Экология риккетсий

Гибель эмбрионов при культивировании риккетсий группы сыпного тифа наступает в более поздние сроки (6-10-е сутки после заражения, иногда и позже), чем риккетсий группы КПЛ (4-6-е сутки), сопровождается более интенсивным накоплением риккетсий при менее выраженных изменениях геморрагического характера. Заражение куриных эмбрионов коксиеллами Бернета вызывает относительно позднюю гибель эмбрионов (6-8-е сутки) при интенсивном размножении возбудителя без выраженных изменений самого эмбриона.

Для культивирования риккетсий могут быть использованы как первично трипсинизированные, так и перевиваемые культуры клеток. Большинство видов риккетсий размножается в культурах клеток почечного эпителия, мезотелия, перевиваемых линиях клеток Vero, HeLa, Нер-2, L929. Коксиеллы Бернета хорошо размножаются также в культурах фибробластов куриного эмбриона и морских свинок, макрофагов и ретикулярных клеток костного мозга и селезенки. Получены данные о возможности культивирования на культурах клеток Vera и Нер-2 риккетсий, не культивируемых на традиционных моделях - морских свинках и куриных эмбрионах (R. tarasevichiae, риккетсий подгруппы R. massiliae).

Для пассирования культуры клеток подвергают версенизации по стандартной методике. Культуры клеток Vero и Нер-2 выращивают в стеклянных флаконах, засев проводят в концентрации 150 тыс. клеток на 1 мл. В качестве питательной среды используют среду Игла MEM с двойным набором аминокислот, к общему объему добавляют до 10 % эмбриональной сыворотки. Подготовленные флаконы заражают 10 %-ной риккетсиальной суспензией в объеме 0,5 мл на флакон. Зараженные флаконы центрифугируют при 800 об/мин при температуре +22 °С в течение 30 мин, после центрифугирования во все флаконы добавляют среду поддержки (Игла MEM с добавлением эмбриональной сыворотки до 1 %) в объеме 1,5 мл на флакон. Флаконы с зараженными клетками культивируют в углекислотном термостате при температуре 35,6 °С в течение 8 суток. После завершения инкубации все флаконы подвергают замораживанию в низкотемпературном холодильнике на -20 °С, а потом оттаиванию для разрушения клеток и максимального выхода из них микроорганизмов. После оттаивания материал центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин, супернатант в объеме 0,5 мл берут на следующий пассаж, а из 0,2 мл делают мазки, остатки супернатанта хранят в криопробирках в низкотемпературном холодильнике. Инфицированность и стерильность культуры клеток определяют в мазках, окрашивая их по Романовскому - Гимзе, и методом флюоресцирующих антител. Отсутствие посторонней микрофлоры в пассажах контролируется также посевом на питательные среды (сахарный бульон, тиогликолевая среда, среда Сабуро, среды на микоплазмы).

Развитие инфекции в клеточных культурах у различных видов родов Rickettsia и Orientia отличается. Для риккетсий Провачека и ориенций цуцугамуши характерно накопление микроорганизмов в больших количествах в отдельных клетках. Дегенеративные изменения клеток вследствие перепроизводства возбудителя сопровождаются их разрывом и освобождением микроорганизмов с распространением инфекции на соседние клетки.

У риккетсий группы КПЛ накопление возбудителя в отдельных клетках не сопровождается их переполнением, риккетсий еще на ранней стадии выходят из клеток без существенных их повреждений с быстрым распространением инфекции клеточной культуры. Дегенеративные изменения клеток обусловлены преимущественно токсическим действием риккетсий.

Методы выделения и последующей идентификации риккетсий требуют специальной подготовки, соблюдения режимных требований (возбудители 2-3-й группы патогенности). К возбудителям второй группы патогенности относят R. prowazekii, Coxiella burnetii, R. rickettsii. Их культивирование можно осуществлять в специализированных риккетсиологических лабораториях или лабораториях особо опасных инфекций, что ограничивает возможности использования методов выделения риккетсий в диагностических целях.

При изучении штаммов риккетсий придерживались классической схемы дифференциации, предложенной П.Ф. Здродовским и Е.М. Голиневич (1972), которая включает:

а) изучение морфологии;

б) характеристику размножения при культивировании в желточных мешках куриных эмбрионов;

в) воспроизведение экспериментальной инфекции на лабораторных животных;

г) иммунологическую характеристику в опытах перекрестного иммунитета;

д) серологический анализ антигенной структуры.

В последние годы выявлен ряд новых риккетсий, не культивируемых на традиционных риккетсиологических моделях (лабораторные животные, куриные эмбрионы). Для их культивирования использована клещевая экспериментальная модель (воспроизведение естественного цикла развития иксодид) и длительно культивируемые линии клеток млекопитающих (Vera, Нер-2) и иксодовых клещей.

Для группоспецифической идентификации риккетсий группы КПЛ можно использовать РСК с сыворотками крови биопробных морских свинок и цельнорастворимыми антигенами оригинальных штаммов риккетсий и музейных штаммов известных видов. Дифференциация риккетсий группы КПЛ ранее базировалась преимущественно на учете их токсических свойств, а также использовании корпускулярных антигенов и иммунных мышиных сывороток для идентификации риккетсий. Можно использовать метод флюоресцирующих антител с мазками-отпечатками желточных мешков куриных эмбрионов, ИФА и РНГА с иммуноглобулиновым диагностикумом для выявления риккетсий группы КПЛ и сыпного тифа производства Пермского филиала ФГУП "НПО "Микроген".

Дальнейшая идентификация проводится в перекрестной РСК с сыворотками мышей СВА и набором антигенов риккетсий, в РНИФ с моноклональными антителами к риккетсиям, а также с помощью генетических методов (рестрикционный анализ ДНК, ДНК-зондирование, полимеразная цепная реакция с использованием праймеров области гена цитратсинтазы и белкового антигена 190 кДа с последующим определением нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов ДНК и др.).

Серологическая диагностика

Реакцию Вейля - Феликса (см. раздел "Антигенное строение риккетсий") с протейными антигенами и варианты реакции агглютинации со специфическими риккетсиальными антигенами в настоящее время практически не применяют в связи с недостаточной чувствительностью и специфичностью. Существует более чувствительный метод микроагглютинации с меченными флюорохромом риккетсиями для серодиагностики риккетсиозов группы СТ производства Пермского филиала ФГУП "НПО "Микроген", однако не нашедший широкого применения в практике.

В течение многих десятилетий РСК являлась базовым методом серологической диагностики риккетсиозов. Метод обладает высокой групповой специфичностью даже при низких (1:10-1:20) разведениях сывороток, однако недостаточно чувствителен в ранней фазе заболевания. Комплементсвязывающие антитела при большинстве риккетсиозов групп СТ и КПП выявляют в конце первой - начале второй недели инфекции, в некоторых случаях - в более поздние сроки. Наличие группоспецифического полисахаридного комплекса в составе препарата растворимого антигена для РСК приводит к отсутствию четкой видовой дифференциации внутри групп СТ и КПЛ, хотя титры антител обычно бывают выше к гомологичному антигену. Группоспецифическая диагностика риккетсиозов группы КПЛ в РСК в России осуществляется с растворимым антигеном R. sibirica, в Америке - R. rickettsii, в Европе - R. conorii, что определяется распространением важнейших риккетсиозов этой группы - клещевого сыпного тифа Северной Азии, пятнистой лихорадки Скалистых гор и марсельской лихорадки соответственно. Более четкая видовая дифференциация внутри групп осуществляется с помощью корпускулярных антигенов, однако чаще не в РСК, а в РНИФ. Антигены и другие ингредиенты для РСК выпускают в Пермском филиале НПО "Микроген".

Реакцию непрямой гемагглютинации применяют для диагностики риккетсиозов как группы СТ, так и группы КПЛ. В качестве гемосенситина используют комплекс ЛПС и белковых антигенов. В нашей стране метод применяется преимущественно для выявления антител к риккетсиям группы СТ. Препарат выпускают в Пермском филиале НПО "Микроген". РНГА - наиболее ранний, чувствительный метод выявления текущей (острой) риккетсиоз-вой инфекции, выявляет преимущественно IgM-антитела, быстро исчезающие после перенесения инфекции. Латекс-агглютинация в целом близка по своим параметрам к РНГА, используется как метод первичного тестирования сывороток крови, группоспецифична, выявляет как IgM-, так и IgG-антитела, в связи с высокой перекрестной реактивностью внутри группы СТ не позволяет дифференцировать эпидемический и эндемический сыпной тиф.

Иммуноферментный анализ применяют для серодиагностики риккетсиозов групп СТ и КПЛ, лихорадки цуцугамуши. Применяют различные варианты ИФА с использованием ренографиночищенных антигенов для сенсибилизации планшет. По чувствительности и специфичности ИФА сопоставима с РНИФ, однако имеет некоторые преимущества для выявления антител в низких титрах (у вакцинированных, в период поздней реконвалесценции), что можно использовать при ретроспективном эпидемиологическом анализе. В России выпускают тест-системы ИФА для выявления антигенов коксиелл Бернета и антител к ним (Санкт-Петербургский НИИЭМ им. Пастера).

В последние годы в Омском НИИ природно-очаговых инфекций разработан ИФА для выявления антител к риккетсиям группы КПЛ, показана эффективность применения ИФА с антигеном R. sibirica для диагностики клещевого риккетсиоза (Н.В. Абрамова и др., 2009,2010).

Реакция непрямой иммунофлюоресценции считается "золотым стандартом" серодиагностики риккетсиозов, используемым в большинстве лабораторий. Метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью, воспроизводимостью, позволяет выявлять IgM- и IgG-антитела как вместе, так и раздельно в зависимости от применяемых конъюгатов. При риккетсиозах группы КПЛ и лихорадке цуцугамуши диагностически значимые титры IgM-антител выявляют в конце первой недели, IgG-антител - в конце второй недели заболевания. В России корпускулярных антигенов для РНИФ не выпускают, экспериментальные серии производят НИИЭМ им. Гамалеи РАМН, Омский НИИ природно-очаговых инфекций, Санкт-Петербургский НИИЭМ им. Пастера.

Методом подтверждения стандартных серологических методов диагностики является иммуноблот. Показано, что перекрестно-реагирующие антитела направлены против ЛПС и относятся к IgM-антителам, IgG-антитела образуются как к ЛПС, так и к белковым антигенам риккетсий. Коммерческие наборы для иммуноблота находятся в стадии разработки.

Диагноз лихорадки Ку вследствие полиморфизма клиники невозможен без лабораторного подтверждения. Основной метод - РСК. Наряду с ним используют более чувствительные методы - РНИФ и ИФА. У больных преобладают антитела к антигену C. burnetii фазы 2; антитела к антигену фазы 1 преобладают при формировании хронического течения.

Молекулярно-биологические методы.

Генетические методы находят все более широкое применение для изучения и идентификации риккетсий. Среди них используют анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ), метод геномной дактилоскопии (ДНК-зонды), анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированной в полимеразной цепной реакции ДНК (ПДРФ аДНК ПЦР), пульсовый гелевый электрофорез, метод сравнения нуклеотидных последовательностей.

Рестрикционный анализ требует для своего осуществления большого количества ДНК, что на первых этапах генетического изучения риккетсий требовало накопления биомасс риккетсий на чувствительных моделях (желточные мешки куриных эмбрионе, культуры клеток). Использование методов, основанных на полимеразной цепной реакции, является более рациональным. При этом не только не требуется длительное культивирование микроорганизмов, но часто эти варианты генетического анализа сказываются более чувствительными и специфичными.

В основе предложенного R.L. Regneiy (1991) метода идентификации и дифференциации риккетсий был положен анализ генов, кодирующих цитратсинтазу (gltA) и белок rOmpA (отрА), основанный за полиморфизме фрагментов рестрикции. Цитратсинтаза является компонентом почти всех живых клеток и ферментом главного цикла метаболизма - цикла лимонной кислоты, играющей ключевую роль в выработке энергии и в обеспечении биосинтетических метаболитов. При помощи ПЦР - амплификации было показано присутствие этого гена в хромосомах всех риккетсий. Определение ПЦР ПДРФ профилей, полученных после расщепления продуктов ПЦР с рестгедсгазой (эндонуклеазой) Alu 1, было использовано для изучения геномных различий риккетсий. Только пять генотипов имели свои характерные профили- R. akari, R. australis, R. japonica, R. massiliae и R. bellii. Все остальные виды изученных риккетсий группы КПЛ характеризовались идентичными профилями.

Дендрограмма генотипического родства секвенсов риккетсиальной цитратсинтазы, полученная в результате анализа ПЦР ПДРФ и оценки процента замены нуклеотидных оснований, свидетельствует о промежуточном положении R. canadensis между кластером, включающим риккетсий сыпнотифозной группы (R. prowazekii, R. typhi), и другим кластером, включающим риккетсии группы КПЛ (Regnery R.L. et al., 1991). Установлена гетерогенность вида R. conorii. Используя праймеры, амплифицирующие 532 первых основания и ферментативное расщепление: помощью эндонуклеаз Pst 1 и Rsa 1, можно дифференцировать все изученные риккетсий группы КПЛ, за исключением R. africae и R. parkeri (Eremeeva М.Е. et al., 1994).

Несмотря на высокую перспективность, особенно для диагностики новых риккетсиозов и анаплазмозов, эти методы, основанные на ПЦР, не нашли широкого применения в практике ввиду сложности и трудоемкости, а также в связи с методическими проблемами взятия и исследования клинического материала от больных. Тем не менее с помощью методов генодиагностики в последние годы доказана этиологическая значимость возбудителей ряда новых риккетсиозов - вызываемого R. slovaca синдрома TIBOLA (англ. - tick borne lymphoadenopathy - "лимфоаденопатия после присасывания клеща"), риккетсиоза, вызываемого R. heilongjiangensis, и др.

Оптимальным для идентификации риккетсий является метод сравнения нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР-амплификации. Первоначально при изучении риккетсиального генома был секвенирован и использован для проведения филогенетического анализа рода Rickettsia ген 16S rRNA (Stochard D.R., Fuerst Р.А., 1995; Roux V., Raoult D., 1995). Специфические последовательности были определены для каждого вида (серотипа), при этом установлено высокое сходство последовательностей - от 97,2 до 99,9 %. В бактериологии принятым критерием для отнесения различных штаммов к одному виду является 70 %-ный уровень гомологии ДНК (Wayne L.G. et al., 1987). Применение этого критерия к риккетсиям группы КПЛ показывает его относительность. На основании этого критерия R. rickettsii, R. conorii, R. sibirica и R. montanensis должны быть отнесены к одному виду (Walker D.H., 1988,1989). Понятно, что сравнение последовательностей 16S rRNA с учетом высокой степени гомологии риккетсий является оптимальным подходом для филогенетического анализа. Для многих представителей рода Rickettsia были изучены и некоторые другие последовательности - отрА, отрВ, git А, ген, кодирующий 17 кДа, которые также используются для классификации и номенклатуры риккетсий.

Лечение и профилактика

Наиболее эффективными и доступными средствами антибиотикотерапии риккетсиозов и лихорадки цуцугамуши являются препараты группы тетрациклинов и фторхинолонов. В лечении лихорадки Ку, равно как и риккетсиозов групп СТ и КПЛ, назначают преимущественно доксициклин, обладающий наилучшими фармакокинетическими характеристиками в отношении этих внутриклеточных микроорганизмов. Назначение тетрациклина или доксициклина в общетерапевтических дозах (2,0 г тетрациклина или 200 мг доксициклина в 2 капсулах в сутки для взрослого) при острых формах риккетсиозов и лихорадки цуцугамуши является эффективным и позволяет нормализовать температуру и улучшить состояние больного в течение 36-96 часов с начала лечения. В связи с возможностью длительной персистенции риккетсий и ориенций лечение необходимо продолжать 2-3 дня после нормализации температуры.

Разработана и применяется живая сыпнотифозная вакцина. Однако наибольшее значение в профилактике СТ имеет борьба с педикулезом, своевременное лабораторное обследование на сыпной тиф длительно лихорадящих больных, особенно из категорий риска (завшивленные, бездомные, беженцы и др.). Применительно к риккетсиозам группы КПЛ и лихорадке цуцугамуши применяют противоклещевые обработки территорий, меры личной защиты от нападения и присасывания клещей, возможно превентивное назначение антибиотиков.

Список используемой литературы

1. Зверев Е.И. Тифо-паратифозные болезни в прошлом и настоящем. М., 1967.

2. Лобан К.М. Важнейшие риккетсиозы человека. Л., 1980.

3. Равич-Биргер Е.Д., Эпштейн-Литвак Р.В. Бактериологические и серологические методы исследования при инфекционных заболеваниях. М., 1965.

4. Здродовский П.М., Голиневич Е.М. Учение о риккетсиях и риккетсиозах, М: 1978 г.

5. Паутов В.Н. Некоторые вопросы экологии риккетсий. Журнал. микр. эпид. и иммун. № 5, с. 92, 1987 г.

Размещено на Allbest.ru