Дестабілізація хромосомного апарату в різних таксонах тварин як показник екологічних змін

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ ТА БІОТЕХНОЛОГІЇ

УДК 575.224+577.21

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора сільськогосподарських наук

ДЕСТАБІЛІЗАЦІЯ ХРОМОСОМНОГО АПАРАТУ В РІЗНИХ ТАКСОНАХ ТВАРИН ЯК ПОКАЗНИК ЕКОЛОГІЧНИХ ЗМІН

03.00.16. - екологія

ГЛАЗКО ТЕТЯНА ТЕОДОРІВНА

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у Центрі сільськогосподарської біотехнології Інституту агроекології та біотехнології УААН, м. Київ.

Офіційні опоненти:

Славов Володимир Петрович, доктор сільськогосподарських наук, професор, чл.-кор. УААН, Інститут м'ясного скотарства УААН, м. Київ, завідувач відділу технології утримання та вирощування м'ясної худоби.

Гродзінський Дмитро Михайлович, доктор біологічних наук, професор, академік НАН України, Інститут клітинної біології і генетики НАН України, м. Київ, завідувач відділу радіобіології і біофізики;

Лукаш Любов Леонідівна, доктор біологічних наук, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ, завідувач відділу генетики людини.

Провідна установа: Білоцерківський державний аграрний університет Міністерства аграрної політики України.

Захист відбудеться 27.11.2001 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.371.01 Інституту агроекології та біотехнології УААН за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Метрологічна, 12.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології та біотехнології УААН.

Автореферат розісланий 20.10.2001 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат хімічних наук Г.В. Заякіна.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Збільшення антропогенного забруднення, темпів екологічних змін призводять до необхідності оптимізації наявних, розробки нових методів біоіндикації ушкоджуючих впливів і прогнозу їх наслідків. Очевидно, що особливої актуальності такі дослідження набули після Чорнобильської катастрофи.

З метою оцінки рівня екологічних змін і прогнозу їх наслідків традиційно розглядають різні біоіндикаторні види. При аналізі забруднення водойм з цією метою часто використовують личинки мотиля, основний компонент бентосу (Кикнадзе и др., 1975). Для біоіндикації екологічних змін у ссавців звичайно розглядають популяції диких видів дрібних мишоподібних гризунів, у яких підраховують частоти цитогенетичних аномалій у клітинах кісткового мозку (Гилева и др., 1992-2000). У разі потреби індивідуальної оцінки генотоксичних ефектів, зокрема, у сільськогосподарських видів тварин і людини, розглядають частоту мутаційних подій у клітинах периферичної крові. Однак дотепер виявляється низька ефективність таких підходів як у відношенні індивідуальних оцінок, так і при біоіндикації, зокрема, іонізуючих впливів у популяцій диких видів дрібних мишоподібних гризунів (Гилева и др., 1992-2000; Пилинская, 1995, 1999). дестабілізація упорядкованість хромосома мутація

Прийнято вважати, що однією з причин виникаючих проблем є низька "чутливість" цитогенетичних методів оцінки мутаційних процесів у соматичних клітинах. У той же час самі цитогенетичні аномалії є загальною назвою різних змін хромосомного апарату. Серед них можна виділити, принаймні, дві групи пошкоджень, пов'язаних одна з одною, але не тотожних за механізмами виникнення і за наслідками для клітинних популяцій: різні типи внутрішньохромосомних пошкоджень (включаючи хромосомні транслокації) і мінливість клітин за кількістю хромосом (анеуплоїдія). Необхідною (але не завжди достатньою) подією для появи мутацій першої групи є порушення безперервності молекули ДНК хромосоми, а в основі анеуплоїдії можуть лежати епігенетичні пошкодження внутрішньоклітинних механізмів контролю ходу мітозу (дефекти веретена поділу, соматична гібридизація клітин і т.д.). Мутації першої групи супроводжуються змінами первинної послідовності структурних генів чи їхньої експресії, другої - кількості копій хромосом (генних доз). Значення індукції таких пошкоджень, їхній порівняльний внесок у розвиток різних соматичних патологій у відповідь на екологічні зміни дотепер залишаються недостатньо вивченими.

Також необхідно підкреслити, що кожна мутація є підсумком цілого каскаду подій. Відомо, що кількість спонтанно виникаючих вихідних пошкоджень на декілька порядків більша, ніж мутацій, що тестуються (Marnett, Plastaras, 2001). Отже їхній підрахунок як показник генотоксичних ефектів реально призводить до оцінки подій, пов'язаних у першу чергу з загальною стабільністю генетичного апарату, ефективністю репарації постійно виникаючих дефектів, селекцією на сумісність мутацій з життєздатністю клітин. У цьому зв'язку стає очевидною актуальність пошуку таких характеристик генетичного матеріалу, зміни яких могли б використовувати за ознаку його загальної дестабілізації, збільшеної імовірності реалізації первинних пошкоджень у мутаційні події.

Організація генетичного матеріалу є ієрархією різних рівнів, починаючи від нуклеотидного, нуклеосомного, хромосомного, включаючи невипадкове положення самого ядра, веретена ділення в клітинному просторі (Marshall et al., 1997). Деякі автори вважають, що всі ці наднуклеотидні рівні його організації служать додатковими елементами генетичного коду, які впливають на фундаментальні генетичні процеси - збереження, реалізацію та успадкування генетичної інформації (Voght, 1990).

Очевидно, що наявність закономірностей в організації "надхромосомного генетичного коду" та їхніх змін під впливом генотоксичних дій можна було б використовувати як інтегральну характеристику стабільності генетичного апарату, що, очевидно, сприяло б оцінці ймовірності появи мутацій.

Прийнято виділяти декілька характеристик упорядкованості генетичного матеріалу в просторі інтерфазного ядра. До основного з них відносяться орієнтація Рабля (релікт останньої анафази - кластеризація центромер на одному полюсі ядра, теломер - на іншому) і невипадкове розташування окремих хромосом відносно одна одної. Однак дотепер не вдалося знайти характеристик такого порядку, універсальних для більшості видів тварин, а також оцінити їхній зв'язок з дестабілізацією хромосомного апарату під впливом екологічних змін.

Аналізу елементів надхромосомної упорядкованості генетичного матеріалу, можливих причин і наслідків його мінливості у різних об'єктів дослідження і присвячена ця робота.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано відповідно до тематичного плану наукових досліджень Інституту агроекології та біотехнології УААН "Вивчити генетичні наслідки екологічних стресів у різних видів тварин", N 0196U012073; згідно з договорами між Інститутом агроекології та біотехнології УААН і Чорнобильським Науковим Центром Міжнародних Досліджень N 143 "Генетичні наслідки екологічного стресу в зоні відчуження Чорнобильської АЕС" та N 13/119-99 "Мишоподібні гризуни як біоіндикатор забруднення регіонів зони відчуження Чорнобильської АЕС", а також у відповідності з проектами, що пройшли конкурс наукових досліджень Міністерства освіти і науки України: "Вивчення закономірностей просторових міжхромосомних взаємодій і їхніх зв'язків з виникненням цитогенетичних аномалій" (5./275); "Вивчення взаємозв'язків між каріотиповою нестабільністю і міжхромосомними асоціаціями в клітинах ссавців" (5.3./150); згідно з договором по проекту 3.05.02./002-92: "Розpoбити методи pанньої діагностики особливо цінних бугаїв та баранів-плідників на основі викоpистання біoхімічних маpкеpів стpуктуpних генів та аналізу цитогенетичної мінливості клітин кpoві" за пpoгpамою 3.5: "Селекція тварин за природною резистентністю з використанням клітинної та генної інженерії"; відповідно до міжнародного договору між Україною і Росією Міністерства освіти і науки України "Розробка методів вивчення молекулярно-генетичних механізмів дестабілізації каріотипу в умовах генотоксичних дій", N 2м/96-98.

Мета і завдання дослідження. Метою досліджень була оцінка елементів упорядкування хромосом у соматичних клітинах тварин (різних таксонів), їхніх змін під впливом середовищних, екологічних факторів, зв'язку таких змін з появою різних типів цитогенетичних аномалій, а також проведення порівняльного аналізу внеску цитогенетичних аномалій (анеуплоїдії і внутрішньохромосомних пошкоджень) у фенотипову мінливість на прикладі клітинних ліній іn vіtro.

У роботі було поставлено наступні задачі:

- оцінити наявність елементів упорядкованості політенних хромосом в інтерфазних ядрах слинних залоз личинок Chіronomus thummі в умовах впливу температурних, сезонних і онтогенетичних факторів;

- провести пошук елементів упорядкованості хромосом у клітинах кісткового мозку лабораторної лінії мишей BALB/c іn vіvo;

- оцінити динаміку внутрішньохромосомних пошкоджень і анеуплоїдії, асоціацій між гомо- і гетерологічними хромосомами в процесі спонтанної неопластичної еволюції ембріональних фібробластів лабораторних ліній мишей C3H/He, CBA/Ca, C57BL/6 і при соматичній гібридизації клітин мієлом лабораторної лінії мишей BALB/c зі спленоцитами норки;

- виконати порівняльний аналіз впливів іонізуючого опромінення, сезону досліджень і віку на частоти стрічання різних цитогенетических аномалій у лабораторних ліній мишей (BALB/c, C57BL/6 і CC57W/Mv);

- оцінити міжхромосомні асоціації і частоти цитогенетичних аномалій у видів полівок, виловлених у місцях мешкання зони відчуження Чорнобильської АЕС з різними рівнями радіонуклідного забруднення;

- розглянути зв'язок міжхромосомних асоціацій у клітинах периферичної крові великої рогатої худоби з дестабілізацією каріотипу в умовах впливу різних ендогенних і екологічних факторів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виявлено, що у відповідь на середовищні, екологічні зміни у тварин різних таксонів (лабораторні лінії мишей, види полівок, різні породи великої рогатої худоби) дестабілізація каріотипу виникає за тими ж ознаками, за якими спостерігається спонтанна нестабільність. Показано, що екологічні зміни тільки підсилюють їхню вихідну нестабільність. Виявлено наявність елементів упорядкованості в організації хромосомного апарату тварин. Зокрема, у досліджених видів ссавців показано наявність організації хромосом у гаплоїдні набори. Іn vіtro виявлені кореляційні взаємозв'язки між копійністю неперебудованих хромосом миші при змінах одиничних фенотипових характеристик клітинних популяцій. Вперше було отримано дані, які свідчать про зв'язок між надхромосомною організацією генетичного матеріалу і каріотиповою стабільністю у тварин з різних таксонів. Так, зокрема, виявлено зв'язки між взаємним розташуванням гомологічних хромосом у метафазних пластинках клітин кісткового мозку представників полівки-економки, звичайної полівки, а також периферичної крові тварин різних порід великої рогатої худоби і підвищеною частотою трапляння у них анеуплоїдних клітин.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Рекомендовано новий метод прогнозу виникнення деяких типів цитогенетичних аномалій (анеуплоїдії, робертсонівських транслокацій), а також оцінки генотоксичних ефектів екологічних змін на підставі аналізу елементів упорядкованості хромосомного апарату і їхнього руйнування. Показано, що при підборі індикаторних видів для біоіндикації екологічного забруднення на підставі частот стрічання цитогенетичних аномалій необхідно враховувати їх видову каріотипову стабільність. Так, із трьох видів полівок найбільш чутливим до індукції анеуплоїдії під впливом хронічного низькодозового іонізуючого опромінення виявився вид звичайної полівки, найменш стабільний в ареалі мешкання і найбільш "молодий" у порівнянні з полівкою-економкою і рудою полівкою. При оцінці індивідуальних генотоксичних ефектів за частотами стрічання цитогенетичних аномалій у ссавців рекомендується враховувати темпи клітинних поділів, а також пул неушкоджених серед клітин, які діляться, для корекції вікових, сезонних впливів. Представлені розробки можуть бути безпосередньо використані для прогнозу виникнення цитогенетичних аномалій у індивідуальних тварин, зокрема, у великої рогатої худоби різних порід (Bos taurus, Bovіdae, Rumіnantіa), а також при аналізі екологічного забруднення з використанням як біоіндикаторних видів дрібних мишоподібних гризунів (Arvіcolіdae, Rodentіa) і личинок мотиля (Chіronomіdae, Dіptera).

Особистий внесок здобувача. Нові теоретичні й експериментальні ідеї, розроблені в дисертації, належать автору. Постановка проблеми, розробка програм досліджень, одержання й аналіз експериментальних даних виконувалися автором особисто або безпосередньо під його керівництвом. Деякі моделі були люб'язно надані автору для цитогенетичних досліджень співробітниками Інституту цитології і генетики СВ РАН, Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ, Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАНУ, Чорнобильським Науково-Технічним Центром Міжнародних Досліджень, яким автор приносить свою щиру вдячність. Цитогенетичний аналіз ряду об'єктів виконувався при участі і під керівництвом автора співробітниками Інституту агроекології і біотехнології УААН Н.А. Кобозєвою, О.А. Ковальовою і С.О. Костенко.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені і доповідалися на міжнародних конференціях і симпозіумах, таких як: XXІІІ Symposіum on Bіolоgіcal models, (Czechoslovakia, Mlyn, 1986); на V з'їзді ВТГіС (Москва, 1987); Всесоюзна міжуніверситетська конференція "Біологія клітини", (Тбілісі, 1987); Всесоюзна конференція по генетиці соматичних клітин у культурі (Москва, 1989); "Канцерогенні нітрозосполучення та їх попередники - утворення і визначення у навколишньому середовищі" (Таллін, 1990); Всесоюзна нарада "Клітинні механізми адаптації" (Чернігів, 1991); І-ша Міжнародна конференція по частковій генетиці сільськогосподарських тварин (Асканія-Нова, 1993); "Молекулярна генетика і біотехнологія в оцінці змін генів сільськогосподарських тварин" (Санкт-Петербург, 1994); І, ІІ, ІІІ Міжнародні конференції "Молекулярно-генетичні маркери тварин" (Київ, 1994, 1996, 1999 рр); VІ Іnternatіonal Congress of Cell Bіology (Czechіja, Prаga, 1994); ІV Міжнародна науково-технічна конференція "Підсумки 8 років робіт з ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС" (Зелений Мис, 1994); "Workshop on Іntercellular Communіcatіon" (Moscow, Pushchіno, Russіa, 1994); "Оne decade after Chernobyl" (Austrіa, 1996), "Молекулярно-генетичні маркери рослин" (Ялта, 1996); XXVth Іnternatіonal Conference on Anіmal Genetіcs ІSAG (France, 1996); "Чорнобиль-96" (Зелений Мис, 1996); Щорічна конференція EAAP (Norway, 1996); "Агробіотехнології рослин і тварин" (Київ, 1997), Третя Міжнародна конференція із стійкого розвитку "Проблеми індустріальних регіонів: менеджмент і екологія" (Запоріжжя, 1998), "XXth Genetіc days" (South Bohemіan Unіversіty, 1998), Чехія; ІІ Європейська цитогенетична конференція "Cytogenetіcs and cell genetіcs" (Австрія, 1999); "Проблеми радіаційної генетики на рубежі століть" (Москва, 2000); VIII Міжнародна конференція "Plant and Animal Genome" (San Diego, CA, 2000).

Публікації. За матеріалами роботи опубліковано 27 статей у наукових журналах, 4 статті в збірниках праць Інституту агроекології та біотехнології УААН; 1 стаття в збірнику праць Інституту землеробства УААН; 21 повідомлення у матеріалах і тезах конференцій; вони включені також у матеріали двох препринтів.

Обсяг та структура роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, шести розділів отриманих власних результатів досліджень і їхніх обговорень, висновків і списку цитованої літератури. Текст дисертації проілюстрований 54 таблицями і 37 рисунками. Перелік цитованої літератури містить 551 найменування. Дисертаційну роботу викладено на 340 сторінках друкованого тексту.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи. До аналізу включені тварини і клітинні популяції, які наведені в табл.1.

Таблиця 1.Тваринні і клітинні популяції, які увійшли до аналізу.

Об'єкт дослідження. Личинки Chіronomus thummі L (Chіronomіdae, Dіptera). У роботі було використано личинки ІІІ-ІV віку Chіronomus thummі з лабораторної культури лабораторії загальної цитології Інституту цитології і генетики СВ РАН. Слинні залози виділяли у фізіологічному розчині (0.115 М NaCl), фіксували в суміші спирт - оцтова кислота (3:1), підфарбовували ацетоорсеїном, поміщали в краплю гліцерину і накривали покривним скельцем. Положення політенних хромосом у ядрах оцінювали під світловим мікроскопом, з кожного ядра малювали схему розташування хромосом у ядрі за допомогою рисувального апарату. Центрифугування залоз проводили в центрифузі VAC-601 із прискоренням 140000g протягом 20 хв. Для аналізу температурних ефектів личинок відбирали з лабораторної культури в бюкси з відстійною водою і поміщали або в термостат, де інкубували личинки при +30°С, або в холодильник, де температура води в бюксах протягом експерименту була +9°С (" ±10°С до стандартних умов культивування). Дослідження проводили в літні, осінні і зимові місяці. Для оцінки онтогенетичних ефектів відбирали личинок у перехідному періоді від одного личиночного віку в іншій. Перехід від ІII до ІV личиночного віку тестували за ознакою "червоної голови" (стадія "червоної голови", Кикнадзе, Груздев, 1970; Кикнадзе и др.,1975).

Аналіз розташування хромосом у метафазних пластинках клітин кісткового мозку лабораторної лінії мишей BALB/c. Роботу було виконано на самках мишей лінії BALB/c. Мишей утримували в умовах віварію Інституту цитології і генетики СВ РАН. Групі тварин однократно вводили внутрішньочеревно адріаміцин (виробництво заводу Лейрас, Фінляндія), розчиненого в 0.9%-ному NaCl, у дозі 20 мг на 1 кг живої маси мишей. Препарати клітин кісткового мозку готували загальноприйнятим способом (без застосування колхіцину): з задніх лапок гіпотонічним розчином КСl (0.54 %) вимивали кістковий мозок, інкубували клітини в цьому розчині 30-40 хв. при температурі 37°С. Фіксували сумішшю метилового спирту й оцтової кислоти (3:1), потім готували препарати і фарбували їх для виявлення G-дисків метафазних хромосом, обробляючи препарати 0.25 %-ним розчином трипсину та фарбуючи їх барвником Гімза (Seabrіght, 1971). Хромосоми ідентифікували у відповідності зі стандартним каріотипом мишей (Cowell, 1984).

Аналіз клітинних ліній ембріональних фібробластів і мієлом. Розглянуто клітини кісткового мозку лабораторних ліній мишей C3H/He, CBA/Ca, C57BL/6, BALB/c і клітинні лінії, що знаходяться на різних стадіях спонтанної неопластичної еволюції. Модель спонтанної неопластичної еволюції ембріональних фібробластів різних ліній мишей була створена д.б.н. В.А. Лавровським (Інститут цитології і генетики СВ РАН, Новосибірськ) і люб'язно надана нам для цитогенетичних досліджень. Шляхом тривалого пасування клітин іn vіtro ним було отримано pяд ліній і субліній ембpіональних фібpобластів мишей С 3H/He, C57BL/6, CBA/Ca. Одержання, динаміка пухлиноспоpідненості, мінливість pяду фенотипових ознак було описано pаніше (Лавpовский и др.,1987). До цитогенетичного аналізу ввійшли 15 субліній ембріональних фібробластів. Тpи сублінії лінії FBL2 (миші C57BL/6),: вихідна FBL2/1, пpоміжна за пухлиноспоpідненістю FBL2/4 і максимально пухлиноспоpіднена сублінія, що пройшла 12 пасажів іn vіvo, FBL2/v12. Чотиpи сублінії лінії FCBA2 (миші CBA/Ca): вихідна FCBA2/1, пpоміжна FCBA2/4 та дві клональні сублінії, отримані в pезультаті клонування клітин максимально пухлиноспоpідненої сублінії FCBA2/v10 - непухлиноспоpіднена FCBA2/v10-7 і максимально пухлиноспоpіднена FCBA2/v10-1. Шість субліній лінії FC3H3 (миші C3H/He): вихідна FC3H3/1, пpоміжна FC3H3/4, максимально пухлиноспоpіднена FC3H3/v7, дві клональні сублінії, отримані пpи клонуванні клітин вихідної непухлиноспоpідної FC3H3/1-64 і пpоміжна за пухлиноспоpідненістю FC3H3/1-11, а також високометастазуюча клональна сублінія FC3H3/4-M, отримана від клітини сублінії FC3H3/4, яка дає пpи пеpевивці в хвостову вену сингенним мишам метастази в легенях у 100 % мишей. Лінії FC3H5 і FC3H8, отримані з ембpіональних фібpобластів мишей C3H/He, що відрізняються від описаних ліній відсутністю пухлиноспоpідненості, незважаючи на майже дворічне пасування в умовах іn vіtro.Три клітинні лінії - FC3H5, FC3H8, FC3H3/4-M відрізнялися від інших клітинних ліній фенотиповою стабільністю за ознакою пухлиноспорідненості при перевивці сингенним тваринам протягом тривалого пасирування.

Розглянуто лінії мієлом і їх сублінії, що походять від лімфоцитів мишей лінії BALB/c (усього 9 клітинних популяцій). Клітинні лінії мієлом і отримані на їхній основі міжвидові гібридоми охарактеризовані за продукцією імуноглобулінів норки - весь комплекс цих клітинних ліній і їхньої характеристики були люб'язно надані нам для цитогенетичних досліджень Н.Л. Галахарь (Інститут цитології і генетики СВ РАН, Новосибірськ).

Для клітин кісткового мозку мишей і кожної клітинної сублінії підраховували число хромосом (Хp) у понад 60 метафазних пластинках, pяд якісних пластинок було сфотогpафовано і каpіотиповано. Хромосоми миші типували відповідно до опису Коуела (Cowell, 1984), хромосоми норки Mustela vison, Schr. (Carnivora, Mustelidae) відповідно опису Мандалі, Фредга (Mandahl, Fredga, 1975).

Оцінка ефектів іонізуючого опромінення у мишей ліній С 57BL/6, BALB/c, CC57W/Mv у зоні відчуження Чорнобильської АЕС. Дослідження виконувалися на мишах ліній BALB/c, CC57BL/6 і СС 57W/Mv двох вікових груп, взятих до аналізу у різні сезони дослідження (зима, літо, осінь), що утримувалися у віварії Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького, у віварії Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (ІМБіГ), а також на тваринах, що утримувалися в спецвіварії цього інституту у 30-км зоні відчуження Чорнобильської АЕС. Тварини для аналізу, а також дані щодо радіаційного навантаження у них були люб'язно надані для досліджень чл.-кор. НАНУ С. С. Малютою (у приміщенні спецвіварію - 40-80мкР/рік, у тушках мишей - 2,4х 102Бк/кг). Усі забарвлені цитогенетичні препарати готували так само, як і при аналізі клітинних популяцій мишей за винятком диференціального фарбування. Для аналізу цитогенетичної мінливості розглядали два типи анеуплоїдії (А-1 з числом хромосом 35-40 і А-2 з числом хромосом 39-41; 2n=40), поліплоїдію, хромосомні аберації, асинхронність розщеплення центромерних районів хроматид, міжхромосомні асоціації за типом робертсонівських транслокацій. Мітотичний індекс і частоту стрічання двоядерних лімфоцитів розраховували на 1000 клітин, мікроядра в одноядерних лімфоцитах - за числом лімфоцитів з мікроядрами на 1000 одноядерних лімфоцитів (у %).

Цитогенетичні дослідження клітин кісткового мозку мишоподібних гризунів (Arvіcolіdae, Rodentіa), виловлених у місцях мешкання з різним рівнем радіонуклідного забруднення зони відчуження Чорнобильської АЕС. Виконано аналіз представників трьох видів мишоподібних гризунів (Arvіcolіdae, Rodentіa), виловлених у 30-км зоні відчуження Чорнобильської АЕС: полівки-економки (Mіcrotus oeconomus P.,2n=30, Fna=54); звичайної полівки (Mіcrotus arvalіs P., 2n=46, Fna=84) і рудої полівки (Clethrіonomys glareolus S.,2n=56, Fna=56). Вилов тварин і оцінки рівнів радіонуклідного забруднення регіонів вилову виконувалися співробітниками Чорнобильського Наукового-Технічного Центру Міжнародних Досліджень (ЧНТЦМД). Досліджували тварин, виловлених живоловками в районі Рудого лісу (100-2000 Кі/км²), озера Глибокого (близько 400 Кі/км²), Чистогаловки (близько 300 Кі/км²), Янова (30-120 Кі/км²), Лельова (15-20 Кі/км²), Роз'їзжого, Ямполя, Залісся, Іванкова (менш 20 Кі/км²), Копачів, Неданчичів (до 5 Кі/км²) у весняно-літній період. Препарати клітин кісткового мозку готували за стандартною методикою без застосування колхіцину так само, як і при дослідженні клітинних популяцій лабораторних ліній мишей. У тварин розглядали ті ж цитогенетичні характеристики, що й у лабораторних ліній мишей.

Цитогенетичні характеристики клітин периферичної крові великої рогатої худоби (Bos taurus; Bovіdae, Rumіnantіa). Дослідження виконувалися на таких породах великої рогатої худоби (Bos taurus; Bovіdae, Rumіnantіa): червона степова (15 голів господарство ім. Кірова, м. Херсон); англерська (15 голів господарство ім. Кірова м. Херсон); чорно-рябі голштини в умовно контрольній групі (13 голів, господарства "Чайка", "Олександрівка" Київської обл., рівень забруднення менш 5 Кі/км²), у групі тварин, які несуть антитіла до вірусу бичачого лейкозу (18 голів, господарство "Дзвінкове" Київської обл.), у групах тварин, що утримувалися в умовах підвищеного радіонуклідного забруднення на межі 30-км зони Чорнобильської АЕС (15 голів, господарство "Куповате" Київської обл., рівень забруднення близько 20 Кі/км²) і в 10-км від ЧАЕС (20 голів, господарство "Новошепеличі", рівень забруднення близько 200 Кі/км²); салерсах (21 голова, агроколедж "Пущино", Росія); сименталах (9 голів, господарство "Прилуки" Чернігівської обл.); українській м'ясній породі двох вікових груп (19 голів господарств "Фрунзе" і "Україна" Чернігівської обл.). Кров брали з яремної вени тварин у стерильні гепаринізовані пробірки. Короткострокову культуру клітин крові готували стандартним способом на середовищі Хенкса-199 з додаванням антибіотиків (стрептоміцин і пеніцилін) і фітогемаглютеніну, фіксували клітини через 72 год після початку культивування. Не додавали ні колхіцин, ні колцемід. Після висушування препарати фарбували барвником Гімза (Merck). Усі забарвлені цитогенетичні препарати аналізували за допомогою бінокулярного мікроскопу Karl Ceіss при збільшенні в 1000 разів. Метафазні пластинки фотографували на плівку "Мікрат-300". У клітинах периферичної крові великої рогатої худоби оцінювали ті ж цитогенетичні характеристики, що й у мишей; анеуплоїдія 53-67 хромосом позначалася як А 1, анеуплоїдія 59-61 хромосома - як А 2 при 2n=60.

Статистичну обробку експериментальних даних виконували з використанням стандартних прийомів (Плохинский,1970). Міжгрупові розходження оцінювали за допомогою критерію Ст'юдента (Плохинский, 1970). Для статистичної обробки використовували стандартні комп'ютерні програми: "QUATTRO PRO", "STATІSТІCA" - для оцінки коефіцієнтів кореляції участі індивідуальних хромосом в асоціаціях між гомологами і гетерологами, "BІOSYS-І" - для оцінки умовних "генетичних відстаней" і побудови дендрограм на основі частот участі індивідуальних хромосом у таких асоціаціях. Розглядали кожен випадок міжхромосомної асоціації в клітині як її певний "генотип". Окреме плече враховували як алельний варіант, а обидва плеча - як генотип. При аналізі кореляційних взаємин використовували вибірковий коефіцієнт кореляції і рангові коефіцієнти кореляції Спірмена і Кендала.

Політенні хромосоми інтерфазних ядер слинних залоз личинок Chіronomus thummі.

Упорядованість політенних хромосом в інтерфазних ядрах клітин слинних залоз личинок ІV віку Chіronomus thummі. Прийнято вважати, що одним із основних елементів упорядкованості хромосом (Хр) вищих організмів в інтерфазних ядрах є їхня поляризація. Вона обумовлена тим, що центромерні райони групуються на одному полюсі ядра, теломерні - на протилежному (Щапова, 1971; Avіvі, Feldman, 1980; Comіngs, 1980; Ashley, Pocock, 1981; Sperlіng, Ltіdtke, 1981; Gremeretal., 1982; Hensetal., 1983; Fussel, 1983). Таке положення Хр щодо полюсів ядра прийнято називати орієнтацією Рабля (Ashley, 1979; Comіngs, 1980) і воно розглядається як релікт руху Хр до полюсів в анафазі мітозу. Однак дотепер відсутні однозначні дані про універсальність такого розташування Хр в різних тканинах і у різних видів. Щоб з'ясувати це питання ми розглянули положення політенних Хр у просторі інтерфазних ядер слинних залоз личинок Chіronomus thummі ІV віку. Ядра замальовували з використанням рисувального апарату і розглядали взаємне розташування Хр. В результаті виконаного аналізу схем 156 ядер були одержані дані, що у більшості ядер центромерні райони Хр І і ІІ розташовані ближче один до одного, ніж до центромер у Хр ІІІ. Порівняння коефіцієнтів кореляції відстаней показало, що найбільші значення характерні для відстаней між Хр І і ІІІ, ІІІ й ІІ (0.41<r<0.74; 0.1<mr<0.2). Найменші значення спостерігалися, як правило, при порівнянні відстаней між центромерним районом Хр ІV і центромерними районами Хр І, ІІ й ІІІ. Тобто, взаємне розташування центромерних районів Хр І, ІІ й ІІІ виявилося невипадковим; центромерні райони Хр І й ІІ мають тенденцію розташовуватися ближче один до одного, ніж до центромер у Хр ІІІ. Аналіз взаємної орієнтації теломерних районів Хр І, ІІ й ІІІ показав, що в 60-70 % випадків теломерні ділянки Хр ІІІ орієнтовані проти теломерних ділянок Хр І й ІІ.

Таким чином, у ядрах клітин слинних залоз личинок Ch. thummі відсутня орієнтація Рабля, є соматична кон'югація гомологів і упорядкованість взаємного розташування 3-х з 4-х хромосом каріотипу (хромосоми І і ІІ розташовані ближче одна до одної і, як правило, орієнтовані проти хромосоми ІІІ).

Для того щоб виявити структурні елементи, які беруть участь у просторовій упорядкованості генетичного матеріалу, було розглянуто вплив ряду факторів на морфологію ядер. З цією метою використовували центрифугування слинних залоз. Виявилося, що центрифугування не призводить до таких змін морфології ядер, які б не зустрічались у клітинах контрольних залоз. В обох випадках спостерігалися чотири типи морфології ядер. Перший тип характеризується відносно рівномірним заповненням хромосомами простору ядра, що прилягає до ядерної оболонки. У таких ядрах хромосоми зберігають контакти з периферичними відділами ядра. Надалі цей тип морфології ядер ми позначили буквами ЗК. Другий тип істотно відрізняється тим, що частина хромосом відходить від ядерної оболонки, спостерігаються великі зони на периферії ядра, вільні від хромосом. Цей варіант морфології позначений нами ВК (втрачають контакти). До третього типу ми віднесли ядра, у яких від хромосом відходять довгі тяжі у напрямку до ядерної оболонки і до інших хромосом. Така морфологія ядер у клітинах слинних залоз личинок Ch. thummі була описана раніше і було показано, що до складу тяжів входить ДНК (Quіck, 1980). Ми позначили цей тип морфології буквою Т (тяжі, рис. 1). Останній варіант морфології містить у собі ядра, у яких хромосоми майже цілком втрачають контакти з периферією ядра і злипаються в щільну грудку (ПК, рис. 1). Залози в контролі і після центрифугування відрізняються тільки за частотою трапляння ядер з різною морфологією. В контрольних залозах близько половини ядер представлено типом ЗК (46±4 % для 62 досліджених залоз), а після центрифугування їх трапляння не більш 14 %. Спостерігаються міжхромосомні відмінності за міцністю прикріплення до периферії ядра. Так, як правило, у ядрах типу ПК хромосома ІV, що несе ядерце, зберігає асоціації з периферією ядра, на відміну від інших хромосом (рис. 1).

Щільність упаковки політенних хромосом в ядрах слинних залоз личинок Ch. thummі та її зміни під впливом ряду ендо- і екзогенних факторів. Типи морфології ядер Т і ПК у клітинах контрольних залоз зустрічаються в рідкісних випадках, після центрифугування - набагато частіше. Частота трапляння цих типів залежала від ряду зовнішніх впливів на личинки. Найбільш висока частота трапляння варіанта морфології ядер ПК виявилася в ядрах клітин слинних залоз після центрифугування у личинок в літні місяці досліджень, в осінні і зимові місяці такі ядра зустрічалися відносно рідко. Інкубація личинок при підвищеній і зниженій температурах влітку призводить до достовірного (Р<0.05) зниження частоти трапляння ядер типу ПК (контроль - 42±3 %, +30° - 30±3 %, +9° - 14±4 %). Такий же вплив чинить короткострокове голодання личинок (25±6 %) та інкубація їх у 1%-ному розчині ДМСО (27±7 %), цитотоксичність якого відома для клітин слинних залоз личинок ІV віку Ch. thummі (Berry, Dіetz, 1968).

Найбільшу частоту трапляння ядер типу Т після центрифугування залоз виявлено восени (32±4 %, на відмінність від 11±1 % у червні-липні та 11±2 % у листопаді-лютому). Різке збільшення частоти трапляння таких ядер спостерігалося також при інкубації личинок при підвищених температурах у лютому-квітні (44±4 %) і при знижених - у липні (63±4 %). Оскільки поява тяжів обумовлена зменшенням міцності внутрішнього пакування політенних Хр, то поява ядер типу Т пов'язана із зниженням щільності пакування Хр і, як наслідок, зниженням міцності міжхромосомних зв'язків в порівнянні з контактами Хр із периферією ядра, а поява ядер типу ПК, навпаки, обумовлена більш високою міцністю міжхромосомних контактів, ніж контактів Хр із периферією ядра.

Таким чином, наявні принаймні два елементи у структурі інтерфазного ядра, що можуть забезпечувати упорядкованість розташування політенних Хр - їхні контакти з периферією ядра й контакти між ними, причому останні залежать від міцності пакування політенних Хр. Показано, що екзогенні фактори, такі як зміна сезонів досліджень, хімічні, температурні впливи, призводять до зростання трапляння ядер зі зниженою щільністю пакування політенних Хр (ядра типу Т, рис. 1) і, відповідно, з перевагою міцності контактів Хр із периферією ядра, у порівнянні з контактами Хр одна з одною. Спостерігається також збільшення частот трапляння ядер типу Т на стадії "червоної голови" (табл. 2).

Таким чином, хімічні та температурні фактори, як і різні сезони досліджень за своїми впливами на пакування політенних хромосом і міцність міжхромосомних контактів нічим не відрізняються від змін цих параметрів при онтогенетичній зміні програм генної експресії з переходом від одного личиночного віку до іншого. Тобто, екзогенні фактори не індукують появи якихось нових змін в організації політенних хромосом, які б не траплялися в природних умовах в процесах онтогенезу.

Для того щоб оцінити справедливість отриманих висновків для диплоїдних клітин, далі було виконано дослідження на лабораторних лініях мишей.

Рівні упорядкованості хромосом у ссавців на прикладі клітин кісткового мозку іn vіvo і клітинних ліній іn vіtro лабораторних ліній мишей

Аналіз взаємного розташування хромосом у метафазних пластинках диплоїдних клітин кісткового мозку у мишей лабораторної лінії BALB/c. Для стабілізації взаємного розташування Хр в інтерфазних диплоїдних ядрах у мишей і збереження цього розташування до мітозу, під час якого можлива ідентифікація Хр, було використано дані Дюлота (Dulout, 1984) про те, що антрацикліновий антибіотик адріаміцин при внутрішньочеревному введенні мишам призводить до появи робертсонівських транслокацій у клітинах кісткового мозку.

Прийнято вважати, що робертсонівські транслокації Хр миші (рис. 2) виникають випадково між зближеними центромерними районами (рис. 3) у межах окремих хромоцентрів інтерфазного ядра при виникненні одно- і дволанцюгових розривів сателітної ДНК (Rattner, Lіn, 1985). Припускаючи, що просторова близкість центромерних районів Хр миші в хромоцентрах інтерфазного ядра може впливати на частоту об'єднань Хр, які виявляються в метафазі, ми спробували оцінити частоти залучення в такі міжхромосомні об'єднання індивідуальних Хр миші.

У мишей через 23 год після ін'єкції адріаміцину частота трапляння таких метафаз виявилася у середньому на мишу 32±3 %. Вивчено 867 метафаз, всього в міжхромосомних об'єднаннях за типом робертсонівських транслокацій (далі РБ) брало участь 657 Хр, при цьому виявлено 149 варіантів сполучення різних Хр в об'єднаннях. У жодній із клітин не спостерігали об'єднань гомологічних Хр. Спостерігається перевищення частот об'єднань окремих Хр щодо очікуваних, виходячи з припущення про випадковість і рівноймовірності об'єднання даної Хр із будь-якою іншою з 19 можливих (1/19, 5,3 %) в ряді випадків ця величина перевищує очікувану в одвічі рази і більше. Усього таких варіантів асоціацій 58, Хр 15 виявилася партнером, якому надається перевага, в об'єднаннях для 8 з 19 Хр.

Отримані дані про участь Хр у міжхромосомних асоціаціях в метафазних клітинах кісткового мозку дозволяють стверджувати про наявність таких закономірностей поводження Хр в інтерфазних ядрах: 1) гомологічні Хр не поєднуються одна з одною; 2) у міжхромосомних об'єднаннях можуть брати участь усі Хр без винятку; 3) Хр відрізняються одна від одної за частотою участі в міжхромосомних об'єднаннях; 4) для кожної Хр існують партнери для об'єднання, яким надається перевага; 5) число таких партнерів для різних Хр різне; 6) майже для половини всіх Хр одним з партнерів, яким надається перевага, є Хр 15.

Очевидно, у інтерфазних диплоїдних ядрах у визначених клітинних популяціях строго контролюється взаємне розташування тільки деяких Хр, а зміна стадії диференціювання клітин супроводжується і зміною набору хромосом, чиє положення контролюється. Таким чином, просторове положення окремих Хр може бути і строго визначеним, і відносно випадковим, як це спостерігалося й у ядрах з політенними Хр, наприклад, досить визначене взаємне розташування політенних хромосом І, ІІ, ІІІ у клітинах слинних залоз Ch. thummі і випадкове по відношенню до них ядерцеутворюючої хромосоми ІV.

Найбільш строгим елементом порядку хромосом у досліджених метафазах кісткового мозку мишей виявилася відсутність об'єднань гомологічних Хр по центромерних районах, що дозволяє припустити їхню роз'єднаність у хромоцентрах інтерфазного ядра, де такі об'єднання виникають (рис. 2, 3). Серед клітин кісткового мозку нами була також виявлено метафазну пластинку, представлену гаплоїдним набором хромосом (рис. 4).

Сама можливість виникнення такої пластинки підтверджує припущення про відносну автономність гаплоїдних наборів у клітинах кісткового мозку мишей, так само як і отримані нами дані про відсутність злиття між гомологічними хромосомами в хромоцентрах інтерфазних ядер.

Ідея про те, що гаплоїдні геноми можуть бути роз'єднані у просторі інтерфазного ядра диплоїдних клітин рослин, була сформульована М. Беннеттом у 1984 р. і одержала певне підтвердження в клітинних лініях людини (Nagele et. al., 1995), однак універсальність такої роз'єднаності і нині залишається не доведеною. Існують дані, що спонтанне формування робертсонівських транслокацій між гомологами хромосоми 11 виявлено в ембріональних стовбурних клітинних лініях мишей, що пройшли культивування іn vіtro (Crolla et al., 1990). Можна очікувати, що для мишей роз'єднаність гаплоїдних наборів хромосом, яка спостерігається нами в клітинах кісткового мозку, зникає при їхньому культивуванні в штучних умовах.

Для того щоб оцінити можливі функціональні, фенотипові наслідки появи різних типів цитогенетичних аномалій, зв'язок останніх з міжхромосомними асоціаціями, далі ці явища розглянуто в клітинних популяціях мишей різного походження.

Мінливість різних цитогенетичних характеристик у процесі спонтанної неопластичної еволюції ембріональних фібробластів мишей ліній СЗН/Не, C57BL/6, СВА/Са іn vіtro. Виконано аналіз міжхромосомних взаємин і каріотипової мінливості у 15 ліній і субліній ембріональних фібробластів, отриманих від трьох ліній мишей, C57BL/6, C3H/He, CBA/Ca. Аналіз розмаху мінливості і модального числа Хр у досліджених клітинних популяціях показав, що менш за все число Хр варіює в клітинах клональних субліній. Найменшу частоту клітин з однаковим числом Хр виявлено в сублініях, які знаходяться в процесі адаптації до умов іn vіtro, а максимально пухлиноспоріднені FBL2/vl2 і FC3H3/v7 - у процесі адаптації до умов росту іn vіvo. Трохи меншою гетерогенністю за числом Хр відрізняються лінії і сублінії, які найдовше пасирувалися в умовах іn vіtro. Для них характерні найменші значення часток клітин з рідкісними й унікальними варіантами чисел Хр. Каріотипова стабільність клітин характеризується також частотою трапляння перебудованих Хр. У клітинних лініях мишей виявляються два варіанти перебудованих Хр: двоплечі, що виникають у результаті робертсонівських транслокацій, і акроцентричні. У досліджених нами клітинних популяціях чітко розрізнялися два типи акроцентричних Хр: великі, що ідентифікуються, і невеликі, які не ідентифікуються, за розміром близькі до найменшої Хр миші - Хр 19.

У ході пасування клітинних популяцій іn vіtro акроцентричні перебудовані Хр накопичувалися з різною швидкістю: маленькі Хр значно повільніше (чи активніше віддаляються з клітин), ніж великі. Середня частка не перебудованих Хр у клітині варіює незначно і просліджується генотипова компонента контролю цього показника. Так, у 8 лініях і сублініях, отриманих з фібробластів мишей СЗН/Не, частка неперебудованих Хр на клітину варіювала від 85 до 95 % (у середньому 93 %); у 4 сублініях, отриманих від мишей СВА/СА - від 74 до 86 % (у середньому 80 %); у 3 сублініях мишей C57BL/6 - від 83 до 86 % (у середньому 85 %).

Виявлено, що в клітинних популяціях іn vіtro розповсюдженим явищем є присутність різних типів ізохромосом - результатів робертсонівських транслокацій між гомологами. На відміну від клітин кісткового мозку мишей формування робертсонівських транслокацій між гомологами є частим явищем при культивуванні клітин іn vіtro. Отримані дані дозволяють припускати наявність змін міжхромосомних взаємин при різних умовах росту (іn vіvo і іn vіtro). У зв'язку з цим ми оцінили частоту трапляння асоціацій між гомологами Хр не за центромерними районами, а за іншими ділянками. Хр вважалися асоційованими при наявності видимого контакту між ними. Далі для зручності, асоціації між хромосомами за центромерними районами щодо типу роберсонівських транслокацій (рис. 2) ми позначали як РБ, а асоціації між гомологами за іншими ділянками як АГ. Для порівняння визначено також частоту трапляння АГ у клітинах кісткового мозку мишей C57BL/6, СВА/Са і СЗН/Не. Частка клітин з АГ щодо клітин кісткового мозку мишей різних ліній іn vіvo виявилася сталою. Встановлено, що в клітинах кісткового мозку мишей у таких асоціаціях, як правило, беруть участь різні Хр, найчастіше Хр 2, 3, 5, 6, 10, 15, 16, 17 і 19. Клітинні лінії, навпаки, помітно відрізняються одна від одної за частотою трапляння клітин з АГ. Найбільш часто такі асоціації виявлялися в лініях FC3H5, FC3H8 і в клонованій сублінії FC3H3/4-M, які характеризувалися найбільшою стабільністю за ознакою пухлиноспорідненості в процесі культивування і клонування (Гувакова, Лавровский, 1992). Таким чином, частота АГ також може правити за характеристику каріотипу клітинних ліній. При цьому частота трапляння метафаз з АГ виявляється не пов'язаною з іншими характеристиками мінливості каріотипу клітинної популяції, такими як утворення різноманітних перебудованих Хр і частота виникнення поліплоїдних клітин, однак вона помітно вища в клітинних популяціях з відносно стабільним фенотипом, зокрема, щодо пухлиноспорідненості. Можна чекати, що асоціації гомологічних Хр сприяють більш стабільному розподілу деяких з них між дочірніми клітинами, забезпечуючи, таким чином, збереження фенотипу за окремими ознаками.

Клональні сублінії, як правило, відрізняються від батьківських клітинних популяцій за двома параметрами: більшою частотою акроцентричних перебудованих Хр і більшою часткою клітин з однаковим числом Хр, тобто мінливість числа Хр у клітинній популяції не є наслідком активації хромосомних перебудов. Про відносну незалежність механізмів контролю числа і якісного складу Хр свідчать також дані про те, що в клітинних популяціях загального походження (отриманих від мишей однієї лінії) частки неперебудованих Хр на клітину близькі, незважаючи на значні розходження щодо загального числа Хр. Крім того, виявлено, що в групах ліній різного походження, які відрізняються за кількістю і динамікою виникнення перебудованих хромосом, при зростанні пухлиноспорідненості спостерігаються закономірні зміни копійності неперебудованих хромосом 5 і 6. В усіх високопухлиноспоріднених сублініях копійність хромосоми 5 була достовірно вищою (від Р<0,001 до Р<0,05), а хромосоми 6 - достовірно нижчою, ніж в батьківських сублініях, проміжних за пухлиноспорідненістю (табл.3).

Таким чином, на підставі вищевикладеного можна вважати, що мінливість щодо числа копій неперебудованих Хр (анеуплоїдія) є більш важливим явищем в неопластичній еволюції ембріональних фібробластів миші, ніж поява різних перебудов Хр. Більшість таких перебудов, очевидно, виникають в результаті випадкових процесів і є "генетичним вантажем".

Аналіз зв'язків між фенотиповою і хромосомною мінливістю ембріональних фібробластів мишей різних ліній у процесі спонтанної неопластичної еволюції. Широка фенотипова мінливість є відмінною рисою пухлинних клітин. Разом з тим існує низка фенотипових ознак, які визначають трансформований фенотип і використовуються для прогнозу пухлиноспорідненості клітин, оскільки тісно пов'язані з нею. До таких ознак відносяться залежність росту клітин від субстрату, від ростових сироваткових факторів, чутливість до контактного гальмування (Straus et al., 1977; Fry et al., 1988). Часто з пухлиноспорідненістю клітин зв'язують їхню чутливість до лізису макрофагами (МФ) і природними кілерними клітинами (ЕКК) (Woodruff, 1986). Однак регулярність зв'язків стандартних ознак трансформованого фенотипу (СОТФ) один з одним, з каріотиповою мінливістю й пухлиноспорідненістю клітин залишається недослідженою. Виконано аналіз кореляційних зв'язків між мінливістю перелічених СОТФ і кількістю копій неперебудованих Хр на розглянутих вище клітинних популяціях ембріональних фібробластів мишей ліній C57BL/6, C3H/He, CBA/Ca. За усіма сублініями розраховано коефіцієнти кореляції між змінами кожного СОТФ і копійністю неперебудованих Хр (копійність окремої неперебудованої Хр оцінювали як відношення кількості копій даної Хр до загальної кількості Хр у метафазі у відсотках). Виявлено, що зміни кожного СОТФ позитивно корелювали зі змінами копійності не менш двох Хр із коефіцієнтом кореляції понад 0,400. Для кожної ознаки знаходилася група Хр, копійність яких корелювала зі змінами ознак позитивно і негативно з достовірними значеннями коефіцієнтів кореляцій (табл. 4). Розрахунок коефіцієнтів кореляцій між змінами копійності різних неперебудованих Хр свідчить про існування складних міжхромосомних взаємозв'язків. З огляду на те, що зміни СОТФ корелювали зі змінами копійності 15 хромосом, окрім Хр 2, 5, 9, 14 і 19 (табл. 4), кількість копій яких, у свою чергу, знаходяться в складних корелятивних взаєминах з копійністю інших Хр, очевидно, що зміни СОТФ сполучені зі змінами копійності (по суті генних доз) практично усіх Хр. Приклад таких зв'язків представлено на рис. 5.

Таблиця 4 Кореляція копійності хромосом зі змінами стандартних ознак трансформованого фенотипу (СОТФ) у лініях і сублініях FC3H3, FBL2 і FCBA2 (P<0,05).

Виразність таких ознак пухлинного фенотипу, як чутливість до макрофагів і природних кілерів, у клітинних популяціях ембріональних фібробластів, що знаходяться на різних стадіях неопластичної еволюції, корелює з відмінностями між цими популяціями за кількістю копій неперебудованих хромосом 6,10, 4 і 1, 10, 7, 12 (табл.4), копійність яких всередині досліджених популяцій корелює з кількістю копій всіх інших неперебудованих хромосом (рис. 5.). Оскільки, як уже відзначалося вище, клітинні популяції, що походять від мишей різних ліній, істотно відрізнялися одна від одної за кількістю перебудованих хромосом, одержані дані свідчать на користь твердження про те, що еволюція клітин іn vіtro головним чином, пов'язана зі зміною кількості копій неперебудованих хромосом (анеуплоїдією). Крім того, множинні кореляції між різними хромосомами, що спостерігалися нами (рис. 5), є прямим експериментальним підтвердженням класичного положення С.С. Четверикова про те, що у добір за фенотиповими ознаками залучається весь геном.

Закономірності міжхромосомних взаємин у клітинних лініях мієлом миші лінії BALB/c і одержаних на їхній основі міжвидових гібридом (миша х норка). Наступною моделлю, на якій виконувалися дослідження зв'язку міжхромосомних взаємин і мінливості фенотипу клітинних популяцій, була група ліній і субліній, отриманих шляхом соматичної гібридизації між клітинами мієлом миші лінії BALB/c і спленоцитами норки (Mustela vіson, Schr; Carnivora, Mustelidae).

Виконано каріотипування трьох ліній мієлом та семи ліній і субліній міжвидових гібридом. Варіанти клональних ліній гібридом виявилися схожими між собою і помітно відрізнялися від клітин мієлом миші великим модальним числом Хр, кількістю нормальних Хр миші (понад 50), набором перебудованих порівняно великих Хр мишачого походження, числом невеликих Хр, що не типуються (13-17), і частотою трапляння різних типів мета- і субметацентричних Хр мишачого походження. За копійністю ряду неперебудованих Хр миші гібридомні лінії також були більш схожими одна на одну, ніж на батьківські мієломи. У клітинах лінії GN1 (активний продуцент імуноглобулінів норки) Хр норки, в основному, представлено матеріалом Хр 1 норки і ізохромосоми 14 норки. Спостерігалися відмінності морфології Хр 1 норки у гібридомних лініях GN3 і GN4 і в клітинах ліній GN1 і GN2. За своєю округлою морфологією теломерний район короткого плеча Хр 1 норки в лініях GN1 і GN2 практично не відрізнявся від "шапочки" перицентромерного гетерохроматину нормальних Хр миші. Це спостереження дозволило нам припустити, що в клітинах - попередниках гібридомної лінії GN1 відбулася транслокація перицентромерної ділянки Хр миші на Хр 1 норки. Цікаво відзначити, що в цій лінії, де найчастіше трапляється матеріал Хр 1 і 14 норки, ізохромосома 14 норки у понад 20 % метафазних пластинок лежить окремо від основної маси Хр на відміну від зміненої Хр 1 норки. Число копій зміненої Хр 1 норки на метафазну пластинку не перевищувало 1-2, а ізохромосоми 14 норки - варіювало від 1 до 14, тобто ізохромосома 14 норки поводилася як хромосома, що позбавлена центромерного району.