Взаємодія ендофітних бактерій з рослинами картоплі

Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ

УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК

УДК 579.26:561.23:574.38:582.951

Взаємодія ендофітних бактерій з рослинами картоплі

03.00.16 - екологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ПОДОЛІЧ Ольга Віталіївна

Київ - 2008



Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті агроекології Української академії аграрних наук

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник, Петюх Григорій Павлович, Інститут цукрових буряків Української академії аграрних наук, завідувач лабораторії новітніх аграрних біотехнологій

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, Ісаєнко Володимир Миколайович, Національний авіаційний університет, директор інституту міського господарства, завідувач кафедри екології

кандидат біологічних наук, Копилов Євгеній Павлович, Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН, старший науковий співробітник лабораторії мікробіометоду

Захист відбудеться “11” березня 2008р. о 11⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.371.01 Інституту агроекології УААН, за адресою: 03143, м. Київ, вул. Метрологічна, 12.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології УААН, за адресою: м. Київ, вул. Метрологічна, 12.

Автореферат дисертації розіслано “ 09 ” лютого 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат сільськогосподарських наук Я.В. Чабанюк



АНОТАЦІЯ

Подоліч О.В. Взаємодія ендофітних бактерій з рослинами картоплі.-Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.16. - екологія. Інститут агроекології УААН, Київ, 2008. фітопатоген ендофітний бактерія картопля

Дисертаційна робота присвячена вивченню взаємодії ендофітних бактерій з рослинами картоплі та їх впливу на продуктивність та імунітет рослин.

За результатами теоретичних узагальнень та комплексних досліджень взаємодії рослин з ендофітними бактеріями показано їх позитивний вплив на ростові процеси і продуктивність картоплі та можливість індукування системної стійкісті рослин до некротрофних фітопатогенів.

Показано, що взаємодія ризобактерій Pseudomonas fluorescens ІМБГ163 з рослинами картоплі сприяє підвищенню кількості ендофітних бактерій, які, в значній мірі, можуть підвищувати фізіолого-біохімічну активність рослин. Під впливом ризобактерії вперше з рослин картоплі виділено ендофітну бактерію роду Methylobacterium, яку ідентифіковано як Methylobacterium radiotolerans. Ця бактерія створює стабільні асоціації з рослинами картоплі і переважно локалізується в паренхімних тканинах та судинах рослин, ймовірно продукує цитокініни і позитивно впливає на ріст і розвиток рослин картоплі.

Запропоновано використання бактеріальних штамів M. radiotolerans ІМБГ290 і Pseudomonas putida 65С для інокуляції рослин картоплі in vitro з метою їх адаптації до умов ex vitro без застосування хімічних засобів захисту рослин.

Ключові слова: ендофітні бактерії, Methylobacterium, рослини картоплі, протекторні еффекти.



Аннотация

Подолич О.В. Взаимодействие эндофитных бактерий с растениями картофеля.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.16. - экология. - Институт агроэкологии УААН, Киев, 2008.

Диссертационная работа посвящена изучению взаимодействия эндофитных бактерий с растениями картофеля и их влияния на продуктивность и иммунитет растений.

Изложенные в диссертации результаты комплексных исследований взаимодействия растений с эндофитными бактериями показывают их позитивное влияние на рост и продуктивность картофеля, а также возможность индуцирования системной устойчивости растений к некротрофным фитопатогенам.

Показано, что взаимодействие ризобактерий Pseudomonas fluorescens ИМБГ 163 с растениями картофеля способствует повышению количества эндофитных бактерий, которые, в значительной степени, могут повышать физиолого-биохимическую активность растений. Под влиянием ризобактерий впервые из растений картофеля выделено эндофитную бактерию рода Methylobacterium, которую идентифицировано как Methylobacterium radiotolerans. Эта бактерия создает стабильные ассоциации с растениями картофеля и, преимущественно, локализуются в паренхимных тканях и сосудах растений, вероятно, продуцирует цитокинины и позитивно влияет на рост и развитие растений картофеля.

Предложено использование бактериальных штамов M. radiotolerans ІМБГ290 и Pseudomonas putida 65С для инокуляции растений картофеля in vitro, с целью их адаптации к условиям ex vitro без использования химических средств защиты растений.

Ключевые слова: эндофитные бактерии, Methylobacterium, растения картофеля, протекторные эффекты.



SUMMARY

Podolich O.V. Interaction of endophytic bacteria with potato plants.-Manuscript.

Thesis for Candidate's degree in Biological Sciences by speciality 03.00.16 -Ecology. - Institute of Agroecology UAAS, Kyiv, 2008.

This manuscript is devoted to studying interaction of endophytic bacteria with potato plants, as well as endophytes influence on plant growth and systemic resistant to phytopathogen. A detailed knowledge of the life-style of endophytes is essential for developing endophytic biofertilizers and biocontrol agents.

Our results suggest that potato supports a diverse bacterial endophytes. The community composition of the culturable component of the microflora was remarkably different from that revealed by culture-independent method. Introduction of rhizobacterium Pseudomonas fluorescens IMBG163 into potato plant tissue resulted in essential rise of endophytic bacterial species number, however, in the further micropropagation of plants their number was reduced. Endophytic isolates from potato varieties Zagadka and Nigru, induced by the rhizobacterium, exhibited beneficial for plant characters. Some bacterial endophytic isolates showed their ability to biocontrolling of phytopathogens, either through direct antagonism of pathogens (Erwinia carotovara subsp. atroseptica and Pseudomonas syringae pv. syringae) or by inducing systemic resistence of plants to pathogens (Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000).

A bacterial strain utilizing methanol was isolated from the roots of potato in vitro plants after induction of endophytic bacterial community by inoculation with P. fluorescens IMBG163. This isolate M1 was characterized by partial 16S rRNA sequence analysis which showed high sequence similarity to the sequence of Methylobacterium radiotolerans. Two molecular methods were used for localizing methylobacteria in potato plantlets: PCR and in situ hybridization (ISH/FISH). A PCR product specific for the Methylobacterium genus was found in DNA isolated from the surface-sterilized plantlet leaves. Presence of Methylobacterium rRNA was detected by ISH/FISH in leaves and stems of inoculated as well as axenic potato plantlets although the bacterium cannot be isolated from the axenic plants. Thus, M. radiotolerans IMBG290 resides in unculturable state within tissues of in vitro-grown potato plants and becomes culturable after inoculation with P. fluorescens IMBG163.

Inoculation of potato plantlets with the M. radiotolerans IMBG290 increased stem height of potato plantlets and plant biomass when compared to controls. Also the carbohydrate and fat content of the shoots of endophyte-inoculated potato plants was higher than in the controls.

Specific reaction on production of indole-acetic acid by M. radiotolerans IMBG290 was negative but the biotest with cucumber etiolated cotyledons demonstrated its capacity of producing cytokinins. Therefore, cytokinins were considered a means for the M. radiotolerans to directly influence plant metabolism.

Therefore M. radiotolerans IMBG290 may offer much potential as the basis for new biostimulators of plant growth and biocontrol agents along with other endophytes isolated from potato tissue culture which exhibited beneficial for plant characters.

Key words: bacterial endophytes, Methylobacterium, potato plantlets, biocontrol effects.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У взаємодії вищих рослин та мікроорганізмів все більшого значення набуває ендофітна мікрофлора. Пріоритетним напрямком в сучасній агроекології є розробка екологобезпечних шляхів підвищення продуктивності рослин та їх захисту від впливу несприятливих факторів довкілля. Одним з таких напрямків є використання потенціалу ендофітних бактерій. У порівнянні з вільноіснуючими бактеріями, ендофіти утворюють стабільніші асоціації з рослиною і, на відміну від них, виживають у тканинах рослин протягом вегетації. Деякі бактерії-ендофіти, підвищуючи імунологічний статус рослин, можуть брати участь у захисті рослин від захворювань, спричинених фітопатогенами (Siciliano et al., 2001; Araujo et al., 2002; Pirttila et al., 2005), від шкідливої дії важких металів і радіонуклідів (Siciliano et al., 2001; Сорочинський та ін., 1998) та допомагати рослинам пристосовуватися до несприятливих умов довкілля (Siciliano et al., 2001). Інші, можуть покращувати їх ріст і розвиток, шляхом постачання рослинам поживних речовин (Verma et al., 2001).

Пошук ендофітних бактерій, здатних позитивно впливати на ріст і розвиток рослин та захищати рослини від захворювань, стимулюючи їх ріст, підвищуючи їх імунний статус відкриває широку перспективу поліпшення фітосанітарного стану та підвищення продуктивності агрофітоценозів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась згідно науково-технічних програм Інституту агроекології УААН „Теоретично обґрунтувати і застосувати на практиці методи сільськогосподарської біотехнології для цілеспрямованого формування сталих агроекосистем” (номер державної реєстрації 0101U003296) та „Розробити науково методичне забезпечення оцінки рівня біологічної безпеки вирощування рослинної продукції в агроекосистемах” (номер державної реєстрації 0106U004046).

Мета і завдання досліджень: встановити характер взаємодії ендофітних бактерій з рослинами картоплі і їх вплив на продуктивність та імунітет рослин.

Відповідно до мети поставлено наступні завдання:

· дослідити вплив інокуляції експлантів картоплі бактерією Pseudomonas fluorescens IМБГ 163 на ендофітні бактерії рослин-регенерантів;

· виділити ендофітні бактерії з рослин картоплі та визначити їх властивості та локалізацію в тканинах рослин;

· провести ідентифікацію окремих ізолятів ендофітних бактерій;

· дослідити вплив ендофітних бактерій на ріст і розвиток рослин та їх імунітет.

Об'єкт досліджень - взаємодія ендофітних бактерій з рослинами картоплі.

Предмет досліджень - ендофітні бактерії та рослини картоплі.

Методи дослідження - 1)мікробіологічні та фізіолого-біохімічні - для виділення ендофітів з рослин картоплі, їх ідентифікації та визначення агрономічно-цінних властивостей; 2)молекулярно-біологічні методи: визначення нуклеотидної послідовності 16S рРНК генів - для встановлення видової належності ізолятів; полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - для ідентифікації окремих ділянок бактеріальної ДНК; метод визначення поліморфізму довжини термінально-мічених рестрикційних фрагментів (ПДТРФ) - для визначення різноманіття ендофітних бактерій в тотальній ДНК рослин; метод in situ гібридизації - для встановлення локалізації ендофітних бактерій в рослинних тканинах; 3)вегетативні досліди - для визначення ефективності застосування ендофітних бактерій у технологічному процесі отримання посадкового матеріалу картоплі; 4)статистичні методи аналізу - для оцінки вірогідності отриманих результатів.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено, що інокуляція рослин картоплі ризобактеріями P. fluorescens IМБГ 163 сприяє збільшенню кількості ендофітних бактерій, які за інших умов не виявляються в рослинах картоплі. Серед них виділено та визначено найбільш активні бактерії - продуценти речовин фітогормональної дії та бактерії, які здатні індукувати системну стійкість рослин до некротрофних фітопатогенів.

Вперше, з рослин картоплі виділено ендофітну бактерію Methylobacterium radiotolerans, встановлено її локалізацію в рослинних тканинах та визначено її роль у рості і розвитку рослин. Показано можливість застосування едофітних бактерій M. radiotolerans ІМБГ 290 та Pseudomonas putida 65С у технологічному процесі отримання посадкового матеріалу, як альтернативу використання хімічних засобів захисту рослин.

Практичне значення. Результати досліджень основних закономірностей формування ефективних асоціативних систем “ендофітні бактерії - рослини картоплі”, дозволили рекомендувати технологічним центрам виробництва оздоровленої розсади картоплі використовувати штами ендофітних бактерій M. radiotolerans ІМБГ 290 та P. putida 65С для обробки експлантів рослин картоплі в умовах in vitro, при адаптації оздоровлених рослин до умов ex vitro з метою захисту посадкового і насіннєвого матеріалу від несприятливих умов довкілля.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи авторкою проаналізовано наукову літературу за темою наукового дослідження. Огляд літератури, написання тексту дисертації, обробку й аналіз отриманих результатів виконано безпосередньо здобувачем. Дисертанткою особисто проведено всі експерименти з інокуляції рослинного матеріалу бактеріями та клонального мікророзмноження. Виділено бактеріальний штам M. radiotolerans ІМБГ 290, проведено його характеристику, ідентифікацію, визначено локалізацію в рослинах та встановлено його вплив на ріст і розвиток рослин картоплі. Всі інші експериментальні роботи проведено за безпосередньої участі здобувача у співробітництві із старшим науковим співробітником відділу регуляторних механізмів клітин Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ к.б.н. Козировською Н.О. Досліди з вивчення впливу інокуляції ендофітними бактеріями на адаптацію рослин картоплі до умов ex vitro проводили разом із співробітниками лабораторії мікроклонального розмноження Інституту картоплярства УААН. Одержані результати надруковано в спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідалися на Міжнародній науковій конференції „Сталий розвиток агроекосистем” (17-20 вересня 2002 р., м. Вінниця); Х з'їзді Товариства мікробіологів України (15-17 вересня 2004 р., м. Одеса); Першій міжнародній конференції студентів та аспірантів „Молодь та поступ біології” (11-15 квітня 2005р., м. Львів); Науковій конференції молодих вчених „Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології” (1-3 грудня 2005р., м. Ужгород); ХІ Міжнародному симпозіумі мікробіологічної екології (20-25 серпня 2006 р., м. Відень, Австрія); Х KAАМОС симпозіумі (4-5 грудня 2006 р., університет Оулу, м. Оулу, Фінляндія); конференції молодих вчених присвяченій 120 річчю М.І. Вавілова (20-22 вересня 2007 р. м. Київ); Міжнародному симпозіумі „Регулятори росту рослин: Внутрішньоклітинна гормональна сигналізація та використання в аграрній промисловості ” (8-12 жовтня 2007 р.м. Київ).

Публікації. Результати досліджень за темою дисертаційної роботи викладено в 12 наукових працях, у тому числі 3 статтях у фахових виданнях, 1 методичних рекомендаціях, 8 наукових збірниках, матеріалах і тезах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 117 сторінках комп'ютерного набору, складається із вступу, огляду літератури, розділу матеріали і методи досліджень, результати досліджень та їх обговорення, висновків, рекомендацій виробництву та списку літератури, який складається з 214 джерел, у тому числі 202 - закордонних авторів. Дисертацію проілюстровано 11 таблицями та 26 рисунками.



ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. На підставі узагальнених даних літератури описано різноманіття ендофітних бактерій різних видів рослин, їх походження і локалізацію. Наведено відомості про вплив біотичних та абіотичних факторів на структуру ендофітів в рослинах. Проаналізовано літературні дані стосовно біоконтролю фітопатогенних мікроорганізмів ендофітними бактеріями та їх вплив на ріст і розвиток рослин.

Матеріали і методи досліджень. Для досліджень взаємодії рослин картоплі з ендофітними бактеріями було відібрано бульби картоплі (Solanum tuberosum L.) сортів Нігру, Загадка, Червона Рута з розсадника відділу селекції Інституту картоплярства УУАН під керівництвом А.А. Осипчука. В експериментах з інокуляції використовували штам P. fluorescens IMБГ163 з колекції Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ.

Інокуляцію паростків картоплі ризобактерією P. fluorescens ІМБГ163 проводили бактеріальною суспензією у концентрації 10⁸ кл/мл протягом 90 хв. Після інкубації апікальні зони експлантів почергово стерилізували у розчинах 70% етилового спирту протягом 15 хв та 5% гіпохлориту кальцію - 3 хв (Маруненко и др., 1991) з подальшою трьохкратною відмивкою в стерильній дистильованій воді. Культивування рослин проводили на безгормональному поживному середовищі МС (Murashige and Skoog, 1962) при 16-годинному світловому фотоперіоді, температурі 24 ⁰С, відносній вологості 80-85% та освітленості 4 тис. люкс. Отримані рослини-регенеранти розмножували методом клонального мікророзмноження (Мусієнко та ін., 2001). Встановлення присутності P. fluorescens ІМБГ163 у рослинах проводили на селективному середовищі КВ (King et al., 1954) при температурі 28 ⁰С.

Ендофітні бактерії виділяли з рослин-регенерантів картоплі, поверхню яких продезінфіковано у 70% етиловому спирті - 1 хв та 6% гіпохлориті кальцію - 20 хв (Pirttilд et al., 2002). Рослинний матеріал розтерали у стерильній ступці і інокулювали на агарові середовища LB, M9 (Миллер, 1972), КВ (King et al., 1954), з метанолом (Романовская и др., 1996) та МПА, розведеному у 6 та 20 разів стерильною дистильованою водою.

Здатність бактерій до продукції ферментів деструкції пектину полігалакторунази та пектатліази, субстратом для яких є полігалактуронова кислота, визначали за здатністю колоній утворювати заглиблення на поверхні кальцій-стабілізованого поліпектатного гелю внаслідок руйнації полігалактуронової кислоти (Wood, 1981). Карбоксиметилцелюлозу та полігалактуронат натрію використовували як джерело вуглецю у концентрації 0,2% у середовищі М9 (Миллер, 1972). Розчин барвника Конго червоного (0,1%) застосовували для визначення наявності целюлазної (ендоглюканазної) активності у дослідних бактерій (Wood, 1981). Усі реагенти - фірми Сігма-Олдридж (США). Протеазну активність визначали за утворення коагуляту протеїнів із знежиреного молока. Для визначення ауксинів у культуральному середовищі бактерій використовували реактив Ерліха (Tang et al., 1947). Антагоністичну активність ізолятів визначали, як описано (Егоров, 1957).

Біотест на індуковану системну стійкість рослин до фітопатогену Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, після їх обробки експериментальними бактеріями, проводили на рослинах арабідопсису (Arabidopsis thaliana) (Van Wees et al., 1997). Аналіз експресії маркерних генів системної стійкості рослин проводили методом зворотньо-транскриптазної ПЛР (ЗТ-ПЛР) з використанням набору реагентів фірми Ферментас (Литва) згідно приписів виробника. Для ПЛР-аналізу сДНК досліджуваних генів використовували праймери, специфічні до генів PR-1, PDF1.2, EIF-4A2 (Ryu et al., 2004)

Виділення тотальної ДНК з in vitro рослин картоплі проводили за методом (Sambrook et al., 1989). Виділення бактерійної ДНК проводили за допомогою наборів реагентів UltraClean^TM (МоБіо Інк., США).

Аналіз поліморфізму довжини термінально-мічених рестрикційних фрагментів ДНК ендофітних асоціацій рослин картоплі проводили методом (Liu et al., 1997). Праймери 507F (5'TGCCAGCAGCCGCGGTA, мічений Cy3 з 5'кінця) та 1384r (5' GGTTACCTTGTTACGACTT) використовували для ампліфікації фрагменту rrs-гена. ПЛР виконували у термоциклері Терцик (РФ). ПЛР продукт було очищено набором реагентів UltraClean^TM PCR Clean-up DNA (МоБіо Інк., США) та оброблено ферментами TaqI або HhaI (Ферментас, Литва). Термінально мічені фрагменти розділяли в 6% денатуруючому поліакриламідному гелі у автоматичному секвенаторі ALF (Фармація, Швеція). Розміри флуоресцентно-мічених фрагментів визначали, використовуючи програму ALF Fragment Manager (Aмершам, США).

Ідентифікацію бактеріального ізоляту М1 проводили прямим визначенням нуклеотидної послідовності фрагмента гена rrs (16S рРНК) за методом Сенгера (Sanger et al., 1977), використовуючи набір Cy5 AutoCycle (Aмершам, США) та автоматичний секвенатор ALF express (Фармація Біотех, Швеція). Аналіз нуклеотидної послідовності проводили за допомогою BLASTn (NBCI) та Vector NTI 6.0 (Iнфомакс Інк., США).

Інокуляцію черенків рослин картоплі in vitro проводили бактеріальною суспензією Methylobacterium radiotolerans ІМБГ290 титром 1Ч10⁵ КУО/мл протягом 3-5 хв. Рослини-регенеранти вирощували на агаризованому безгормональному поживному середовищі МС.

Визначення присутності M. radiotolerans ІМБГ290 в рослинах проводили методом ПЛР з використанням специфічних праймерів для бактерій роду Methylobacterium MB4 (5'-CCGCGTGAGTGATGAAGG-3') і MB (5'-AGCGCCGTCGGGTAAGA-3'). Отримані ПЛР продукти розділяли електрофорезом в агарозному 2,0% гелі.

Локалізацію M. radiotolerans в різних органах рослин картоплі проводили методом іn situ гібридизації з використанням мічених діоксігініном або флуорофором проб, специфічних до бактерій роду Methylobacterium (Pirttilд et al., 2000).

Здатність до продукції цитокінінів ендофітною бактерією M. radiotolerans ІМБГ290 визначали біотестом за збільшенням маси етиольованих сім'ядолей огірка (Cucumis L.) (Процко, 1977).

Для отримання стійкої до умов ex vitro розсади та посадкового матеріалу картоплі проводили інокуляцію експлантів in vitro рослин на останньому етапі їх клонального мікророзмноження. Для інокуляції експлантів використовували бактерії чистої культури титром 1Ч10⁵ КУО/мл. Черенки рослин картоплі in vitro в стерильних умовах інкубували у бактеріальній суспензії протягом 3-5 хв при кімнатній температурі. Після інкубації експланти переносили на безгормональне агарове середовище МС для отримання рослин-регенерантів. Культивування проводили при 16-годинному світловому фотоперіоді, температурі 24 ⁰С, відносній вологості 80-85% та освітленні 4000 лк. Отримані рослини розклоновували і живці висаджували у касети з субстратом (перліт, вермикуліт, тощо), насиченим поживним розчином у розрахунку 0,5-1 мл на 1 л середовища Кнопа. Протягом чотирьох тижнів розсаду вирощували у лабораторії з контрольованими умовами освітлення, вологості і температурою. Розсаду висаджували у теплиці і вирощували, ще протягом чотирьох тижнів для отримання мінібульб картоплі.

При обробці одержаних результатів використовували методи математичної статистики (Доспехов, 1985), програму SigmaPlot 8.0 та авторські програми для Microsoft Excel і Statistica 6.0.

Створення штучної in vitro асоціації рослин картоплі з ризобактеріями P. fluorescens ІМБГ163. Експланти меристематичних зон паростків картоплі сортів Нігру і Загадка були інокульовані ризобактеріями P. fluorescens ІМБГ163. Відразу після інокуляції проводили аналіз чисельності інтродукованих бактерій штаму P. fluorescens ІМБГ163 в експлантах паростків картоплі. Результати мікробіологічного аналізу показали, що в експлантах картоплі сорту Нігру кількість бактеріальних клітин складала 1,34Ч10⁵ КУО/г сирої рослинної тканини, що в свою чергу майже не відрізнялась від кількості інтродукованих бактерій в експлантах картоплі сорту Загадка, яка становила 1,3Ч10⁵ КУО/г сирої маси.

Через тиждень після висадки інокульованих бактеріями P. fluorescens ІМБГ163 експлантів картоплі на поживне середовище MC спостерігали вихід цих бактерій у середовищі в зоні ризоплани у вигляді специфічного ореолу. Рослини, у яких в зоні ризоплани спостерігали подібний феномен за морфологічними ознаками не відрізнялись від контрольних рослин.

З літератури відомо, що деякі бактерії істотно скорочують період органогенезу у тютюну, пшениці (Петак та ін., 1998) і картоплі (Волкогон та ін., 2001) за рахунок синтезу рістстимулюючих речовин та збільшують загальну масу коріння і пагонів рослин (Mirza et al., 2001). Отже, доцільно було прослідкувати вплив бактеріального штаму P. fluorescens ІМБГ163 на ростові процеси асептичних рослин картоплі.

За нашими спостереженнями, після висадки інокульованих експлантів на поживне середовище МС, інтенсивне утворення пагонів відбувалось на 5 добу, коренів - на 8 добу, так само як і у контрольному варіанті. Але через три тижні у рослин-регенерантів картоплі сорту Загадка, інокульованих штамом P. fluorescens ІМБГ163, відбувався інтенсивний ріст. У контрольному варіанті рослини росли і розвивалися повільно. Вплив даного штаму бактерій на регенерацію рослин картоплі сорту Нігру в умовах in vitro не спостерігали. Відомо, що взаємодія бактерій роду Pseudomonas з культурою тканин картоплі є видоспецифічною, тому не завжди спостерігається покращення росту і розвитку рослин та збільшення регенерантами біомаси у порівнянні з неінокульованими рослинами (Сonn et al., 1997).

Враховуючи той факт, що бактерії роду Pseudomonas за певних умов здатні проникати в рослинні тканини (Garbeva et al., 2001; Козировська, 2001), перед нами стало завдання визначити присутність бактеріальних клітин інокулянта всередині рослини та прослідкувати збереження бактеріальних популяцій в різних органах картоплі при їх клональному мікророзмноженні. Для цього листки і коріння отриманих через три тижні після інокуляції рослин-регенерантів тестували на селективному середовищі КВ.

Проведення мікробіологічного тестування сегментів листків і коріння з отриманих рослин-регенерантів картоплі в умовах in vitro показало присутність бактерій P. fluorescens ІМБГ163 як в рослинах першого вегетативного покоління, так і в рослинах, отриманих після двох циклів клонального мікророзмноження. Кількість рослин, в яких було виявлено бактерії штаму P. fluorescens ІМБГ163, з кожним пасажем, від R1 до R3, зменшувалась, а в поколінні R4 бактерії мікробіологічним аналізом вже не визначались.

Ми вважаємо, таке зниження рівня колонізації рослин може бути пов'язано або зі зникненням бактеріальних клітин з тканин рослин картоплі, або зі здатністю популяції бактеріальних клітин переходити у латентний стан, в якому такі клітини лишаються живими, але втрачають здатність до розмноження, і таким чином, не можуть бути виявлені шляхом висіву на селективні середовища. А бактерії роду Pseudomonas відомі як такі, що здатні входити у латентний стан, коли вони не культивуються за певних несприятливих умов (Bjцrklцf et al., 2003).

Вплив P. fluorescens ІМБГ163 на асоціацію ендофітних бактерій картоплі. Бактерії, потрапляючи в рослинні тканини під час інокуляції експланта, не тільки здатні впливати на розвиток рослин в умовах in vitro, але і взаємодіяти з резидентними ендофітними бактеріями, впливаючи на їх стан, якісний та кількісний склад.

При визначенні присутності штаму P. fluorescens ІМБГ163 в рослинах-регенерантах картоплі сорту Нігру, після їх інокуляції мікробіологічним методом, тобто висадкою сегментів листя і коріння на селективне середовище КВ першого і п'ятого вегетативних поколінь, було показано присутність не тільки ризобактерій P. fluorescens ІМБГ163, а і бактеріальні рожево пігментовані колонії - ізолят М1. В контрольних рослинах нічого подібного не спостерігали.

Можна припустити, що ризобактерії P. fluorescens ІМБГ163 могли спровокувати вихід, із внутрішніх тканин рослин-регенерантів, інших бактеріальних клітин, які співіснують з рослинами картоплі даного сорту.

Ізолят М1 виділявся з усіх органів рослин: листя, стебел, коріння та колонізував рослину від верхівки до коріння. При цьому рослини-регенеранти росли і розвивалися добре, що свідчить про толерантність даної бактеріальго ізоляту до рослин картоплі.

Виходячи з того, що інокуляція рослин картоплі сорту Нігру штамом P. fluorescens ІМБГ163 могла спровокувати вихід ізоляту М1, було перевірено вплив цього штаму на угруповання ендофітних бактерій рослин картоплі сорту Загадка в умовах in vitro.

З отриманих рослин-регенерантів картоплі сорту Загадка, інокульованих бактеріями штаму P. fluorescens ІМБГ163 та з неінокульованих рослин виділяли ендофітні бактерії. Мікробіологічний аналіз рослин першого та другого вегетативних поколінь, отриманих з інокульованих експлантів, показав зменшення якісного складу резидентних бактерій. З тканин рослин першого вегетативного покоління було виділено 4 морфотипи ендофітних бактерій у кількості 1,2Ч10⁴ КУО/г з кореня і 2 морфотипи (по 20 КУО/г) із стебел. У другому вегетативному поколінні кількість виділених морфотипів зменшилася. На агаризованому середовищі з кореня рослин другого вегетативного покоління, відповідно, виділялося два морфотипи бактерій у кількості 2,0Ч10³ КУО/г. У контрольних рослинах, отриманих із неінокульованих експлантів, зміна якісного складу бактеріальних ізолятів була незначною. За данними мікроскопічного аналізу, бактерії є грам-позитивними паличками та диплококами, і це узгоджується з даними (Sessitsch et al., 2004), що свідчать про домінування грам-позитивних бактерій у ендоризі картоплі.

Оскільки бактерії, тісно асоційовані з рослиною, можуть змінювати свій стан, втрачаючи здатність культивуватися не тільки на штучних середовищах, а також у внутрішніх тканинах рослини при вирощування їх в культурі in vitro, використання методу поліморфізму довжини термінально-мічених рестрикційних фрагментів є інформативним методом для спостереження за якісними змінами в бактеріальних угрупованнях, асоційованих із рослинами.

За результатами аналізу поліморфізму довжини термінально мічених рестрикційних фрагментів ДНК рослин, ендофітна асоціація рослин-регенерантів картоплі сорту Загадка складається з тринадцяти філотипів ендофітних бактерій, які представлено тринадцятьма термінально-міченими рестрикційними фрагментами розміром від 39 до 568 п. н., отриманих у результаті рестрикції rrs-гену з ендонуклеазою HhaI.

Структура ендофітної асоціації стебла відрізняється від асоціації кореня. Мінімум чотири бактеріальні філотипи переходять з вічка до кореня і стебла, а один, з вічок не переходить у тканини кореня та листа рослин картоплі після їх введення в культуру in vitro. Шість термінально мічених фрагментів розміром (68, 262, 364, 435, 482, 539 п. н.) були виявлені тільки на рослинах, інфікованих бактеріальним штамом P. fluorescens ІМБГ163, який суттєво змінює ендофітну асоціацію коріння першого вегетативного покоління рослин, порівняно з контролем. В корінні першого покоління рослин, інфікованих псевдомонадами, виявляли десять філотипів (64, 68, 117, 262, 364, 432, 435, 482, 556, 568) при тому, як у контрольних тільки п'ять (64, 117, 432, 556, 568). У другому поколінні у складі ендофітної асоціації визначаються молекулярно-генетичним методом лише п'ять філотипів (64, 68, 117, 262, 568) з десяти у першому поколінні. При цьому у контрольному варіанті в корінні рослин другого покоління лише три філотипи (64, 117, 568) з п'яти, які визначено у першому поколінні.

Отже, склад ендофітної асоціації кореня збіднюється при клональному мікророзмноженні, а стебла - практично залишається без зміни. Структура ендофітної асоціації стебла несуттєво змінюється при введенні псевдомонасу (на один філотип збільшується).

Індукування розмноження ендофітів різними факторами, наприклад, фітопатогеном, до межі, коли бактерії можуть бути зареєстровані чутливими методами, відоме (Reiter et al., 2002), як і відомо, що несприятливі умови для розвитку рослини ускладнюють структуру бактеріальних асоціацій (Idris et al., 2004). Нами вперше показано збільшення різноманіття ендофітів у рослин картоплі in vitro під впливом ризобактерій. Ймовірно існують механізми, за допомогою яких рослина переводить деякі ендофіти з латентної у активну форму існування, і таким чином мобілізує свої резерви для боротьби за виживання в нестандартних умовах вирощування (умови in vitro).

Властивості бактеріальних ізолятів рослин картполі та їх таксономічна належність. Відомо, що ендориза картоплі, яка або вирощувалася на ділянках у грунті, або живцювалася, містить певну кількість типів бактерій та грибів (Krechel et al., 2002; Sessitsch et al., 2004). Бактерії належать до широкого спектру підгруп (-, -, - Protobacteria, Flexibacter-Cytophaga-Bacteroides, грам-позитивні бактерії з високим вмістом G+C пар та Planctomycetales).

З метою пошуку ендофітних бактерій з корисними для рослин властивостями було виділено ендофіти з рослин картоплі, інокульованих ризобактеріями P. fluorescens ІМБГ163, та проведено їх фізіолого-біохімічну характеристику. Серед усіх ендофітних бактерій, що активувалися після інокуляції рослин картоплі сорту Загадка і Нігру бактеріальним штамом P. fluorescens ІМБГ163, відібрано декілька ізолятів, які найчастіше виділялися з тканин, для подальшого їх вивчення. Це декілька бактеріальних ізолятів грамнегативних паличок. Ізоляти 62-65 виділено з тканин стебла рослин-регенерантів картоплі сорту Загадка першого вегетативного покоління після обробки P. fluorescens ІМБГ163, ізоляти 66 та 73 - з тканин кореня рослини картоплі у другому і третьому вегетативних поколіннях, та ізолят М1 виділений з рослин картоплі сорту Нігру. Деякі бактеріальні ізоляти виявляли антагоністичну активність до бактеріальних фітопатогенів Erwinia carotovora subsp. atrofaciens та Pseudomonas syringae pv. Syringae.

На відміну від штаму P. fluorescens ІМБГ 163, яким обробляли експланти картоплі, ізоляти мали ферментативні активності: пектиназну, целюлазну, протеазну, які є важливі для взаємодії з клітинною стінкою рослини та можуть бути асоційованими з біохімічними процесами, що відбуваються при модуляції стійкості рослини до стресів (Okubara et al., 2005).

Визначення таксономічної належності ізоляту М1.

Для встановлення видової належності бактеріального ізоляту бактерій М1, було визначено нуклеотидну послідовність частини гену, що кодує РНК малої субодиниці рибосоми бактерій М1.

Ампліфікацію ділянки гена проводили парою праймерів, один з яких помічено Cy5-барвником, тому можливо було проводити пряме секвенування, без клонування продукту у плазміді. Порівняльний аналіз визначеної послідовності 400 п. н. з відомими послідовностями з банку генів (GenBank, NCBI) підтвердив попередній висновок про приналежність ізоляту М1 до метилотрофних бактерій і показав найбільшу гомологію до бактерій видів M. radiotolerans (96-100%), M. organophilum (90%). Більш детальний аналіз цієї послідовності ДНК показав, що позиції крайніх нуклеотидів фрагменту мали місце у межах 791-1234 п. н. Фрагмент мав консервативну частину гену, яка характеризувалася постійним складом нуклеотидів у зазначених видів, і варіабельну ділянку (50 нуклеотидів), ідентичну виду M. radiotolerans. Від інших видів метилотрофних бактерій ізолят М1 відрізнявся 3-10 відмінностями у межах зазначеної послідовності. Таким чином, можна вважати, що найвірогідніше М1 є представником виду M. radiotolerans. Отриману послідовність внесено до банку генів (GenBank) під номером EF583689 (Methylobacterium radiotolerans). Даний штам було позначено як, ІМБГ290.

Як відомо, різні штами роду Methylobacterium часто виділяють з ґрунту, прісних водоймищ (Романовская и др., 1991), з бруньок, листя, коріння і культури тканин in vitro різних рослин, а також вони відомі як ендофітні бактерії (Pirttila et al., 2005; Van Aken et al., 2004; Leifert et al., 1994; Wilson et al., 1999; Pirttila et al., 2000; Doronina et al., 2004; Maliti et al., 2005). Наприклад, метилобактерії було виявлено як ендофіти зародку шотландської сосни (Pinus sylvestris) (Pirttila et al., 2000), також у цитрусових рослинах (Araujo et al., 2002; Lacava et al., 2006), бобових (Sy et al., 2001), та у тканинах тополі (Van Aken et al., 2004). З рослин картоплі метилотрофні бактерії були виділені нами вперше. Вони виділялися лише з рослин, які були попередньо інокульовані ризобактеріями P. fluorescens ІМБГ163.

Для перевірки можливості активації розмноження та виходу метилотрофних бактерій з рослин картоплі сорту Нігру під впливом ризобактерій, було проведено ПЛР на ДНК матриці інокульованих P. fluorescens ІМБГ163 і неінокульованих рослин картоплі сорту Нігру із специфічними праймерами (МВ і МВ4) для бактерій роду Methylobacterium.

У результаті ампліфікації рослинної ДНК, виділеної з листя рослин картоплі інокульованих ризобактерією, отримано продукт розміром 1015 п. н. як в рослинах першого, так і другого вегетативних поколінь, що свідчило про присутність M. radiotolerans ІМБГ290 в рослинах. В результаті ПЛР на матриці ДНК неінокульованих рослин метилотрофні бактерії не визначалися.

Можливо, метилотрофні бактерії природно співіснують з рослинами картоплі даного сорту в некультивованому стані, а колонізація тканин рослин штамом P. fluorescens ІМБГ163 активувала розмноження і вихід M. radiotolerans ІМБГ290 на поверхню рослин. Наскільки нам відомо, збільшення асоціації ендофітних бактерій в рослинах під впливом непатогенних бактерій не було відомо раніше. Індукування некультивованих бактерій різними факторами навколишнього середовища до межі, коли їх можна визначати чутливими методами, вже було раніше описано в іноземній літературі (Reiter et al., 2002; Indir et al., 2004). Однак деталі таких механізмів індукування поки що невідомі.

Здатність ендофітних бактерій рослин картоплі індукувати системну стійкість рослин. Останнім часом, все більше уваги приділяється вивченню механізмів формування індукованої системної стійкості (ІСС) у рослин, через перспективи біологічних способів захисту рослин, як альтернативи застосуванню хімічних засобів захисту рослин від захворювань. Проте, поки що, немає інформації щодо участі ендофітних мікроорганізмів у передачі сигналів, які йдуть до рослинної клітини із-зовні, і їхню присутність у тканинах рослин не враховують при дослідженні цих механізмів. Першим етапом у вивченні ймовірної ролі асоціації резидетних ендофітів у індукуванні системної стійкості рослини in planta є дослідження здатності окремих компонентів асоціації викликати ІСС у рослини.

Біотестування ІСС на рослинах арабідопсису полягає у перевірці їх стійкості до некротрофних фітопатогенів, після інокуляції рослин експериментальними бактеріями. Попередньо інокульовані рослини арабідопсису ізолятами ендофітних бактерій рослин картоплі вирощували у двох режимах (на агаризованому середовищі МС і комерційному стерильному грунті) і обробляли фітопатогеном P. syringae pv. tomato DC3000. У чутливих рослин ураження проявлялось жовтінням листя у місці контакту з патогеном у 100%, а стійкі рослини мали менший відсоток ураженого пожовклого листя.

Для позитивного контролю використовували ризобактерії P. fluorescens WCS417r, які індукують системну стійкість у арабідопсису до некротрофних фітопатогенів (Van Loon et al., 1998). Залік результатів проводили за відсотком уражених листків. За визнаною методикою рослина вважається стійкою, якщо вражається менше 50% листків. Отже, отримані результати свідчать про індукування системної стійкості до ураження фітопатогеном Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 більшістю протестованих ендофітів картоплі.

Таким чином, біотестування, що є попереднім тестом визначення індукування системної стійкості у рослин, показало, що більшість протестованих бактерій зменшують кількість уражених листків у арабідопсиса, тобто індукують клітинний захист у рослини.

Визначення експресії індикаторних генів клітинного захисту рослин, оброблених бактеріями. Гени арабідопсису PR-1 та PDF1.2 є індикаторами різних сигнальних шляхів клітинного захисту рослини: саліцілово- та ясмоново/етилен-залежних, відповідно (Ryu et al., 2005). Як зазначено вище, для виникнення ІСС необхідні ясмоново- та етилен - опосередковані шляхи передачі сигналу у рослині від ризобактерії (Pozo et al., 2002). Оскільки завданням було визначити роль ендофітних бактерій картоплі у формуванні ІСС, було використано метод ЗТ-ПЛР для визначення експресії гена PDF1.2, який кодує дефенсин у арабідопсису, і є прикладом синергізму між етилен- та ясмоново-сигнальними шляхами. Як негативний контроль використовували ген PR-1, маркерний для саліцілово-залежного шляху та характерний для системної набутої стійкості, і як позитивний контроль- EIF-1a ген фактора елонгації- 1 альфа.

Результати аналізу показали, що інокуляція арабідопсису ендофітним бактеріальним ізолятом рослин картоплі Pseudomonas putida 65C вже через дві доби призводить до cплеску експресії PDF1.2-гена, на відміну від контрольного зразка (без інокуляції), який має низький базовий рівень, і не впливає на експресію PR-1 гену. Експресія гена EIF-1a присутня у всіх зразках, незалежно від захисту рослини, у тому числі, і у необробленої рослини. Ген PR-1 - захисного білка активується тільки після обробки рослин фітопатогенною бактерією.

Доведення активування генa арабідопсису PDF2.1, яке відбувається при трансдукції сигналу від елісітора до клітини рослини по ясмоново-залежному шляху є доведенням факту формування цього (або одного з цих) шляху у рослини під впливом ендофітної бактерії P. putida 65C, отже, і того, що індукується системна стійкість у рослини.

Локалізація M. radiotolerans ІМБГ290 в тканинах рослин картоплі та їх вплив на ріст і розвиток рослин.

Вплив M. radiotolerans ІМБГ290 на ріст і розвиток рослин картоплі в умовах in vitro. Відомо, що деякі штами роду Methylobacterium здатні стимулювати проростання насіння і розвиток рослин, можливо, за рахунок синтезу фітогормонів (Lindstrom et al., 2002; Ivanova et al., 2000; Ivanova et al., 2001). В наших експериментах, інокуляція експлантів in vitro рослин картоплі сорту Червона рута бактерією M. radiotolerans ІМБГ290 стимулювало розвиток регенерантів та призводило до збільшення біомаси рослин. Так, за даними морфометричного і вагового аналізу рослин картоплі сорту Червона рута, інокульовані рослини відрізнялися достовірно від контрольних за висотою та масою. Зазначені результати дають підставу очікувати, що бактерії M. radiotolerans ІМБГ290 здатні продукувати регулятори росту рослин.

Тест на виділення індоліл-оцтової кистоти був негативним, а біотест на виділення цитокінінів на етиольованих сім'ядолях огірка показав достовірну різницю у масі між контрольними і обробленими сім'ядолями M. radiotolerans ІМБГ290.

Результати біотесту також показали, що приріст маси етиольованих сім'ядолів при обробці бактеріальною культурою M. radiotolerans ІМБГ290 у концентрації 5х10⁸ кл/мл відповідає позитивному контролю з додаванням кінетину у концентрації 0,5 мг/л. Отже, найвірогідніше, штам M. radiotolerans ІМБГ290 здатний синтезувати цитокініни.

Найбільшу питому кількість бактеріальних клітин M. radiotolerans ІМБГ290 було визначено у корінні на 45 добу росту і розвитку рослин, трохи менше їх було у листі і ще менше у стеблі. Протягом вегетації рослин кількість бактеріальних клітин у всіх органах рослин збільшувалась і вже на 105 добу найбільше бактеріальних клітин було локалізовано у листі, порівняно з іншими органами рослин. У другому вегетативному поколінні рослин, після їхнього клонального мікророзмноження, кількість бактеріальних клітин майже не зменшилася, у порівнянні з першим поколінням (45 доба росту рослин), що доводить конкурентноздатність бактерій.

Отже, при клональному мікророзмноженні рослин картоплі бактеріальні клітини штаму M. radiotolerans ІМБГ290 переходили з одного вегетативного покоління в наступне і таким чином утворювали стабільні асоціації з рослинами.

Локалізація ендофітних бактерій в тканинах рослин картоплі

Метилотрофні бактерії часто знаходять в рослинних тканинах (Leifert, 1994; Pirttila et al., 2000; 2005), але локалізація, інфекційний процес і роль цих бактерій у рослинах вивчаються рідко. В наших екпериментах, локалізацію метилотрофних бактерій в in vitro рослинах картоплі, інокульованих M. radiotolerans ІМБГ290, та в контрольних рослинах, визначали методом in situ гібридизації з зондом МВ специфічним для бактерій роду Methylobacterium (Pirttilд et al., 2000).

Результати аналізу показали присутність сигналів гібридизації рРНК метилотрофних бактерій в тканинах листків неінокульованих рослин, в основному, на верхівці листка в губчатій і полісадній паренхімі та в судинах ксилеми. У тканинах листа інокульованих рослин сигнал присутній в судинах ксилеми і в тканинах паренхіми.

В стеблах інокульованих рослин та неінокульованих рослин рРНК метилотрофів присутня в паренхімних та судинних тканинах. В контрольних рослинах сигнал слабший, ніж в оброблених. Фарбування ДНК, в зразку тканин стебла інокульованих рослин після in situ гібридизації, бромистим етидієм показав присутність Methylobacterium внутрі клітин паренхімних тканин. Особливо в тканинах паренхіми стебла, в сигналах після in situ гібридизації і фарбування ДНК, помічено присутність біоплівки. Присутність сигналів гібридизації рРНК бактерій роду Methylobacterium показали, що бактерії локалізуються в тканинах рослин у вигляді біоплівки. В корінні інокульованих рослин рРНК метилотрофів присутня у васкулярних і паренхімних тканинах. В контрольних рослинних тканинах кореня рРНК бактерій роду Methylobacterium не було знайдено.

Отже, метилотрофні бактерії присутні в усіх органах (листях, стеблах, коріннях) попередньо інокульованих рослин картоплі. Отримані нами результати in situ гібридизації продемонстрували прямі докази присутності метилотрофних бактерій у внутрішніх тканинах рослин картоплі. Ці бактерії можуть співіснувати з рослинами картоплі, які культивуються в умовах in vitro вже протягом півтора року. В неінокульованих рослинах більш інтенсивний сигнал гібридизації рРНК метилотрофів отримано в тканинах листків та стебел. Таким чином, метилотрофні бактерії віддають перевагу надземним органам рослин.

У зв'язку з тим, що метилотрофні бактерії в рослинах картоплі не можливо було виділити на селективні середовища, але при цьому визначалися у рослинах молекулярними методами (ПЛР, in situ гібридизація), це ще раз підтверджує той факт, що метилотрофні бактерії природно співіснують з рослинами картоплі в некультивованому стані. Відомо, що бактерії роду Methylobacterium можуть зберігатися у природному середовищі, формуючи біопліву (Kelley et al., 2004). Біоплівку часто знаходять на поверхні рослин, вона забезпечує бактерії механізмами для виживання в несприятливих умовах навколишнього середовища (Morris et al., 1997). Біоплівка - це також некультивований стан деяких бактерій. В наших експериментах in situ гібридизації певні структури біоплівки були визначені в паренхімі тканин стебла in vitro рослин картоплі. Тому постійне існування бактерій у вигляді біоплівки у внутрішніх тканинах картоплі пояснюється їхньою недостатньою культивованістю.

Ендофітні бактерії найбільш часто локалізуються в міжклітинних просторах та у судинах ксилемних тканин рослин (Reinhold-Hurek et al., 1987; Nghuen et al., 1989; James and Olivares 1997; Gyaneshwar et al., 2001; Compant et al., 2005). В наших дослідженнях специфічний сигнал метилобактерії in situ гібридизації був в основному локалізований в судинах ксилемних тканин листя і стебла неінокульованих рослин картоплі in vitro. Ці результати відповідають даним щодо внутрішньої колонізації рису бактеріями Serratia marcescens (Gyaneshwar et al., 2001), та колонізації рослин бавовни ендофітними бактеріями Enterobacter asburiae (Quadt-Hallmann and Klopper, 1996). В наших експериментах, відсутність бактеріальних клітин метилобактерії в корінні неінокульованих рослин картоплі, може пояснюватись імовірною участю цих бактерій в утилізації одновуглецевих сполук у внутрішніх тканинах паренхіми листа, де ці речовини продукуються у великих кількостях. Дослідниками було висунуто гіпотезу глобального “метанольного циклу”, яка передбачає участь у ньому рослин, які утворюють і виділяють метанол (Fall et al., 1996). Бактерії роду Methylobacterium використовують метанол, який виділяють рослини за допомогою продихів (Nemecek-Marshall et al., 1995), але механізм і характер цієї взаємодії до цього часу залишається мало вивченим, хоча на сьогодні відомо, що біля 50 білків рослин індукуються під час колонізації філосфери метилотрофними бактеріями (Gourion et al., 2006).

Застосування ендофітних бактерій для адаптації рослин картоплі, при клональному мікророзмноженні до умов ex vitro та для захисту посадкового матеріалу від фітопатогенів. Останнім часом широко застосовують розмноження та оздоровлення рослин в умовах in vitro. Обсяги виробництва оздоровленої розсади картоплі тільки в окремих технологічних центрах сягають мільйони рослин на рік (www.redbio.org/html/Content), так само, як і виробництва мінібульб (www.quantumtubers.com). Такі технології потребують розробки екологічно безпечних засобів захисту рослин від патогенної мікрофлори при адаптації до умов ex vitro для того, щоб запобігти значній втраті рослин під час перенесення у відкритий грунт. Окрім фізіологічних та анатомічних відхилень, які з'являються під час культивування в асептичних умовах, пробіркові рослини практично втрачають механізми стійкості до фітопатогенів, що ускладнює виживання таких рослин у відкритих грунтах. Використання бактерій для індукування системної стійкості рослин, як альтернативи агрохімічним засобам, має ряд очевидних переваг.

Збільшення обсягів розмноження рослин в умовах in vitro стало поштовхом до низки досліджень з розробки нових методів, які дозволяють отримувати стійкі асоціації між рослинами та корисними бактеріями для подолання трансплантаційного стресу у пробіркових рослин (Formmel at al., 1991; Kozyrovska et al., 1995; Петак и др., 1998; Pandey et al., 2000; Nowak et al., 2003).

Для інокуляції картоплі сорту Повінь відібрано два штами ендофітних бактерій P. putida 65С та M. radiotolerans ІМБГ290. Пробіркові рослини даного сорту, які попередньо пройшли оздоровлення від вірусів в інституті картоплярства УААН, обробляли суспензією бактерій при клональному мікророзмноженні. Отримані інокульовані та неінокульовані рослини-регенеранти картоплі через два місяці були розчеренковані і без повторного інокулювання висаджені у вермикуліт для адаптації. Контрольні рослини оброблено комерційним бактеріальним препаратом КЛЕПС (позитивний контроль) або залишено без будь-якої обробки (негативний контроль). Варто також зазначити, що попередньо оброблені експланти не обробляли перед висадкою у грунт.

Таким чином, приживлення живців картоплі, отриманих з рослин картоплі в умовах in vitro, за обробки різними препаратами становило: M. radiotolerans ІМБГ 290 - 94% , P.putida 65С - 92%, протруйник - 91%, контроль - 25%. Відповідно, вихід повноцінної розсади становив для М. radiotolerans ІМБГ290 - 91% , P. putida 65С - 90%, протруйник - 89%, контроль - 0%. Отже бактеризація оздоровленої картоплі на стадії переводу до умов ex vitro штамами M. radiotolerans ІМБГ290, P. putida 65С або біопрепаратом КЛЕПС дозволила підвищити приживлення рослин і сформувати повноцінну розсаду, а також уникнути обов'язкового застосування високовартісних хімічних пестицидів, котрі шкодять здоров'ю людей, знижують різноманітність природних популяцій бактерій та порушують екологічну рівновагу. Після висадки отриманої розсади у грунт врожайність мінібульб була вищою у варіантах з обробкою бактеріям становила M. radiotolerans ІМБГ290- 576 г/м², P. putida 65С - 589 г/м², що у порівняно з контролем (258 г/м² ) більше на 50 %. У варіантах з бактеріями зростає кількість і маса бульб першої фракції. Таким чином, позитивний вплив бактерій на розсаду сприяє збільшенню врожаю мінібульб з мінімальними витратами і без застосування протруйників.

...