прогностической оценки экологического качества воды по изменению уровня окислительного метоболизма у дафний, живущих и размножающихся в условиях антропогенного загрязнения.

В качестве теста используется реакция привитой сополимееризации (ПС) меченного по углероду индикатора акриламида 14С.

Принцип метода состоит в том, что при введении в живой организм индикатора - мономера в клетках происходит полимеризация этого насыщенного соединения, инициируемая метаболическими свободными радикалами, при этом образуются сополимеры, у которых цепи меченого полимера соединяются с биополимерами. Небольшие молекулы водорастворимого мономера легко проникают в живую клетку и достаточно быстро вымываются из нее, тогда как сополимеры, выключаются из нормального метаболизма и при длительной инкубации накапливаются в клетках объекта. Это обуславливает высокую чувствительность метода. Меченые сополимеры, концентрация которых в клетках биологического объекта пропорциональна количеству образующихся во время инкубации свободных радикалов, могут быть затем обнаружены методом радиометрии. Общая чувствительность метода существенно повышается при использовании современных жидкостных сцинтилляционных счетчиков.

Концентрация свободных радикалов в клетках и тканях характеризует уровень окислительно - восстановительных реакций, так как свободные радикалы являются промежуточными продуктами этих реакций. В клеточном метаболизме у животных наиболее распространены СР - реакции в ферментативных цепях окисления митохондрий и микросом, возможно, в процессе генерации АТФ, а также при неферментативном окислении. В ряде работ показано, что концентрация СР в тканях коррелирует с их функциональной активностью и является весьма чувствительным показателям различного рода повреждений клеток и тканей.

Тест - объектом для оценки степени загрязнения пресных водоемов методом ПС может быть представитель пресноводных биоценозов рачок Daphnia magna, широко распространенный в прибрежной зоне стоячих или медленно текучих водоемов. Вся процедура определения занимает не более двух суток и проводится в 2 этапа. Первый этап - отбор проб- проводится в полевых условиях с использованием обычной лабораторной посуды и шприца для введения индикатора - раствора меченого акриламида. Концентрация и активность меченого вещества столь мала, что нет необходимости в создании особых условий безопасности для работы. Нельзя лишь допускать попадания раствора в рот или на поверхность слизистых глаз, а так же следует тщательно собирать в контейнер остатки раствора и отходы опыта и своевременно доставлять их для уничтожения в лабораторию. Пробы отбираются в специальные флаконы для сцинтилляционного счета. На втором этапе работы требуется жидкостный сцинтилляционный счетчик, то есть исследование должно завершаться в лаборатории.

Работа: исследование нарушений развития эмбрионов водных животных с применением метаболического критерия. ( Методика разработана О. П. Мелеховой и Г. В. Коссовой)

В данной работе предлагается освоить оригинальный метод оценки эмбриотоксичности воды, основанный на определении физиологического состояния зародышей по метаболическому критерию - уровню свободнорадикальных реакций. Применение эмбриональных моделей в экспериментах по выявлению действия повреждающих факторов позволяет сделать предположения о механизмах повреждения, используя в качестве биотестов эмбрионы низших позвоночных на разных стадиях развития. В серии многолетних исследований автором метода был открыт универсальный метаболический параметр, характеризующий эмбриональные клетки в период детерминации, то есть вступления в многоступенчатый процесс цитодифференцировки. Таким параметром оказалась активное развитие свободнорадикальных процессов. Удалось показать их участие в первичных стрессовых реакциях эмбриональных клеток при действии имических и радиационных повреждающих факторов. Предложенный в лабораторной работе радиоиндикаторный метод выявления свободных радикалов лежит в основе нового метода биотестирования. Существенными преимуществами этого метода являются высокая чувствительность, возможность получения результатов в кратчайшие сроки, удобство для применения в полевых условиях. Важно отметить также, что результаты измерений метаболической стрессовой реакции при длительных наблюдениях коррелируют с последующими патологическими изменениями тест - объекта.

Измерения уровня свободнорадикальных реакций осуществляются методом привитой сополимеризации с помощью радиоактивного индикатора.

Работа: биодиагностика почв по ферментативной активности.

Почвенно - энзимологические методы позволяют определять не количественное содержание ферментов в почве, а активность ферментов, находящихся преимущественно а адсорбированном состоянии на поверхности почвенных коллоидов и частично в почвенном растворе.

Принцип метода определения активности почвенных ферментов основан на учете количества переработанного в процессе реакции субстрата или образующегося продукта реакции в оптимальных условиях температуры, pH среды и концентрации субстратов.

Сущность метода определения активности почвенных ферментов почвы заключается в следующем: навеску почвы насыщают антисептиком, добавляют буферный раствор со значением pH, оптимальным для данного фермента, и определенное количество субстрата. Реакционную смесь выдерживают в термостате в течении определенного времени, и после этого проводят количественный учет продуктов реакции. Активность фермента выражают в количествах переработанного субстрата или образующегося продукта реакции в течение определенного промежутка времени и рассчитывают на единицу веса почвы или гумуса.

Для корректировки результатов ставят следующие контроли: 1) почва, стерилизованная сухим жаром при 180 градусов Цельсия в течение трех часов; 2) нестерильная почва без субстрата; 3) субстрат без почвы со всеми реактивами.

В соответствии с рекомендацией Международного биохимического союза по ферментам за единицу измерения принята стандартная ферментная единица (Е) : 1Е соответствует такому количеству фермента, которое при заданных условиях катализирует превращение 1 мкМ субстрата в 1 мин. При определении почвенных ферментов это количество рассчитывают на единицу веса почвы.

Методика отбора почвенных образцов определяется поставленными перед исследователем задачами. Во всех случаях образцы почв должны наиболее полно характеризовать исследуемую площадь.

Образцы высушивают непосредственно после взятия в полевых условиях до воздушно - сухого состояния, обязательно в тени. Перед анализом почву тщательно очищают от корней растений и других растительных остатков и камней. Высушенные пробы растирают и просеивают через сито с диаметром отверстий 1 мм. Хранить почву перед анализом в холодильнике.

Ферменты, относящиеся к классу оксидоредуктаз, катализируют окислительно - восстановительные реакции, играющие ведущую роль в биохимических процессах в клетках живых организмов, а также в почве. Наиболее распространены в почвах такие оксидоредуктазы, как каталаза и дегидрогеназы, активность которых является важным показателем генезиса почв.

Каталаза разлагает на воду и молекулярный кислород ядовитую для клетки перекись водорода, образующуюся в процессе дыхания живых организмов в результате различных биохимических реакций окисления органических веществ.

Активность каталазы определяется газометрическим методом по объему выделившегося кислорода, основанным на измерении скорости разложения перекиси водорода при ее взаимодействии с почвой.

Дегидрогеназы- ферменты, которые участвуют в процессе дыхания, отщепляя водород от окисляемых субстратов. Одни дегидрогеназы переносят водород непостредственно на молекулярный кислород, другие - на какие - либо акцепторы, например на хиноны, метиленовую синь.

Для определения активности дегидрогеназы в качестве акцептора водорода применяют бесцветные соли тетразолия, которые восстанавливаются в красные соединения формазана.

Гидролазы - осуществляют реакции гидролиза разнообразных сложных органических соединений, действуя на различные связи: сложноэфирные, глюкозидные амидные, пептидные и др. К этому классу относятся ферменты инвертаза, уреаза и др., активность которых является важным показателем биологической активности почв и широко используется для оценки антропогенного воздействия.

Инвертаза действует на В - фруктофуранозидную связь в сахарозе, раффинозе, стахиозе и производит расщепление сахарозы на эквимолярные количества глюкозы и фруктозы.

Фотоколориметрическое определение активности инвертазы основано на учете восстанавливающих сахаров, образующихся при расщеплении сахарозы.

Разложение органических азотистых соединений осуществляется при непосредственном участии внеклеточных ферментов. Образующийся при уразной активности аммиак служит источником питания растений.

Уреаза катализирует гидролиз мочевины. Конечными продуктами гидролиза являются аммиак и углекислый газ. Мочевина попадает в почву в составе растительных остатков, навоза и как азотное удобрение; она образуется также в самой почве в качестве промежуточного продукта в процессе превращения азотистых органических соединений - белков и нуклеиновых кислот.

Работа: биотестирование водоемов по уровню белков - металлотионеинов в мягких тканях двустворчатых моллюсков.

Металлотионеины (МТ) - низкомолекулярные белки с молекулярной массой 6 -7 до 15 кДа, способные связывать ионы тяжелых металлов. Каждый белок способен одновременно связывать шесть двухвалентных и одиннадцать одновалентных металлов. МТ обнаружены во всех исследованных эукариотических и прокариотических организмах в концентрациях до 2- 3 мкг/г клеток или ткани.

Показано участие этих белков в снижении токсичности ионов металлов и регуляции гомеостаза Zn и Cd в клетках. Синтез МТ в клетках и тканях индуцируется воздействиями токсической и генотоксической природы. В опытах in vitro и in vivo продемонстрирована роль МТ в снижении токсичности и детоксикации тяжелых металлов: связанные с МТ они менее токсичны.

Принцип предложенного в лабораторной работе метода основан на замещении ионов металлов, хелатированных в МТ, на радиоактивный Cd в мягких тканях двустворчатых моллюсков.

Объектами биотестирования воды по МТ используют моллюсков - перловицу и беззубку из семейства Unionodae размером 3- 12 см. Внутреннее строение у них одинаково. Знание анатомии и умение препарировать моллюсков позволяют определить содержание МТ в любом органе моллюска.

Импорт биохимических тест-систем в Россию

Импорт биохимических тест-систем в натуральном выражении в 2009 году составил 23,0 млн. тестов, сообщается в исследовании Abercade Рынок диагностического оборудования, реагентов и тестов для биохимического анализа в 2009-2010 годах.

В 2010 году наблюдалось значительное увеличение объёмов импортных поставок (почти в 2 раза), что может быть связано со значительным снижением поставок в 2009 году, обусловленным экономическим кризисом. Импорт биохимических тест-систем в Россию в 2010 году составил 52,2 млн. тестов.

Важно отметить, что импорт составлял основную часть рынка биохимических тест-систем в 2010 г., это обусловлено несколькими факторами:

* использование в лабораторной диагностике оборудования закрытого типа, для которого могут быть использованы только определённые наборы реагентов;

* гарантированно высокое качество поставляемой продукции и приверженность потребителей к импортным торговым маркам.

В 2009 году отмечалось некоторое снижение импортных поставок в пользу отечественного производства, что было обусловлено мировым экономическим кризисом и смещением спроса в сторону более доступных отечественных тест-систем.

На данный момент импортные поставки биохимических тест-систем находятся на стабильно высоком уровне и превышают объёмы внутреннего производства, диагностические лаборатории предпочитают использовать качественные и надёжные тест-системы импортного производства. Отечественные производители же в большинстве своём работают на импортном сырье и не выработали достаточно хорошую стратегию продвижения своей продукции и повышения её конкурентоспособности.

Список литературы

1. Мелехова О. П. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование / О. П. Мехелева, Е. И. Сарапульцева. - М.: Академия, 2008.- 288с.

2. Бурдин К.С. Основы биологического мониторинга/ К.С. Бурдин. - М: Изд-во МГУ, 1985.

3. Звягинцев Д.Г. Биология почв/ В. Г. Звягинцев.- М: Изд-во МГУ, 2005.

4. Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии/ Ф.Х. Хазиев.-М.: Наука, 1991.

5. Филенко О.Ф. Антропогенное влияние на водные экосистемы/ О.Ф. Филенко. - М.: Т-во научных изданий КМК, 2005.

6. Егорова Е.И. Биотестирование и биоиндикация окружающей среды/ Е.И. Егорова. - Обнинск: ИАТЭ, 2000.

7. Мелехова О.П. Свободнорадикальные процессы в пространственно- временной регуляции развития низших позвоночных/ О.П. Мелехова. - М.: Изд-во МГУ, 2005.

8. Федоров В.Д. Изменения в природных биологических системах/ под. ред. В.Н.Максимова. - М.: РАГС, 2004.

9. Стрельцов А.Б. Региональная система биологического мониторинга/ А.Б. Стрельцов. - Калуга, 2003.

10. Другов Ю.С. Экспресс - анализ экологических проб/ Ю.С. Другов. - М.: Бином, 2010.

Размещено на Allbest.ru