Оптимізація структури мікробних угруповань кореневої зони озимої пшениці

Размещено на http://allbest.ru

ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ ТА БІОТЕХНОЛОГІЇ

УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК

03.00.16 - Екологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора сільськогосподарських наук

Оптимізація структури мікробних угруповань кореневої зони озимої пшениці

Шерстобоєва Олена Володимирівна

Київ - 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії технічної мікробіології Південного філіалу Інституту сільськогосподарської мікробіології Української академії аграрних наук та лабораторії екології ґрунтових мікроорганізмів Інституту агроекології та біотехнології Української академії аграрних наук

Науковий консультант - доктор біологічних наук, професор, академік УААН

ПАТИКА Володимир Пилипович,

Інститут агроекології і біотехнології УААН, директор інституту, м. Київ

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук, професор,

Петриченко Василь Флорович,

Інститут кормів УААН, директор інституту, м. Вінниця;

доктор біологічних наук, професор, заслужений діяч науки України,

Гвоздяк Ростислав Ількович,

Інститут мікробіології і вірусології НАНУ,

завідувач відділом фітопатогенних бактерій, м. Київ

доктор сільськогосподарських наук,

ЮРЧАК Лариса Дем'янівна,

Національний ботанічний сад ім. М.М. Гришка

НАНУ, провідний науковий співробітник відділу алелопатії, м. Київ

Провідна установа - Білоцерківський державний аграрний університет

Захист відбудеться “ 25 ” травня 2004 р. о 1300 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.371.01. при Інституті агроекології та біотехнології УААН за адресою: вул. Метрологічна, 12, м. Київ, Україна, 03143

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології та біотехнології УААН

Автореферат розісланий “____” ______________2004 р.

В. о. вченого секретаря спеціалізованої вченої ради,

доктор сільськогосподарських наук С.І. Тарасюк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Світова проблема необхідності підвищення валової продукції сільськогосподарського виробництва для зростаючого населення планети і критичний екологічний стан агроекосистем потребують створення якісно нових агротехнологій (Tilman et al., 2002).

Потенціальна можливість вирішень деяких аспектів екологічної проблеми методами сільськогосподарської мікробіології доведена багатьма авторами і базується на тому, що природою закладені всі механізми регулювання біосферних процесів: азотфіксація, антагонізм мікроорганізмів до фітопатогенів і шкідників сільськогосподарських культур, синтез мікроорганізмами біологічно активних речовин, спроможних суттєво впливати на фізіологічний стан рослин і їх імунітет, тощо (Кандыбин, 1987; Патика, 1992; Cмирнов та ін., 2002; Chainwаy, 1998; Smil, 2000; ).

Одним із засобів підвищення продуктивності сільськогосподарських угідь без шкоди для довкілля може бути збагачення кореневої зони рослин штамами мікроорганізмів, які відібрані за високою активністю корисних для рослин властивостей. Вже накопичено значний експериментальний матеріал щодо їх позитивного впливу на продуктивність рослин і якість одержаної продукції (Патика та ін., 1993; Тихонович, 1997; Lugtenberg, 2000). Проте, на даний час вивчення механізмів регулювання рослинно-мікробних взаємодій залишається недосконало вивченим. Тому необхідні глибокі дослідження щодо локалізації і вивчення чисельності популяцій штамів мікроорганізмів, інтродукованих у кореневу зону рослин, їх впливу на таксономічну і функціональну структуру резидентних мікробних угруповань та їх біологічну активність. У подальшому на основі чітких уявлень просторових, функціональних і екологічних взаємодій штамів-інтродуцентів з рослинами і мікроорганізмами їх кореневої зони важливо розробляти стратегію формування однієї з ланок сталого розвитку агроекосистем.

Відомо, що інтродукція штамів мікроорганізмів у ризоценоз залежить від їх конкурентної здатності. Тому, заміна менш активних резидентних штамів мікроорганізмів грунту на більш активні і конкурентноспроможні інтродуковані штами, дозволяє більш продуктивно використовувати явище рослинно-мікробних асоціативних взаємодій (Емцев и др., 1988; Белимов и др., 1998). Вони спроможні конкурувати з фітопатогенними формами мікроорганізмів і сприяти покращанню санітарного стану рослин (Мелентьев, 2000; Кравченко и др., 2002; Pishchik et al., 1995; Wei, 1996). Але умови здійснення цих взаємодій індивідуальні для кожної рослинно-мікробної системи і для оптимізації її функціонування потребують досконалого вивчення.

Створення комплементарних високоефективних рослинно-мікробних асоціативних і симбіотичних систем передбачає скринінг штамів мікроорганізмів з більш високою активністю комплексу потенційно корисних для рослин властивостей, створення на їх основі біотехнологій виробництва препаратів та технологій їх застосування у сільськогосподарському виробництві. Всі вищезазначені питання й лягли в основу досліджень даної роботи і вказують на їхню актуальність.

Зв'язок роботи з науковими програмами. Дисертаційна робота виконувалась за державними науковими програмами і тематичними планами Південного філіалу Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН відповідно науково-технічних програм УААН “Родючість ґрунтів” за завданням „Розробити високоефективні технології застосування мікробних препаратів у відновлювальних ресурсозберігаючих системах землеробства” (№ державної реєстрації 0198U005047); „Виробництво, переробка та зберігання сільськогосподарської продукції” за завданням „Розробити технології виробництва та використання мікробіологічних препаратів у землеробстві” (№ державної реєстрації 0198U005046); згідно тематичних планів Інституту агроекології та біотехнології УААН „Формування сталих агроекосистем” за завданням „Теоретично обґрунтувати і застосувати на практиці методи сільськогосподарської біотехнології для цілеспрямованого формування сталих агроекосистем” (№ державної реєстрації 0101U003296).

Мета і завдання досліджень. Мета досліджень - теоретичне обґрунтування, розробка науково-методичних засад і практичних заходів оптимізації структури мікробного угруповання кореневої зони озимої пшениці шляхом інтродукції штамів діазотрофів з комплексом потенційно корисних для рослин властивостей, безпечних для теплокровних тварин та розробка біотехнологій одержання препаративних форм штамів діазотрофів і їх ефективного використання у сільськогосподарському виробництві.

Для досягнення поставленої мети було поставлено такі завдання:

виділити з високопродуктивних біоценозів, описати та ідентифікувати штами азотфіксуючих бактерій, адаптовані до кореневих ексудатів озимої пшениці;

встановити локалізацію і чисельність популяцій інтродукованих штамів бактерій у ризоплані, ризосфері та едафосфері озимої пшениці;

вивчити функціональну структуру мікробних угруповань ризоплани, ризосфери і едафосфери озимої пшениці та її трансформацію;

встановити вплив інтродукованих у кореневу зону рослин діазотрофів на надходження азоту в грунт та рослини;

вивчити антифунгальну дію діазотрофів-антагоністів фітопатогенних грибів і розробити біопротекторний препарат сумісний з іншими біопрепаратами; пшениця кореневий діазотроф біопрепарат

на основі досліджень аутекології штамів діазотрофів розробити технологію одержання їх різних препаративних форм;

визначити ефективність мікробних препаратів і вплив ряду агрозаходів на взаємодію мікроорганізмів з рослинами;

дати еколого-гігієнічну оцінку біопрепаратів на основі азотфіксуючих бактерій.

Об'єкт дослідження: реакція рослин і мікробного угруповання кореневої зони на інтродукцію діазотрофів; аутекологія нових штамів діазотрофів і біотехнологічні розробки препаративних форм.

Предмет дослідження: штами діазотрофів, структура і активність мікробного угруповання кореневої зони озимої пшениці; продуктивність інокульованих рослин; субстрати для штучного формування популяцій штамів діазотрофів.

Методи досліджень: - лабораторні методи - визначення морфологічних, фізіолого-біохімічних і культуральних властивостей високоефективних штамів діазотрофів, функціональної і таксономічної структури та активності мікробного угруповання кореневої зони озимої пшениці, екологічної безпеки біопрепаратів на основі азотфіксуючих штамів бактерій для теплокровних тварин; вмісту азоту в грунті, фітомасі і зерні методами ґрунтової, технічної і медичної мікробіології, токсикології, агрохімії;

- вегетаційні і польові - вивчення ефективності застосування біопрепаратів, їх впливу на мікробіологічні властивості грунту та кількісні показники продуктивності озимої пшениці і інших сільськогосподарських культур;

- статистичний метод - встановлення вірогідності отриманих результатів експериментів, функціональних залежностей між різними чинниками і процесами на основі математико-статистичного, розрахунково-порівняльного методів аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вирішена актуальна агроекологічна проблема оптимізації структури мікробного угруповання кореневої зони озимої пшениці, яка включає розробку теоретичних і науково-методичних питань інтродукції діазотрофів у кореневу зону, їх впливу на мікробні угруповання ризоплани, ризосфери і едафосфери та продуктивність рослин.

Вперше встановлена локалізація і чисельність популяцій діазотрофів Agrobacterium radiobacter 204 і 8301, Paenibacillus polymyxa 6M, інтродукованих у кореневу зону озимої пшениці. Показана висока залежність діазотрофів від кореневих ексудатів і їх конкурентна здатність у мікробному угрупованні за рахунок засвоєння молекулярного азоту і важкорозчинних фосфатів та продукування речовин фітогормональної і антифунгальної дії.

Вперше доведено, що під впливом інтродукованих штамів діазотрофів у ризоплані та ризосфері озимої пшениці збільшується відношення числа бактерій і мікроміцетів, зокрема, за рахунок підвищення загальної чисельності азотфіксуючих бактерій і зниження кількості мікроміцетів у локальностях, де їх популяції набувають найбільшої чисельності. Це супроводжується відповідним підвищенням азотфіксуючої і целюлозоруйнуючої активності та антифунгального потенціалу мікробного угруповання ризосфери, що обумовлює надходження біологічного азоту в грунт і фітомасу рослин, поліпшення фітосанітарного стану та підвищення продуктивності озимої пшениці. В едафосфері подібних ефектів не виявлено.

На основі аутекологічних досліджень високоактивних штамів діазотрофів і біотехнологічних розробок створені високоефективні і екологічно безпечні технології одержання їх препаративних форм у гельних і вермикулітних субстратах.

Вперше показано, що вирощування озимої пшениці після гороху і чорного пару сприяє інтродукції високоефективних штамів діазотрофів і функціонуванню еколого-трофічної групи азотфіксаторів у кореневій зоні, що створює передумови для підвищення продуктивності рослин. Ячмінь і кукурудза, як попередники, створюють несприятливий едафофон для інтродукції діазотрофів і функціонування резидентної азотфіксуючої мікрофлори у кореневій зоні озимої пшениці, що й обумовлює низький рівень її врожайності. Вирощування інокульованої озимої пшениці після гороху дозволяє за рахунок азотфіксації, рістстимуляції і антифунгальної дії штамів підвищити її урожайність у середньому на 0,16 - 0,43 т/га.

Вперше, на основі токсикологічних, мікробіологічних, серологічних і гістологічних досліджень дано обґрунтування безпеки штамів Agrobacterium radiobacter 204 i Rhizobium leguminosarum П-2 як біоагентів препаратів діазофіт і ризобофіт.

Практичне значення отриманих результатів. Сільськогосподарському виробництву рекомендовані штами діазотрофів і біопрепарати на їх основі: діазофіт, ризобофіт, алкалігін, флавобактерин, антифунгальний препарат БСП, а також технології їх ефективного використання у виробництві.

Рекомендовано технології одержання мікробних препаратів і технічні умови їх промислового виробництва на вермикулітному і гельному субстратах, які захищені патентами України №№: 17694А,С05F11/08.-1997; 49390A,C12N1/20, C12 Q 1/04/-2002; 53187F, C12N1/20, C05F11/08.- 2003; 56032A, C05F11/08, C12N.- 2003.

Для екологічного і санітарного контролю виробництва мікробних препаратів рекомендовано методи визначення кількості бактерій Agrobacterium radiobacter, Paenibacillus polymyxa, Rhizobium і Bradyrhizobium у повітрі робочої зони як біоагентів препаратів. Методи впроваджені в санітарно-епідеміологічних контролюючих органах МОЗУ.

Для використання в біотехнологічних розробках запропоновано метод елективної селекції діазотрофів, адаптованих до кореневих виділень певного виду рослин, який захищений патентом України № 59033A, 7C05F11/08.-2003.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною роботою автора, в якій проаналізовано відповідну наукову літературу, висунуто робочу гіпотезу та концепцію, обґрунтовано і розроблено програму досліджень, проведено лабораторні, вегетаційні, польові та виробничі досліди та статистичний аналіз одержаних результатів. Мікробіологічні і біотехнологічні експериментальні дослідження, аналіз одержаних результатів, їх узагальнення та інтерпретація, написання друкованих наукових праць, наукових звітів, складання технологічних регламентів і технічних умов, виконано автором особисто або безпосередньо під її керівництвом. Автор приймала участь у розробці рекомендацій виробництву.

Польові досліди проводились сумісно з співробітниками відділу агротехніки Миронівського інституту пшениць ім. В.М. Ремесла, кандидатом сільськогосподарських наук А.І. Шевченко, старшим науковим співробітником А.І. Твердохліб; завідувачем відділом біологізації землеробства Інженерно-технологічного Інституту „Біотехніка” УААН, доктором сільськогосподарських наук В.В. Гармашовим; дослідження безпеки препаратів на базі Українського наукового гігієнічного центру МОЗУ у співпраці із співробітниками лабораторії гігієни і токсикології біопрепаратів (керівник: доктор медичних наук, професор Т.Г. Омельянець).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, основні положення та висновки дисертації доповідались та обговорювались на вчених радах Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН, Інституту агроекології та біотехнології УААН, на засіданнях Комісії з біологічних факторів Комітету з питань гігієнічної регламентації МОЗУ, а також наукових конференціях, симпозіумах, з'їздах: „Экологические аспекты загрязнения окружающей среды”, Киев, 1996; „Селекція, насінництво і технології вирощування польових культур”, Чернівці, 1996; „Биоконверсия органических отходов и охрана окружающей среды”, Киев, 1996; „Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье”, АР Крим (Алушта), 1998; „Экологические проблемы садоводства”, Ялта, 1998; „Сталий розвиток агроекологічних систем в умовах обмеженого ресурсного забезпечення”, Київ, 1998; „Насінництво кормових культур в сучасних умовах господарювання”, Київ, 1999; „Промышленные технологии производства средств биологизации земледелия.”, Одесса, 1999; „Оптимізація структури агроландшафтів і раціональне використання ґрунтових ресурсів”, Київ, 2000; „Онтогенез рослин, біологічна фіксація молекулярного азоту та азотний метаболізм”, Тернопіль, 2001; „Сталий розвиток агроекосистем”, Вінниця, 2002; „Optimization of processes nitrogen fixation, phosphor mobilization and control plant's disease in biological agriculture”, Hungary, 2002; „Микробиология и биотехнология ХХІ столетия”, Минск, Белорусь, 2002; „Використання побічної продукції в землеробстві”, Київ, 2003; „11-th Inter. Congr. On Molecular Plant-microbe Interactions”, St.-Petersburg, Russia 2003.

Публікації. Результати досліджень і матеріали за темою дисертації викладені у 61 науковій праці, у тому числі, 1 монографії (у співавторстві), 29 наукових статтях у фахових виданнях, 18 тезах, 7 науково-методичних працях, 6 патентах України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 296 сторінках машинописного тексту, ілюстровано 77 таблицями, 42 рисунками, 14 фотографіями. Складається з 7 розділів, 5 з яких є експериментальною частиною роботи, вступу, загальних висновків, рекомендацій виробництву, додатків. Список використаних джерел включає 416 найменувань, з них 147 іноземною мовою.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Наведено аналіз експериментальних даних і теоретичних розробок опублікованих зарубіжними і вітчизняними дослідниками щодо впливу інтродукції мікроорганізмів у ризосферу рослин на активність мікробного угруповання кореневої зони і продуктивність рослин. На основі здійсненого аналізу обґрунтовано актуальність і перспективність проведення досліджень.

Умови, матеріали і методи досліджень

Досліджували як нові штами діазотрофів, що виділяли з коренів рослин природних фітоценозів і високопродуктивних агрофітоценозів різних географічних і грунтово-кліматичних зон, так і штами, які одержали з різних наукових організацій для створення їх препаративних форм і дослідження ефективності їх застосування в Державній мережі дослідів України і Росії. Рослинним об'єктом досліджень була озима пшениця, в окремих біотехнологічних розробках - й інші культури.

Виділяли азотфіксуючі штами бактерій з кореневої зони рослин методом скринінгу, а також розробленим і запатентованим нами елективним методом (Шерстобоєва та ін., 2003).

Морфологію бактеріальних клітин вивчали за допомогою фазово-контрастної і електронної мікроскопії, використовуючи мікроскопи „Laboval 4” і „TESLA BS-540”. Бактеріальні культури для електронно-мікроскопічних досліджень фіксували у парах оксиду осмію.

Культуральні і фізіолого-біохімічні властивості виділених штамів бактерій вивчали за методами, які використовуються як ідентифікаційні тести (Скворцова, 1981; Смирнов и др., 1982; Ash, 1993). За встановленими диференційними ознаками ідентифікували нові штами бактерій, використовуючи 9-те видання визначника Bergey (1984).

Нітрогеназну активність штамів діазотрофів та ґрунтового угруповання кореневої зони рослин визначали методом ацетиленредукції (Hardy, 1968) за допомогою газового хроматографа марки „Chrom-5”.

Спектр дії антагоністичних властивостей досліджених штамів мікроорганізмів щодо фітопатогенних грибів визначали за посібником „Мікологія и фітопатологія” (1982). Інфекційний фон грунту штучно формували, застосовуючи тест-культури фітопатогенних мікроміцетів Fusarium graminearum та Bipolaris sorokiniana.

Резистентні до антибіотику штами діазотрофів одержували культивуванням на середовищах зі зростаючим градієнтом концентрації (Герхард, 1984).

Чисельність основних еколого-трофічних груп мікроорганізмів визначали методом граничних розведень і висівом їх на елективні поживні середовища (Звягінцев, 1991). Технологічність нових штамів бактерій визначали за Г.А. Нікітіним (1981), динаміку росту культур бактерій при періодичному культивуванні - за І. Л. Работновою (1989).

Грунт кореневої зони диференціювали пошарово за методом В.П. Патики та ін. (1991), ризоплану від ризосфери відокремлювали за методом О.О. Берестецького та ін. (1978).

Безпеку штамів симбіотичних і асоціативних бактерій та препаратів на їх основі щодо теплокровних організмів вивчали згідно діючих методичних вказівок (Григорьева,1981; Фримель,1987; Алексеева, 1991).

Польові досліди проводили на базі Миронівського Інституту пшениці ім. В.М. Ремесла (МІП УААН): грунт - чорнозем типовий, вміст гумусу в орному шарі 3,6-4,2%, рухомого фосфору - 128-189, обмінного калію - 95-127 мг/кг грунту, рН сольове - 5,2-6,5, гідролітична кислотність - 1,7-2,2 мг-екв; на базі Одеської ДСГДС УААН: грунт - чорнозем південний з вмістом гумусу 2,8-3,1%, легкогідролізованого азоту - 44-48, рухомого фосфору - 105-123, обмінного калію 181-223 мг /кг грунту, рН водне - 6,9; на базі Південного філіалу Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН грунт чорнозем: вміст гумусу 2,2-3,3%, легкогідролізованого азоту - 23-28 мг, рухомого фосфору - 50-61 мг, калію - 50-58 мг/кг грунту. Повторення дослідів чотириразове, рендомізоване розміщення ділянок. Норма висіву насіння - 5 млн. насінин на 1 га.

Агрохімічні аналізи здійснювали стандартними методами, що наведені у „Практикумі по агрохімії” (1989).

Статистичний аналіз вірогідності одержаних результатів проводили за допомогою методик, описаних Б.А. Доспеховим (1985) і стандартних комп'ютерних програм „Статистика” (Царенко та ін, 2000).

Моніторинг і виділення діазотрофів з комплексом

потенційно корисних для рослин властивостей

Створення мікробних препаратів та застосування їх в екологічно безпечних агротехнологіях для поліпшення кореневого живлення рослин і захисту їх від фітопатогенів передбачає селекцію мікроорганізмів з природних і аграрних високопродуктивних біогеоценозів, які можуть бути конкурентоздатними при інтродукції у кореневу зону культурних рослин і регуляторно впливати на структуру і активність її мікробного угруповання. Методом скринінгу з 139 зразків грунту нами було одержано 528 ізолятів, які утворювали колонії на безазотних поживних середовищах. Більшість ізолятів виявились олігонітрофілами. 16 штамів проявляли високу нітрогеназну активність, із них лише штами 7201 і 8306 (0,3% від загальної кількості ізолятів), утворювали асоціативні зв'язки з рослинами пшениці. За допомогою розробленого елективного методу (Шерстобоєва та ін., 2003) з 37 зразків ризосферного грунту виділено 5 штамів бактерій з високим рівнем нітрогеназної активності, які здатні до асоціативної азотфіксації з рослинами пшениці і накопичення на 2,5-4,2 мг азоту в 1 г більше, ніж неінокульовані рослини.

Дослідження морфологічних, фізіолого-біохімічних та культуральних властивостей виділених штамів діазотрофів дозволило ідентифікувати їх як Agrobacterium radiobacter 8301 і 8301 Paenibacillus polymyxa 6М, Alcaligenes рaradoxus 221 і 207, Flavobacterium sp. 7201 та Azospirillum brasilense 408.

Культури нових штамів діазотрофів набувають максимальних значень нітрогеназної активності від 57 до 957 нм С2Н4/см3/годину при інкубуванні у середовищі з малатом і глюкозою, крім азоспірил, які максимальну активність 441 нм С2Н4/ см3/годину демонструють при культивуванні на середовищі з органічними солями натрію (табл.1). Штами не ростуть і не фіксують азот у середовищі з метанолом, тобто не є олігонітрофілами (Андріюк та ін, 1992).

Таблиця 1

Азотфіксація (НА), фосфатмобілізація, стимуляція росту рослин

та антифунгальні властивості нових штамів діазотрофів

Штами	НА, нм С2Н4/ мл/год.	Зона розчинення фосфатів, мм	Стимуляція росту рослин, %	Пригнічення росту фітопатогенів, мм
		мінеральні	органічні
Agr. radiobacter 8301	110±14	-	0,9±0,2	57,8±0,5	2 ч 15
Agr. radiobacter 8306	752±15	1,4±0,3	1,8±0,3	23,7±0,3	3 ч 5
P. polymyxa 6М	62±4	-	2,3±0,4	5,2±1,0	32 ч 39
Alc. рaradoxus 221	957±46	0,9±0,1	0,6±0,1	7,9±1,0	0
Az. brasilense 408	441±21	-	-	34,2±0,7	0
Alc. рaradoxus 207	659±35	-	-	42,1±0,5	0
Flavobacterium sp.7201	672±20	-	-	18,4±1,0	0

Замочування насіння озимої пшениці у культурі штамів у різній мірі стимулює ріст рослин. Культивування на середовищах Муромцева з трикальційфосфатом та з фітином як джерел фосфору мінерального та органічного походження, виявило здатність Alc. рaradoxus 221, P. polymyxa 6М, Agr. radiobacter 8301 і 8306 до фосфатмобілізації. P. polymyxa 6М, Agr. radiobacter 8301 і 8306 продемонстрували гальмування розвитку п'яти тест-культур фітопатогенних мікроміцетів, і величини зон пригнічення складали відповідно 32 - 39, 2 - 15 і 3 - 5 мм.

Методами зустрічних культур і накладання агарових блоків встановили , що P. polymyxa 6М має широкий спектр антагоністичної дії і пригнічує ріст 11 з 14 досліджених тест-культур фітопатогенних мікроміцетів.

Характерною особливістю P. polymyха 6М є відсутність бактеріостатичної дії щодо бактерій-продуцентів мікробних препаратів, які застосовуються в Україні для поліпшення кореневого живлення сільськогосподарських рослин, що в подальшому дало змогу використовувати його як біопротектор антифунгальної дії у комплексі біопрепаратів. При мікроскопічних дослідженнях у фазовому контрасті впливу антагоніста P. polymyxa 6М на тест-культури фітопатогенних мікроміцетів спостерігали лізис міцелію мікроміцетів у зоні дифузії антифунгальної речовини. Швидка дезактивація антибіотичної речовини in vitro в стерилізованій мікрофільтрацією культуральній рідині, опосередковано свідчила про білкову природу антибіотичного чинника. Визначили, що основний фактор антагонізму штаму щодо мікроміцетів обумовлено продукцією ферменту хітинази. Встановлено також додаткові фактори антагонізму, які обумовлені високою питомою швидкістю росту штаму та підвищенням показника рН середовища за рахунок продукції лужних метаболітів.

Висновки, зроблені на основі результатів лабораторних досліджень антагонізму чистих культур мікроорганізмів на штучних середовищах, часто не реалізуються у природному середовищі. Проте інокуляція насіння озимої пшениці культурою P. polymyxa 6М знижувала кількість пропагул мікроміцетів на його поверхні

Через 2 години після інокуляції насіння пшениці і ячменю штамом-антагоністом кількість пропагул грибів на їх поверхні, у порівнянні з контролем, була менша вихідної в 1,3 - 4,0 рази, через 1 місяць - в 7 - 9 разів, що не поступалось дії хімічних фунгіцидів фундазолу і максиму.

Зниження кількості епіфітної мікофлори обробкою насіння P. polymyxa 6М у вегетаційному досліді значно знижувала як поширення кореневих гнилей озимої пшениці, так і інтенсивність їх проявлення. Уражених гниллю рослин виявлено менше на 12%, ніж у варіанті без інокуляції, і на 11% знизився розвиток хвороби. Наслідками контролю фітопатогенів було підвищення антифунгальної активності у кореневій зоні і суттєвий (18,8%) приріст сухої біомаси рослин (табл. 2).

Таблиця 2

Вплив Paenibacillus polymyxa 6М на фітомасу і спонтанну ураженість

озимої пшениці сорту Обрій кореневими гнилями

Варіант досліду	Поширення хвороби,%	Розвиток хвороби, %	Суха фітомаса, г/ судину	Приріст до контролю,%
Контроль	44,8	31,5	1,6	_
Інокуляція	32,7	20,4	1,9	18,8
НІР05	4,16	3,90	0,07

У більшій мірі проявилась біопротекція P. polymyxa 6М при вирощуванні інокульованого насіння озимої пшениці на інфекційному фоні фітопатогенного мікроміцету Fusarium graminearum. У цьому випадку, поширення кореневих гнилей зменшувалось на 29% і у 2,5 рази перебільшувало ефективність його дії у попередньому досліді зі спонтанним ураженням рослин кореневими гнилями (табл. 3). Інтенсивність проявлення кореневих гнилей при дії P. polymyxa 6М на інфекційному фоні була менше у 2,2 рази. В той час як накопичення сухої маси рослин було на 46,2% більшим, ніж у контролі.

Таблиця 3

Вплив Paenibacillus polymyxa 6М на фітомасу і ураженість озимої пшениці сорту Обрій кореневими гнилями на інфекційному фоні Fusarium graminearum

Варіант досліду	Поширення хвороби, %	Розвиток хвороби, %	Суха фітомаса, г/судину	Приріст до контролю, %
Контроль	83,0	42,4	1,3	-
Інокуляція	59,1	19,4	1,9	46,2
НІР05	7,22	4,7	0,13

Таким чином, досліджені штами асоціативних діазотрофів є активними азотфіксаторами за функціональною ланкою у мікробному ценозі. Крім того, вони здатні продукувати рістрегулюючі речовини, трансформувати мінеральні або органічні недоступні рослинам фосфати, проявляти антагонізм щодо фітопатогенів. Зазначені властивості штамів важливі для їх адаптації у природному середовищі і конкурентоспроможності у мікробному ценозі грунту.

Вплив діазотрофів на мікробне угруповання

кореневої зони озимої пшениці

Інокуляція озимої пшениці штамами асоціативних діазотрофів рослин показала, що поверхнева тканина коренів ювенільних рослин є недоступною для проникнення досліджених штамів у гістосферу. Проте пошкодження епіблеми скарифікацією або кореневими гнилями дозволяє Аgr. radiobacter 204str і P. polymyxa 6Мstr і B. subtilis 26Dstr проникати в гістосферу і утворювати невеликі локальні популяції без системної дисемінації у тканинах (табл. 4).

Таблиця 4

Вплив ендофітних популяцій бактерій на фітомасу і ураженість озимої пшениці гельмінтоспоріозною гниллю

Варіант	Чисельністьпопуляцій, КУО/см	Ураженість рослин, %	Фітомаса, г
Контроль		49,3 ± 3,4	0,22 ± 0,04
Agr. radiobacter 204str	9 - 21	39,9 ± 5,0	0,22 ± 0,07
P. polymyxa 6Мstr	12 - 27	16,5 ± 2,2	0,27 ± 0,04
B. subtilis 26Dstr	17 - 44	14,0 ± 3,8	0,25 ±0,09

У досліді на інфекційному фоні Bipolaris sorokiniana ступінь ураженості рослин, які містили ендофітні популяції P. polymyxa 6M str і B. subtilis 26D str був нижчим на 33 - 35 %, порівняно з контрольними рослинами. Позитивний ефект захисту рослин від хвороби підтвердився результатами визначення накопичення рослинами сухої фітомаси. Так, при біомасі рослин 0,22 г у контрольному варіанті біомаса рослин, з кореневих тканин яких висівались B. subtilis 26D str і P. polymyxa 6M str була, відповідно, 0,25 і 0,27 г.

Agr. radiobacter 204str і 8301str та P. polymyxa 6Мstr проявили найбільш високу конкурентну здатність у ризоценозі озимої пшениці. Вони колонізували ризоплану, ризосферу та едафосферу, але розташування їх популяцій носило індивідуальний характер. Інтродуковані діазотрофи утворювали максимальні за чисельністю популяції у зоні дії кореневих виділень, яка зменшувалась за мірою віддалення від коренів

Популяція штаму Agr. radiobacter 204str однаково представлена в ризоплані і ризосфері і складала 53 - 68 тис. КУО/г. Чисельність популяції Agr. radiobacter 8301str в ризоплані була найвищою і складала 61 тис. КУО/г, але вже в ризосфері знижувалась удвічі.

Факультативний анаероб бацилярний штам P. polymyxa 6М str найбільшу активність проявляв у грунті ризосфери, досягаючи чисельності 52 тис./г. На кореневій поверхні його чисельність була вдвічі меншою, що пояснюється більшою конкурентною здатністю не спороносних бактерій у ризоплані (Звягинцев и др., 1999). Не можна виключити й наявність поживного субстрату у вигляді міцелію мікроміцетів, якого значно більше у ризосфері, ніж у ризоплані рослин.

Вивчення структури мікробного комплексу диференційованої кореневої зони 30-ти добових рослин озимої пшениці показало, що в усіх локальностях кореневої зони за чисельністю переважають прокаріоти і відсоток мікроміцетів складає всього 0,03% від загальної чисельності мікроорганізмів у ризоплані і 0,08% - у ризосфері. Завдяки міцелярному характеру росту мікроміцети представлені рівномірно розвинутими популяціями.

На відміну від них, бактеріальне угруповання ризоплани характеризується великою чисельністю амоніфікаторів - 115 млн. КУО/г коренів, яка зменшується в ризосфері в 2,5 рази, а в едафосфері - у 8 разів. Целюлозоруйнівних бактерій виявлено в 30 разів більше в ризоплані, порівняно з ґрунтом, що обумовлено наявністю біля кореневої поверхні поживного субстрату у вигляді відмерлих рослинних клітин. Азотфіксуюча мікрофлора найбільш представлена в ризоплані і ризосфері (до 180 тис. КУО/г), знижуючись вдвічі в едафосфері. Оліготрофів, навпаки, в ризосфері виявляли менше у 3 рази, ніж в едафосфері, а на кореневій поверхні вони практично відсутні. Конкуренція за елементи живлення зосередила мікроорганізмів-антагоністів у зонах найбільш збагачених кореневими ексудатами і їх найбільшу чисельність виявляли в зоні дії кореневих виділень.

Колонізація кореневої зони озимої пшениці діазотрофами ініціювала трансформацію функціональної і таксономічної структури їх мікробного угруповання. Так, в ризоплані рослин, інокульованих Agr. radiobacter 204str, кількість азотфіксуючих бактерій збільшувалась у 1,5 рази, в ризосфері майже у 2 рази порівняно з контролем. Найбільша чисельність популяції Agr. radiobacter 8301str в ризоплані обумовила високу чисельність азотфіксуючих бактерій на кореневій поверхні (рис.3). Колонізація коренів P. polymyxa 6М не впливала на кількість асоціативних ризопланих діазотрофів. Проте, вона сприяла значній активізації розвитку азотфіксуючих бактерій у грунті ризосфери, де їх загальна чисельність досягала 290 тис. КУО/г грунту, що відповідало найбільшій чисельності інтродукованого P. polymyxa 6М у цій локальності.

Інтродукція діазотрофів у різній мірі пригнічувала розвиток мікроскопічних грибів у ризоплані і ризосфері рослин (рис. 4). Найбільший ефект гальмування розвитку мікроміцетів спостерігали при інокуляції насіння діазотрофом P. polymyxa 6М.

Завдяки багатофакторності антифунгальної дії він знижував чисельність пропагул мікроміцетів у всіх досліджених локальностях кореневої зони. Агробактерії, у шарах грунту віддалених більш ніж на 1,5 мм від кореневої поверхні, де чисельність їх популяції знижувалась втричі, не впливали на їх розвиток.

За умов азотного дефіциту, характерного для ризосфери, діазотрофи, завдяки засвоєнню молекулярного азоту, отримують перевагу і витискають азотозалежні мікроорганізми, у тому числі представників таксономічної групи мікроміцетів.Чисельність мікроорганізмів-антагоністів фітопатогенних мікроміцетів у кореневій зоні озимої пшениці була максимальною у ризоплані і грунті, прилеглому до кореневої поверхні, що обумовлено необхідністю конкурувати за елементи живлення з іншими представниками мікробного угруповання і інтродукція антифунгального штаму P. polymyxa 6М збільшувала їх кількість. Відповідно, зростав антифунгальний потенціал грунту.

Встановили певні тенденції активізації азотозалежних мікроорганізмів - стрептоміцетів, целюлозоруйнуючих мікроорганізмів і мікроорганізмів трансформуючих органофосфати.

Спираючись на функціональні особливості і логіку взаємовідношень азотфіксуючих і целюлозоруйнуючих мікроорганізмів, можна було сподіватись на значну підтримку активності розкладу целюлози біологічним азотом. Проте інтродуковані діазотрофи проявляли незначний вплив на розвиток популяцій мікроорганізмів, які руйнують целюлозу. Таку тенденцію виявили лише в ризоплані при колонізації коренів штамами агробактерій, де чисельність їх популяцій була максимальною.

Закономірного і достовірного впливу інтродукованих штамів діазотрофів на інші еколого-трофічні групи (амоніфікатори, оліготрофи, стрептоміцети, педотрофи тощо) не відмітили. Це пояснюється їх різницею у ферментних системах і функціональній ролі як ланок у ланцюзі мікробних процесів, які відбуваються у грунті кореневої зони рослин.

На відміну від горизонтального, вертикальний розподіл до 7,5 см у глибину не показав значних коливань чисельності популяцій інтродукованих діазотрофів і основних еколого-трофічних груп мікроорганізмів. Для нього характерно планомірне зниження чисельності інтродукованих агробактерій в ризоплані від базальної до апікальної частини кореня, що пов'язано з різницею у швидкостях росту кореня і колонізації його поверхні штамами-інтродуцентами, а також від інтенсивності кореневої ексудації різними частинами коренів.

Активізація процесу фіксації азоту в кореневій зоні рослин сприяла надходженню азоту в грунт і фітомасу. Інтродукція Agr. radiobacter 204 і 8301, Р. polymyxa 6М у кореневу зону озимої пшениці сорту Обрій сприяла підвищенню вмісту загального азоту в грунті ризосфери, відповідно, до 0,28, 0,30 і 0,27%, що незначно відрізнялось від контрольного рівня і було обумовлено відтоком азотних сполук у рослини (рис. 5). У шарі грунту 1,5 - 3,0 мм ризосфери інокульованих рослин вміст загального азоту, залишався на такому ж високому рівні і значно, на 0,08-0,11%, переважав вміст загального азоту в грунті контрольного варіанту. За мірою віддалення від кореня вміст загального азоту знижується до рівня в грунті контрольного варіанту, що відповідає зниженню загальної чисельності мікроорганізмів.

Результатом оптимізації складу мікробного угруповання і активізації корисних для рослин мікробних процесів у кореневій зоні було надходження доступних азотних сполук у рослини з ризосферного грунту. Так, у фітомасі озимої пшениці, інокульованої діазотрофами, вміст азоту був на 1,5 - 2,0 мг/г більше, ніж у фітомасі контрольних рослин. Це є свідченням того, що рослини активно засвоювали азотні сполуки, створюючи від'ємний градієнт їх концентрації у грунті кореневої зони. Тому, незважаючи на суттєвий приріст вмісту азоту в ризосфері за рахунок біологічного азоту, він був значно нижчий, ніж у грунті без рослин, і діяльність діазотрофів не ліквідувала повністю його дефіцит.

Коректність висновків, зроблених на основі результатів експериментів, одержаних у модельних дослідах, була підтверджена мікробіологічними аналізами грунту ризосфери різних сільськогосподарських культур у польових дослідах з біопрепаратами, розташованих у різних грунтово-кліматичних умовах.

Так, аналіз грунту кореневої зони озимої пшениці сорту Обрій у польових дослідах ПФ ІСГМ УААН 1997-1999 рр., інокульованої Agr. radiobacter 204str, показав, що кількість представників штаму в ризосфері в фазу кущіння складала близько 40 тис. КУО в 1 г грунту і слабо змінювалась за роками. Інтродукція штаму Agr. radiobacter 204str сприяла збільшенню кількості азотфіксуючих бактерій з 7,6 до 18,8 млн. КУО в 1 г грунту і, відповідно, підвищенню азотфіксуючої активності ризоценозу в 2 рази порівняно з контролем (табл. 5). Отримані у наступних роках результати відрізнялись від наведених лише величиною абсолютних чисел, але реакція ризоценозу і спрямованість процесів були аналогічними.

Аналіз складу та активності ризоценозу озимої пшениці виявив, що розклад заораної зеленої маси кукурудзи при внесенні 40 кг/га мінерального азоту або інтродукції Agr. radiobacter 8301 супроводжувався перебудовою мікробного угруповання кореневої зони і його активності.

Таблиця 5

Реакція мікробного угруповання ризосфери озимої пшениці сорту Обрій

на інтродукцію Agrobacterium radiobacter 204str

Варіант досліду	Чисельність мікроорганізмів, КУО в 1 г грунту	НА*, нм С2 Н4 /корінь /добу
	Амоніфікатори, х106	Спорові бактерії, х103	Стрептоміцети, х106	Мікромі цети, х103	Азотфіксуючі бактерії, х106
Контроль	34,0 ± 2,5	650 ± 50	1,7 ± 0,1	100 ± 16	7,6 ± 2,4	1,16 ± 0,29
Інокуляція	22,2 ± 1,2	590 ± 30	1,3 ± 0,3	25 ± 3	18,8 ± 6,0	2,02 ± 0,45

Примітка. НА * - нітрогеназна активність

У фазу кущіння збільшувалась чисельність трофічних груп мікроорганізмів, які відповідають за деструкцію високомолекулярних сполук. Це в свою чергу, у відповідності з законами мікробної сукцесії на органічній речовині, індукувало розвиток мікроорганізмів, які споживають низькомолекулярні органічні сполуки і трансформують їх у мінеральні форми, доступні відповідним трофічним групам мікроорганізмів і рослинам.

Нестача азоту при розкладі органічних добрив з високим вмістом вуглецю індукувала розвиток азотфіксуючих мікроорганізмів і підвищення процесу азотфіксації у кореневій зоні рослин. Внесення мінерального азоту дещо гальмувало активність азотфіксації у ранні фази розвитку рослин (табл. 6).

Таблиця 6

Біологічна активність мікробного угруповання кореневої зони озимої пшениці сорту Обрій у фазу кущіння при внесені мінерального азоту і інтродукції Agrobacterium radiobacter 8301 (Одеська ДСГДС, 1996-1998 рр.)

Варіант	Контроль	N40	Agr. radiobacter 8301
Нітрогеназна активність нМ С2Н4 /корінь/добу
Без органічних добрив	12,8 ± 2,7	9,8 ± 0,6	21,7 ± 0,3
Рештки кукурудзи	18,3 ± 3,1	14,5 ± 1,1	37,8 ± 3,5
Целюлозоруйнівна активність, %
Без органічних добрив	16,2 ± 3,1	25,6 ± 5,3	28,5 ± 3,0
Рештки кукурудзи	37,2 ± 3,0	61,2 ± 4,9	58,3 ± 7,3
Антифунгальна активність, середня величина зони пригнічення грибів, мм
Без органічних добрив	0	0	0
Рештки кукурудзи	0 ч 1	0 ч 1	7 ч 17

Целюлозоруйнівна активність зростала на 21 - 24% при внесенні 40 кг/га мінерального азоту і при надходженні біоазоту, що обумовлено оптимізацією співвідношення вуглецю і азоту.

Азотфіксуючий штам Agr. radiobacter 8301 відноситься до конкурентноздатних ризопланних мікроорганізмів і може гальмувати розвиток фітопатогенних мікроміцетів. Тому при інтродукції діазотрофу спостерігали підвищення антифунгального потенціалу ризосферного грунту в фазу кущіння озимої пшениці, і особливо, в варіанті з заорюванням рослинних решток кукурудзи. Величини зон пригнічення 3-х тест-культур фітопатогенних мікроміцетів були 7, 9 і 17 мм .

Таким чином, проведені модельні, вегетаційні і польові дослідження довели можливість оптимізації структури мікробного угруповання кореневої зони озимої пшениці шляхом інтродукції конкурентноздатних і адаптованих до її кореневих виділень штамів діазотрофів. Важливим для розуміння механізмів дії діазотрофів на рослини має виявлена закономірність збільшення кількості азотфіксуючих бактерій і антагоністів фітопатогенних мікроміцетів та пригнічення розвитку мікроміцетів у ризоплані та ризосфері з відповідним зростанням азотфіксуючої, антифунгальної та целюлозоруйнівної активності мікробних угруповань. Для едафосфери, зони послаблення дії кореневих ексудатів, подібних закономірних змін не встановили.

БІОТЕХНОЛОГІЯ одержання препаратИвних форм

Високоефективних штамів бактерій

Однією з умов оптимізації мікробного угруповання кореневої зони рослин є активний фізіологічний стан штамів-продуцентів. З метою створення препаративних форм, які сприяють збереженню життєздатності і активності мікроорганізмів, визначали технологічність перспективних штамів бактерій, технологічні параметри їх культивування, динаміку і кінетичні показники росту культур на різних етапах періодичного культивування. Аутекологічні дослідження високоефективних штамів були направлені на створення оптимальних умов для розвитку їх популяцій в штучно створених субстратах.

Результати проведених досліджень високоефективних штамів діазотрофів для озимої пшениці та інших перспективних симбіотичних і асоціативних азотфіксуючих бактерій, наданими нам авторами штамів для розробки технологій створення їх препаративних форм, показали, що більшість штамів є досить технологічними і їх питома швидкість росту в виробничих середовищах коливається в межах 62-79 год.-1.

Серед виділених нами штамів діазотрофів винятком був бацилярний штам Р. polymyxa 6M. Уже за 12 годин інкубації культура досягає стаціонарної фази розвитку зі зниженням рН культуральної рідини до 5,6 . Подальший розвиток культури супроводжується поступовим підлужуванням середовища, що свідчить про ферментативні перебудови і початок другої стадії метаболізму. На 28-й годині культивування розпочинається спороутворення, а на 3-ю добу спостерігається вивільнення 10% спор, що свідчить про технологічну зрілість культури. Для даної фазі розвитку культури відповідало максимальне значення реакції середовища рН 7,5. У перші 10 годин росту питома швидкість росту у виробничому середовищі дорівнювала 0,44 год.-1. Середня тривалість генерації в експоненціальній фазі росту була 3,2 години, що вказує на надзвичайно високу метаболічну активність штаму в цей період росту. Цим можна пояснити відносно легку інтродукцію P. polymyxa 6M у ризосферу рослин.

Він швидко засвоює поживні елементи і, продукуючи речови ни антифунгальної дії, захоплює екологічну нішу мікроміцетів та близьких за трофічними потребами бактерій. Результати аутекологічних досліджень штамів бактерій (табл. 7) показують, що вони відрізняються за параметрами умов культивування. Але їх походження з природного середовища обумовлює не дуже велику флуктуацію оптимальних для їх розвитку показників цих параметрів.

Таблиця 7

Оптимальні умови розвитку культур бактерій-продуцентів

у виробничому середовищі

Вид, штам	рН середовища	Температура, оС	Аерація, обертання качалки, об./хв.	Термін культивування, год.	Кількість клітин, млрд./мл
P. polymyxa 6М	6,8-7,2	22-26	60-220	20-24	1,2±0,2
Аgr. radiobacter 8301	6,5-7,5	25-32	90-220	30-36	5,9±0,7
Аgr. radiobacter 8306	6,2-7,0	28-30	90-220	30-40	17,0±3,1
Аgr. radiobacter 204	6,5-7,0	28-32	90-220	30-40	8,8±3,3
Аlc. paradoxus 207	6,6-7,2	26-32	200-220	44-48	9,9±1,4
Flavobacterium sp. 7201	6,8-7,0	24-30	170-220	48-60	16,4±1,3
Rh. leguminosarum Н-7	6,8-7,2	26-28	150-220	48-60	14,5±0,6
Ent. nimipressuralis32-3	6,6-6,8	28-30	200-220	48-60	21,9±4,6
Ent. aerogenes 30ф	7,2-7,4	26-30	200-220	28-30	17,8±5,1

Так, особливості метаболізму кожного штаму потребували слабокислої або слаболужної реакції середовища і температури інкубації в межах 22 до 32 оС, що притаманно природним ґрунтовим умовам.

У більшому ступені вони розрізнялись за швидкістю росту. Штами асоціативних діазотрофів P. polymyxa 6М, Аgr. radiobacter 8301 і 8306 та Ent. aerogenes 30ф за першу добу культивування досягали стаціонарної фази росту, а штами симбіотичних азотфіксаторів Rh. leguminosarum Н-7 і П-2, а також штам Ent. nimipressuralis 32-3 максимальної кількості накопичення клітин досягали на 2-3 добу культивування. Для аерації і омивання бактеріальних клітин середовищем для постачання їм елементів живлення і видалення продуктів дисиміляції потрібне постійне перемішування середовища або пропускання певного об'єму повітря через культуральну рідину. Найменшу інтенсивність перемішування потребують факультативний анаероб P. polymyxa 6М і толерантні до мікроаерофільних умов агробактерії. При 60 - 90 об./хв. вони накопичували таку ж біомасу, як і при 220 об./хв. Швидкоростучі бульбочкові бактерії потребують мінімуму на рівні 150 і 170 об./хв., а ентеробактерії - 200 об./хв. Розвиток культур штамів не гальмується підвищенням інтенсивності перемішування середовища і лише економічні міркування зниження енергетичних витрат на цей процес спонукають до визначення мінімального рівня оптимальних параметрів культивування для досліджених штамів.

Субстрат-протектор запобігає ушкодженню клітин при потраплянні у природне середовище, сприяє адаптації популяції до умов кореневої зони рослин та обумовлює стабільність специфічних взаємодій з представниками мікробного ценозу. Торф і лігнін найпоширеніші наповнювачі, але вони вимагають енерговитратних термолабільної або радіаційної методів стерилізації (Хотянович, 1991). У зв'язку з цим, склад субстрату для штамів формували, застосовуючи вермикуліт - алюмосилікат, який можна прогрівати при високих температурах. Порівняльна оцінка якості вермикулітних препаратів з іншими в польових дослідах вказала на їх технологічну ефективність і перспективність.

Використання у мікробіологічній промисловості екзополісахаридів для іммобілізації мікроорганізмів ініціювало спроби створити субстрат на їх основі. Склад середовища формували на основі оксиду кремнію, з якого у кислому середовищі утворювався справжній мінеральний гель. 1% пиловидного лігніну з розміром часток менше 0,2 мм вводили як колонізуючий компонент. За джерело біогенних елементів використовували мелясу і глютен. У цьому субстраті культури активно продукували полісахариди, які в сполученні з мінеральним гелем утворювали желеподібну консистенцію, що сприяло збереженню життєздатності бактерій. Порівняльні характеристики субстратів для культивування Agr. radiobacter 204 (табл. 8), показують, що біомаса бактерій у гельному і вермикулітному субстраті накопичується повільно і максимальна її кількість досягається за місяць інкубування, відповідно, 20 і 17 млрд. КУО/ г субстрату.

Але нативні культури штаму швидко втрачають активність, а в гельному і вермикулітному препаратах після 6 місяців зберігання залишається на рівні 2,7 і 3,8 млрд. клітин у 1 г.

При розробці технології одержання біопрепарату штаму P. polymyxa 6М спостерігали його активне розмноження у бобовому середовищі з моно- і дивуглеводами. Бацили синтезували значну кількість полісахаридного слизу і продукували речовини антибіотичної дії. Проте, лише невеликий відсоток клітин утворював якісні термостійкі спори, що витримують прогрів при 80о С впродовж 5-ти хвилин.

Таблиця 8

Динаміка титру Agrobacterium radiobacter 204 у різних субстратах, млрд./ г

Препарат	Вихідний титр	Термін зберігання, місяці
		1	3	6
Рідкий (безсубстратний)	52	10	< 1	< 1
Гельний, на основі нативних полісахаридів штаму	28	29	< 1	< 1
Гельний, з додатком мінерального гелю	6	20	12	2,7
Вермикулітний	15	17	14	3,8

Зазначена властивість спор має велике значення для одержання сухого препарату за допомогою термальної сушки. Також стабілізація препарату антисептиками і антиоксидантами для подовження терміну зберігання є можливою лише при наявності спор, стійких до руйнуючих факторів. Заміна в середовищі чистих вуглеводів мелясою, горохового екстракту кукурудзяним, нормалізує процес спороутворення і технологічна зрілість культури (10% спор у вивільненому стані) досягається через 4 доби культивування (табл. 9) .

Таблиця 9

Вплив джерел вуглецю та азоту на якісні показники гельного препарату Paenibасіllus polymyxa 6М

Середовище	Кількість термостійких спор, млн. КУО/мл	Досягнення технологічної зрілості, діб	В'язкість культуральної рідини, мПас
Горохове з глюкозою	139 ± 22	7	1870 ± 140
Горохове з сахарозою	93 ± 9	8	1440 ± 180
Горохове з мелясою	306 ± 49	7	980 ± 50
Кукурудзяний екстракт з мелясою	289 ± 34	4	1310 ± 90

Встановлена можливість стабілізувати препарат на 6 місяців додаванням 0,25% фенолу в якості антисептика - антиоксиданту і 0,25% карбоксиметилцелюлози для стійкості без змін та розшарувань гельної структури. Титр життєздатних спор на кінець зберігання складає близько 90% від вихідного.

При порівняльній оцінці антифунгальной дії гельного препарату і рідкої культури, встановлено, що обробка насіння гельним препаратом знижує кількість пропагул грибів на його поверхні в 10 разів, а рідка - в 2 рази. Отже, гельний препарат, як біопротектор діє ефективніше і швидше.

Вегетаційні і польові досліди з визначення ефективності застосування гельних, вермикулітних і торф'яних препаративних форм діазотрофів, проведені нами (табл. 10), а також відомі з літератури (Завалин и др., 2000; Гармашов, 2002), продемонстрували перевагу субстратних препаратів над рідкими.

Таблиця 10

Вплив обробки насіння різними препаративними формами

діазофіту на урожайність озимої пшениці

Варіант досліду	Урожайність, т/га	Прибавка урожаю зерна
		т/га	%
Контроль, без інокуляції	3,8	-	-
Торф'яний	4,2	0,4	10,1
Гельний	4,2	0,4	10,9
Рідкий	4,0	0,2	5,8
НІР05	0,27

Таким чином, були розроблені технології одержання препаративних форм високоефективних штамів бактерій-продуцентів з комплексом агрономічно корисних властивостей на основі вермикулітного і гельного субстратів, які сприяють кращому збереженню життєздатності і функціональної активності бактеріальних клітин та адаптації їх у природному середовищі.

Ефективність застосування мікробних препаратів

У польових дослідах встановлено, що приріст врожайності озимої пшениці Миронівська 61 складав в середньому 0,16 - 0,42 т/га і залежав від застосованого препарату (табл. 11). Найбільш стабільну за роками прибавку врожаю отримали при обробці насіння препаратами на основі штамів адаптованих до кореневих виділень озимої пшениці алкалігину та діазофіту, відповідно, на 0,42, 0,33 і 0,28 т/га, а також антифунгальним препаратом хетоміком, - на 0,35 т/га.

Передпосівна обробка насіння більшістю біопрепаратів у 1,5 - 2 рази посилювала азотфіксацію в ризосфері інокульованих рослин, яку визначали в фазу кущіння. Антифунгальні препарати БСП і хетомік значно посилювали нітрогеназну активність мікробного угруповання кореневої зони, що може бути наслідком пригнічення розвитку мікроміцетів і активізації розвитку популяцій азотфіксаторів, як це було показан...