Применение методов математического анализа в методологии исследований хирономид

Размещено на http://www.allbest.ru/

Применение методов математического анализа в методологии исследований хирономид

Актуальность исследования СЛ.2

Негативное антропогенное воздействие на окружающую среду и его неблагоприятные последствия очевидны, тем более, что загрязнение биосферы уже давно приобрело трансграничный характер распространения. Огромную угрозу представляют загрязнения континентальных пресноводных водоемов вследствие значительного хозяйственно-промышленного прессинга. хромосомный полиморфизм популяция хирономид

В настоящее время к приоритетным ксенобиотикам относятся тяжелые металлы, играющие роль и в загрязнении водоемов. И в первую очередь, разнообразные соединения металлов концентрируются в донных отложениях, что приводит к нарушениям жизненных процессов у бентосных организмов.

Для объективной оценки биологических последствий антропогенных воздействий на экосистемы и биоценозы водоемов наряду с традиционными режимными наблюдениями необходимо расширение экспериментальных исследований с целью выявления структурно-функциональных изменений наследственного материала организмов, подвергающихся воздействию соединений тяжелых металлов.

Чрезвычайно важную роль в жизни практически всех типов водоемов играют личинки семейства Chironomidae, являющиеся доминирующими видами макрозообентоса: их численность обычно составляет более половины численности обитателей дна, вследствие чего хирономиды представляют собой удобную модель при анализе антропогенных воздействий. Кроме того, хирономиды имеют самые крупные в природе политенные хромосомы, которые позволяют проводить цитогенетический анализ воздействия различных токсических веществ на хромосомные перестройки.

Еще одним важным свойством личинок хирономид является их способность легче, чем другие водные организмы, накапливать тяжелые металлы и другие вещества внутри своего тела благодаря высокой проницаемости покровов.

Вопрос о воздействии тяжелых металлов на бентосные организмы и, в частности, на личинок хирономид на сегодняшний день изучен недостаточно.

Трудности исследований в этой области заключаются в том, что в водной среде присутствуют целые комплексы этих токсикантов в виде различных соединений, и достаточно трудно определить специфичность действия отдельного элемента.

В современных научных исследованиях математическое моделирование играет большую роль, что объясняется общим прогрессом науки - модельное описание требует формальной ясности и недвусмысленности. Методы математического анализа в биологии применяются для прогнозирования поведения различных объектов, для оптимизации их функцирования (с целью проектирования и управления), для описания и конкретизации характера зависимостей исследуемых величин, а также для повышения информативности при демонстрации полученных данных с учетом их многофакторности и множественности взамосвязей.

СЛ.3 Цель работы: с помощью инструментов математического анализа выявить зависимости изменчивости хромосомного полиморфизма природных популяций Glyptotendipes glaucus Mg. нескольких водоёмов Калининградской области от сезона генерации и половой принадлежности, а также экспериментальных выборок данного вида хирономид от содержания тяжелых металлов в экспериментальных растворах.

Поставлены следующие задачи:

- Выявление и визуализация с помощью метода профилограмм локализации хромосомных инверсий в плечах хромосом, а также зависимости отношения числа инверсионных последовательностей к числу геномных комбинаций, как параметра оценки хромосомного полиморфизма, от сезона генерации и половой принадлежности личинок Glyptotendipes glaucus Mg.

- Графическая и аналитическая интерпретация воздействия ряда концентраций сульфатов меди, цинка, железа на хромосомный инверсионный полиморфизм Glyptotendipes glaucus Mg. в эксперименте с использованием метода регрессионного анализа, а также определение градации мутагенной активности в ряду исследуемых ионов тяжелых металлов в отношении личинок Glyptotendipes glaucus Mg.

СЛ.4 Материалы и методы исследования

Материалом исследования послужили первичные данные цитогенетического анализа политенных хромосом личинок хирономид G. glaucus IV стадии развития, собранных из шести водоемов г. Калининграда (пруд Нижний, система прудов Карасевка, озеро Пеньковое, пруд Чистый, озеро Школьное, пруд Ботанического сада), а также личинок хирономид G. glaucus IV стадии развития, выращенных в ходе эксперимента из кладок, собранных в прибрежной зоне тех же водоемов с погруженных в воду частей растений, разлагающихся макрофитов и коряг.

Сбор личинок с корней и погруженных в воду листьев рогоза, озерного камыша и последующую фиксацию производили стандартными методами. Идентификация вида G. glaucus проводилась по морфологии личинок и уточнялась кариологически.

Временные цитологические препараты политенных хромосом слюнных желёз личинок готовились по стандартной ацето-орсеиновой методике.

Картирование G. glaucus осуществлялось по Беляниной, Дурновой (1998), обозначения плеч использовались по Михайловой (1989).

В качестве кариотипических показателей природных популяций и экспериментальных личинок G. glaucus были использованы:

1) среднее число гетерозиготных инверсий на особь - т.е. отношение числа всех гетерозиготных инверсий каждого хромосомного плеча к общему числу особей в исследованной выборке;

2) количество инверсионных последовательностей - т.е. общее число всех встреченных стандартных и инвертированных последовательностей хромосом, встреченных у всех особей в выборке;

3) количество генотипических сочетаний, которые формируют все выявленные в выборке последовательности хромосом;

4) отношение двух последних показателей - т.е. числа инверсионных последовательностей к числу генотипических сочетаний.

Для изучения воздействия тяжелых металлов: цинка, меди и железа на политенные хромосомы G. glaucus в лабораторных условиях были выбраны концентрации веществ исходя из концентраций данных металлов в природных водоемах города Калининграда, и пересчитаны на молярную концентрацию металла [Ме²⁺], моль/л:

- Сульфат цинка (II) (концентрации в природных водоемах - 34 мг/л, 40,7 мг/л и 61,65 мг/л) > [Zn²⁺] = 0,52 ммоль/л, 0,62 ммоль/л, 0,94 ммоль/л

- Сульфат железа (II) (46 мг/л, 78 мг/л, 433 мг/л) > [Fе²⁺] = 0,82 ммоль/л, 1,40 ммоль/л, 7,76 ммоль/л

- Сульфат меди (II) (0,6 мг/л и 1,2 мг/л) > [Сu²⁺] = 0,00945 ммоль/л,

0, 01889 ммоль/л.

Кладки G. glaucus для эксперимента погружали в растворы, а также в отстоянную воду (контроль). После выклева личинок перемещали в отстоянную воду. Личинки выращивались до 4-го возраста в течение 2-4 месяцев, после чего фиксировались в спиртоуксусной смеси.

Всего были проанализированы данные кариотипов 609 особей G. glaucus из природных водоемов и 440 экспериментальных особей.

Математическая обработка и визуализация данных проводилась с помощью методов профилограмм и регрессионного анализа с использованием пакета программ STATISTICA 5.0.



Сл.5 Особенности биологии и экологии хирономид

Сл.6 Структурно-функциональная организация политенных хромосом Gliptotendipes glaucus

Сл.7 Применение методов математического анализа в экологии и биологии

Сл. 7 Математические методы в исследованиях хирономид

Сл.8. Профильный (полигональный) метод

Сл.8. Регрессионный анализ

Сл. 9. Механизмы токсичности ионов металлов

Биологические последствия воздействия металлов проявляются, прежде всего, в прямом токсическом воздействии на гидробионтов, приводящих в тяжёлых случаях к массовой гибели гидробионтов. При воздействии малых концентраций металлов отмечается нарушение первичной продукции и трофических связей, а также равновесия между авто- и гетеротрофными организмами, что, в конечном счёте, приводит к нарушению биотического круговорота и дестабилизации водных экосистем. Наряду с прямым токсическим действием на организм, тяжелые металлы вызывают отдалённые биологические последствия, производя мутагенное, эмбриотоксическое, гонадотоксическое и другие воздействия.

Проникновение металла из воды в организм может осуществляться через покровы и с пищей. Для проявления токсических свойств ион металла должен пересечь биологическую мембрану и проникнуть внутрь клетки.

Катионы металлов могут формировать координационно-ковалентные связи с широким классом молекул (лиганды). Большинство лигандов, имеющих биологическое значение (белки, нуклеиновые кислоты), содержат в молекуле кислород -, азот-, серосодержащие, электрон - донорские группы, с которыми и взаимодействуют металлы. Последствия взаимодействия металлов с лигандами многообразны. Прежде всего, это разрыв водородных связей внутри макромолекулы, замещение других металлов в связи с лигандами и как следствие этого - изменение третичной структуры комплекса, приводящее к изменениям их биологических свойств: угнетению активности энзимов, нарушению транспортных свойств и т.д.

Присоединение металлов к лигандам мембранных структур, прежде всего, приводит к нарушению процессов активного или пассивного трансмембранного транспорта.

Взаимодействие с лигандами нуклеиновых кислот потенциально может повлиять как на процессы транскрипции, так и трансляции, и лежать в основе мутагенного и канцерогенного действия определенных металлов. Угнетение энзимов, участвующих в процессе репарации ДНК, также может иметь значение в развитии мутагенеза и канцерогенеза.

Если металл взаимодействует со структурами энзима, расположенными вне активного центра, но влияющими на его конформацию (следовательно, и на активность), возможно неконкурентное ингибирование. Так, хотя ртуть не взаимодействует с активным центром гемоглобина, связывающим кислород, она существенно изменяет характер кривой диссоциации оксигемоглобина, нарушая его третичную структуру.

Действие металлов на белки может приводить к нарушению их третичной структуры. Поскольку лиганд (белок), способный связывать катион, окружен и другими молекулами, такое взаимодействие носит лишь отчасти специфический характер.

Взаимодействуя с нуклеиновыми кислотами, катионы могут образовывать координационно-ковалентные связи с фосфатными группами и атомами азота пуриновых и пиримидиновых оснований. Такие металлы, как кадмий и медь, вероятно, связываясь с нуклеотидами, разрывают водородные связи и дестабилизируют структуру ДНК.

Находясь в микро количествах в клетке и изменяя структуру нуклеиновых кислот, металлы нарушают процессы передачи информации (репликацию, транскрипцию, трансляцию), блокируют синтез белка и приводят к генетическим аномалиям.

Металлы порой являются активаторами энзимов, участвующих в синтезе и репарации нуклеиновых кислот. Так, цинк необходим для реализации активности тимидинкиназы. Его замещение при интоксикации другими металлами, например, кадмием, приводит к нарушению активности энзима, препятствует синтезу ДНК. Мутагенная активность соединений мышьяка в настоящее время отчасти связывается с угнетением активности энзимов, участвующих в репарации ДНК.

В этой связи велика роль изучения взаимодействия токсикантов с мембран-связанными лигандами. Способность металлов взаимодействовать именно с этими структурами обусловлена не только их особыми свойствами, но и локализацией.

Внешняя поверхность клеточной мембраны первой взаимодействует с металлом. Вещества, медленно проходящие через мембрану, могут образовывать прочные связи с лигандами и тем самым существенно изменять свойства мембран. Так, ртутьорганическое соединение хлормеродрин, взаимодействуя с SH-группами эритроцита (преимущественно мембранными), угнетает транспорт сахаров через мембрану. Вещества, легко проникающие через мембрану, такие как метилртуть, вероятно, слабо влияют на её свойства.

Взаимодействовать металлы могут с любыми мембранными образованиями: митохондриями, эндоплазматическим ретикулумом, лизосомами. Иногда взаимодействие металла с макромолекулой вообще не приводит к изменению ее физиологической активности.

Токсическое действие некоторых металлов может быть обусловлено их конкуренцией с эссенциальными элементами. Так, ксантиноксидаза угнетается вольфрамом - конкурентом молибдена. Свинец блокирует утилизацию железа при гемасинтезе, угнетая активность феррохелатазы. Существуют данные, что Cd блокирует трансплацентарное поступление Zn в организм плода и тем самым инициирует тератогенные эффекты.

Действие свинца на митохондрии может быть следствием переноса металла в субклеточные структуры с помощью специфической системы трансмембранного транспорта кальция. Между необходимыми металлами также возможна конкуренция. Так, медь и молибден - конкуренты. Поэтому при интоксикации медью молибден ослабляет симптоматику отравления.

Описание трех графиков с металлами

Показатель числа инверсионных последовательностей в концентрациях железа сохранялся на уровне контроля (10-11) и не показал значимости как и в растворах цинка и меди. Однако число геномных комбинаций, сформированных этими последовательностями, резко возрастает в 2-3 раза вместе с увеличением концентраций железа в экспериментальном растворе. То есть этот показатель изменяется в соответствии с подобной тенденцией в средах с цинком и медью. Также прослеживается уменьшение отношения числа инверсионных последовательностей к числу геномных комбинаций от 1,2 до 3,0 раз вместе с возрастанием концентраций вещества. Подобная закономерность так же наблюдалась в растворах цинка и меди (рисунок 46).

Таким образом, в результате проведённых экспериментов с концентрациями трех тяжёлых металлов: цинком, медью и железом можно отметить чёткую закономерность в изменении следующих трех показателей: числа инверсионных последовательностей, числа геномных комбинаций, отношения числа инверсионных последовательностей к числу геномных комбинаций. Показатель числа гетерозиготных инверсий на особь, в отличие от такового в природных популяциях, не показал достоверной зависимости от концентраций исследованных веществ.



Заключение

Параметр оценки хромосомного полиморфизма - отношение числа инверсионных последовательностей к числу геномных комбинаций уменьшается в связи с увеличением концентраций тяжелых металлов в экспериментальных растворах. Самое высокое значение этого показателя (2,0) наблюдалось в контрольных выборках, а самые низкие показатели - в высоких концентрациях.

Эксперимент показывает, что популяция, находясь в условиях стресса, начинает формировать большее количество геномных комбинаций из имеющихся последовательностей дисков хромосом, а увеличение числа инверсионных последовательностей не так велико, что и приводит к закономерному уменьшению показателя отношения числа инверсионных последовательностей к числу геномных комбинаций.

Интерпретация данных с помощью метода профилограмм позволяет собрать воедино и визуализировать следующие положения.

Локализация инверсий имеет место преимущественно в ____ плече хромосомы, что можно объяснить……

ЧИП/ЧГК выше у особей женского (мужского) пола, что может быть связано с……….

ЧИП/ЧГК выше у особей летней (зимней) генерации, что может свидетельствовать о ……….

Графическая и аналитическая интерпретация воздействия ряда концентраций сульфатов меди, цинка, железа на хромосомный инверсионный полиморфизм Glyptotendipes glaucus Mg. в эксперименте с использованием метода регрессионного анализа позволяет определить градацию мутагенной активности в ряду исследуемых ионов тяжелых металлов в отношении личинок Glyptotendipes glaucus Mg, не соблюдая равных условий эксперимента для исследуемых металлов, тем самым экономя время и избавляя от необходимости дополнительных опытов. Регрессионный анализ дает возможность оценки и сравнения мутагенной активности ионов металлов, использовавшихся в экспериментах в разных концентрациях. Мутагенная активность металлов возрастает в ряду ___________ , что может быть обусловлено закономерным возрастанием _________ в ряду ионов анализируемых металлов.



Приложение

У=ЧИП/ЧГК

Х = [Ме2+]

Цинк

х	0,52	0,62	0,94
у	1,5	1,42	1,0

y = -1.2202 x + 2.1527

Медь

х	0,00945	0,01889
у	1,25	1,0

y = -26.4811 x + 1.5002

Железо

х	0,82	1,40	7,76
у	1,66	1,11	0,68

y = -0.1108 x + 1.5186

железо-цинк-медь

ЧИП/ЧГК снижается, а значит полиморфизм увеличивается в ряду железо-цинк-медь. Медь обладает максимальной мутагенностью для хирономид.

Уравнение парной регрессии

На основании поля корреляции можно выдвинуть гипотезу (для генеральной совокупности) о том, что связь между всеми возможными значениями X и Y носит линейный характер.

Линейное уравнение регрессии имеет вид y = bx + a + е

Здесь е - случайная ошибка (отклонение, возмущение).

Причины существования случайной ошибки:

1. Невключение в регрессионную модель значимых объясняющих переменных;

2. Агрегирование переменных. Например, функция суммарного потребления - это попытка общего выражения совокупности решений отдельных индивидов о расходах. Это лишь аппроксимация отдельных соотношений, которые имеют разные параметры.

3. Неправильное описание структуры модели;

4. Неправильная функциональная спецификация;

5. Ошибки измерения.

Так как отклонения е_i для каждого конкретного наблюдения i - случайны и их значения в выборке неизвестны, то:

1) по наблюдениям x_i и y_i можно получить только оценки параметров б и в

2) Оценками параметров б и в регрессионной модели являются соответственно величины а и b, которые носят случайный характер, т.к. соответствуют случайной выборке;

Тогда оценочное уравнение регрессии (построенное по выборочным данным) будет иметь вид y = bx + a + е, где e_i - наблюдаемые значения (оценки) ошибок е_i, а и b соответственно оценки параметров б и в регрессионной модели, которые следует найти.

Для оценки параметров б и в - используют МНК (метод наименьших квадратов). Метод наименьших квадратов дает наилучшие (состоятельные, эффективные и несмещенные) оценки параметров уравнения регрессии.

Но только в том случае, если выполняются определенные предпосылки относительно случайного члена (е) и независимой переменной (x).

Формально критерий МНК можно записать так:

S = ?(y_i - y^*_i)² > min

Система нормальных уравнений.

a*n + b?x = ?y

a?x + b?x² = ?y*x

Для наших данных система уравнений имеет вид

3a + 2.08 b = 3.92

2.08 a + 1.54 b = 2.6

Из первого уравнения выражаем а и подставим во второе уравнение:

Получаем эмпирические коэффициенты регрессии: b = -1.2202, a = 2.1527

Уравнение регрессии (эмпирическое уравнение регрессии):

y = -1.2202 x + 2.1527



Эмпирические коэффициенты регрессии a и b являются лишь оценками теоретических коэффициентов в_i, а само уравнение отражает лишь общую тенденцию в поведении рассматриваемых переменных.

Для расчета параметров регрессии построим расчетную таблицу (табл. 1)

x	y	x2	y2	x * y
0.52	1.5	0.27	2.25	0.78
0.62	1.42	0.38	2.02	0.88
0.94	1	0.88	1	0.94
2.08	3.92	1.54	5.27	2.6

1. Параметры уравнения регрессии

Выборочные средние.

Выборочные дисперсии:



Среднеквадратическое отклонение

1.1 Коэффициент корреляции

Ковариация.

Рассчитываем показатель тесноты связи. Таким показателем является выборочный линейный коэффициент корреляции, который рассчитывается по формуле:

1.2. Уравнение регрессии (оценка уравнения регрессии)

Линейное уравнение регрессии имеет вид y = -1.22 x + 2.15



1.3. Коэффициент эластичности

Коэффициент эластичности находится по формуле:

1.4 Ошибка аппроксимации

Ошибка аппроксимации в пределах 5%-7% свидетельствует о хорошем подборе уравнения регрессии к исходным данным.

1.5 Эмпирическое корреляционное отношение

Эмпирическое корреляционное отношение вычисляется для всех форм связи и служит для измерение тесноты зависимости. Изменяется в пределах [0;1].

где

Индекс корреляции

Для линейной регрессии индекс корреляции равен коэфииценту корреляции r_xy = -1.

Для любой формы зависимости теснота связи определяется с помощью множественного коэффициента корреляции:

1.6 Коэффициент детерминации

Чаще всего, давая интерпретацию коэффициента детерминации, его выражают в процентах.

R²= -1² = 0.99

Для оценки качества параметров регрессии построим расчетную таблицу (табл. 2)

x	y	y(x)	(yi-ycp)2	(y-y(x))2	(xi-xcp)2	|y - yx|:y
0.52	1.5	1.52	0.0374	0.00033	0.03	0.0121
0.62	1.42	1.4	0.0128	0.000569	0.00538	0.0168
0.94	1	1.01	0.094	3.2E-5	0.0608	0.00568
2.08	3.92	3.92	0.14	0.000931	0.0963	0.0346

2. Оценка параметров уравнения регрессии

2.1 Значимость коэффициента корреляции

Для того чтобы при уровне значимости б проверить нулевую гипотезу о равенстве нулю генерального коэффициента корреляции нормальной двумерной случайной величины при конкурирующей гипотезе H₁ ? 0, надо вычислить наблюдаемое значение критерия

и по таблице критических точек распределения Стьюдента, по заданному уровню значимости б и числу степеней свободы k = n - 2 найти критическую точку t_крит двусторонней критической области. Если t_набл < t_крит оснований отвергнуть нулевую гипотезу. Если |t_набл| > t_крит -- нулевую гипотезу отвергают.

По таблице Стьюдента с уровнем значимости б=0.05 и степенями свободы k=1 находим t_крит:

t_крит (n-m-1;б/2) = (1;0.025) = 12.706

где m = 1 - количество объясняющих переменных.

2.2 Интервальная оценка для коэффициента корреляции (доверительный интервал)

r(-1.04;-0.95)

2.3 Анализ точности определения оценок коэффициентов регрессии

Несмещенной оценкой дисперсии возмущений является величина:

S²_y = 0.000931 - необъясненная дисперсия (мера разброса зависимой переменной вокруг линии регрессии).

S_y = 0.0305 - стандартная ошибка оценки (стандартная ошибка регрессии).

S_a - стандартное отклонение случайной величины a.

S_b - стандартное отклонение случайной величины b.

2.4 Доверительные интервалы для зависимой переменной

(a + bx_p ± е)

где

Рассчитаем границы интервала, в котором будет сосредоточено 95% возможных значений Y при неограниченно большом числе наблюдений и X_p = 1

Индивидуальные доверительные интервалы для Y при данном значении X

(a + bx_i ± е)

где

t_крит (n-m-1;б/2) = (1;0.025) = 12.706

2.5 Проверка гипотез относительно коэффициентов линейного уравнения регрессии

1) t-статистика. Критерий Стьюдента.

t_крит (n-m-1;б/2) = (1;0.025) = 12.706

Доверительный интервал для коэффициентов уравнения регрессии

(b - t_крит S_b; b + t_крит S_b)

(a - t_крит S_a; a + t_крит S_a)



2) F-статистика. Критерий Фишера.

Табличное значение критерия со степенями свободы k₁=1 и k₂=1, F_табл = 161

Размещено на Allbest.ru

...