Роль ентомопатогенних бактерій bacillus thuringiensis у формуванні стійких агроекосистем

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

УДК 579.26:579.64:632. 937.1

Роль ентомопатогенних бактерій Bacillus thuringiensis У формуванні стійких агроекосистем

03. 00. 16 - екологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

ПАТИКА ТЕТЯНА ІВАНІВНА

КИЇВ - 2001

 Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії технічної мікробіології Південного філіалу Інституту сільськогосподарської мікробіології Української академії аграрних наук.

Науковий керівник - кандидат біологічних наук,старший науковий співробітник НАДКЕРНИЧНИЙ Станіслав Петрович

Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН, завідувач лабораторії мікробіометоду

Офіційні опоненти -доктор сільськогосподарських наук, професор, академік УААН Тараріко Олександр Григорович

Інститут агроекології і біотехнології УААН завідувач відділенням агроекології - доктор біологічних наук, професор ГВОЗДЯК Ростислав Ількович

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАНУ, завідувач відділу фітопатогенних бактерій

Провідна установа - Інститут захисту рослин УААН

Захист дисертації відбудеться 21.12.2001 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.02 при Національному аграрному університеті за адресою: 03041, Київ, вул. Героїв Оборони 15, навч. корп. 3, ауд. 65.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, Київ, вул. Героїв Оборони 15, навчальний корпус 10.

Автореферат розісланий 20.11.200 1 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Менджул В.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останній час при розробці заходів захисту рослин з успіхом застосовується інтегрований підхід, який передбачає використання засобів контролю за екосистемами, що базуються на природних взаємовідношеннях видів. Це новий варіант концепції “управління шкідників”, розроблений ще на початку ХХ століття, але забутий у зв'язку з бурхливим розвитком хімічних засобів захисту рослин (Кандибін, 1989; 1991). Сьогодні перспективним вважається екологічний підхід, який передбачає оптимальну комбінацію біологічних, агротехнічних, селекційно-генетичних, хімічних та інших методів, спрямованих проти комплексу шкідників та хвороб сільськогосподарських культур. Найбільш вагомою ланкою в ланцюгу екологічного підходу є біометод, зокрема використання біопрепаратів на основі ентомопатогенних бактерій групи Bacillus thuringiensis як природних паразитів шкідливих комах, яким належить важлива роль у формуванні стійких агроекосистем.

При сучасній зацікавленості у попередженні забруднення навколишнього середовища і при необхідності розробки програм регулювання чисельності шкідників B. thuringiensis є одним з небагатьох доступних для цієї мети агентів, який ефективний проти чисельних видів шкідливих комах із загонів Lepidoptera, Hymenoptera, Diptera, Coleoptera і водночас не токсичний для інших (корисних) комах, рослин, риб, теплокровних тварин та людини (Митрофанов та ін., 1997).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відповідності до завдань науково-технічної програми (НТП) “Родючість ґрунтів” підпрограми “Сільськогосподарська мікробіологія” на 1996 - 2000 рр. і завдання Південного філіалу Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН “Розробити високоефективні технології застосування мікробних препаратів у відновлювальних ресурсозберігаючих системах землеробства в зонах Степу і Півдня України” ( державний номер реєстрації 0198U005046 ).

Мета і завдання дослідження. Метою наших досліджень було одержання нових високоефективних і технологічних штамів ентомопатогенних бактерій групи Bacillus thuringiensis,вивчення ролі даних мікроорганізмів у формуванні стійких агроекосистем, створення на їхній основі біопрепаратів та вивчення ефективності новостворених препаратів як засобів захисту рослин від колорадського жука і капустяної совки.

Для досягнення поставленої мети було визначено основні завдання наших досліджень:

виділити з природних популяцій комах ентомопатогенні кристалоносні бактерії і отримати їхні чисті культури;

вивчити культурально-морфологічні і фізіолого-біохімічні властивості виділених штамів ентомопатогенних бактерій та ідентифікувати їх;

відібрати ефективні проти колорадського жука і технологічні штами;

визначити оптимальні умови культивування і склад поживних середовищ для вирощування нових штамів B. thuringiensis;

розробити рідку і пастоподібну препаративні форми на основі високоефективних та технологічних штамів B.s thuringiensis;

вивчити ефективність використання новостворених препаратів проти колорадського жука ( Leptinotarsa decemlineata), капустяної совки ( Barathra brassicae );

вивчити вплив препаратів B. thuringiensis на бджіл.

Наукова новизна одержаних результатів. Новизною проведеної наукової роботи є створення відсутніх на даний час вітчизняних мікробіологічних препаратів на основі бактерій групи B. thuringiensis, що дозволить значно посилити інтегровану систему захисту рослин від листогризучих шкідників і звести до мінімуму використання хімічних інсектицидів. ентомопатогенний бактерія штам колорадскьий

Діючу основу препаратів складають оригінальні штами бактерій, виділені в південних регіонах України, які за ентомоцидною дією і технологічністю перевищують виробничий (стандартний ) штам 98.

Створено дві форми препарату на основі B. thuringiensis 0239 (рідкий концентрат, паста) з економічними і безпечними для рослин і тварин стабілізуючими добавками. Використання даного препарату забезпечує надійний захист рослин від колорадського жука і капустяної совки та благополуччя довкілля.

Практична цінність і реалізація результатів роботи. Значний інтерес і цінність для практики представляє створений на основі ентомопатогенних кристалоносних бактерій Bacillus thuringiensis препарат для захисту рослин від колорадського жука та капустяної совки з ефективністю 80-97 % і терміном зберігання до одного року.

Дані препарати забезпечать зниження чисельності шкідливих комах в агроценозах до безпечного рівня і в кінцевому результаті значно зменшать частку хімічних обробок та оздоровлять навколишнє середовище.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом проаналізована відповідна література, отримано нові високоефективні і технологічні штами B.thuringiensis, створено на їх основі препарат, проведено лабораторні, вегетаційні та польові дослідження, аналіз і теоретичне обґрунтування одержаних результатів, зроблено відповідні висновки при сприянні співробітників лабораторії технічної мікробіології ПФ ІСГМ УААН.

Апробація роботи. Основні положення і окремі розділи роботи розглядались і схвалені на таких рівнях: науково-практичній конференції “Проблеми наукового забезпечення агропромислового виробництва” (м. Одеса, 1999 р.); науково-практичній конференції молодих вчених “ Наукове обґрунтування сталого розвитку агроекологічних систем Чернігівщини в ринкових умовах і обмеженого ресурсного забезпечення” (м. Чернігів, 1999 р.); науково-практичному семінарі молодих вчених та спеціалістів “ Вчимося господарювати “ (м. Київ - Чабани, 1999 р.); на засіданнях методичної комісії, вченої ради ПФ ІСГМ УААН ( 1996 - 2000 рр.) та вченої ради ІСГМ УААН ( 1998 - 2000 рр.), методичній комісії ІАБ УААН (2001 р.).

Публікації. Наукові результати з теми дисертації опубліковано в 15 друкованих роботах, з яких 8 статей опубліковано у провідних наукових виданнях.

Структура і обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 124 сторінках машинописного тексту, містить 32 таблиці,9 малюнків; складається з вступу, 6 розділів, рекомендацій виробництву, висновків і додатків. Список використаних джерел включає 201 найменування, в тому числі 57 іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі дано загальну характеристику роботи, розкрито сутність і стан наукової проблеми та її значення, обґрунтовано актуальність теми, поставлені мета та задачі дослідження, розкрито наукову новизну та практичне значення результатів, охарактеризовано об'єкти та методи досліджень.

У першому розділі подається огляд літератури з питань бактеріального методу боротьби зі шкідливими комахами. Розглядаються фізіолого-біохімічні ознаки і токсиноутворення ентомопатогенних бактерій Bacillus thuringiensis, механізм їх дії. В ході аналізу наукової літератури показано необхідність використання біопрепаратів на основі Bacillus thuringiensis в інтегрованій системі захисту рослин.

У другому розділі викладена загальна методика й основні методи дослідження.

Дослідження проводились в лабораторії технічної мікробіології Південного філіалу Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН, на дослідних полях Південного філіалу і КСП “Гвардейский” Сімферопольського району АР Крим, в дослідному господарстві ІСГМ УААН, Інституті бджільництва УААН.

Ентомологічним об'єктом для виділення нових штамів ентомопатогенних мікроорганізмів групи Bacillus thuringiensis були хворі і загиблі комахи, зібрані в різних регіонах України (в Кримській, Херсонській, Миколаївській, Одеській, Запорізькій областях ).

Вивчення ефективності використання ентомопатогенних бактерій проти комах проводилось згідно “ Методическим рекомендациям по изучению микроорганизмов - регуляторов численности опасных насекомых и клещей “ (1984 ).

Морфологію вегетативних та спорових форм бацил вивчали за методиками, наведеними в роботі В. А. Смирнова (1962 ).

Таксономічне положення бактерій визначали за схемою ідентифікації Barjac, Bonnefoi (1968) і Lysenco (1963), яка дозволяє порівнювати нові штами з типовими культурами кристалоутворюючих бацил, виявляти їх фізіологічні і біохімічні властивості. Як типовий при ідентифікації був використаний штам B. thuringiensis 98 першого серотипу.

Кількісний облік бактерій проводили за загальноприйнятими у мікробіології методиками.

Мінливість Bacillus thuringiensis 0239 в залежності від умов тривалого зберігання вивчали за методами Н. М. Барбашової, Г. А. Владимирової, О. П. Єрмолової (1979 ), використовуючи метод тонкошарової хроматографії з АТФ- мітчиком.

Наявність спор і екзотоксину B. thuringiensis в біопрепараті та збереження інсектицидних компонентів на листях картоплі проводили мікробіологічними методами, хроматографуванням на пластинах “Сілуфол -254” в системі пропанол- аміак -вода з використанням хроматоскопа.

Вплив інсоляції на збереження спор B. thuringiensis на листях картоплі вивчали методом водних змивів ("Методы экспериментальной микологии", 1982 ).

Вплив біопрепаратів B. thuringiensis на шкідників картоплі і капусти вивчали в умовах лабораторних, лабораторно-польових, польових та виробничих дослідів. При проведенні досліджень керувались методиками польового досліду Б. О. Доспєхова (1985 ) та методиками А. А. Євлахової, О. І. Швецової ( 1965 ), В. П. Приставко, В. М. Гораль (1968 ).

Для визначення ентомопатогенних властивостей досліджуваних штамів як біотест використовували личинки колорадського жука ( L. decemlineata ) молодшого віку. Кормом для личинок слугували листя картоплі, які обробляли споровою суспензією штамів. В лабораторних дослідах титр спор такої суспензії складав 100 млн. в 1 мл, в польових - 200 млн. в 1 мл. Ефективність штамів визначали за кількістю загиблих личинок на 3-тю, 5-ту, 7-му і 10-ту добу досліду.

Вивчення дії пастоподібного біопрепарату B. thuringiensis різних концентрації (0,1%, 0,5 %, 1%, 2,5%, 5% ) на капустяну совку (B. brassicae ) проводили на гусеницях різного віку. Кормом для гусениць слугували листя капусти, які обробляли суспензією біопрепарату відповідної концентрації. Ефективність препарату визначали за кількістю лялечок, що утворилися, та їх масою.

При вивченні впливу B. thuringiensis на бджіл використовували цукровий сироп, в який добавляли пастоподібний препарат в концентраціях 0,1%, 0,5%, 1,0%, а також проводили обробку рослин гречки препаратом.

Оптимізацію складу живильних середовищ та умов культивування для вирощування нових штамів B. thuringiensis здійснювали за методом математичного планування експерименту В. І. Максимова, В. А. Федорова ( 1969 ).

Виділення біомаси мікроорганізмів B. thuringiensis з культуральної рідини проводили шляхом центрифугування ( В. І. Яковлєв (1987 ), М.В.Фомченко (1992 ), Ф. Ю. Рачинський, М. Ф. Рачинська (1982 ).

Одержані результати досліджень обробляли методами математичної статистики ( Доспєхов, 1985; Плохінський, 1970; Лєскова, 1984 )

Методичні питання, які не мають загального характеру, розглянуті у відповідних розділах дисертації.

У третьому розділі наведені результати культурально-морфологічних і фізіолого-біохімічних ознак бактерій групи B. thuringiensis.

Виділення нових штамів ентомопатогенних бактерій проводили з хворих і загиблих комах природних популяцій різних регіонів Півдня України. Комахи визначені як представники рядів твердокрилих ( Coleoptera ), лускокрилих (Lepidoptera ), двокрилих (Diptera ). В ході мікробіологічного їх аналізу виділено 14 ізолятів, серед яких за морфологічними ознаками бактеріальних клітин і колоній, а також за наявністю спор та параспоральних тілець для подальших досліджень було відібрано 5 штамів (табл. 1) Bacillus thuringiensis (0161, 0230, 0234, 0236, 0239 ).

Методом фазово-контрастної мікроскопії встановлено, що вегетативні клітини бактерій, які вивчаються, являють собою рівні або злегка звивисті палички, частіше зібрані у ланцюжки, мають перитрихіально розташовані джгутики. Спори - субтермінальні, кристали ендотоксину знаходяться у протилежному кінці клітини - спорангії.

Доведено,що досліджувані штами здатні відтворювати ацетил-метил-карбінол і лецитиназу, виявляють високу спроможність до гідролітичного розщеплення крохмалю. Зона гідролізу складає 4 - 6 мм. Як джерело вуглецю засвоюють сахарозу, маннозу, саліцин, ескулін.

Таблиця 1. Фізіолого-біохімічні властивості бактерій групи Bacillus thuringiensis.

№ штаму

Серотип

Утворення

Гідроліз

Засвоєння

Редукція нітратів N03-No2

Реакція з яєчним жовтком

Наявність екзотоксину

А М К

Лецитинази

Уреази

Вуалі

Пігменту

Індолу

Кислоти з арабінози, манніту

Крохмалю

Желатини

Сахарози

Ескуліну

Маннози

Саліцину

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

Станд-

1

+

+

-

+

-

-

-

+

+

+

++

++

+

+

+

+

арт98

0161

1

+

+

-

+

-

-

-

+++

+

++

+++

+

+

+

+

+

0230

Н.0.

+

+

-

+

-

-

-

+++

+

++

+++

+

+

+

+

-

0234

1

+

+

-

+

-

-

-

+++

+

+

+++

+

+

+

+

+

0236

Н.О.

+

+

-

+

-

-

-

+

+

+

+++

+

+

+

+

-

0239

1

+

+

-

+

-

-

-

+++

+

+

+++

+

+

+

+

+

Примітки: 1 + реакція позитивна; 2 - реакція негативна; 3 - н.о. - належність штаму до серотипу не визначена.

Штами володіють протеолітичною активністю, яка виявляється при розрідженні желатини і пептонізації казеїну молока. Не утворюють уреазу, пігментів. При рості на МПБ відмічено наявність вуалі. Добре росте в середовищах з органічним азотом ( МПА ), солями амонію.

Ріст бактерій при посіві штрихом на МПА - сірувато-кремовий. Культури швидкоростучі. Колонії на поверхні МПА з'являються на другу-третю добу, мають округлу форму,матові, в'язкі. На твердих та рідких середовищах штами B. thuringiensis ростуть в межах 20 - 45⁰С, а температурний оптимум 28 - 30 ⁰С.

Ріст бактерій спостерігається в діапазоні рН 6, 8 - 8, 6, а оптимальною є реакція середовища 7,0 - 7,6. Ознаки штамів стійкі. Вони патогенні для листогризучих комах - шкідників і безпечні для рослин, корисних комах, теплокровних тварин і людини.

Всі визначені фізіолого-біохімічні показники (табл.1) відповідають показникам штаму 98, що дозволило штами 0161, 0234 і 0239 попередньо віднести до B. thuringiensis першого серотипу.

Ефективність застосування отриманих штамів проти личинок колорадського жука вивчали в порівнянні з виробничим штамом B. thuringiensis 98, що використовувався як стандарт. Одержані дані польових досліджень представлені в табл. 2 .

Таблиця 2. Ефективність використання штамів B. thuringiensis проти личинок колорадського жука молодшого віку ( польовий дослід )

Штам	Титр спор млн / мл	Загибель по днях обліку, %
		3	5	7	10
Контроль (без обробки)	-	0	0	0	1,3+0,3
Стандарт 98	100 200	33,3+0,3 42,0+0,7	82,0+1,0 90,6+1,4	89,0+1,0 99,3+1,4	96,0+1,4 100+0,0
0161	100 200	28,7+1,0 33,6+0,3	56,0+1,4 70,4+0,7	65,0+1,7 78,8+0,7	77,9+1,0 87,4+0,7
0230	100 200	27,3+1,0 41,3+0,7	58,0+1,0 64,0+1,7	63,3+1,0 76,7+1,0	85,0+1,0 92,6+0,7
0234	100 200	35,3+0,3 56,0+1,4	78,7+0,7 91,3+1,0	89,0+1,0 96,0+1,4	90,0+0,7 99,3+1,4
0236	100 200	16,0+0,3 34,6+0,3	21,3+0,3 44,6+0,7	50,6+1,0 68,6+1,4	85,3+1,0 90,0+1,0
0239	100 200	38,6+0,7 54,0+0,7	86,0+0,7 90,0+1,0	90,0+1,0 97,3+0,7	96,0+1,4 100+0,0

Наведені результати свідчать, що штами, які вивчалися, володіють досить високою ентомопатогенною дією щодо личинок колорадського жука молодшого віку (1-2), їх ефективність в лабораторному досліді складала 79 - 100 %, в польовому - 78 -100 %.

Вивчення токсигенного потенціалу отриманих штамів показало, що вони здатні утворювати як ендотоксин, так і екзотоксин, а за інтенсивністю процесу токсиноутворення нові штами значно перевершують виробничий (стандартний). Так, при культивуванні B. thuringiensis 0234 i B. thuringiensis 0239 в культуральній рідині екзотоксину накопичувалось в 1,5 рази більше, ніж при вирощуванні B. thuringiensis 98.

Таким чином, в результаті проведення досліджень нами одержано нові високоефективні і технологічні штами ентомопатогенних бактерій ідентифікованих як B. thuringiensis 0234 і B. thuringiensis 0239, які заслуговують на увагу як перспективні біоагенти для створення на їх основі препаратів проти широко поширених шкідників - колорадського жука та капустяної совки.

В четвертому розділі наведені результати досліджень технологічного процесу виробництва препаративних форм на основі B. thuringiensis.

Проведено дослідження щодо визначенню умов одержання якісного спорового посівного матеріалу, оптимізації середовищ і параметрів культивування нових перспективних штамів B. thuringiensis для розробки технології одержання їх препаративних форм.

Оптимізація умов культивування і складу живильних середовищ для вирощування нових штамів Bacillus thuringiensis. При підборі живильних середовищ для культивування одержаних штамів ентомопатогенних бактерій було встановлено, що B. thuringiensis 0234 і 0239 добре ростуть і спороносять на багатьох відомих живильних середовищах, які використовуються на виробництві. Так, ріст штаму В. thuringiensis 0239 на рідкому дріжджополісахаридному середовищі (ДПС) характеризувався короткою лаг-фазою і швидким досягненням зрілості культури (фаза спороутворення). Титр клітин в експоненціальній фазі росту зростав від 0,5 - 3,5 млрд. в 1 мл, відповідно на 16-ту і 32-гу годину після інокуляції. Максимальний титр клітин (3,9 млрд. в 1 мл) спостерігався упродовж 16 годин і поступово знижувався після 2 діб росту. В процесі культивування значення рН середовища змінювалось від 7,8 до 7,2 упродовж 12 годин з наступним підвищенням до 8,8.

Отже, ДПС забезпечує оптимальний ріст і розвиток отриманих штамів B. thuringiensis і тому була використана в подальших дослідженнях для одержання посівного матеріалу при розробці препарату на основі штаму B. thuringiensis 0239.

При вирощуванні штаму B. thuringiensis 0239 на мікробіологічних коливалках були визначені оптимальні умови для його росту і розвитку, а саме: частота коливання становила 200 - 220 об./хв., рН середовища 7,6 - 8,0, температура 28 - 32 ⁰С, період культивування 36 - 44 години. Для підвищення виходу термостійких спор і збільшення кількості білкового ендотоксину живильне середовище збагатили білком та вуглецем, замінивши кукурудзяне борошно на соєве і збільшивши кількість меляси.

Методом математичного планування експерименту оптимізували концентрації цих компонентів для збалансування співвідношення С : N, що є одним з основних умов активного спороутворення штамів B. thuringiensis.

Серія експериментів та розрахунки дослідів за методом крутого сходження для визначення оптимальних умов культивування B. thuringiensis 0239 в рідкому середовищі показали, що концентрації живильних ростових речовин, мікроелементів і співвідношення С : N найбільш економічні і сприятливі в середовищі наступного складу: соєве борошно - до 15,8 , меляса - до 10,5 , кукурудзяний екстракт - до 15,1 г/л. Використання даного середовища забезпечило високий вихід спор і кристалів ендотоксину, що досягає 4-6 млрд. в 1 мл.

Одержання нових форм препаратів на основі Bacillus thuringiensis і вивчення їх ефективності. Тривале зберігання культур мікроорганізмів призводить до зниження їх біологічної активності, що спричиняється цілим рядом причин ( через сторонні мікроорганізми, природну мінливість бактерій тощо ).

Вивчаючи вплив стабілізуючих добавок на зберігання біоагентами препаратів їх ентомопатогенних властивостей, а також на збільшення терміну впродовж якого препарати виявляють високу ентомоцидну дію, нами доведена доцільність використання аскорбінової кислоти (антиоксидант), карбоксиметилцелюлози (КМЦ) як стабілізатора білка, хлориду калію і фенолу як антисептиків-антиоксидантів. Застосування вищеназваних речовин значно підвищувало життєздатність спор при зберіганні препарату.

Доведено також, що найбільш сприятливі умови для утворення спор В. thuringiensis 0239 і їх зберігання мали місце при внесенні хлориду калію, аскорбінової кислоти і КМЦ. В цьому варіанті найвищий титр спор зберігався упродовж всього періоду проведення досліду.

Для одержання пастоподібної форми препаратів на основі штамів B. thuringiensis 0239 і В. thuringiensis 98 був підібраний відповідний режим центрифугування культуральної рідини, що дозволило найбільш повно осаджувати спори, кристали ендотоксину та клітини-спорангії.

В результаті отримано препарат, який являє собою пасту вологістю 30 - 33 % з місткістю 21 - 24 млрд. спор і стільки ж кристалів ендотоксину в 1 г препарату. Вміст екзотоксину в новоствореному препараті був на 45-50 % вищий, ніж в препараті на основі виробничого ( стандартного) штаму. Щоб забезпечити збереження високої активності діючої основи препаратів, їх фізичних властивостей: гомогенності, персистентності і адгезійності тощо, були проведені дослідження по визначенню оптимальних доз речовин - стабілізаторів і консервантів, які безпечні для рослин.

Як відомо, при центрифугуванні рідкого концентрату B. thuringiensis термостабільний водорозчинний екзотоксин, в основному, залишається в надосадній рідині, а споро-кристалічний комплекс накопичується в осаді. Представляло інтерес визначення ефективності кожного з цих компонентів діючої основи препаратів. В умовах лабораторного досліду було вивчено ефективність як різних форм препаратів на основі B. thuringiensis 0239, так і компонентів їх діючої основи. Одержані результати (табл.3) свідчать про високу ефективність рідкого концентрату (97.6%), це можна пояснити тим, що в такому випадку виявляється синергічна дія всіх ентомоцидних компонентів препарату ( ендотоксину, екзотоксину, спор та вегетативних клітин ). Використання пасти було менш ефективним через втрату значної кількості екзотоксину.

Таблиця 3. Інсектицидна дія різних форм препарату на основі В.thuringiensis 0239 та складових його діючої основи (біотест -личинки колорадського жука 1-2в )

Варіанти досліду	Загибель комах по днях обліку, %
	3	5	7	10
Контроль (обробка рослин водою)	0	4,0+0,7	4,0+0,7	11,0+1,0
Обробка рослин суспензією спор і кристалів	15,6+0,3	40,0+1,0	48,8+1,5	66,7+1,4
Обробка рослин надосадовою рідиною	22,2+0,3	53,0+0,7	55,6+1,0	71,0+0,7
Обробка рослин пастою	20,0+0,7	42,2+1,4	65,0+1,4	78,0+1,0
Обробка рослин рідким концентратом	25,5+0,7	37,7+1,0	84,3+0,7	97,6+1,4

Ефективність використання експериментальних партій різних форм препарату на основі B. thuringiensis 0239 як засобів захисту картоплі від колорадського жука вивчали в умовах польових дослідів. Випробування проводили в порівнянні з бітоксибациліном (БТБ). Одержані дані узгоджуються з результатами лабораторних дослідів і свідчать про високу ефективність як рідкого концентрату, яка досягала 95 відсотків, так і препарату у вигляді пасти. За ентомоцидною дією обидві форми новоствореного препарату перевершують бітоксибацилін, що використовувався в досліді як стандарт.

Слід зазначити, що препарати на основі ентомопатогенних бактерій групи B. thuringiensis за характером проникнення і первинного ураження належать до засобів кишкової дії, тому для розвитку бактеріальної інфекції в уражених комахах необхідний певний інкубаційний період до 10 - 12 діб, що повинно враховуватись при визначені ефективності даних препаратів. Уражені комахи в інкубаційний період стають малорухомими, перестають їсти, уповільнюється їх ріст, розвиток і через деякий час більшість з них гине.

Таким чином, проведені дослідження дозволили створити новий високоефективний препарат для захисту рослин від колорадського жука на основі ентомопатогенного штаму B. thuringiensis 0239. Розроблено дві форми препарату: рідкий концентрат з титром спор і кристалів 4 млрд./мл і терміном зберігання три місяці; пасту, що містить не менше 20 млрд./г спор і кристалів з терміном зберігання один рік.

Встановлено норми витрат препарату для обробки картоплі проти колорадського жука, а саме: рідкого концентрату 30 л/га, пасти 6 кг/га.

Встановлено, що новостворений препарат - більш ефективний засіб захисту картоплі від колорадського жука, ніж широко відомий бітоксибацилін.

Збереження спор Bacillus thuringiensis в біопрепараті. За роки досліджень у лабораторних умовах вивчався вплив соєвого борошна і хлористого натрію на якість біопрепарату при його тривалім зберіганні.

Хлористий натрій як наповнювач (в концентрації 0,8-1,0% від об'єму культуральної рідини) підвищував збереження спор при зберіганні біопрепарату. Так, через 3 роки в біопрепараті з місткістю хлористого натрію кількість активних спор складає 72,1-95,0% від вихідного титру.

При використанні соєвого борошна збереглося значно менше життєздатних спор, їх число через 3 роки зберігання препарату досягло менш 6,5 - 17,0 %.

Таким чином, використання хлористого натрію як наповнювача забезпечує високу життєздатність спор упродовж тривалого періоду зберігання пастоподібного препарату.

Збереження спор біопрепарату і екзотоксину Bacillus thuringiensis на листях картоплі. Динаміка кількості спор біоагента препарату на листях картоплі (терміном 20 діб після обробки) наведена в табл. 4.

Значне зменшення кількості спор B. thuringiensis спостерігали вже через добу після обробки. На 5 діб - кількість спор зменшилась ще в десять разів і на такому рівні залишалась до десятої доби. Різке зменшення даного показника відмічено через 15 діб після обробки рослин біопрепаратом. Щодо збереження екзотоксину, то, як свідчать одержані дані, екзотоксин зберігається на оброблених рослинах упродовж 5-7 днів.

Таблиця 4. Збереження спор Bacillus thuringiensis на листях картоплі

Строки відбору зразків	Кількість спор біоагента	Сума опадів за 1 добу, мм	Тривалість сонячного сіяння за 1 день, год.
	на 1 г листя, тис.	в % до норми витрат
1	2	3	4	5
День обробки	10000+ 2700	100	=	=
Через добу	4000 + 500	40	2,0	10,4
Через 5 діб	420 + 90	4,2	0,0	11,0
Через 10 діб	400 + 130	4,0	6,0	8,1
Через 15 діб	50 + 11	0,5	0,0	12,5
Через 20 діб	8,7 + 0,9	0,09	0,0	11,2

Вивчення впливу сонячної радіації на збереження спор на рослинах картоплі показало, що під дією сонячної радіації кількість життєздатних спор через добу зменшилась на 70-80%, тоді, як на рослинах захищених від сонця - на 25 - 30%.

Таким чином, одержані результати свідчать про те, що в умовах Півдня України термін зберігання життєздатних спор В. thuringiensis на оброблених рослинах складає 7-10 діб, а екзотоксину - 5-7 діб, що спонукає до повторної обробки рослин препаратом на основі даного біоагента через 7-8 діб.

У п'ятому розділі наведена технологія використання біопрепаратів для захисту картоплі від колорадского жука і капустяної совки. В екологічно безпечних системах захисту сільськогосподарських культур від шкідливих комах домінуюче місце займають біопрепарати на основі бактерій B. thuringiensis. Вони входять до цієї системи з метою зменшення пестицидного пресу на агроценоз.

Вплив препаратів Bacillus thuringiensis на структуру популяції колорадського жука. Вивчена динаміка морфологічних елементів популяції колорадського жука і ефективність дії біопрепаратів B. thuringiensis 98 і 0239. В перші 3 доби після обробки препаратами B. thuringiensis процес зниження чисельності личинок шкідника відбувався повільно, але рослини при цьому личинками не пошкоджувались, що обумовлено антифідантним ефектом, який має контактний характер.

Ефективність біопрепаратів тісно пов'язана з термінами їх використання - при більшій чисельності личинок 1-го - 2-го віку під час обробки спостерігається більш висока ефективність препарату.

Так, ефективність пастоподібних препаратів B. thuringiensis 98 і B. thuringiensis 0239 була найвищою при умові, коли кількість личинок колорадського жука 1-го - 2-го віку складала майже 70% від загальної кількості шкідника на рослинах картоплі (табл. 5).

Таблиця 5. Вплив препаратів В. thuringiensis на личинки колорадського жука

Варіанти	Термін обліку, доба	Чисельність шкідника, штук	% загибелі за днями обліку	Пошкодження рослин,%
		Личинки 1-го -2-го віку	Личинки 3-го -4-го віку	Всього
Хімічний препарат банкол	0 3 7 10	66 10 8 10	59 12 8 3	125 22 16 13	- 84,0+0,3 89,6+0,7 89,6+0,7	15
Стандарт паста ВТ 98	0 3 7 10	44 29 20 14	32 17 10 6	76 46 30 20	- 39,8+0,3 60,5+1,0 73,7+0,3	35
Паста ВТ 0239	0 3 7 10	138 71 60 32	40 30 25 12	178 101 85 44	- 43,3+0,7 52,2+0,3 75,3+1,0	35

В результаті використання препаратів B. thuringiensis 98 і 0239 проти личинок молодшого віку 1 генерації знижується плодовитість і життєздатність жуків не тільки 1-ої, але і 2-ої генерації, проти якої препарати не використовувались. Особини інфікованої популяції, які вижили, відкладають менше яєць, ритм їх харчування і активності порушений, в кінцевому результаті настає відмирання значної частини шкідників і різке зниження загальної чисельності популяції.

Вплив препаратів Bacillus thuringiensis на структуру популяції капустяної совки. Спостереження за тератогенною дією пастоподібного препарату B. thuringiensis на капустяну совку показали, що морфологічна потворність лялечок мала місце частіше всього у тій групі комах, гусениці яких були інфіковані в 3-му віці (рис. 1). При інфікуванні гусениць другого віку потворних лялечок не виявлено. Потворність лялечок завжди проявляється в редукції ротового апарату. Серед контрольних комах морфологічних відхилень не траплялось.

Рис.1. Кількість живих лялечок капустяної совки під впливом біопрепарату B.thuringiensis (дослід: 40 гусениць)

Таким чином, пастоподібний препарат на основі B. thuringiensis ефективний не тільки проти личинок колорадського жука 1-го -2-го віку, але й популяцій капустяної совки. Причому, специфічна дія препарату обумовлена неоднаковою сприйнятливістю до нього личинок і гусениць різних віків та високою чутливістю комах на стадії метаморфозу.

Вплив препаратів B. thuringiensis на бджіл. Пастоподібний біопрепарат на основі B. thuringiensis містить не тільки спори та кристали (ендотоксини), але й термостабільний екзотоксин, наявність якого підсилює ентомоцидний ефект і розширює спектр дії препарату. Дія біопрепарату на корисних комах - важливий показник для гігієно-токсикологічних досліджень. В досліді встановлено, що при обробці рослин гречки пастоподібним препаратом в концентраціях 0,5 -1,0% токсична дія його на бджіл не проявляється. Загибель корисних комах спостерігали тільки при використанні біопрепарату в 3% концентрації, яку практично не застосовують в захисних заходах.

У шостому розділі наводяться результати щодо економічної ефективності використання біопрепаратів B. THURINGIENSIS для захисту картоплі від колорадського жука. Економічно обґрунтовано, що біозахист на основі B. thuringiensis в системі контролю шкідників дозволяє економити і більш раціонально використовувати енергоресурси в сільськогосподарському виробництві, а також знижує собівартість до 7% та підвищує рентабельність на 11-30%.

ВИСНОВКИ

1. З 936 природних популяцій комах Півдня України виділено 14 ізолятів бактерій, 5 із яких є ентомопатогенними кристалоносними штамами з високою (79 - 100 %) ефективністю щодо личинок колорадського жука ( Leptinotarsa decemlineata L.)

2. Високоефективні штами (п'ять) за культурально-морфологічними, фізіолого-біохімічними, серологічними ознаками ідентифіковано як Bacillus thuringiensis var. thuringiensis та передані в депозитарій ІСГМ УААН.

3.Розроблено технологію виробництва біопрепарату на основі високоактивного штаму B. thuringiensis 0239, що дозволяє зберігати життєздатність та функціональну активність бактерій в препараті до одного року.

4.Складено лабораторний регламент отримання рідкого концентрату та пастоподібного препаратів B. thuringiensis 0239. Оптимізовані рідкі виробничі середовища на основі кукурудзяного екстракту, соєвого та кукурудзяного борошна, меляси, кормових дріжджів. В результаті оптимізації титр клітин бактеріальних культур в рідкому концентраті становив 2 - 4 млрд./мл, а в пастоподібному препараті - 20 -24 млрд/г.

5. Вивчено роль стабілізуючих добавок (аскорбінової кислоти, фенолу, КМЦ ) в збереженні біоагентами препаратів ентомоцидної активності, збільшенні терміну зберігання препаратів та визначено оптимальні дози даних речовин для різних форм препаратів.

6. Встановлено норми витрат при використанні препарату В. thuringiensis 0239 проти личинок колорадського жука, які складають 30 л/га рідкого концентрату з титром спор 4 млрд./мл та 6 кг/га пастоподібного з титром спор до 20 млрд/г.

7. В умовах лабораторних, польових і виробничих дослідів проявляється висока ефективність біопрепаратів на личинках колорадського жука молодшого віку. Ентомоцидна ефективність рідкого концентрату біопрепарату складає 90-95%, пастоподібного - 85 - 95%.

8.Біопрепарат В. thuringiensis в різних формах високоефективний щодо капустяної совки. В концентрації 0,5-1,0% згубно впливає на гусениць капустяної совки, кількість загиблих особин досягає 94-98%.

9.Встановлено, що обробка рослин гречки пастоподібним препаратом B. thuringiensis 0239 в концентраціях 0,5-1,0% не впливає на бджіл. Згубна дія препарату мала місце тільки при 3% концентрації, яка не використовується в захисних заходах.

10. Використання біоінсектицидів В. thuringiensis є більш економічно вигідним захисним заходом в порівнянні з хімічними препаратами. Собівартість 1 ц продукції при використанні біопрепарату складає 84 грн., прибуток 8636 грн./га та рівень рентабельності даного заходу - 78,4%, а для банколу економічні показники відповідно становлять: 101,5; 642,5 і 47,8%.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

Значний інтерес для практики сільськогосподарського виробництва становить новий препарат створений на основі високоефективного штаму B. thuringiensis 0239. Розроблено його препаративні форми. Використання такого препарату забезпечить надійний захист рослин від колорадського жука та інших листогризучих шкідників, що сприятиме значному підвищенню урожайності сільськогосподарських культур, поліпшенню якості одержаної продукції та збереженню довкілля від надмірного забруднення засобами хімізації.

Для керівників і спеціалістів сільськогосподарських підприємств розроблені рекомендації “ Комплексне застосування біопрепаратів на основі азотфіксуючих, фосформобілізуючих мікроорганізмів, фізіологічно активних речовин і біологічних засобів захисту рослин “ / Київ, 2000 /, в підготовці яких брала участь і автор даної дисертаційної роботи.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Патыка Т. И., Кузнецова Л. Н., Колбасова В.В., ПатыкаВ.Ф. Физиолого - биохимические и энтомоцидные свойства эффективных штаммов Bacillus thuringiensis // Бюлетень Інституту сільськогосподарської мікробіології. - 1998. - № 2. - С. 21 - 23.

2. Надкерничний С. П., Патика Т. І., Шерстобоєва О. В., Патика В.П. Біометод: підсумки, проблеми, перспективи // Захист рослин. - 1999. - № 6. - С. 2 - 3.

3. Патыка Т.И, Татарин Л.Н.,КузнецоваЛ.Н.,ШерстобоеваО.В., Патыка В. Ф. О технологичности высокоэффективных штаммов Bacillus thuringiensis как основы для производства битоксибациллина // Бюлетень Інституту сільськогосподарської мікробіології. - 1999. - № 4. - С. 33 - 35.

4. Патика В.П.,Шерстобоєва О.В.,Патика ТІ., Мельничук Т.М.,Гармашов В. В., Кислухіна М. В. Мікробіологічні фактори сталого розвитку сучасного ресурсозберігаючого землеробства // Збірник наук. праць “ Аграрний вісник Причорномор'я”. Сільськогосподарські науки. - № 3 / 6 /, ч. 1: агрономія. - Одеса, 1999. - С. 156 - 160.

5. Шерстобоева Е.В.,Патыка Т.И., Кузнецова Л.Н., ТатаринЛ.Н. Биопрепараты против колорадского жука на основе Bacillus thuringiensis // Сб. матер. VIII Междунар. симпозиума “Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье “. - Алушта, 1999 - С. 380 - 382.

6. Богдан С. Д., Машко Н. А., Патыка Т. И. Биотехнология производства биопрепаратов для защиты картофеля от колорадского жука // Сб. науч. трудов Междунар. симпозиума ВПС МОББ.Промышленные технологии производства и применения средств биологизации земледелия. Мониторинг энтомофагов. - 28 сент. - 2 окт. , 1999. - Одесса, 1999. - С. 37 - 38.

7. Шерстобоева Е. В., Патыка Т. И., Кузнецова Л. Н., Татарин Л. Н. Биопрепараты против колорадского жука на основе Bacillus thuringiensis // Сб. научн. трудов Междунар. симпозиума ВПС МОББ. Промышленные технологии производства и применения средств биологизации земледелия. Мониторинг энтомофагов. - Одесса, 1999. - С. 143 - 144.

8. Патыка Т. И. Влияние препаратов Bacillus thuringiensis на динамику морфологических элементов популяции колорадского жука // Матеріали науково - практичного семінару молодих вчених та спеціалістів “ Вчимося господарювати “.- Київ - Чабани, 1999. - С. 5 - 7.

9. Патыка Т. И. Энтомоцидные свойства новых штаммов Bacillus thuringienis // Матер. наук. - практ. конф. молодих вчених “ Наукове обґрунтування сталого розвитку агроекологічних систем Чернігівщини в ринкових умовах і обмеженого ресурсного забезпечення”. - Чернігів, 5 -6 квітня, 1999. - Чернігів, 1999. - С. 58 - 60.

10. Патыка Т. И., Татарин Л. Н. Препараты Bacillus thuringiensis как микробные средства биологизации земледелия // Наук. - виробн. конф. “ Оптимізація структури агроландшафтів і раціональне використання ґрунтових ресурсів”. - Київ, 4 - 7 липня, 2000. - Київ, 2000. - С. 90.

11. Патыка Т. И. Энтомопатогенные бактерии Bacillus thuringiensis как основа инсектицидных препаратов // Бюлетень Інституту сільськогосподарської мікробіології. - 2000. - № 6. - С. 65.

12. Ветрова В. В., Татарин Л. Н., Кузнецова Л. Н., Патыка Т. И. Биопрепарат - битоксибациллин для защиты сельскохозяйственных культур от колорадского жука и других листогрызущих вредителей // Информационный листок № 103 - 98. - Симф.: Крымский РЦНТЭИ, 1998. - 4 с.

13. Патика В.П., Тараріко Ю.О., Мельничук Т.М., Патика Т.І. та ін. //Рекомендації УААН, ІАБ, ІСГМ. “ Комплексне застосування біопрепаратів на основі азотфіксуючих, фосформобілізуючих мікроорганізмів, фізіологічно активних речовин і біологічних засобів захисту рослин. - К.: Аграрна наука,2000.-38 с.

14. Кузнєцова Л. М., Патика Т. І. Штам Bacillus thuringiensis для створення біопрепарату проти колорадського жука . // Вісник аграрної науки. -2001. - № 5. - С. 77.

15. Патика В.П.,Шерстобоєва О.В., Кузнєцова Л.М.,Патика Т.І., Машко Н. О. Бітоксибацилін - високоефективний мікробіологічний препарат для боротьби з листогризучими шкідниками. // Зб. наук. розробок " Сільськогосподарська мікробіологія - на допомогу аграрному виробництву." - Чернігів, 2001. - С. 42-43.

АНОТАЦІЯ

Патика Т. І. Роль ентомопатогенних бактерій Bacillus thuringiensis у формуванні стійких агроекосистем. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03. 00. 16 - екологія. - Національний аграрний універсітет, Київ, 2001.

Дисертація присвячена мікробіологічному методу інтегрованої системи захисту рослин, питанню високоефективних засобів контролю за екосистемами - “управління шкідниками” за допомогою препаратів Bacillus thuringiensis. З природних популяцій Півдня України виділено 5 ентомопатогенних кристалоносних штамів з 79 - 100 % ефективністю щодо личинок колорадського жука ( Leptinotarsa decemlineata L.). На основі культуральних, морфологічних, фізіолого-біохімічних властивостей штами ідентифіковані як Bacillus thuringiensis var. thuringiensis. На основі високоефективного і технологічного штаму B. thuringiensis 0239 розроблена технологія лабораторного одержання біопрепарату терміном зберігання до одного року.

В умовах лабораторних, польових і виробничих дослідів досягнута висока ефективність біопрепаратів щодо личинок колорадського жука молодшого віку і особин капустяної совки. Ентомоцидна ефективність біопрепарату складає 85-98%. Встановлено, що препарат B. thuringiensis 0239 в 0,5-1,0% концентраціях не токсичний для бджіл. Результати роботи можуть бути використані у сільськогосподарському виробництві при застосуванні біопрепаратів на основі природних мешканців біоценозу- ентомопатогенних мікроорганізмів (B. thuringiensis), як таких, що при науково обґрунтованих системах регулювання розвитку і управління чисельністю шкідливих організмів не призводитимуть до порушення рівноваги в сучасних агроекосистемах.

Ключові слова: штами, ентомопатогенні бактерії, Bacillus thuringiensis, біопрепарати, ентомоцидна активність, титр спор, колорадський жук, капустяна совка, захист рослин.

SUMMARY

T. I. Patyka. Role of entomopatogenic bacteria Bacillus thuringiensis in formation of stable agroecosystems. - Manuscript.

Thesis for candidate's degree of agricultural sciences according to speciality 03.00.16 - ecology. - National Agricultural University, Kyiv, 2001.

The dissertation is dedicated to microbiological method of integrated protection of plants and high-effective means for checkup of ecosystems -"pest control' by biopreparations containing Bacillus thuringiensis.

There were 5 entomopathogenic crystall-bearing strains marked out from natural populations of the South of Ukraine with 79 - 100% effectiveness towards to maggots of colorado beetle (Leptinotarsa decemlineata L.) On the base of morphological, physiological and biochemical properties the strains were identified as Bacillus thuringiensis var. thuringiensis.

On the base of high-effective and technological strain of Bacillus thuringiensis 0239 there was created a technology for laboratory getting of biopreparation with keeping term about one year.

High effectivity of biopreparations towards to maggot of Leptinotarsa decemlineata in early age and Barathra brassicae was demonstrated in laboratory, field and processing experiments. The enthomocide effectivity of the biopreparation came to 85 - 98%. It was found out that the preparation of B. thuringiensis 0239 in concentration of 0,5 - 1,0% did not make any toxically effect on bees.

The results of the dissertation work can be used in agricultural manufacturing during usage of biopreparations on the base of natural inhabitants of biocenosys namely the enthomopathogenic microorganisms (B. thuringiensis). The usage of the preparations will not lead to violation of balance in present-day ecosystems in case of scientific based systems for regulation of pest number.

Key words: strains, entomopathogenic bacteria, Bacillus thuringiensis, biopreparation, entomocyde activity, Leptinotarsa decemlineata, Barathra brassicae, protection plants, titre spores.

АННОТАЦИЯ

Патыка Т.И. Роль энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis в формировании устойчивых агроэкосистем. - Рукопись

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.16 - экология. - Национальный аграрный университет, Киев, 2001.

Диссертация посвящена микробиологическому методу интегрированной защиты растений, вопросу эффективных средств контроля за экосистемами - “управления вредителями” при помощи препаратов на основе бактерий группы Bacillus thuringiensis.

В условиях лабораторных, полевых и производственных опытов показана высокая эффективность биопрепаратов B. thuringiensis по отношению к личинкам колорадского жука младшего возраста и особей капустной совки. Энтомоцидная эффективность биопрепарата составляет 85 - 98%.

Результаты диссертации могут быть использованы в сельскохозяйственном производстве при применении биопрепаратов на основе природных обитателей биоценоза - энтомопатогенных бактерий B. thuringiensis, которые при научно-обоснованных системах защиты растений не вызывают нарушений равновесия в агроэкосистемах.

Ключевые слова: штаммы, энтомопатогенные бактерии, Bacillus thuringiensis, биопрепараты, титр спор, колорадский жук, капустная совка, защита растений.

Размещено на Allbest.ru

...