Особливості бобово-ризобіального симбіозу і вплив екологічних факторів на нього

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство аграрної політики та продовольства України

Вінницький національний аграрний університет

Кафедра української та іноземних мов

РЕФЕРАТ

з прочитаної англомовної літератури

на тему:

«Особливості бобово-ризобіального симбіозу і вплив екологічних факторів на нього»

Спеціальність 03.00.16 - екологія

ВІННИЦЯ - 2012

План

Вступ

Розділ 1. Симбіози бобових рослин і ризобій

1.1 Етапи бобово-ризобіального симбіозу

1.2 Процеси при бобово-ризобіальному симбіозі

Розділ 2 Бульбочки бобових

2.1 Екологічні ніші бульбочкових бактерій

2.2 Вплив екологічних факторів на бобово-ризобіальний симбіоз

Розділ 3. Симбіози небобових рослин і азотфіксуючих мікроорганізмів

Розділ 4. Штучне формування азотфіксуючого симбіозу у небобових рослин

Висновоки

Аnnotation

Glossary

References

Зміст

Вступ

Розділ 1. Симбіози бобових рослин і ризобій

1.1 Етапи бобово-ризобіального симбіозу

1.2 Процеси при бобово-ризобіальному симбіозі

Розділ 2. Бульбочки бобових

2.1 Екологічні ніші бульбочкових бактерій

2.2 Вплив екологічних факторів на бобово-ризобіальний симбіоз

Розділ 3. Симбіози небобових рослин і азотфіксуючих мікроорганізмів

Розділ 4. Штучне формування азотфіксуючого симбіозу у небобових рослин

Висновоки

Аnnotation

Glossary

References

симбіоз бобовий ризобіальний бактерія

Вступ

Широке застосування мінеральних азотних добрив у рослинництві гальмують доволі високі енергетичні затрати на їх виробництво, що в умовах нинішньої світової фінансової кризи спонукає дослідників до пошуку альтернативних шляхів забезпечення сільськогосподарських культур необхідними сполуками цього елемента. Саме таким шляхом є його біологічна фіксація з повітря мікроорганізмами, здатними зв'язувати молекулярний азот атмосфери й перетворювати його на сполуки, придатні для засвоєння рослинами.

У зв'язку з цим серед заходів поліпшення азотного живлення рослин в агрокультурі особливе місце належить теоретичним і практичним розробкам, спрямованим на значне підвищення рівня біологічного перетворення азоту атмосфери на органічні азотовмісні сполуки мікроорганізмами-азотфіксаторами, насамперед бульбочковими бактеріями. Останні у симбіозі з бобовими рослинами здатні фіксувати молекулярний азот повітря, забезпечувати потребу в ньому макросимбіонтів і накопичувати його в орному шарі ґрунту в кількості від 40 до 500 кг/га за рік залежно від вирощуваної бобової культури.

Актуальним сьогодні є також пошук нових азотфіксувальних мікроорганізмів і створення на їх основі ефективних симбіотичних асоціацій, які можна було б застосовувати для підвищення врожайності сільськогосподарських культур і водночас запобігати забрудненню навколишнього середовища синтетичними сполуками.

Фундаментальні дослідження фіксації атмосферного азоту, що проводяться вченими багатьох країн світу, спрямовані на вивчення її механізмів, деталізацію перебігу фізіолого-біохімічних процесів, які відбуваються під час зв'язування інертної молекули азоту в доступні рослинам азотні сполуки. Практичний аспект розробок у цьому напрямі полягає в пошуку шляхів мобілізації внутрішніх резервів азотфіксаторів для досягнення максимальної інтенсифікації процесу.

Успішне вирішення цих завдань можливе лише за умови з'ясування суті багатьох фізіологічних і біохімічних реакцій, що сприяють посиленому синтезу й функціонуванню ферментного нітрогеназного комплексу, який відповідає за біологічне зв'язування молекулярного азоту. Незважаючи на значні успіхи в дослідженні порушеної проблеми, інтенсивність процесу азотфіксації у широкомасштабному виробництві значно нижча від рівня, отриманого в дослідах, проведених у контрольованих умовах, тобто біологічний потенціал азотфіксувальних мікроорганізмів на сьогодні реалізований ще далеко не повністю.

Симбіотичні відносини з мікроорганізмами відіграють важливу роль в житті рослин. Вони забезпечують мінеральне живлення, захист від патогенів і тварин, що живляться рослинами, адаптацію до стресів, а деякою мірою - і регуляцію розвитку рослин. Ці функції виконують різні внутрішньоклітинні симбіонти (бульбочкові бактерії, ендомікоризні гриби), ендофіти, які заселяють тканини надземних і підземних органів (азотфіксатори Acetobacter і Azoarcus або ріжкові гриби), а також ектосимбіонти, які заселяють поверхню рослин. Хоча симбіотичні відносини з мікроорганізмами для рослини не є обов'язковими, в реальних екологічних умовах, за дефіциту основних елементів живлення і постійних стресів, її виживання значною мірою залежить від утворення симбіозів з мікроорганізмами [1].

Розділ 1. Симбіози бобових рослин і ризобій

Найбільш вивчені симбіози, які утворюються бобовими рослинами і бульбочковими бактеріями (ризобіями). Ризобії (бактерії родів Azorhizobium, Bradyrhizobium, Rhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium) є факультативними рослинними симбіонтами, які легко культивуються ex planta [1-3]. При взаємодії з рослиною-живителем ризобії індукують нодуляційний процес, тісно пов'язаний з основними функціями рослин - цитодиференціюванням і органогенезом, азотним і вуглецевим обміном, захистом від патогенів і регулювання розвитку.

Бобово-ризобіальний симбіоз досить специфічний. Більшість рослин здатні формувати симбіоз тільки з певними формами ризобій (Medicago, Melilotus, Trigonella - з Rhizobium meliloti; Trifolium - з R. leguminosarum bv. trifoli; Pisum і Vicia - з R. leguminosarum. bv. viceae) [4-7]. Утворення симбіозу обмежено майже виключно родиною бобових. Єдиною небобовою, яка здатна до симбіозу з ризобіями, є тропічна рослина Parasponia (род. Ulmaceae) [1].

При взаємодії з мікроорганізмами у рослини з'являються нові ознаки (наприклад, здатність використовувати молекулярний азот у бобових при симбіозі з ризобіями, або токсичність у злакових при симбіозі з ріжковими грибами). Поява цих ознак є результатом комплементарної взаємодії рослинних і мікробних генів, внаслідок якої відбувається їх перехресна регуляція, а іноді і перенос між партнерами окремих генів. Таким чином, утворення симбіозу можна розглядати як результат об'єднання генів-партнерів у стабільні функціональні одиниці, основними функціями яких є регуляторні (сигнальні) взаємодії, морфогенез симбіотичних структур і метаболічна інтеграція партнерів [1, 9].

1.1 Етапи бобово-ризобіального симбіозу

Одним з найвагоміших результатів досліджень симбіотичної азотфіксації в останні роки стало виявлення сигналів, які регулюють специфіку мікробно-рослинної взаємодії. Молекулярний механізм цієї взаємодії можна поділити на два етапи: на першому - молекули- індуктори флавоноїдної природи викликають експресію відповідних генів бульбочкоутворення рослини-живителя. Продуктом цих генів є бактеріальний фактор (Nod-фактор), здатний активно впливати на рос- лину-донора. Ці сигнальні молекули є похідними олігосахаридів і, в більшості, копіюють дію добре відомих рослинних гормонів, таких як ауксини і цитокініни. Вони здатні викликати численні зміни кореневих волосків і індукувати диференціацію деяких клітин всередині кореня, що призводить до виникнення меристематичної тканини, яка дає початок утворенню нових бульбочок. При цьому є суттєва відмінність в дії Nod- факторів та рослинних гормонів: тільки сигнали від комплементарного мікросимбіонта здатні викликати індукцію бульбочкоутворення, тобто кожний штам ризобій продукує певний набір Nod-факторів. Специфічність штамів ризобій стосовно тієї чи іншої рослини залежить як від якісного складу Nod-факторів, так і від їх співвідношення [8, 9].

Важливою стадією утворення симбіозу є адсорбція клітин ризобій на поверхні кореневих волосків. Вона визначається здатністю рослини синтезувати глікопротеїни, що отримали назву лектинів, які зв'язуються з полісахаридами на поверхні бактерій. На початку 80-х років було висунуто “лектинову гіпотезу”, згідно з якою специфічність утворення бульбочок є результатом комплементарної взаємодії поверхневих структур бактеріальних і рослинних клітин по типу антиген-антитіло. Потім було показано можливість прикріплення до кореневих волосків не тільки специфічних (тобто тих, що утворюють бульбочки), але й неспецифічних штамів. Тільки наприкінці 80-х років вдалося довести участь лектинів у специфічній бобово-ризобіальній взаємодії. З використанням штамів агробактерій було здійснено перенос в корені конюшини гена PSL, який кодував синтез лектину гороху. В результаті конюшина отримала здатність синтезувати гороховий лектин і формувати бульбочки з ризобіями гороху[10].

Таким чином, на даний час встановлено існування двох типів сигнальної взаємодії при бобово-ризобіальному симбіозі: це дистанційна взаємодія (флавоноїди - Nod-фактори) і контактна взаємодія (лектини- полісахариди). Спроби довести, що існує єдиний механізм визначення специфічності, тобто, що лектини виконують роль рецептора Nod- факторів, успіху не мали [11].

Після обміну молекулярними сигналами (флавоноїдами і Nod- факторами) і попереднього поверхневого контакту, у рослини починає формуватися структурна основа симбіозу - бульбочка за рахунок морфо-фізіологічного диференціювання клітин. При цьому сигнальна взаємодія партнерів переходить в нову стадію, яка пов'язана з регуляцією рослиною швидкості розмноження і чисельності клітин симбіонта. Така регуляція дуже важлива тому, що потенційна швидкість розмноження у бактеріальних клітин набагато вища, ніж у рослинних. Неконтрольоване розмноження ендосимбіотичних мікроорганізмів часто може бути шкідливим для рослини і її здатність строго контролювати розмноження симбіонта відрізняє мутуалістичний симбіоз від паразитизму [12].

1.2 Процеси при бобово-ризобіальному симбіозі

На початку 90-х років було показано, що при утворенні бобово- ризобіального симбіозу у рослини індукується низка процесів, які нагадують захисні реакції при інфікуванні патогенними мікроорганізмами. Це синтез флавоноїдів, фенолів, хітиназ, калози і пероксидаз. Однак, в бульбочках ці реакції виражені не настільки сильно, як при інфікуванні патогенами, і їх результатом є не інактивація мікроорганізму, а регуляція його розмноження і метаболічної активності. Така тонка регуляція мікросимбіонтом захисних систем рослини можлива завдяки наявності у ризобій відповідних генів. Мутації в цих генах блокують розвиток симбіозу і замість нормальних бульбочок утворюються псевдобульбочки, які не містять інфекційних ниток з бактеріальними клітинами і заповнені недиференційованою тканиною. Функцією вказаних генів є синтез різних компонентів клітинної поверхні бактерій: кислих екзополісахаридів (ехо-гени), нейтральних екзополісахаридів (ехр-гени), ліпополісахаридів (^- гени) і циклічних глюканів (ndv-гени) [13].

При бобово-ризобіальному симбіозі спостерігається регуляція кількості бульбочок, що дозволяє рослині уникати надлишкового бульбочкоутворення і економити енергію. У бобових одержано мутації, які порушують регуляцію утворення бульбочок. Їх добір ведеться за фенотипом супербульбочкоутворення (Nod++), коли кількість бульбочок підвищується в 2-10 разів у порівнянні з вихідними рослинами. Звичайно такі мутанти формують бульбочки за наявності високих доз нітратів, тоді, як у рослин “дикого” типу при цьому пригнічується розвиток симбіозу. У зазначених мутантів загальна нітрогеназна активність, яка обчислюється на одну рослину, підвищена, а питома нітрогеназна активність (на одиницю маси бульбочки) знижена. У більшості Nod++-мутантів спостерігається зниження надземної маси рослин, що зумовлюється перевитратою енергії на утворення великої кількості азотфіксуючих бульбочок. Отже, на прикладі мутантів Nod++ видно, що контроль над кількістю ендосимбіонта є важливою умовою підтримки мутуалістичного характеру відносин партнерів. Послаблення цього контролю може привести до перетворення відносин з мутуалістичних у паразитичні, незважаючи навіть на те, що біохімічний процес, який лежить в основі симбіозу, а саме фіксація молекулярного азоту, не порушується [12].

Утворення рослиною-живителем спеціалізованих структур, що містять мікробні клітини, є характерною ознакою мутуалістичного симбіозу. Ці органи є екологічною нішею для симбіонта, структурною основою для обміну метаболітами, а також для контролю чисельності і фізіологічної активності симбіонта. Ці функції характерні для бульбочок бобових. По- перше, бульбочки є високоспеціалізованою екологічною нішею для ризобій: інші мікроорганізми проникають в них рідко. По-друге, в бульбочках створюються оптимальні умови для обміну між партнерами вуглецевими і азотними сполуками, а також мікроаерофільні умови, необхідні для функціонування нітрогенази. По-третє, завдяки локалізації бактерій в бульбочках їх чисельність і активність легко регулюються залежно від зовнішніх умов (освітлення, вологість, наявність зв'язаного азоту), в несприятливих умовах рослина може втрачати бульбочки, які стали непотрібними [13].

Інфікування бобових ризобіями відбувається через кореневі волоски. В місці найбільш різкого скручування волоска спостерігається локальне порушення клітинної стінки, в якому задіяні літичні ферменти обох партнерів. Плазматична мембрана рослинної клітини при цьому впинається в цитоплазму, і бактерії проникають всередину кореневого волоска. В результаті, навколо бактеріальних клітин утворюється спеціальна порожнина - інфекційна нитка, стінки якої за структурою подібні стінкам рослинних клітин, а порожнина якої заповнюється полісахаридним матриксом, який синтезується як рослинною клітиною, так і ризобіями. Таким чином, даний процес є результатом не активного проникнення бактеріальних клітин в кореневі волоски, а скоріше, шляхом захоплення рослиною мікросимбіонта [14].

Одночасно з інфікуванням відбувається закладання бульбочкової меристеми, яка пов'язана з індукцією проліферації клітин кортекса кореня.

Основною стадією симбіозу є перехід бактерій з інфекційної нитки в клітину рослини-донора, який здійснюється шляхом ендоцитозу. При цьому бактерії оточуються перибактероїдними мембранами, які утворюються з тілець апарата Гольджі і ендоплазматичного ретикулюма, і містять компоненти бактеріального походження. Число бактерій всередині перибактероїдного простору залежить від виду рослин: по одному у гороху, люцерни і конюшини, по 5-10 - у сої і квасолі. Ця різниця пов'язана з тим, що у одних бобових проліферація бактерій зупиняється одразу після їх ендоцитозу, в інших - бактерії ще кілька разів діляться поза інфекційною ниткою. Бактеріальна клітина (або декілька клітин) оточуються загальною перибактероїдною мембраною, яка є елементарною структурно-функціональною одиницею симбіозу, і має назву “симбіосома” [10, 11].

Деякий час після виходу з інфекційної нитки ризобії зберігають свої розміри і паличкоподібну форму, але потім поступово перетворюються в особливі симбіотичні форми - бактероїди, які в 3-5 разів крупніші, ніж бактерії. Диференціювання бактерій пов'язано з репресією багатьох генів, яка настільки глибока, що бактероїди після відмирання бульбочок не можуть знову перетворюватися в бактерії. В бактероїдах синтезується нітрогеназа, яка каталізує відновлення N2 в NH4+, а також низка інших ферментів, необхідних в нітрогеназній реакції, після чого в бульбочках починається процес фіксації азоту. Отже, бактероїди можна розглядати як тимчасові клітинні органели, функція яких полягає в постачанні рослині сполук азоту [11, 15]. Функції бактероїдів не з'ясовані остаточно. В 1989р. Д. Джимінез і Д. Казадесус [16] запропонували “альтруїстичну” модель, згідно з якою підтримка генів азотфіксації в популяціях ризобій здійснюється шляхом диференційованого розмноження в бульбочках і наступного виходу в грунт саме тих клонів, які фіксують азот in planta. У відповідності з цією моделлю диференціювання частини бактеріальних клітин в бактероїди розглядається як “жертва” внутрішньобульбочкового клону, яка забезпечує розмноження недиференційованих бактеріальних клітин. Значна кількість таких клітин (до 106-107) зберігається в кожній азотфіксуючій бульбочці і після її відмирання переходять до складу грунтової популяції [17].

В 1996 р. Д. Гордон [18] запропонував модифікацію “альтруїстичної” моделі, згідно з якою, бактерії певного штаму, які є в азотфіксуючих бульбочках, синтезують живильні речовини (ризопіни), що є специфічними субстратами для клітин того ж самого штаму, який знаходиться в ризосфері рослин. Допускається, що саме здатність до синтезу таких факторів зумовлює еволюцію симбіотичної азотфіксації в бактеріальних популяціях. Модель, запропонована Д. Гордоном, базується на механізмах групового добору, який призводить до виникнення ознак, корисних не тільки для їх хазяїв, але й для групи родичів. У випадку бобово-ризобіального симбіозу “альтруїстичні” відносини спостерігаються між членами одного клону: диференційованими бактероїдами і недиференційованими клітинами, які є в бульбочках і ризосфері. В останні роки важливу роль групового добору показано для широкого кола симбіонтів [19].

Розділ 2. Бульбочки бобових

Бульбочка являє собою складний орган бобової рослини, основними структурами якого є інфікована бактеріями тканина, в якій відбувається фіксація азоту; провідні тканини, по яких надходять рослинні фото- синтати і виносяться продукти азотфіксації; меристема, за рахунок якої відбувається ріст бульбочки.

Бульбочки бобових зазвичай поділяються на детерміновані (в яких меристема існує лише протягом кількох днів, а після її зникнення ріст бульбочки і оновлення азотфіксуючої тканини припиняється) і недетер- міновані (меристема функціонує кілька місяців, що забезпечує постійне оновлення азотфіксуючої тканини). Ці типи бульбочок розрізняються за морфолого-фізіологічними характеристиками. Недетерміновані бульбочки характеризуються вищим ступенем диференціації як рослинних, так і бактеріальних клітин. Детерміновані і недетерміновані бульбочки об'єднує центральне розташування азотфіксуючої тканини і периферійне розташування провідних судин, що дозволяє віднести їх до “стеблового” типу.

Але різноманіття морфологічних особливостей симбіозу не вичерпується детермінованим і недетермінованим типами бульбочок. Для деяких бобових (арахіс, цезальпінієві) характерна інша, “коренева” структура бульбочок: провідні пучки розташовані в центрі, а азотфіксуюча тканина - на периферії. Подібним чином побудовані і бульбочки небобових рослин, які утворюють симбіоз з актиноміцетами Frankia (дерев'янисті дводольні) і з ризобіями (Parasponia). “Кореневі” бульбочки утворюються не з меристеми, яка інфікується de novo в кортексі кореня, а з примордіїв бокових коренів, і, таким чином, дані бульбочки можна розглядати як модифіковані корені. У тропічних бобових Sesbania і Aeshynomene бульбочки формуються не тільки на корені, але й на стеблі; в останньому випадку не відбувається утворення меристеми de novo і бульбочка утворюється із зачатку повітряного кореня [19].

Ще простіша організація симбіозу у деяких примітивних бобових з підродини цезальпінієвих. Багато з них взагалі не здатні формувати бульбочок, але утворюють дуже тісні асоціації з азотфіксаторами, що існують вільно і активно колонізують кортекс кореня і навіть можуть проникати всередину рослинних клітин. В тих випадках, коли бульбочки все ж утворюються, ризобії не виходять в рослинну цитоплазму, а азотфіксація відбувається в інфекційній нитці. Такі типи структурної організації симбіозу є, з еволюційної точки зору, вихідними стосовно механізму, при якому відбувається проникнення бактерій через кореневий волосок з наступним утворенням нової меристеми, бактероїдів і симбіосом [38].

Важливою умовою функціонування бульбочок є підтримка в них мікроаерофільних умов, тому що нітрогеназа, яка синтезується, швидко і незворотньо інактивується молекулярним киснем. З другого боку, енергозатратний процес азотфіксації можливий лише за високої інтенсивності окислювального фосфорилювання, для чого необхідно, щоб велика кількість кисню надходила до бактеріальних цитохромоксидаз. Для вирішення “кисневого парадоксу” рослина має два механізми. Перший - утворення дифузного бар'єру (шару клітин, які щільно прилягають одна до одної, що запобігає газообміну бульбочок з навколишнім середовищем). Другий - синтез гемоглобінподібного білка (легоглобіну), який зв'язує кисень і забезпечує його транспорт до симбіосом. Довгий час вважалося, що синтез легоглобіну є унікальною властивістю бобових, яка могла виникнути в результаті дуже обріднених генетичних подій, наприклад, горизонтального переносу генів з тварин до рослин, але, як виявилося, гемоглобінподібні білки в невеликій кількості синтезуються в усіх рослинах, виконуючи роль сенсорів кисню. Гемоглобінподібні білки синтезуються в бульбочках небобових рослин, які утворюють симбіоз з актиноміцетами Frankia (“актиноризні” рослини) і з ризобіями (Parasponia) [38]. Таким чином, взаємодія рослин і симбіотичних мікроорганізмів являє собою комплекс процесів, які реалізуються через молекулярні механізми. В процесі формування і функціонування симбіозів відбувається взаємодія генів партнерів, які на час існування симбіозу об'єднуються в надорганізмову генетичну систему. Результатом дії цієї системи є тісна метаболічна інтеграція партнерів, регуляція рослиною- донором швидкості розмноження симбіонта і утворення спеціалізованих симбіотичних структур. Бобово-мікробні симбіози варіюють за ступенем складності своєї морфологічної організації. Але в усіх випадках розвиток структурної основи симбіозу контролюється рослинними генами, експресія яких відбувається тільки при взаємодії з мікроорганізмами. Формування симбіозу - це особлива стратегія розвитку рослин, яка еволюційно пов'язана із загальними морфологічними програмами, але сформувалася головним чином в процесі спільної еволюції з мікроорганізмами [19].

2.1 Екологічні ніші бульбочкових бактерій

Кожна популяція макро- і мікроорганізмів займає певне місце в екосистемі та характеризується такими показниками як місцепроживання та екологічна ніша. Екологічна ніша характеризує ступінь екологічної спеціалізації даної популяції, її місце в біогеоценозі як функціональної одиниці.

У життєвому циклі бульбочкових бактерій можна виділити дві стадії: стадію вільноіснуючих гетеротрофів та стадію симбіотичної взаємодії з бобовими рослинами. Під час сапрофітного існування (ex planta) екологічною нішею для ризобій є ґрунт, який забезпечує їх необхідними елементами живлення. Після проникнення мікроорганізмів у корені бобових (in planta) екологічною нішею для бульбочкових бактерій стає рослина, фізіологічні та генетичні особливості якої безпосередньо впливають на мікросимбіонта.

Поширення бульбочкових бактерій у різних ґрунтах визначають за наявністю кореневих бульбочок. Зазначені методи дозволяють врахувати лише вірулентні штами ризобій, які селекціонуються рослиною-живителем. Незважаючи на те, що в ґрунті в значній кількості можуть бути наявні невірулентні бактерії, саме вірулентні ризобії вносять найбільший вклад у накопичення біологічного азоту. У зв'язку з дослідженням розмірів та різноманіття популяцій останнім часом увагу дослідників привертає вивчення нуклеотидних послідовностей ДНК, отриманої безпосередньо з ґрунту [19], а також використання селективних середовищ для прямого виділення ризобій з ґрунту [20].

Незважаючи на те, що бульбочкові бактерії є одним з головних компонентів агроекосистем бобових рослин, вони складають відносно невелику частину ґрунтових мікроорганізмів. Так, штами Rhizobium і Bradyrhizobium становлять 0,1-8,0 % від загальної кількості бактерій у ризосфері та 0,01-0,14 % від їх біомаси [21].

Експериментально доведено, що ризобії здатні довгий час залишатися у грунті без рослин і функціонувати як сапрофіти. Дані, отримані В. Brnnel із співавт. [22], свідчать, що інтродуковані у нестерильний ґрунт штами B. japonicum після 8-13 років сапрофітного існування зберігають генетичну організацію та симбіотичні властивості.

Чисельність бульбочкових бактерій у різних ґрунтах значно варіює і залежить від низки абіотичних, біотичних та антропогенних факторів. У ґрунтах, де тільки починають вирощувати певні види бобових культур, бульбочкові бактерії взагалі можуть бути відсутні.

Необхідно відмітити, що у ґрунті існують бульбочкові бактерії, які відрізняються за активністю, вірулентністю та конкурентноздатністю. У різних ґрунтах змінюється лише їх кількісне співвідношення. Окультурення ґрунтів, особливо пов'язане з внесенням органічних добрив або вапнуванням, покращує умови для розмноження та розвитку ризобій. Активні штами цих бактерій частіше трапляються в нейтральних ґрунтах (чорноземах, окультурених дерново-підзолистих).

Аборигенні популяції ризобій, на відміну від несимбіотичних бактерій, характеризуються високою гетерогенністю. У ґрунті одночасно можуть існувати як вірулентні, так і фенотипно наближені до них невірулентні штами, а також значна кількість рекомбінантних генотипів. Важливу роль у процесі формування структури популяцій бульбочкових бактерій та забезпеченні їх гетерогенності має перенос плазмід між штамами в ґрунті. Плазміди ризобій можуть виступати у ролі векторів для переносу хромосомних генів цих мікроорганізмів. За розрахунками W. Dudman [23], якщо чисельність ризобій у ґрунті становить 108 бактеріальних клітин, то за добу може утворюватися не менш як 100 нових генотипів мікроорганізмів. Як зазначалося вище, обмін генетичною інформацією іноді приводить до появи симбіотичних властивостей у невірулентних ризобій. Однак характер успадкування симбіотичних ознак істотно залежить від таксономічної спорідненості штамів. Згідно моделей популяційної динаміки бульбочкових бактерій, нові рекомбінантні штами, які характеризуються розширеними екологічними властивостями in planta, повністю витискають з мікробного ценозу батьківські авірулентні форми, а штами з розширеними екологічними властивостями ex planta, як правило, не можуть повністю витиснути ізогенні батьківські форми.

На долю бульбочкових бактерій у ґрунті істотно впливає рослина-живитель. Це зумовлено: 1) впливом кореневих виділень, 2) розмноженням бульбочкових бактерій у бульбочках з наступним виходом їх у ґрунт, 3) здатністю рослини-живителя “вибирати” певні генотипи ризобій з ґрунтової популяції [21].

За присутності рослини відбувається різке збільшення чисельності специфічних бульбочкових бактерій, оскільки в ризосфері бобових культур створюються більш сприятливі умови для їх розвитку, ніж у ґрунті, віддаленому від коренів. Існування ризобій у прикореневій зоні значною мірою залежить від кореневих виділень, які містять різноманітні поживні речовини та біологічно активні сполуки. Експериментально доведено, що кореневі ексудати сприяють активному руху ризобій до коренів.

Слід відмітити, що збільшення чисельності ризобій у присутності рослини може бути зумовлено як специфічною, так і неспецифічною стимуляцією розвитку мікробних популяцій кореневими ексудатами. Так, У Yanni із співавт. [24] було показано, що у ризосфері рису відбувається інтенсивний розвиток бульбочкових бактерій конюшини.

Важливе значення у взаємовідносинах мікро- і макросимбіон- тів мають генетична природа штаму та сорт рослини. Так, для ризобій характерним є збільшення генетичного різноманіття бактеріальних популяцій у присутності рослини-живителя, оскільки умови розвитку мікроорганізмів у ризосфері сприяють більш інтенсивному переносу генів між різними штамами, ніж у ґрунті. Тому в природі має місце високий поліморфізм за симбіотичними ознаками популяцій бульбочкових бактерій та сортів бобових рослин.

Слід зазначити, що серед бобових культур існують форми, які не вступають у симбіотичні відносини із специфічними ризобіями. Прикладом можуть бути афганський горох, стійкий до інфікування більшістю європейських штамів R. leguminosarum [25], та безбульбочкова соя [26]. Дана ознака детермінована наявністю у рослин генів, що зумовлюють стійкість до нодуляції. Встановлено, що в рецесивному стані алель sym 2 робить інокуляцію гороху місцевими бульбочковими бактеріями неможливою, причому ця властивість зберігається при включенні гену в різні генотипи. У сої ця ознака контролюється одним рецесивним геном rj Гібрид сої (Лінкольн х Ричард), який містить цей ген у гомозиготному стані, також не здатний формувати бульбочки [27]. Проте, стійкість до нодуляції не є абсолютною. Так, з ґрунтів Туреччини та Росії виділено штами R. leguminosarum bv. viciae, які, завдяки наявності гену nod X, здатні інокулювати афганські горохи [28].

Після переходу до симбіотичного стану бульбочкові бактерії ведуть зовсім інший “спосіб життя”, екологічною нішею для них стають бульбочки. Вони захищають бактерії від дії зовнішніх несприятливих факторів та забезпечують їх поживними речовинами у вигляді рослинних фотоасимілятів. Бактерії, в свою чергу, надають рослинам продукти біологічної фіксації азоту, необхідні для побудови рослинного організму. В результаті взаємодії генетично гетерогенної популяції вірулентних ризобій з рослиною- живителем у ній збільшується частка штамів, які здатні активно фіксувати азот повітря. Згідно “альтруїстичної” моделі [29], відбір на підтримку генів азотфіксації відбувається завдяки “альтруїзму” не бактерій по відношенню до рослини, а одних бактеріальних клітин (бактероїдів) по відношенню до інших (недиференційова- них бактерій).

Слід також відмітити, що симбіоз бобових рослин з бульбочковими бактеріями є вигідним для макросимбіонта лише за умов дефіциту зв'язаних форм азоту, а за наявності азотовмісних сполук утворення бульбочок не завжди покращує розвиток рослин [30-32]. Відносини бульбочкових бактерій з зовнішнім середовищем у цей період регулюються рослиною-живителем, а вплив ґрунту проявляється тільки опосередковано. Фактори, які негативно діють на рослину, таким же чином діють і на розвиток бульбочкових бактерій та функціонування бульбочок.

У бактероїдній тканині бульбочок ризобії повністю домінують, а після відмирання рослин вони формують місцеву популяцію бульбочкових бактерій. Перехід in planta ^ ex planta викликає виникнення популяційної хвилі, що призводить до елімінації частини популяції ризобій в ґрунті за рахунок індивідуального добору. У більшості випадків ґрунт виконує функцію підтримання популяції бульбочкових бактерій до моменту інфікування ними відповідної бобової рослини.

Таким чином, бульбочкові бактерії належать до мікроорганізмів, які здатні до гетеротрофного та симбіотрофного способу життя. В результаті взаємовигідного співіснування зростає екологічний потенціал обох партнерів симбіозу, один з яких (макросимбіонт) отримує нову метаболічну функцію - фіксація молекулярного азоту повітря, а інший (мікросимбіонт) отримує захист від дії факторів зовнішнього середовища та елементи живленн

2.2 Вплив екологічних факторів на бобово-ризобіальний симбіоз

На взаємовідносини бульбочкових бактерій з рослиною- живителем впливають різноманітні екологічні фактори: абіотичні, біотичні та антропогенні. Ці фактори регулюють утворення бобово- ризобіального симбіозу та нерідко відіграють визначальну роль у реалізації потенційних можливостей симбіонтів і ефективності даної системи.

Оскільки бульбочкові бактерії довгий час існують в ґрунті як сапрофіти, на їхній розвиток, фізіологічні властивості і здатність вступати у симбіотичні взаємовідносини з рослинами істотно впливає механічний склад ґрунту та вміст у ньому гумусу. Тип ґрунту та його властивості можуть обмежувати або, навпаки, сприяти розповсюдженню та домінуванню в ньому бактерій, різних за активністю. Для різних типів ґрунтів показник бульбочкоутворення у сої достатньо стійкий і найсприятливіші умови для нодуляційного процесу створюються у багатих на гумус ґрунтах. L. Heatherly із співавт. [33] було показано, що найвищий приріст урожаю надземної маси рослин сої від інокуляції спостерігається на пилуватому суглинку, в той час як найбільший урожай насіння був на глинистому ґрунті.

Одним з головних екологічних факторів для бульбочкових бактерій є температура. Вони стійкі до низьких температур і гинуть при температурі вищій 50 оС. Значне підвищення температури призводить до зниження чисельності В. ]аротсит у грунті. Оскільки ризобії та бобові рослини по-різному реагують на температурний стрес, вплив температури на симбіоз визначається сорто-штамовою взаємодією.

Дефіцит вологи або перезволоження негативно впливають як на рослину-живителя, так і на бульбочкові бактерії. Вважається, що оптимальна вологість, яка необхідна для формування та ефективного функціонування симбіотичної системи, становить 60-70 % повної вологоємності. Так, у період посухи у бобових рослин знижується азотфіксувальна активність та поглинання мінерального азоту кореневою системою. За умов нестачі або надлишку вологи у бульбочкових бактерій порушується респіраторна функція, внаслідок чого зменшується їх чисельність в екотопі.

На ріст та розвиток бульбочкових бактерій також істотно впливає аерація ґрунту. Вважається, що при кисневому голодуванні для виживання ризобій у ґрунті велике значення можуть мати окиси азоту, які використовуються як акцептори електронів [34, 35]. Зниження концентрації кисню біля коренів призводить до слабкого розвитку кореневої системи та зменшення кількості бульбочок і рівня поглинання коренем калію, кальцію і фосфору.

Слід відмітити, що симбіотичні системи дуже чутливі до реакції ґрунтового розчину. У більшості випадків низькі значення рН призводять до зниження активності та вірулентності бульбочкових бактерій або до їх загибелі. За даними китайських дослідників [36] при збільшенні кислотності середовища у штамів B. japonicum порушується полярний характер розподілу екзополісахаридних рецепторів, у результаті чого знижується адсорбція бактеріальних клітин на коренях. Разом з тим, існують штами, які витримують низькі значення рН (на рівні 4,5) і при цьому мають високу нодуляційну здатність. Вапнування кислих ґрунтів дозволяє підвищити рН і створити сприятливі умови для розвитку симбіозу. Важливо підкреслити роль рослини-живителя як екологічного фактору, який корегує вплив кислотності ґрунту на вірулентність та активність ризобій.

Існує специфіка азотного живлення бобових рослин та вплив різних доз азотних добрив на взаємовідносини їх із бульбочковими бактеріями. Соя та квасоля належать до групи бобових культур, у яких однаково виражена активність автотрофного та симбіотрофного типів живлення. Коефіцієнт ефективності у них наближається до 100 %. Переважання симбіотрофного азотного живлення над автотрофним виявлено у вики мохнатої та конюшини східної, а також у малоокультурених видів Trifolium ambiguum M. Bieb. і Lupinus digitatus Forsk. Внесення мінерального азоту, як правило, знижує рівень використання молекулярного азоту пропорційно використаній дозі добрива. Протиріччя щодо необхідності застосування невеликих стартових доз азотних добрив в технології вирощування сої можуть бути пов'язані з тим, що дослідження проводилися з різними сортами і за різних грунтово-кліматичних умов [37]. Деякі науковці пропонують визначати доцільність внесення азотних добрив під бобові рослини відповідно до умов регіону вирощування даної культури [38].

Істотний вплив на бобово-ризобіальний симбіоз має вміст у ґрунті фосфору, калію та мікроелементів. Так, при використанні фосфорно-калійних добрив покращується розвиток кореневої системи рослин, підвищується кількість бульбочок та ефективність симбіозу [39]. Відмічено позитивний вплив мікроелементів на ріст і розвиток бульбочкових бактерій, процеси нодуляції та функціонування леггемоглобіну і нітрогенази. Недостатня кількість цих елементів у ґрунті призводить до порушення нормального розвитку бульбочок та зниження активності азотфіксації.

Серед біотичних факторів найбільше значення для ризобій мають кореневі виділення бобових рослин. Вони можуть істотно впливати на популяції бульбочкових бактерій в екотопі, стимулювати або пригнічувати їхню активність [40-42]. У місцевих популяціях цих мікроорганізмів відбувається відбір за реакцією на умови прикореневої зони рослин та ґрунту. У літературі є також повідомлення щодо впливу на ризобії кореневих ексудатів небобових рослин.

Антропогенний вплив на бульбочкові бактерії проявляється у застосуванні в сільськогосподарській практиці речовин, які порушують природну взаємодію ризобій з рослиною-живителем, що може призвести до спрощення біологічних систем . До найбільш вивчених ксенобіотиків належать пестициди, які широко застосовуються з метою захисту рослин від хвороб, шкідників тощо. Вони відіграють роль потужного екологічного фактору, викликають зміни чисельності, морфологічних ознак мікроорганізмів та нерідко проявляють мутагенну активність і є генетичною загрозою для ґрунтової мікробіоти.

Таким чином, під впливом екологічних факторів обмежується розмір та активність популяцій бульбочкових бактерій у природних екотопах, регулюється формування та продуктивність рослинно-мікробних систем. Дані щодо активності окремих компонентів агроценозу та їх взаємозв'язку з іншими компонентами, а також реакції на природні та антропогенні чинники можуть слугувати цінним матеріалом для прогнозування процесів, що відбуваються в агроекосистемах, з метою забезпечення їх стабільності.

Розділ 3. Симбіози небобових рослин і азотфіксуючих мікроорганізмів

Як понад 100 років тому було встановлено, що деякі небобові рослини також здатні утворювати на кореневій системі бульбочки. Дослідження останніх 30 років показали, що спонтанне утворення на небобових рослинах бульбочок пов'язане з проникненням у їх кореневу систему мікроорганізмів, здатних фіксувати молекулярний азот [27-29].

Найбільш вивченими системами біологічної фіксації атмосферного азоту серед небобових є симбіози квіткових дводольних рослин з актиноміцетами роду Frankia [14, 44-45] та папоротей роду Azolla з ціанобактеріями Anabaena azolla [46-48]. В цих системах азотфіксуючі бактерії розвиваються в спеціалізованих структурах (бульбочках), що забезпечує їм сприятливі умови існування.

Бактерії роду Frankia можуть інфікувати рослину-живителя двома способами: через кореневий волосок або проникаючи через міжклітинники епідермісу. Кожний із способів залежить від специфіки рослин. У випадку волоскового зараження гіфа Frankia проникає через деформований волосок, далі вона лізує клітинну стінку, і рослина у відповідь починає створювати додаткову клітинну стінку навколо місця лізису. Потім, в результаті розростання рослинної тканини, відбувається інкапсуляція і утворюється структура аналогічна інфекційній нитці. Мітотична активність в кортексі кореня зростає, що призводить до утворення пребульбочки, яка містить інкапсульовані гіфи Frankia. Потім Frankia починає формувати везикули, в яких нітрогеназа здійснює фіксацію азоту. При “актиноризному” симбіозі початок фіксації азоту пов'язуютьз появою везикул в інфікованих кортикальних тканинах. Утворення везикул контролюється рослиною-живителем [14]. Слід зазначити, везикули Frankia можуть утворюватися і в чистих культурах при нестачі азоту в середовищі. Клітини Frankia поділяються на три типи: гіфи, везикули і спорангії. На відміну від ризобій, Frankia можуть фіксувати азот в чистих культурах при атмосферному парціальному тиску кисню шляхом формування специфічних везикул, де нітрогеназа захищається від кисню завдяки багатошаровій ліпідній оболонці [44].

“Актиноризні” рослини зустрічаються в природі дуже часто в різних кліматичних зонах. Нараховується 20 родів і до 200 видів цих рослин. В помірному кліматі це види родів Alnus, Hippophae, Elaegnus, Myrica, в субтропічному - Coriaria, Casuaria, Ceanothus [37]. 41 представник роду Alnus здатен утворювати азотфіксуючі бульбочки в зоні помірного клімату.

Вивчення мікроорганізмів, виділених з бульбочок “актиноризних” рослин, показало, що до їх складу поряд з франкіями входять також інші бактерії і актиноміцети. У різних рослинах співвідношення грибів, бактерій і актиноміцетів в бульбочках істотно розрізняються, Так у бульбочках лоху домінують актиноміцети, у бульбочках колетії і цеанотуса - бактерії, у бульбочках коріарії - гриби [37]. Результати, отримані при вивченні лисохвосту, показали, що його бульбочки містять мікоризоутворюючий гриб, бактерії, і в низці випадків - актиноміцети. Бактерії знаходяться і в середині везикули мікоризоутворюючого гриба. Нормальна ультраструктура бактеріальних клітин свідчить, що вони можуть співіснувати з грибом. Нестійкий рівень азотфіксуючої активності знайдених бульбочок протягом вегетаційного періоду може свідчити про вторинне проникнення азотфіксуючих бактерій в клітини бульбочок, які раніше були заселені мікоризоутворюючим грибом [40]). Вивчення вмісту мікроорганізмів у бульбочках різних видів “актиноризних” рослин показало, що в бульбочках 14 видів рослин (Alnus barbata, A. firma, A. glutinosa, A. japonicum, A. nepalensis, A. pendula, A. tinctoria, Elaeagnus angurtifolia, E. viridis, Myrica cerifera, M. coralinensis) переважають представники родів Nocardia, представники роду Streptomyces переважали в 7 видах “актиноризних” рослин (A. glutinosa, A. incana, A. nepalensis, A. pendula, E. angustifolia, E. pungens, M. cerifera) [41].

Широке розповсюдження симбіозів ціанобактерій Anabaena azolla з папоротями роду Azolla можна пояснити високою пластичністю метаболізму згаданого мікроорганізму, що є основою формування адаптаційної стійкості. Ціанобактерії здатні здійснювати багатоканальні фізіолого-біохімічні реакції, переходячи з одного шляху метаболізму на інший. В аеробних умовах вони не мають здатності до азотфіксації, але виявляють її в анаеробних; переміщуючись в ризосферу рослин від фотосинтезу переходять на темновий спосіб життя, при зміні освітлення змінюють співвідношення аноксигенного і оксигенного фотосинтезу [42]. Вважається, що при утворенні симбіозів з рослинами у ціанобактерій активність глутамінсинтетази істотно знижується, що призводить до виділення мікросимбіонтом частини фіксованого азоту у вигляді NH4+, який поглинається рослиною-донором. У всіх вивчених симбіотичних форм ціанобактерій активність глутамінсинтетази приблизно однакова і складає 25% від активності глутамінсинтетази штамів ціанобактерій, що існують поза симбіозом [43]. При переході від симбіозу до вільного існування вони завжди перебувають у більш або менш тісних консорціумах з іншими організмами, частіше всього з бактеріями. Природні консорціуми на основі ціанобактерій дуже різноманітні, нараховується більше 300 видів бактерії-супутників ціанобактерій. Це дає можливість створювати штучні консорціуми на основі ціанобактерій, вводячи в склад консорціуму бактерії родів Rhizobium, Agrobacteriumr, Enterobacter, Pseudomonas. Згадані консорціуми виявились стійкими й ефективними [44].

Таким чином, найефективнішим способом забезпечення рослин зв'язаним азотом є мутуалістичний симбіоз, коли рослина вступає в симбіоз з азотфіксуючими мікроорганізмами, що значно розширює екологічні можливості як мікросимбіонту (який відходить від конкуренції з сапрофітною мікрофлорою і отримує доступ до джерел живлення, що легко засвоюються), так і живителя (для якого відкривається можливість жити в умовах дефіциту або навіть повної відсутності зв'язаного азоту). Крім того, утворення таких симбіозів різко підвищує інтенсивність процесу фіксації азоту, тому що мікросимбіонт використовує метаболічні можливості рослини-живителя для покриття енергетичних витрат, які необхідні для розриву потрійного зв'язку в молекулі N = 14, а також отримує можливість швидко звільнюватися від амонію, що утворився. Тому найінтенсивніше азотфіксація відбувається при утворенні ендосимбіозів, коли мікроорганізм проникає всередину тканин, або навіть клітин рослини, забезпечуючи таким чином тісну метаболічну інтеграцію партнерів [17, 45, 46].

Розділ 4. Штучне формування азотфіксуючого симбіозу у небобових рослин

В сучасній мікробіології широко обговорюються альтернативні способи забезпечення небобових рослин доступним азотом за рахунок використання потенціалу грунтових азотфіксуючих мікроорганізмів [50]. Розглядаються наступні шляхи підвищення активності азотфіксації:

прямий перенос ms-генів з бактеріальних клітин в рослинні;

інокуляція рослин генетично модифікованими по шТ-гену штамами бактерій [51], а також бактеріями, які продукують ауксиноподібні речовини [52];

створення асоціацій культурних рослин з ендофітними азотфіксуючими мікроорганізмами, які виділяються з природних симбіозів [53]

створення рослин, які заселяються діазотрофами через стадію змішаного калуса (калусні клітини з діазотрофами) за рахунок використання явища тотипотентності рослинних клітин;

формування штучних симбіозів за рахунок процесу паранодуляції на коренях небобових рослин [54-55].

Паранодуляція - це штучне індукування утворення псевдобульбо- чок на коренях небобових рослин під впливом різних хімічних агентів: гормонів рослин, літичних ферментів, гербіцидів і т.п. Такі агенти отримали назву абіогенні фактори нодуляції [57, 58]. Паранодуляція може здійснюватися при дії на рослини таких речовин, як ауксиноподібні сполуки (2,4-діхлорфеноксиоцетова кислота, хлорамбен, хлорсульфорн) [56], а також ферменти (целюлаза и пектиназа) [57]. Саме таким шляхом були одержані бульбочки рослин пшениці, рису, кукурудзи, ріпаку [58]. Вплив абіогенних нодуляційних факторів на рослину можливий тільки у вузькому діапазоні концентрацій, що ускладнює їх застосування в польових умовах. Формування на коренях небобових рослин псевдобульбочок під впливом абіогенних факторів нодуляції призводить до порушень морфологічної організації кореня не тільки в зоні епідермісу і кортикальної паренхіми, але й центрального циліндра. Це сприяє проникненню ризосферних бактерій як в міжклітинники паренхіми коренів, так і в клітини провідних тканин, що може призвести до закупорки судин ксилеми і загибелі рослини в цілому [56].

Однак формування псевдобульбочок ще на гарантує посилення активності процесу азотфіксації, оскільки не завжди ці морфологічні структури заселяються бактеріями-діазотрофами. Тому з метою покращання азотного живлення рослин псевдобульбочки одночасно інокулюються азотфіксуючими мікроорганізмами, які одержали назву “біологічні агенти нодуляції" [56].

Мікроорганізми, що використовуються як біологічні нодуляційні агенти, повинні відповідати наступним вимогам: синтезувати гормоно- подібні речовини і ферменти, які порушують клітинну стінку рослин, а також адсорбуватися на поверхні коренів рослин. Адсорбція біологічних факторів нодуляції на поверхні коренів рослин, проникнення їх всередину тканин тільки кортикальної паренхіми і розповсюдження по системі міжклітинників сприяє формуванню на коренях калусоподібних структурпсевдобульбочок протягом усього періоду життя рослини [56].

Відомі роботи щодо одержання парабульбочок на коренях ячменю і кукурудзи під впливом 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти (2,4-Д), яка у високих концентраціях (20-30кг/га) є гербіцидом, а в низьких (20г/га)гормоном росту рослин. Одночасно з використанням 2,4-Д проводили інокуляцію рослин Azospmппum lipoferum. Показано, що рослина-донор здатна забезпечити необхідний азоспірилам субстрат для здійснення всередині бульбочок процесу фіксації атмосферного азоту. Цитологічні дослідження показали локалізацію азоспірил всередині бульбочок, які відзначаються високою нітрогеназною активністю [59].

Під впливом 2,4-Д на коренях капусти спостерігали утворення бульбочкоподібних структур при одночасному застосуванні штаму асоціативної азотфіксуючої бактерії Pseudomonas caryophyШ, яка була виділена з ризосферного грунту рослин ячменю. Псевдобульбочки утворилися на кореневих волосках на 4-5 добу після інокуляції і мали діаметр близько 1 мм. Кількість псевдобульбочок складала 20 шт. на одну рослину, вони формувалися у всіх інокульованих рослин. Нітрогеназна активність коренів з псевдобульбочками була в сім разів вищою, ніж коренів капусти, які також інокулювали Pseudomonas caryophylli, але не використовували 2,4-Д [66].

Використовуючи абіогенний нодуляційний агент 2,4-Д і бактерії родів Azotobacter, Klebsiella, Azospirillum, Azorhizobium і Alcaligenes у пшениці, спостерігали утворення псевдобульбочок. При цитологічних дослідженнях псевдобульбочок виявлена внутрішньоклітинна локалізація бактерій і показано формування парабульбочок з примордіїв бокових коренів. Парабульбочки мали рожевий колір і містили структури, які нагадували інфекційні нитки бобових рослин. Ацетиленредуктазна активність парабульбочок в 4-7 разів перевищувала цей показник у інокульованих, але необроблених 2,4-Д рослин. Азотфіксуюча активність парабульбочок була підтверджена також при застосуванні прямого ізотопного (15^)-методу [60].

Описані парабульбочки на коренях рису, які утворилися під впливом ауксинів та інокуляції бактерією Azospirillum brasilense. Показано, що азоспірили сприяють підвищенню активності полігалактуронази в коренях рису без їх морфологічних змін. Інокуляція рослин з одночасним застосуванням 2,4-Д або індоліоцтової кислоти супроводжується морфологічними змінами з утворенням бульбочок на коренях рису. Спостерігалася позитивна кореляція між активністю полігалактуронази, ступенем кореневого морфогенезу і ендоризосферною колонізацією Azospirillum brasilense коренів рослин і ця кореляція визначалася типом і концентрацією застосованого абіогенного фактора нодуляції (2,4-Д або індолілоцтової кислоти) [61].

Досліджували штучне утворення псевдобульбочок з високою нітрогеназною активністю на коренях озимого рапсу. Абіогенним агентом нодуляції слугував 2,4-Д. Як біогенний нодуляційний агент використовували природну асоціацію бактерій (Micrococcus sp. + Rhodococcus sp.), що характеризувалася стабільністю складу, але відрізнялася низьким рівнем азотфіксації. З метою посилення нітрогеназної активності рослини рапсу додатково інокулювали сумішшю культур азотфіксуючих бактерій (Azotobacter nigricans + Bacillus sp.), яка забезпечувала стабільно високий рівень азотфіксуючої активності. В результаті на коренях рапсу на десяту добу спостерігалося утворення псевдобульбочок (9-15 на одну рослину), причому кількість бульбочок не змінювалася протягом наступного вегетаційного періоду.

Методом електронної мікроскопії вивчали ультраструктуру утворених псевдобульбочок на коренях рапсу. Встановлено, що бактеріальні клітини локалізуються не тільки в міжклітинниках, але й колонізують трахеальні елементи первісної ксилеми, які в рослинах забезпечують транспорт води і мінеральних солей від коренів до листків. При цьому бактерії імобілізуються на сформованій специфічній вторинній оболонці. В центрі рослинних клітин з'являються гетероморфні бактеріальні клітини, від поверхні мембран яких клітин відокремлюється велика кількість пухирців-везикул, що може засвідчувати активний стан бактерій. Ці везикули є структурами специфічними для даного симбіозу, тому що вони відсутні як у макро-, так і мікросимбіонта і спостерігаються тільки у псевдобульбочках. Одержані результати засвідчили, що активність азотфіксації у небобових рослин посилюється внаслідок паранодуляції безпосередньо в грунті [53].