Дафнии как биоиндикаторные организмы

Размещено на http://www.allbest.ru/

Кыргызский Национальный университет им. Ж. Баласагына

Факультета Биологии

Кафедра Биоэкологии и МПБ

КУРСОВАЯ РАБОТА

На тему: «Дафнии как биоиндикаторные организмы»

Выполнила: студент 4-го курса гр. Б-2-09

Таалайбекова Тинатин

Проверил: доцент Токтосунов Т.А.

Бишкек 2013



Содержание

Введение

Глава 1. Обзор источников информации о биотестировании природных вод

Глава 2. Методика проведения биотестирования воды

2.1 Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы

2.2 Условия выполнения биотестирования

2.3 Описание тест - объекта

2.4 Критерии выбора тест - объекта в токсикологических исследованиях

2.5 Условия культивирования (и биотестирования) дафний

2.6 Проведение биотестирования

2.7 Обработка и оценка результатов

Глава 3. Результаты исследования и их анализ

Заключение

Список использованной литературы

Приложение



Введение

В последние 5-10 лет особое внимание уделяется методам биологического мониторинга, которые основаны на использовании живых организмов, особенно чувствительных к конкретным химическим веществам. Использование методов биомониторинга не требует больших экономических затрат (дорогостоящей аппаратуры, больших лабораторий и т.д.), а также позволяет оценить качество среды в случаях, когда количественное содержание загрязнителя может быть определено каким-либо методом, но отсутствуют сведения о биологической активности загрязнителя.

Биомониторинг является составной частью экологического мониторинга и включает в себя следующие подсистемы: биотестирование, биоиндикацию и биоаккумуляцию.

Биотестирование и биоиндикация - это два схожих исследовательских приема, в которых о качестве среды, о факторах, воздействующих на эту среду, судят по выживаемости, продуктивности, поведению, а также по различным физико-биологическим параметрам живых организмов. Биотестирование подразумевает использование живых организмов, специально помещаемых в данную среду (тест-объекты), а биоиндикация - живых организмов, естественным образом обитающих в данной среде.

Биотестирование с помощью таких высокочувствительных к загрязнению разного рода (ионы тяжелых металлов, нефтепродукты, УФ-излучение и т.д.) тест-объектов (биоиндикаторов), как дафнии (рачки - фильтраторы водоемов), пиявки, инфузории (простейшие), хлорелла (микроводоросль) и другие, находит в настоящее время широкое применение во многих странах.

Биоаккумуляция - частный случай биотестирования или биоиндикации, в котором о качестве среды, о факторах, воздействующих на эту среду, судят по степени накопления вредных веществ в живых организмах.

В настоящее время общепризнана необходимость введения нового вида контроля качества вод - биоиндикация на токсичность, - интегральный показатель, отражающий реальную картину токсического загрязнения водных объектов.

Оценка токсичности природных вод с помощью биотестирования широко применяется в настоящее время.

Цель работы: изучить острую и хроническую токсичность природных вод путем биотестирования с использованием в качестве биоиндикатора Daphnia magna.

Достижение поставленной цели предполагает решение следующих задач:

изучить методическую базу мониторинга природных объектов путем биотестирования;

изучить эколого - биологические особенности жизнедеятельности тест - объекта Daphnia magna ;

освоить методику проведения биотестирования природных вод;

Актуальность данной работы заключается в необходимости широкого внедрения данного метода мониторинга для оценки токсичности природных вод, так как метод биотестирования с использованием Daphnia magna обладает рядом преимуществ над остальными биологическими методами мониторинга природных объектов:

- они экспрессны (определение острой токсичности возможно за 96 ч, хронической токсичности - за 28 -30 сут;;

- они компактны (могут использоваться в полевых условиях);

- возможно проведение анализов микрообъемов воды (от 2 - 5 мл, для дафний требуется 1 - 1,5 л воды для анализа одной пробы);

- возможно проведение непрерывных анализов (нет необходимости в постановке отдельных экспериментов по установлению острой и хронической токсичности воды);

- экономически целесообразны.

Практическая значимость. Материалы и результаты работы могут быть использованы на внеклассных занятиях по экологии, а также для широкого информирования местного населения о состоянии природных вод .



Глава 1. Обзор источников информации о биотестировании природных вод

Под биотестированием (bioassay) обычно понимают процедуру установления токсичности среды с помощью тест-объектов, сигнализирующих об опасности независимо от того, какие вещества и в каком сочетании вызывают изменения жизненно важных функций у тест-объектов.

Для биотестирования используются различные гидробионты - водоросли, микроорганизмы, беспозвоночные, рыбы. Наиболее популярные объекты - ювенальные формы (juvenile forms) планктонных ракообразных-фильтраторов Daphnia magna, Ceriodaphnia affinis.

Важное условие правильного проведения биотестирования - использование генетически однородных лабораторных культур, так как они проходят поверки чувствительности, содержатся в специальных, оговоренных стандартами лабораторных условиях, обеспечивающих необходимую сходимость и воспроизводимость результатов исследований, а также максимальную чувствительность в токсическим веществам. В ходе биостестирования исследуется тест - функция тест - объекта.

Тест-функция (test function) - это жизненная функция или критерий токсичности (toxicity criterion), используемые в биотестировании для характеристики отклика тест-объекта на повреждающее действие среды.

Выделяют следующие тест-фукнкции, используемые в качестве показателей биотестирования для различных объектов:

- для инфузорий, ракообразных, эмбриональных стадий моллюсков, рыб, насекомых - выживаемость (смертность) тест-организмов.

- для ракообразных, рыб, моллюсков - плодовитость, появление аномальных отклонений в раннем эмбриональном развитии организма, степень синхронности дробления яйцеклеток.

- для культур одноклеточных водорослей и инфузорий - гибель клеток, изменение (прирост или убыль) численности клеток в культуре, коэффициент деления клеток, средняя скорость роста, суточный прирост культуры.

- для растений - энергия прорастания семян, длина первичного корня и др.

Длительность биотестирования зависит от задачи, поставленной исследователем. Она может быть нескольких видов:

А) Острые биотесты (acute tests), выполняемые на различных тест-объектах по показателям выживаемости, длятся от нескольких минут до 24-96 ч.

Б) Краткосрочные (short-term chronic tests) хронические тесты длятся в течение 7 суток и заканчиваются, как правило, после получения первого поколения тест-объектов.

В) Хронические тесты (chronic tests) на общую плодовитость ракообразных, охватывающие 3 поколения, длятся до рождения молоди в F3.

В ходе биотестирование исследуется токсический эффект вещества на организмы.

Токсический эффект (toxic effect) - это изменение любого показателя жизнедеятельности или функций организма под воздействием токсиканта. Зависит от особенностей яда, специфики метаболизма организма, факторов внешней среды (содержание кислорода, рН, температуры и др.).

Под токсичностью(toxicity) среды понимается cвойство химических веществ проявлять поверждающее или летальное действие на живые организмы. Вещество, оказывающее токсическое действие, называется токсикантом, а процесс воздействия токсиканта на организм - токсикацией (на экосистему - токсификацией). По Н.С.Строганову, количественно токсичность вещества для отдельного организма определяется как величина, обратная медианной летальной концентрации: Т = 1/LC50.

Токсичность водной среды (toxicity of water environment) - это токсичность воды и донных отложений для гидробионтов, возникающая вследствие появления в ней токсических веществ природного или антропогенного происхождения (ксенобиотиков), загрязнения сточными водами, токсическими атмосферными осадками и пр. При возникновении токсичности водной среды вода из среды, поддерживающей жизнь, становится средой, губительной для жизни. Степень токсичности водной среды оценивается методами биотестирования, а также по превышению ПДК (предельно допустимых концентраций).

При биотестировании используют определение острой и хронической токсичности, поэтому необходимо их различать.

Острая токсичность выражается в гибели отравленного организма за короткие промежуток времени - от нескольких секунд до 96 ч. Хроническая токсичность среды проявляется через некоторое время в виде нарушений жизненных функций организмов и возникновения патологических состояний (токсикозов). У водных организмов хроническая токсичность выражается в гонадотропном и эмбриотропном действии токсиканта, что приводит к нарушению плодовитости (продуктивности), эмбриогенеза и постэмбрионального развития, возникновению уродств (мутаций) в потомстве, сокращению продолжительности жизни, появлению "карликовых" форм

Гибель тест-объектов - это не единственный критерий токсичности. Существует достаточно много методов биотестирования, которые дают прекрасные результаты, но вытеснить выживаемость. а также плодовитость и качество потомства они не смогли. Показатель "выживаемость/смертность" , конечно, не самый чувствительный. Но с него обычно начинают оценку токсичности природных или морских вод. Более важным для водной экосистемы является критерий плодовитости и качества потомства. В биотестировании используется лабораторная культура партеногенетических самок, которые каждые 8-14 день рождают молодь, которая отличается от взрослых самок только размерами. Это позволяет изучать влияние отдельных веществ в ряде поколений, что очень важно для прогнозирования последствий попадания в водную среду тех или иных токсикантов.



Глава 2. Методика проведения биотестирования воды

Методика основана на установлении различия между количеством погибших дафний в анализируемой пробе (опыт) и культивационной воде (контроль).

Критерием острой летальной токсичности является гибель 50% дафний и более в опыте по сравнению с контролем за 96 ч биотестирования.

2.1 Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы

Применяются следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы:

- микрокомпрессор аквариумный АЭН ТУ 16-064-011;

- лупа складная ГОСТ 7954, ТУ 3-3-227;

- груши резиновые разные (пипеточные луковицы) ТУ 38-106-003;

- термолюминостат, поддерживающий температуру воды (20±2)°С, освещенность (500+100) лк;

- термометр по ГОСТ 112 с ценой деления шкалы 1°С; холодильник, поддерживающий температуру (4±2)°С;

- рН-метр ГОСТ 25.7416.0171 или аналоги;

- колбы мерные по ГОСТ 1770, вместимостью 0,5 и 1,0 дм3 по ГОСТ 1770, 2 класса точности;

- бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026;

- вату и марлю для изготовления ватно-марлевых пробок;

- пипетки мерные вместимостью от 1 до 10 см3 по ГОСТ 29227, 2 класса точности;

- посуду стеклянную: вместимостью 2 дм3 для культивирования дафний; вместимостью от 100 до 150 см3 для биотестирования; вместимостью 1 дм3 для транспортирования и хранения проб воды;

- цилиндры мерные вместимостью 0,1; 0,5 и 1,0 дм3 по ГОСТ 1770, 2 класса точности;

- дрожжи хлебопекарные по ГОСТ 171;

- культура зеленых водорослей (для корма - родов Chlorella или Scenedesmus).

2.2 Условия выполнения биотестирования

Биотестирование проводят в помещении, где не хранят и не работают с летучими веществами, не используют обработку помещения инсектицидами.

Объем пробы воды для определения острой летальной токсичности должен быть не менее 1 дм3.

Температура анализируемой пробы при биотестировании должна быть (20±2)°С, концентрация кислорода в пробе в начале биотестирования - не менее 6 мг/дм3. Если его концентрация ниже 6 мг/дм3, пробу аэрируют микрокомпрессором. Воздух должен подаваться равномерно до достижения концентрации кислорода 6 мг/дм3. Во время биотестирования пробу не аэрируют.

Битестирование проводят при рассеянном свете. Не допускается попадание прямых солнечных лучей на тест-объект. Длительность светового периода соответствует естественному. Рекомендуется использовать термолюминостат.

Плотность посадки односуточных дафний в опыте и контроле должна составлять 10 экземпляров на 100 см3. Повторность трехкратная.

2.3 Описание тест - объекта

В качестве тест-объекта используют лабораторную культуру дафний - Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) (Приложени1, фото 1).

Хотя для первичной оценки острой токсичности воды можно было использовать и природных представителей. Однако необходимо помнить, что организмы, взятые в природных водоемах, генетически неоднородны, часто и обитают в загрязненных водоемах и адаптированы к различным загрязняющим веществам. Для корректного использования таких организмов в качестве тест-объектов для биотестирования следует, как минимум, провести их акклимацию в стандартных лабораторных условиях.

Оптимальным подходом можно считать более длительный и сложный, но оправданный путь - получения достаточного для экспериментов количества потомства во втором и последующих поколениях. У Дафны магна, например, потомство было получено от одной партеногенетической самки, которая дала начало новой лабораторной культуре.

Дафния магна одна из самых широко известных видов ветвистоусых рачков и самая крупная среди дафний, обитающих в наших водоемах. Она достигает длины 5-6 мм. Магна обычно живет в мелких водоемах. Тело у нее заключено в полупрозрачную двустворчатую раковину, скрепленную на спинке и расходящуюся на брюшной стороне.

Раковину дафния периодически сбрасывает и заменяет новой. Голова дафнии спереди вытянута в остренький "клюв" или "хоботок" На голове находятся два глаза, которые у полностью развитых экземпляров сливаются в один сложный глаз. У многих видов рядом с ним находится еще один небольшой глаз. На голове имеются две пары антенн. Передние антенны - палочковидные, очень маленькие. Зато задние антенны непропорционально велики по сравнению с телом. Они ветвисты, причем каждая ветвь антенны снабжена длинными перистыми щетинками. Задние антенны служат основным органом передвижения ветвистоусых, одновременно взмахивая обеими задними антеннами, рачки отталкиваются ими и таким образом плывут короткими скачками. Регулируя частоту взмахов антен, дафнии могут не только "парить", но и подниматься в верхние слои воды или, наоборот, уходишь на глубину. Таким образом, они совершают вертикальные перемещения (миграции), связанные с поиском пищи, изменением температуры воды или времени суток. Грудной отдел ветвистоусых укорочен и состоит из 4 - 6 сегментов, каждый из которых снабжен парой ножек. У самок между спинной поверхностью тела и спинным краем раковины имеется обширная полость, выполняющая задачу выводковой камеры. В эту сумку откладываются яйца, где они и развиваются. Летом, в теплую погоду, в выводковой камере самки формируются неоплодотворенные яйца (по 50-100 штук у каждой особи), из которых выходят только самки, очень быстро покидающие тело матери. Поэтому, как правило, все пойманные летом дафнии оказываются самками. В течение всего лета самки размножаются партеногенетически. С наступлением холодов из некоторых яиц рождаются самцы, а у самок начинают образовываться яйца, которые могут развиваться лишь после оплодотворения самцом. Самцы у дафний редки, появляются обычно к осени и всегда значительно мельче самок. После оплодотворения ими самок образуются яйца (обычно не более двух), богатые желтком и совершенно непрозрачные. Оболочка с яйцами образует седлышко, или эфиппий. Эфиппии свободно плавают или опускаются на дно, они переносят замораживание и высыхание. Высохшие эфиппии разносятся ветром. Тепло и влага пробуждают яйца к жизни; из них выводятся самки, способные в течение многих поколений размножаться без самца.

2.4 Критерии выбора тест - объекта в токсикологических исследованиях

Имеющаяся на данный момент информация о Daphnia magna позволяет заключить, что представители этой группы животных соответствуют большинству критериев, по которым выбираются тест - объекты для биотестирования, так как:

- способны накапливать загрязняющее вещество и не погибают под действием встречающихся в природе концентраций;

- имеется много видов Daphnia magna, легко доступных в природе;

- имеют приемлемые размеры;

- легко культивируются в лабораторных условиях;

- образ жизни хорошо изучен;

- имеют короткий жизненный цикл развития.

Daphnia magna отвечают также требованиям к индикационным видам беспозвоночных животных, используемых в биологическом мониторинге водной среды:

- по своей экологии заметно подвергаются воздействию тех веществ среды, на которые ориентирован мониторинг;

- занимают функционально значимое место в экосистемах всех регионов;

- широко распространены во всех областях;

- заметно реагируют на изменение среды колебаниями численности.

Поэтому в дополнение к их важной роли в экологии водных сообществ, Daphnia magna представляют собой подходящие организмы для токсикологических исследований.

Изложенное выше свидетельствует, что Daphnia magna представляют интерес и являются перспективными объектами для разработки системы биотестирования природных вод.

2.5 Условия культивирования (и биотестирования) дафний

Культуру дафний выращивают в стеклянной посуде вместимостью до 2 дм3. Посуду моют питьевой содой и тщательно ополаскивают дистиллированной водой. Нельзя применять синтетические моющие средства и органические растворители.

Для культивирования дафний используют питьевую воду. Питьевую воду предварительно дехлорируют путем отстаивания и аэрируют микрокомпрессором до достижения концентрации растворенного кислорода не менее 6 мг/дм3.

Начальная плотность культуры дафний должна быть от 10 до 15 особей в 1 дм3. Один раз в неделю взрослых дафний в возрасте до 4 недель и молодь (для дальнейшего поддержания культуры) пересаживают отдельно в посуду со свежей водой.

Пересаживают дафний при помощи стеклянной трубки внутренним диаметром 5-7 мм так, чтобы их не травмировать. Для этого конец трубки помещают под поверхность воды и держат до тех пор, пока дафнии не перейдут в трубку. Аэрировать воду в посуде с дафниями не рекомендуется.

Дафний кормят один раз в сутки суспензией зеленых водорослей и один раз в неделю - суспензией хлебопекарных дрожжей.

Для приготовления дрожжевого корма 1 г свежих или 0,5 г воздушно-сухих дрожжей заливают 100 см3 дистиллированной воды. После набухания дрожжей суспензию тщательно перемешивают и отстаивают в течение 30 мин. Надосадочную жидкость добавляют в посуду с дафниями в количестве 5 см3 на 1 дм3 воды.

В качестве водорослевого корма для дафний рекомендуется использовать зеленые протококковые водоросли - сценедесмус или хлореллу.

Водоросли вносят в культуру дафний из расчета 1 см3 суспензии водорослей (плотность клеток составляет примерно 350 млн.кл/см3). Суспензию водорослей получают центрифугированием или отстаиванием в холодильнике в течение 2-3 суток. Надосадочную жидкость сливают, а осадок разбавляют в 2 раза дистиллированной водой и используют в качестве корма.

Для биотестирования используют дафний в возрасте до 24 ч, которых кормят за 2-3 ч до начала биотестирования. Чтобы получить необходимое количество тест-объектов для биотестирования, 20-30 самок дафний с выводковыми камерами, полными яиц или зародышей, за одни сутки до биотестирования пересаживают в стеклянную посуду емкостью от 0,5 до 1,0 дм3 с водой для культивирования и вносят корм. После появления молоди (каждая самка может выметать от 10 до 40 молодых дафний) взрослых особей удаляют.

2.6 Проведение биотестирования

При биотестировании выполняют следующие операции.

1. Пробу воды наливают в стеклянные сосуды по 100 см3 (опыт). Другие сосуды наполняют таким же объемом отфильтрованной воды из емкостей, где культивируются дафнии (контроль). Повторность в опыте и контроле трехкратная.

2. В каждый опытный и контрольный сосуд помещают по 10 дафний в возрасте до 24 ч. Их быстро переносят стеклянной трубкой диаметром 5-7 мм, погрузив ее в воду.

3. Продолжительность биотестирования составляет 96 ч. Во время биотестирования дафний не кормят.

4. В конце биотестирования визуально подсчитывают количество живых дафний. Живыми считают дафний, которые свободно передвигаются в толще воды или всплывают со дна сосуда не позже, чем через 15 сек после его легкого встряхивания. Остальных дафний считают погибшими.

2.7 Обработка и оценка результатов

1. На основании результатов трех параллельных определений количества живых дафний в контроле и опыте находят средние арифметические количества живых дафний в контроле (опыте).

Рассчитывают в процентах количество погибших дафний в опыте по отношению к контролю.

2. Вывод о наличии или отсутствии острой летальной токсичности пробы воды делают на основании величины: гибель 50% дафний и более- анализируемая проба проявляет острую летальную токсичность.

3. Результаты учета выживаемости и плодовитости тест-объектов в ходе опыта заносят в таблицу:

Место отбора пробы, дата отбора	Тест - функция	Показатель	Среднее арифметическое показателей выживаемости и плодовитости	Оценка тестируемой воды
	Выживаемость Плодовитость

4. Оценка результатов теста. Вода признается нетоксичной, если ни в одной серии опытов не отмечено нарушений поведения тест-объектов или достоверных отклонений показателей смертности/плодовитости по сравнению с контролем.

биотестирование токсикологический культивирование дафния



Глава 3. Результаты исследования и их анализ

При кратковременном биотестировании (до 96 часов), которое позволяет определить острое токсическое действие воды, выживаемость дафний в тестируемых пробах не изменилась. Показателем выживаемости служит среднее количество тест - объектов, выживших в тестируемой воде или в контроле за определенное время. Критерием токсичности является гибель 50% и более процентов дафний за период времени до 96 часов в тестируемой воде по сравнению с контролем. Отсюда можно сделать вывод, что исследуемая вода не оказывает острого токсического действия на тест - объект.

Статистическая обработка результатов длительного тестирования (28 суток), которое позволяет определить хроническое токсическое действие воды на дафний по снижению их выживаемости и плодовитости, в течение которого было получено от исходных самок три помета, позволяет заключить, что анализируемая вода хроническим токсическим действием не обладает.



Заключение

1. При оценке качества природных вод методами токсикологического анализа индикационные свойства D. magna проявляются, прежде всего, в изменении показателя - физиологическое состояние, который необходимо использовать в качестве приоритетного.

2. Экспериментально выявлена новая специфическая реакция дафний на действие загрязняющих веществ в сточных водах предприятий машиностроительного комплекса - всплытие и прикрепление дафний к поверхностной пленке воды.

3. Выполнение средообразующей функции дафний возможно в производственном стоке Марийского ЦБК начиная с 25 кратного разведения, в стоках содорегенерационного цеха, бумажной фабрики, ВНИИ ЦБП без разведения и в стоках промывного цеха после 2-х суточной аэрации и в пищевом производстве средообразующая функция дафний применима в сточных водах хлебобулочного цеха.

4. Средообразующая деятельность D. magna в сточных водах вторичного отстойника биологических городских сооружений улучшает качество очистки по бактериологическому показателю: количество общих колиформных бактерий за 2 суток снижается на 100%. На сточных водах из вторичного отстойника городских очистных сооружений возможно получение «живого корма» - культуры D. magna, которая не обладает токсичностью. 5. При введении культуры D. magna в технологический процесс очистки сточных вод на стадии вторичного отстойника возможно использование ее индикационных свойств для оценки качества сточных вод по изменению их физиологического состояния, средообразующей функции -для улучшения качества сточных вод по бактериологическому показателю и трофической роли для получения добавочного продукта - «живого корма».

Список использованной литературы

1. Брагинский Л.П. Методологические аспекты токсикологического биотестирования на Daphnia magna Str. и других ветвистоусых ракообразных (критический обзор) // Гидробиол. журн. - 2000. - Т. 36, N 5. - С. 50-70.

2. Дятлов С.Е. Роль и место биотестирования в комплексном мониторинге морской cреды // Экология моря. - 2000, вып.51. - С. 83-87.

3. Крайнюкова А.Н. Биотестирование в охране вод от загрязнения // Методы биотестирования вод. - Черноголовка, 1988. - С. 4-14.

4. Кузьменко М.И.,Брагинский Л.П., Ковальчук Т.В., Романенко А.В. Гидроэкологический русско-украинско-английский словарь-справочник. - К.: "Демиур", 1999. - 262 с.

5. Онегов А. Школа юннатов. Живой уголок/Худож. В. Ра-даев, В. Храмов. - М.: Дет. лит., 1990. - 271 с.: ил.

6. Семенченко В.П. Принципы и системы биоиндикации текучих вод. - Минск: "Орех", 2004. - 125 с.

7. http://www.microbiotests.be/



Приложение 1

Фото самки Daphnia magna.

Размещено на Allbest.ru

...