Екологічні аспекти формування та функціонування корозійно небезпечних угруповань ґрунтових мікроорганізмів

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ, МОЛОДІ ТА СПОРТУ україни

ОДЕСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені І. І. МЕЧНИКОВА

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

03.00.16 - екологія

Екологічні аспекти формування та функціонування корозійно небезпечних угруповань ґрунтових мікроорганізмів

Піляшенко-Новохатний Андрій Ігорович

Одеса 2011

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в відділі загальної та ґрунтової мікробіології Інституту мікробіології і вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України.

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор член-кореспондент НАНУ, Андрєюк Катерина Іванівна, Інститут мікробіології і вірусології НАН України імені Д.К. Заболотного, провідний науковий співробітник

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, Гвоздяк Петро Ілліч, Інститут колоїдної хімії і хімії води НАН України імені А.В. Думанського, головний науковий співробітник

доктор біологічних наук, професор, Стефурак Василь Петрович, Івано-Франківський національний медичний університет

доктор біологічних наук, ст. наук. співроб., Таширєв Олександр Борисович, Інститут мікробіології і вірусології НАН України імені Д.К. Заболотного, завідувач відділу екстремофільних мікроорганізмів

Захист відбудеться 17 червня 2011р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.051.06 при Одеському національному університеті імені І.І. Мечникова за адресою: м. Одеса, Шампанський провулок, 2.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Одеського національного університету імені І.І. Мечникова за адресою: 65082, Україна, м. Одеса, вул. Преображенська, 24.

Автореферат розісланий травня 2011р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, Д 41.051.06 доктор біологічних наук, професор Т.О.Філіпова

1. Актуальність теми

підземний корозійний мікроорганізм земля

Наш час можна характеризувати як час поглиблення протиріччя між бажаннями суспільства в повному обсязі користуватися перевагами технічного прогресу і одночасно зберегти чистоту довкілля. Окремим випадком цього протиріччя є проблеми, що виникають при забезпеченні промисловості джерелами енергії, задля вирішення якої в останні роки спостерігається інтенсифікація будівництва магістральних нафто- і газопроводів. Наслідком чого є зростання антропогенного навантаження на довкілля, що призводить до інтенсифікації ґрунтової корозії під впливом мікроорганізмів. Рівень екологічних ризиків в зонах прокладення трубопроводів стає критичним.

На сучасному етапі досліджень все чіткішим стає розуміння того, що проблема мікробної корозії є складовою в більш загальному комплексі екологічних проблем, пов'язаних з активізацією антропогенного впливу на довкілля, і має розглядатися як еколого-технологічна. В процесі великомасштабного підземного будівництва, яке здебільшого проводиться без попередньої екологічної експертизи, мікробна сукупність ґрунту зазнає виняткових комплексних техногенних навантажень. Відбувається зсув екологічної рівноваги. Створюються нові умови існування звичайних форм ґрунтових мікроорганізмів .

Екологічний аспект проблеми, що розглядається, це перш за все, питання про збудників і механізми біокорозійного процесу. В зв'язку з цим особлива увага приділялась вивченню складу корозійно активних сукупностей мікроорганізмів, визначенню механізмів, що сприяють залученню ґрунтових бактерій до корозійних процесів, та пошуку критеріїв, які дозволяють провести оцінку ступеню їх корозійної активності [К.І. Андрєюк, 1987; W.A. Hamilton, 1985; H. A. Videla, L. K. Herrera, 2005; К.І. Андрєюк та ін., 2005].

На нашу думку, екологічно безпечна експлуатація подібних споруд та їх протикорозійний захист неможливий без чіткого розуміння суті процесів, які відбуваються на поверхні металу, зануреного у ґрунт, їх першопричин, характеру збудників та прогнозування віддалених екологічних наслідків. На сучасному етапі досліджень в сфері мікробноіндукованої корозії особливої актуальності набуває вивчення процесів пов'язаних з формуванням та функціонуванням на поверхні металу біоплівок, утворення яких є найбільш істотною модифікацією зовнішньої поверхні металу під впливом мікроорганізмів. Можна з впевненістю стверджувати, що ключ до розуміння процесів, щодо змін поверхневих характеристик металу, і відповідних змін інтенсивності корозійного процесу, лежить в розкритті механізмів утворення біоплівки. Мікробна колонізація металевих поверхонь в значній мірі змінює класичні уявлення про характер поверхневих електрохімічних процесів, що мають місце при хімічній корозії. Утворення біоплівок на металі є результатом процесу накопичення екстрацелюлярного матеріалу, який починається негайно після занурення його до біологічноактивного середовища. Спостерігаються суттєві відмінності в якісному складі і концентрації іонів, що накопичуються в біоплівці, зміни значень pH оточуючого середовища, і зниження окислювально-відновлювального потенціалу. Біоплівка є динамічною системою, в який по всій її товщі мають місце різноманітні транспортні процеси та хімічні перетворення [Lewandowski, 2000].

Роль біоплівок в збільшенні інтенсивності корозії в умовах активного біологічного впливу на поверхню металу може бути різною і полягати в одночасній або послідовній реалізації декількох механізмів.

Виняткова поширеність та специфічність мікробної корозії вимагає термінового корегування параметрів активного протикорозійного захисту у відповідності до рівня біологічної активності ґрунтів та передбачає певні обмеження при використанні захисних покриттів та промислових інгібіторів корозії. Розробка таких комплексних антикорозійних заходів має за мету звести до мінімуму ті негативні наслідки, що можуть виникати в ґрунтах, як результат порушення екологічної рівноваги.

Зв'язок роботи з науковими планами, програмами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках тем бюджетного фінансування “Изучить роль микроорганизмов в коррозии подземных сооружений в различных почвенно-климатических зонах Советского Союза и разработать рекомендации по защите этих объектов от микробных повреждений.” № держ. реєстрації 01.86.0. 072640 (1986 - 1990 рр., виконавець), “Вивчити основи взаємодії агресивних мікробних уруповання з промисловими матеріалами”, № держ. реєстрації 01.9.10057065 (1991 - 1993 рр., виконавець), “Екоадаптація та функціонування мікробних угруповань в умовах техногенезу” (1994 - 1998 рр., відповідальний виконавець), “Формування та функціонування біоплівки як чинника мікробноіндукованої корозії” (1999 - 2003 рр., відповідальний виконавець), "Мікробноіндукована корозія в біоплівці як модельна система для вивчення метал-мікробної взаємодії" (2004 - 2008 рр., відповідальний виконавець), а також в рамках тем, які фінансувались з Державного фонду фундаментальних досліджень “Дослідження гідрогеназ бактерій циклу сірки в процесах корозії металу з метою створення нових систем антикорозійного захисту” № держ. реєстрації 5.186 (1993 - 1994 рр., керівник теми), “Вивчити вплив взаємодіючих факторів на аборигенну мікрофлору верхньопалеогенових стратонів України з метою прогнозування екологічного стану геологічних відкладів” № держ. реєстрації 6.216 (1994 - 1996 рр., відповідальний виконавець), контракту № 84/27861, укладеного між міністерствами зв'язку СРСР та Республіки Куба (1990р., виконавець), господарського договору з Управлінням метрополітену м.Ташкент “Изучить причины возникновения чрезвычайной экологической ситуации на станции метрополитена “Чкаловская”- "Ташкент” (1990 - 1991рр.. відповідальний виконавець), а також контракту з газотранспортувальною компанією "Gasuni", Нідерланди (2005 р., виконавець).

Мета і задачі досліджень. Метою даної роботи було з`ясування механізмів формування та спільного функціонування корозійно активних угруповань ґрунтових мікроорганізмів під впливом техногенних факторів, а також розробка ефективних заходів протикорозійного захисту підземних споруд, які були б максимально безпечними для довкілля.

Виходячи з мети роботи нами вирішувались такі задачі:

Дослідити механізми перетворень аборигенних мікробних угруповань ґрунтів різних кліматичних зон, прилеглих до підземних металевих споруд, на корозійно активні, під впливом екологічно небезпечних техногенних навантажень.

Визначити якісний склад корозійно активних мікробних угруповань та розподіл функцій між мікроорганізмами, що входять до таких угруповань в загальному корозійному процесі.

Визначити механізми, за рахунок реалізації яких якісна сталість корозійно активних угруповань підтримується упродовж тривалого часу.

Дослідити причини, внаслідок яких швидкість біокорозійного процесу досягає надвисоких значень і може зберігатися на такому рівні тривалий час, з метою подальшої розробки точкових методів його блокування.

Визначити параметри росту корозійно небезпечних груп бактерій, що входять до біоплівки, яка утворюється на поверхні підземних споруд, з метою визначення критеріїв оцінки потенційної біокорозійної активності ґрунтів та прогнозування тривалості і інтенсивності МІК.

Дослідити взаємозв'язок між складом метаболітів, що продукується корозійно активним угрупованням мікроорганізмів, та ступенем корозійних пошкоджень металевих споруд.

Дослідити механізми впливу гідрогеназ сульфатвідновлювальних бактерій на інтенсивність процесів мікробної корозії та визначити тип ферменту, який безпосередньо бере участь у корозійному процесі. цілому.

Визначити причини недостатньої ефективності дії традиційних заходів протикорозійного захисту на корозійно небезпечні мікроорганізми, з метою розробки науково обґрунтованих та екологічно безпечних систем боротьби з біокорозією.

Розробити наукові основи екологічно безпечних режимів протикорозійного захисту підземних металевих споруд з урахуванням фізико-хімічних особливостей оточуючого їх ґрунту.

Об'єкт дослідження. Механізми та процеси формування і функціонування угруповань ґрунтових мікроорганізмів та їх взаємодія з абіогенними чинниками.

Предметом дослідження були механізми формування та спільного функціонування корозійно активних угруповань ґрунтових мікроорганізмів під впливом техногенних факторів.

Методи дослідження. При виконанні роботи крім класичних методів екологічного моніторингу та мікробіологічних методів ідентифікації складових сукупності ґрунтових бактерій були використані різні підходи стаціонарної кінетики та класичної термодинаміки, фізико-хімічні методи дослідження такі як газорідинна хроматографія, ЕПР-спектроскопія, рентгено-фазовий аналіз.

Наукова новизна одержаних результатів. За результатами експериментальних досліджень вперше теоретично обґрунтовано механізми формування та спільного функціонування корозійноактивних угруповань ґрунтових мікроорганізмів під впливом техногенних факторів та запропоновано нові критерії контролю за розвитком біокорозійних процесів, визначення яких дозволить попереджувати техногенні аварії на магістральних нафто- та газопроводах і здійснювати довгострокові прогнози розвитку корозійної ситуації на етапі проектування підземних споруд.

Вперше показано, що в природних умовах, при техногенних порушеннях екологічної рівноваги, сульфатвідновлювальні бактерії (СВБ) здатні бути центром, довкола якого формується мікробне угруповання з чітко розмежованими функціями кожного з асоціантів.

Проведені дослідження вперше дозволили виявити трофічні та енергетичні чинники, які сприяють формуванню корозійно небезпечних мікробних угруповань. Встановлено, що інтенсивність корозійних процесів в ґрунті можна характеризувати у відповідності до якісного складу мікробних метаболітів, які в ньому виявляють.

В природних екосистемах концентрація ростового субстрату, що вимірюється, не відповідає загальній кількості його в обігу. Виходячи з цього, запропонований підхід до оцінки потенційної агресивності ґрунтів за спроможністю та інтенсивністю продукування певних метаболітів їх мікробними угрупованнями, може надавати інформацію, необхідну для прогнозування відтермінованих реакцій екосистеми під впливом техногенезу.

Проведені дослідження щодо впливу гідрогенази на інтенсивність біокорозійних процесів дозволили вперше отримати прямі докази регуляторної функції цього ферменту, а також запропонувати робочу гіпотезу, яка пояснює значне прискорення ґрунтової корозії під час дії мікроорганізмів на метал.

Виходячи із здатності гідрогеназ СВБ до прояву поліредуктантних властивостей, вперше були проведені теоретичні термодинамічні розрахунки ефективних значень потенціалу катодного захисту. Справедливість отриманих теоретичних розрахунків була підтверджена в лабораторних модельних дослідах по вивченню впливу різних кисеньвмісних аніонів на швидкість корозії сталевих пластин в присутності сульфатвідновлювальних бактерій в реакційному середовищі. Вперше був складений "ряд корозійної активності аніонів".

Вперше теоретично обґрунтована і в умовах модельного досліду підтверджена можливість додаткового залучення кисню до реакцій мікробної корозії. Це явище названо нами хлоридзалежна оксигенація.

Запропонована система обчислення оптимальних значень потенціалу катодного захисту споруд в залежності від складу ґрунтових аніонів, яка може бути застосована при проектуванні систем протикорозійного захисту в підземному будівництві.

Вперше встановлено функції окремих компонентів корозійно небезпечного мікробного угруповання в загальному процесі мікробної корозії.

Практична цінність роботи. Виявлено механізми, що призводять до значного прискорення корозійних процесів на підземних спорудах внаслідок активізації життєдіяльності ґрунтових мікроорганізмів. Сукупність одержаних результатів склала основу впровадженого в дію з 01.01.1997 р. ДСТУ 3291-95, яким визначаються методи пошуку активних зон мікробної корозії на підземних спорудах, а також методи оцінки біокорозійної активності ґрунтів, які дозволяють планувати системи ефективного протикорозійного захисту на етапі проектування споруд.

Показано, що при виборі інгібіторів для пасивного антикорозійного захисту металевих споруд та конструкцій від мікробної корозії слід надавати перевагу інгібіторам, які діють за неконкурентним механізмом.

Одержані дані про склад метаболітів, які продукуються угрупованням ґрунтових мікроорганізмів, можуть бути використані при прогнозуванні змін корозійної ситуації в залежності від ступеню забруднення довкілля.

Матеріали дисертації є складовою частиною навчального посібника "Геохімічна діяльність мікроорганізмів та її прикладні аспекти", що вийшов з друку в видавництві "Наукова думка" в 2008 році і рекомендований Міністерством освіти і науки України для студентів вищих навчальних закладів, які вивчають мікробіологічні та інженерні дисципліни. В 2010 році на першому Всеукраїнському конкурсі "Університетська книга", цей посібник здобув диплом другого ступеню в номінації "Кращий підручник з природничих наук та математики".

Особистий внесок здобувача. Всі основні експериментальні результати, які наведені в дисертаційній роботі, одержано особисто здобувачем, або при його безпосередній участі. Дисертаційна робота виконана в комплексі з співробітниками Фізико-механічного інституту НАН України м. Львів (канд. техн. наук Міндюк А.П., надання для досліджень інгібіторів серії КХО), Інституту проблем матеріалознавства НАН України (канд. техн. наук Швець В.А., проведення рентгено-фазових досліджень) та Іінституту ВНДІПІтрансгаз (Ішутін Н.А., Печорін О.М., Егоров Є.В., Калькутін Ю.Г., забезпечення відбору зразків ґрунту на магістральних газопроводах).

Первинну мікробіологічний аналіз природних зразків ґрунтів, ізоляційних матеріалів та продуктів корозії, а також підтримання колекції культур корозійноактивних мікроорганізмів проводили разом з канд. біол. наук Антоновською Н.С., канд. биол. наук Рожанською О.М., канд. біол. наук Пуріш Л.М., канд.біол.наук Асауленко Л.Г., провідн. інж. Коптєвою Г.Є.

Загальне керівництво плануванням експерименту здійснювали член-кореспондент НАНУ К.І. Андрєюк та доктор біологічних наук Козлова І.П.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представлені на: Шостому конгресі болгарських мікробіологів, Варна, 1985 р.; Конференції “Биоценоз в природе и промышленных условиях”, Пущино, 1985 г.; Всесоюзній конференції до 130-річчя С.Н.Виноградського, Москва,1986 р.; IV Міжнародній конференції з мікробної екології, Югославія, Любляна, 1986 р.; Всесоюзному семінарі Мінгазпрому СРСР, Саратов, 1986 р.; ІІІ Всесоюзній конференції по біопошкодженнях, Донецьк, 1987 р.; 10 Конгресі Угорського мікробіологічного товариства, Сегед, 1987 р.; 10 Міжнародному конгресі по корозії металів, Індія, Мадрас, 1987 р.; Міжнародній конференції по трубопровідних конструкціях, ФРН, Гамбург, 1987 р.; Всесоюзній науково-технічній конференції “Прогрессивные методы и средства защиты металлов и изделий от коррозии”, Москва, 1988 р.; І Республіканській конференції по біомінералогії, присвяченій 125-річчю В.І. Вернадського, Луцьк, 1988р.; 5 Міжнародному симпозіумі з мікробної екології, Японія, Кіото. 1989 р.; VII з'їзді Українського мікробіологічного товариства, Чернівці, 1989 р.; 9 Міжнародному симпозіумі з біогеохімії навколишнього середовища, Москва, 1989 р.; V Республіканській конференції “ Корозія металів під напругою і методи захисту”, Львів, 1989 р.; ІІ, ІІІ,IV, V, VI, VII та VIII Міжнародних конференціях-виставках “Проблеми корозії і протикорозійного захисту матеріалів”, Львів, 1994, 1996, 1998, 2000, 2002, 2004, 2006 рр.; Європейському конгресі по корозії “Eurocorr'96”, Франція, Ніца, 1996 р., Міжнародному практичному семінарі "Проблемы антикоррозионной защиты магистральных трубопроводов и резервуаров", Київ, 2001 р., 15 Міжнародному Корозійному Конгресі, Гранада, Іспанія, 2002 р., Европейських конгресах по корозії “Eurocorr'2003", Будапешт, Угорщина, "Eurocorr'2004" Ніца, Франція, "Eurocorr'2005" Лісабон, Португалія, "Eurocorr'2006" Маастріхт, Нідерланди, 16 Міжнародному Корозійному Конгресі, Пекін, Китай, 2005 р, 13 Міжнародному симпозіумі з біопошкоджень, Мадрід, Іспанія, 2005 р, 6 Латино-американському конгресі по біодеградації та біопошкодженням, Богота, Колумбія, 2007 р., 14 Міжнародному сімпозіумі з біопошкоджень, Месіна, Італія, 2008 р.

Публікації. За темою дисертації надруковано 73 роботи, з яких 1 колективна монографія, 1 навчальний посібник, 24 статті в фахових журналах та збірниках, 1 авторське свідоцтво СРСР, 44 повідомлення в матеріалах наукових конференцій, 1 ДСТУ та 1 стаття в енциклопедичному виданні.

Структура і обсяг роботи. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури (1 розділ), матеріалів і методів дослідження (1 розділ), експериментальної частини (3 розділи), аналізу результатів, висновків та додатків. Робота викладена на 272 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 59 рисунками, 24 таблицями, налічує 342 літературних джерела, з яких 261 латиницею.

2. Основний зміст роботи

Огляд літератури

В розділі викладена історія розвитку проблеми МІК, розглянуто питання поширеності та механізмів мікробноіндукованої корозії, наведено дані про екологію та фізіологічні особливості сульфатвідновлювальних бактерій як основного збудника корозійних процесів у ґрунті.

Розглянуто особливості утворення біоплівок корозійноактивних бактерій на поверхні металу, їх склад та архітектоніка.

Наведено дані по локалізації, структурні та функціональні відмінності трьох різних типів гідрогеназ сульфатвідновлювальних бактерій. Розглянуто можливі механізми участі цього ферменту в біокорозійних процесах. Наведено дані стосовно методів запобігання розвитку корозійних процесів в реальних експлуатаційних умовах.

Матеріали і методи досліджень.

Вивчення різних аспектів мікробноіндукованої корозії потребує, окрім загальних методів, що застосовуються в ґрунтовій мікробіології, також і нових підходів, які розробляються у відповідності до поставлених завдань.

Відбір проб ґрунту та ґрунтової води для мікробіологічних та хімічних досліджень проводили згідно вимогам ДСТУ 3291-95.

Виділення мікробних угруповань проводили наступним чином: наважку ґрунту 200г заливали водопровідною водою в кількості 400 см3 та обробляли ультразвуком на установці УЗДН 2Т при 22 кГц по 60 с двічі з інтервалом в 1 хвилину. Одержану суспензію центрифугували при 5000 g, щоб осадити ґрунт. Надосадову рідину фільтрували через паперовій фільтр, після чого центрифугували 60 хвилин при 25000 g. Осад переносили в одну центрифужну пробірку і ще раз центрифугували в стерильній водопровідній воді в тому ж режимі. Після центрифугування осад переносили в мірну колбу на 50 см3 з подальшим висівом отриманого матеріалу на елективні середовища.

Кількісний та якісний склад мікробних угруповань визначали методом десятикратних граничних розведень при висіві вихідної проби (10 г ґрунту в 90 г стерильної водопровідної води) на відповідні селективні середовища. Чисельність Thiobacilus thioparus визначали на середовищі Бейеринка, сульфатвідновлювальних бактерій - на середовищі Постгейта “B”, гетеротрофних бактерій роду Pseudomonas - на середовищі Стровинского. В зразках продуктів корозії визначали кількість сульфатвідновлювальних та тіонових бактерій.

Виділення чистих культур досліджуваних мікроорганізмів проводили за загальноприйнятими методами, описаними в літературі [Романенко, Кузнецов, 1974, Bruschi et al., 1977, Rees et al., 1998]. Визначення сульфатвідновлювальних бактерій и бактерій роду Pseudomonas проводили згідно визначнику Bergey [Определитель…,1997].

Гідрогеназоактивні безклітинні препарати сульфатвідновлювальних бактерій отримували шляхом обробки відмитих цілих клітин за допомогою ультразвуку (22 кГц протягом 30 с). Після цього центрифугуванням при 5000 g 30 хвилин відокремлювали незруйновані клітини. Одержану надосадову фракцію центрифугували при 30000 g 1 годину для відокремлення неактивної фракції мембран. Супернатант, що містив 80% вихідної гідрогеназної активності використовували в подальших дослідах.

Гідрогеназну активність визначали спектрофотометричним методом по збільшенню екстинції при 340 нм, що відповідає відновленню НАД+. Перебіг реакції реєструвався на спектрофотометрі “Specord UV-Vis” із застосуванням анаеробної фотометричної кювети. Зазначений метод використовували на початкових етапах роботи при первинному визначені рівня гідрогеназної активності. В подальших дослідженнях активність гідрогенази визначали по зниженню концентрації водню в реакційному флаконі. Вимірювання проводили на газорідинному хроматографі ЛХМ 8МД (модель 5) з застосуванням детектора катарометра. Хроматографічна колонка довжиною 1,5 м, діаметр 4 мм заповнена молекулярними ситами 5Е. Газ-носій аргон. Швидкість газу - носія 20 мл/хвилину.

Визначення концентрації низькомолекулярних монокарбонових кислот: мурашиної, оцтової, пропіонової та масляної в культуральній рідині та ґрунтових витяжках проводили методом газорідинної хроматографії на хроматографі Chrom-5 (Чехія) з використанням детектора іонізації в полум'ї. Об'єм проб, що вводяться в колонку - 10 мкл. Газ-носій - гелій, швидкість газа-носія - 30 мл/хвилину. Колонка діаметром 3 мм, довжиною 1,2 м, заповнена Сепароном CHN. Температура термостату - від 130 2оC до 180 2oC зі швидкістю нагрівання 4oС на хвилину. Температура випаровувача - 150 2оC.

Визначення вмісту вільних амінокислот проводили за стандартною методикою, що описана в літературі [Методы…,1984]. Аналіз проводили на аналізаторі амінокислот ВС-200 (Bio Cal, Німеччина). Кислі та середні амінокислоти визначали на колонці з іонообмінною смолою АМУХЕ-6. На шестидесятій хвилині аналізу відбувалось переключення з буферу рН 3,25 на буфер з рН 4,2. Основні амінокислоти визначали на колонці зі смолою АМУХЕ-5. рН буферу елюції - 5,25.

Метаболічну активність виділених мікробних угруповань вивчали за допомогою газорідинної хроматографії на хроматографі ЛХМ - 8МД (модель 5) з використанням детектору по теплопровідності. Концентрацію кисню визначали, використовуючи колонку, що заповнена молекулярними ситами 5? (довжина - 1 м, діаметр - 4 мм). Концентрацію вуглекислого газу визначали на колонці, що заповнена Полісорбом-1 (довжина - 2 м, діаметр - 4 мм). Газ-носій - аргон, швидкість газу-носія - 30 мл/хв.

Спектри електронно-парамагнітного резонансу безклітинних препаратів СВБ знімали на ЕПР-спектрометр “Varian-9” (США). Умови аналізу: температура - 40 К; мікрохвильова частота - 9,52 GГц; модулююча амплітуда - 1mT; мікрохвильова потужність - 0,2 mВт. Роботу проводили на базі Інституту геохімії та фізики мінералів НАН України.

Рентгено-фазові дослідження продуктів корозії металу проводили на базі Інституту проблем матеріалознавства НАН України. Використовували установку УРС-20, з Cr-випромінювачем при використанні монохроматору. Значення кутів розсіювання підраховували за формулою Вульфа-Брега з подальшим порівнянням отриманих значень зі стандартними [Горелик и др.,1970].

Полярографічні дослідження проводили на аналізаторі РА-2 (Чехія) у відповідності до методу описаного в літературі [Физико-химические методы…,1980].

Аналітичні методи. Загальний вміст сірки та заліза в досліджуваних зразках визначали за методами, наведеними в ДСТУ 3291-95.

Концентрацію Са2+ - іонів визначали методом атомно-абсорбційної спектрометрії з використанням фотометру AAS-1 (Німеччина) [Физико-химические методы…,1980].

Визначення концентрації білка проводили за методом Лоурі [Методы…,1984.]. Як стандарт використовували бичачий сироваточний альбумін.

Корозійні дослідження. Вивчення швидкості корозії катодно поляризованого металу в культурі сульфатвідновлювальних бактерій проводили в електрохімічному реакторі, підключеному до потенціостату П-5848, якій забезпечував катодну поляризацію дослідних пластин в діапазоні від -0,8 В до -1,7 В за Cu/CuSO4 електродом.

Швидкість корозії металу визначали гравіметричним методом. Втрату ваги дослідних зразків вимірювали після їх обробки спеціальним розчином для зняття продуктів корозії. Розрахунки значення швидкості корозії проводили згідно формули, наведеної в літературі [Справочник…,1987].

Модельні зразки бетону в формі кубу розміром 20 х 20 х 20 мм виготовляли з портландцементу марки 400 ПЦ П/АШ 400. В них занурювали арматурні стержні зі стандартного дроту з сталі-3 діаметром 5 мм і довжиною 50 мм. Арматура вводилася по центру кубу на повну глибину занурення таким чином, щоб за межею бетону знаходилося 30 мм вільної частини арматури. Виготовлення залізобетонних зразків проводилося на кафедрі фізики Київського Національного університету будівництва і архітектури.

Зразки залізобетону вміщували у флакони, заповнені сумішшю рідких середовищ Летена і Ваксмана (в співвідношенні 1:1) та інокульовали клітинами тіонових бактерій (Thiobacillus ferrooxidans і Thiobacillus thiooxidans), а також в середовище Постгейта і Гильтая (у співвідношенні 1:1) з внесеними культурами СВБ і денітрифікувальних бактерії (ДНБ). Суспензії бактерій вносили в кількості 106 клітин в 1см3 середовища.

Статистичний аналіз результатів здійснювали відповідно до методичних рекомендацій [Лакин Г.Ф., 1990]. Були застосовані методи кореляційного аналізу, а також визначення стандартної похибки та стандартного відхилення (довірчого інтервалу). Результати оброблено загальноприйнятими методами за стандартними комп'ютерними програмами.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Загальна активність життєдіяльності мікробіоти ґрунту є дуже чутливим показником, який негайно реагує на будь-які зміни зовнішнього середовища, що ведуть до порушення встановленої в системі екологічної рівноваги. На сучасному етапі розвитку цивілізації найбільш потужним фактором є техногенез.

Привнесення в ґрунт великої кількості неприродних для даної екологічної системи матеріалів здатне викликати до життя складні специфічні механізми взаємодії та взаємовпливу ґрунтових мікроорганізмів і технічних матеріалів. Така взаємодія може мати дуже негативні наслідки як з точки зору екологічної ситуації, так і з точки зору забезпечення експлуатаційної надійності інженерної споруди.

Порівняльні дослідження мікробних угруповань ґрунтів, які не перебувають під впливом техногенних факторів, та ґрунтів, що постійно знаходяться під різноманітним техногенним навантаженням, дозволили виявити внутрішні кількісні розбіжності в їх складі (Таблиця 1).

Як видно з таблиці 1, в техногенних угрупованнях спостерігається характерне збільшення кількості ТБ, СВБ та ЗВБ, тобто мікроорганізмів, які здатні проводити трансформацію сполук сірки та заліза. В середньому підвищення вмісту цих груп бактерій складало 3 порядки в порівнянні з аборигенним ґрунтом. Подібне збільшення може, на наш погляд, бути обумовленим високим вмістом іонів Fe2+ в ґрунті, що знаходиться під техногенним навантаженням.

Таблиця 1 Порівняльні характеристики техногенних та аборигенних мікробних угруповань

Тип угруп.	Fe2+ мкг/г ґрунту	Кількість бактеріальних клітин в 1 г ґрунту
		амоніфікувальні (АБ)	денітрифікувальні (ДНБ)	тіонові (ТБ)	сульфат-відновлюв. (СВБ)	залізо-відновлюв. (ЗВБ)
Аборигенне	605	10710-1	10710-1	104 10-1	10110-1	10210-1
Техногенне	30020	10810-1	10610-1	106 10-1	10410-1	10510-1

Базуючись на цих спостереженнях, можна висловити попереднє припущення, що сталь, яка кородує, здатна сприяти розвитку таких фізіологічних груп мікроорганізмів, які здатні в подальшому значно прискорити хід корозійного процесу за рахунок власної життєдіяльності. Тобто, нами був підтверджений факт утворення на поверхні кородуючого металу специфічної біоплівки, яка в попередніх роботах, що провадилися в відділі загальної і ґрунтової мікробіології, дістала назву "феросфера" [Андреюк и др., 1987].

Ми вважали за доцільне дослідити взаємовплив на швидкість корозії трьох співасоціантів корозійно агресивного угруповання мікроорганізмів "феросфери". Окрім сульфатвідновлювальних та тіонових бактерій до сфери наших досліджень було залучено Stenotrophomonas maltophilia, які є обов'язковим супутником зазначених вище бактерій [Антоновская и др.,1992].

Рис. 1 Швидкість корозії металевих зразків в присутності різних сполучень корозійно активних мікроорганізмів.

Як видно з рис. 1, максимальна швидкість корозії виявляється у варіанті, коли на метал одночасно діють три різних види мікроорганізмів, що входять до складу природних корозійно активних угруповань мікроорганізмів. До того ж швидкість розчинення металу за умови спільної дії мікроорганізмів перевищує суму швидкостей корозійних реакцій, які спостерігаються при дії індивідуальних культур.

Так, сумарна швидкість корозії, що спричинена індивідуальним впливом Desulfovibrio desulfuricans та Thiobacilus thioparus, складає 17,38 мг/дм2 * добу, в той самий час при сумісному вирощуванні цих бактерій швидкість сягає 22,7 мг/дм2 * добу.

Аналогічні підрахунки для корозійного угруповання повного складу дають 19,71 мг/дм2 * добу та 32,14 мг/дм2 * добу, відповідно. Підсилення корозійної дії, що спостерігається, складає 30,6% для бінарної асоціації та 63% для повного угруповання.

Таким чином, ми маємо підстави говорити про певний синергічний ефект в випадках, коли корозія контролюється водночас декількома видами мікроорганізмів.

Пояснення цьому факту ми одержали при вивченні гідрогеназної активності клітин біоплівки.

Як видно з рис. 2, гідрогеназна активність малоактивного штаму 45 практично не змінюється в залежності від моделі росту як для індивідуальної культури, так і для бінарної асоціації з ТБ. На відміну від цього, гідрогеназна активність штаму 10 в випадку біоплівкової моделі росту, або, інакше кажучи, для клітин "феросфери" збільшується майже у 2,5 рази. Слід зазначити, що присутність ТБ практично ніяким чином не сприяє такому підвищенню активності. Отже, ми маємо підстави висловити припущення, що інтенсифікація біокорозійних процесів відбувається за рахунок активізації гідрогенази СВБ, яку спричиняє підвищена концентрація іонів заліза в "феросфері" - біоплівці.



Рис. 2 Порівняльна активність гідрогенази для планктонної та біоплівкової моделей росту СВБ

Загальновідомо, що температура та вологість довколишнього середовища є одними з найбільш значущих факторів при розвиненні корозійних процесів. Ми мали нагоду дослідити вплив цих факторів на прикладі кабельних мереж, прокладених в різних регіонах Республіки Куба.

Результати мікробіологічних обстежень показали, що чисельність і активність досліджуваних бактерій коливається в широких межах. Відповідно, гідрогеназна активність СВБ також змінювалась від одиниць до сотень мікромолей зв'язаного Н2 за хвилину на 1мг клітинного білку.

На підставі проведених досліджень загальну корозійну ситуацію кабельних мереж Республіки Куба було оцінено як вкрай несприятливу. Значні корозійні руйнування об'єктів обумовлені високою інтенсивністю життєдіяльності бактерій циклу сірки. Характерною відзнакою при порівнянні ситуації в різних регіонах країни було те, що максимальні пошкодження спостерігали там, де зазначали більш високий ступень антропогенного навантаження, а саме, інтенсивне забруднення кабельних колодязів побутовими та промисловими відходами, які потрапляють до колодязів разом з дощовою водою.

Екологічні зміни в ґрунтах, які є наслідком масштабного підземного будівництва, будуть перш за все спрямовані на досягнення нового рівня стабільності мікробного угруповання. При цьому переорієнтування метаболічних процесів мікроорганізмів здатна призводити до аварійних ситуацій. Виходячи з цього, цілком ймовірно, що для захисту металевих конструкцій від біокорозії важливе не лише розуміння того, як мікроорганізми впливають на метал, але і те, як метал впливає на мікроорганізми.

З метою виявлення таких зв'язків між мікроорганізмами, які складають корозійно агресивне угруповання, нами були проведені дослідження щодо визначення складу мікробних метаболітів в ґрунтах, прилеглих до місць корозійного пошкодження металу підземних трубопроводів.

Узагальнені результати наведено на рис.3. Виявлено відмінності якісного складу мікробних метаболітів в ґрунтах, відібраних з верхньої та нижньої утворюючої трубопроводу. Так, слід зазначити, що підвищену концентрацію серіну, а також присутність сірковмісних амінокислот - цистеїну і метіоніну спостерігалась лише в ґрунтах, прилеглих до нижньої утворюючої трубопроводу, тобто в місцях, де спостерігались максимальні корозійні пошкодження металу.

Окрім цього, в зразках ґрунту, відібраних з нижньої утворюючої трубопроводу, виявлено форміат, який є біосинтетичним попередником серіну і цистеїну. Одержані результати дозволяють зробити певні висновки щодо можливих механізмів формування сталого якісного складу корозійно агресивного угруповання мікроорганізмів. Так, накопичення ацетату сприяє підвищенню чисельності СВБ, тому що він є субстратом для їх росту. Метіонін - обов'язковий фактор для повноцінної нормальної життєдіяльності Stenotrophomonas maltophilia. Цистеїн, що синтезується з метаболічних попередників, здатен брати участь в утворенні позаклітинних активних центрів, подібних до гідрогеназного, і в такий спосіб підтримувати необхідний для угруповання в цілому високий рівень забезпечення енергетичними еквівалентами [Beech I.B., 2005, Levandowsky Z., 2002].

Припущення щодо можливого утворення аналогів активного центру гідрогенази з елементів не біологічного походження знайшло підтвердження в дослідах по вивченню ЕПР-спектрів ґрунтів, прилеглих до кородуючого металу.

Рис. 3

В порівнянні з вихідним ґрунтом, ЕПР-спектр ґрунту, в якому розвивалися корозійні процеси, виявляв значні відмінності (Рис.4). Так інтенсивність резонансної лінії g = 2,03, яка відповідає сигналу [4Fe - 4S] - центра, зростала більш ніж в 12 разів. В той же час загальний вміст заліза в ґрунті, визначений хіміко-аналітичними методами збільшувався лише в 3,5 рази. На нашу думку, цей факт свідчить на користь того, що для розвитку інтенсивного біокорозійного процесу важливе не загальне підвищення концентрації іонів заліза в прилеглому ґрунті, а саме збільшення вмісту специфічних сполук заліза, що мають структуру, подібну до структури активного центру гідрогенази, і здатні виконувати аналогічні функції біосинтезу метаболітів.

Питання прогнозування віддалених наслідків експлуатації підземних споруд на сьогоднішній день майже не вивчається. Це в значній мірі пов'язано з відсутністю загальної концепції прогнозування наслідків техногенного втручання в природне середовище. На нашу думку, певний внесок в створення подібної концепції може надати вивчення змін якісного складу угруповання ґрунтових мікроорганізмів та спрямованості сумарних метаболічних процесів угруповання. Подібні дослідження були проведені нами для угруповань мікроорганізмів, вилучених з ґрунтів та підземних вод, що безпосередньо контактували з поверхнею тунелів метрополітену м. Ташкент.

Дослідження проводили на зразках, відібраних з двох ділянок, одна з яких характеризувалась безпечними з точки зору екології умовами експлуатації, а друга перебувала в зоні техногенного забруднення.

Виходячи з даних попередніх досліджень щодо складу мікробних метаболітів, які можна вважати індикаторами біокорозійного процесу, в відібраних зразках води та ґрунту визначали наявність саме цих речовин.

Якісний склад мікробних метаболітів в усіх досліджених зразках був майже ідентичний. Виняток складала лише наявність лактату в зразках, відібраних на екологічно небезпечній ділянці. Подібний факт може розглядатися як важливий, враховуючи те, що лактат - один з основних субстратів СВБ. Кількісний вміст тестових речовин був в 1,5 - 3 рази вищий для зразків, відібраних на ділянці підвищеної екологічної небезпеки.

На перший погляд, висновок щодо більшої корозійної активності мікробного угруповання з екологічно небезпечної ділянки метрополітену цілком правомірний. Проте, низькомолекулярні органічні сполуки в ґрунті постійно трансформуються внаслідок діяльності мікроорганізмів. Тому ми лише здатні зафіксувати концентрацію певної речовини на певний момент часу. Таким чином, існує вірогідність того, що деякі з характеристичних речовин взагалі не будуть зафіксовані у досліджуваних зразках ґрунтів.

В умовах лабораторного модельного досліду в синтетичне поживне середовище, на якому вирощувалися мікробні угруповання, вилучені з зразків описаних вище, вносили різні джерела вуглецю. Використовували глюкозу - найбільш універсальне джерело вуглецю та енергії при вирощуванні мікроорганізмів; гексан - модель екологічного забрудника; лактат - найбільш поширений вуглецевий субстрат СВБ.

Результати досліджень виявились досить несподіваними. Так, мікробне угруповання, виділене з безпечної ділянки, при рості на лактаті виявилась здатною до накопичення всіх сполук, зарахованих нами до індикаторів процесу біокорозії. Порівняння складу накопичуваних продуктів при рості на різних субстратах виявило цікаву закономірність. При рості на гексані в усіх випадках спостерігалось накопичення лактату, а ріст на лактаті приводив до інтенсивної продукції цистеїну та форміату, активного виділення вуглекислого газу. Отже, можна зробити висновок, що забруднення ґрунтів нафтопродуктами призводить до переорієнтування сумарних метаболічних процесів мікробного угруповання на переважне накопичення лактату, що в свою чергу дає поштовх надпродукції корозійно небезпечних метаболітів.

Рівень антикорозійного захисту залізобетонних споруд в цей час досить низький. Це в певній мірі пов'язано тим, що, на думку ряду авторів, масштаби мікробіологічного чинника непорівнянні з величезною бетонною масою морських і річкових гідротехнічних споруд [Дрозд и др., 1988, Дурчева, Рожанская, 1994, Крисс, Рукина, 1941, Савицкий, 1982, Tatnal, 1981].

Нами було проведене мікробіологічне обстеження залізобетонних конструкцій одного з об'єктів атомної станції з метою прогнозу інтенсивності розвитку біокорозійних процесів після введення станції в експлуатацію.

Активність життєдіяльності накопичувальних культур, виділених з відібраних зразків, оцінювали за інтенсивністю утворення ними вуглекислого газу і водню.

В таблиці 2 наведено результати визначення частоти виявлення деяких груп мікроорганізмів, тобто відсотку інфікованих зразків по відношенню до загального числа досліджених зразків, що є загальноприйнятим і демонстративним показником ступеня зараженості споруди мікроорганізмами.

Інтенсивність накопичення агресивних газоподібних метаболітів - вуглекислого газу і водню - дозволяє опосередковано оцінити міру участі мікробних угруповань в процесах біопошкодження залізобетону. З цієї точки зору найбільш цікавими для дослідження є угруповання, виділені з бетону і арматури. Найбільшу стимулюючу дію на накопичення СО2 виявляють нітрат- і сульфат-іони, причому NО-3 в однаковій мірі стимулює продукцію вуглекислого газу обома угрупованнями. Приріст в порівнянні з контролем становить 3%. Наявність в середовищі сульфат-іону в набагато більшому ступені впливає на життєдіяльність угруповання, виділеного з арматури. Накопичення ним СО2 зростає на 7% в порівнянні з контролем, тоді як при культивуванні угруповання, виділеного з тіла бетону, всього на 0,5%.

Таблиця 2 Частота виявлення бактерій в різних точках відбору (%)

Бактерії	Поза спорудою	На поверхні споруди	В товщі бетону
АБ	100	73,35	66,65
ДНБ	805	53,35	33,35
ТДНБ	805	66,65	66,65
СВБ	905	93,35	88,85

Таким чином, можна прогнозувати, що не лише інтенсивність утворення біогенної вуглекислоти, але і участь в цьому процесі тієї або іншої групи бактерій визначається вмістом і співвідношенням між зазначеними іонами, що заглиблюються в товщу бетону з водою.

Накопичення водню угрупованнями мікроорганізмів при внесенні в реакційні флакони лактату і сульфату не фіксувалося, що, ймовірно, пов'язано з його використанням СВБ в процесі сульфатредукції. У присутності нітрату водень утворюють всі угруповання, що досліджуються, і його вміст в газовій фазі дослідних флаконів коливався від 7 до 45%. Угруповання, виділене з арматури, було більш активне і утворювало в фізіологічному розчині приблизно на 30% більше водню, ніж угруповання, виділене з сольових утворень бетону. Встановлений факт накопичення водню мікробними угрупованнями, виділеними з різних дільниць споруди, вказує на потенційну небезпеку розвинення водневої крихкості сталевих елементів конструкцій за умови постійного притоку вологи і солей в пори бетону.

Отримані результати дозволяють дійти до висновку, що внаслідок ідентичності еколого-трофічних груп мікроорганізмів, які виявляються в зонах корозійних пошкоджень металу, як на підземних спорудах, так і на арматурі залізобетонних конструкцій, механізми, що призводять до корозійного руйнування, будуть ідентичні.

Сучасні теорії механізмів МІК передбачають утворення біоплівки як обов'язковий, характеристичний етап цього процесу. При цьому інтенсивність процесів значною мірою залежить від активності гідрогенази [Iverson, 1987, Mara & Williams, 1977].

Було висловлено припущення, що початковий рівень швидкості корозії визначається швидкістю росту мікроорганізмів до моменту розриву біоплівки [Mara & Williams, 1977]. В зв'язку з цим нам вбачалось за доцільне вивчити закономірності росту мікроорганізмів, що виділялись з продуктів корозії технічних матеріалів, що експлуатуються в підземних умовах.

Для сульфатвідновлювальних бактерій загальною особливістю росту була наявність двох експоненційних фаз. Це можна пояснити особливостями використання лактату. Ймовірно, що лактат використовується клітинами СВБ двома шляхами. Перший - безпосереднє використання на конструктивні потреби. Другий - попередня трансформація до ацетату та водню з подальшим засвоєнням ацетату. Подібна схема відома для деяких інших груп бактерій [Розанова, Назина, 1989, Hamilton 1985].

Максимум гідрогеназної активності для всіх досліджених штамів СВБ спостерігався наприкінці другої експоненційної фази. Це також можна вважати опосередкованим доказом на користь засвоєння лактату СВБ через ацетат і водень. Також двостадійний характер мають криві росту Rh. glutinis 141 i Arthrobacter sp.102. Але, якщо для Arthrobacter sp.102 максимум гідрогеназної активності, аналогічно СВБ, припадав на другу експоненційну фазу, то для дріжджів активність була максимальною на початку експерименту і поступово зменшувалась з часом, що можна пояснити зсувом рН в кислий бік.

Типовий s-подібний характер кривих росту спостерігали для залізовідновлювальних і тіонових бактерій. Але для тіонових бактерій гідрогеназна активність змінювалась аналогічно дріжджам, а для залізовідновлювальних бактерій спостерігався чіткий максимум, який припадав на експоненціальну фазу.

Питомі швидкості росту для всіх вивчених мікроорганізмів наведені в таблиці 3. Для сумісного росту СВБ і ЗВБ характерною є двофазність. Швидкість росту при цьому залишається на рівні індивідуальних культур (0,12 год-1), але майже в 2 рази збільшується гідрогеназна активність (Табл.3). Для природної асоціації спостерігали трифазний ріст при максимальній швидкості 0,17 год-1. Додавання до природної асоціації Dsv.desulfuricans шт. 45 приводило до того, що ростова крива набувала типового s-подібного вигляду. Швидкість росту при цьому не змінювалась, а гідрогеназна активність збільшувалась на 25% в порівнянні з вихідною.

Питання про механізми, за рахунок яких гідрогеназа здатна впливати на загальний хід біокорозійного процесу, залишаються остаточно не з'ясованими.

Отримані нами ростові криві засвідчують, що максимуми гідрогеназної активності окремих еколого-трофічних груп мікроорганізмів, що складають корозійно-небезпечні угруповання, відповідають різним фазам росту. На нашу думку, подібний факт свідчить на користь здатності підтримувати високий загальний рівень відновлювальної активності угруповання в цілому, незалежно від фізіологічного стану окремих асоціантів.

Таблиця 3 Швидкість росту та гідрогеназна активність мікроорганізмів - збудників корозії

Род, вид, штам	Питома швидкість росту () година -1	Гідрогеназна активність мкмоль/Н2 хв мгб
Desulfovibrio desulfuricans шт. 45	1 = 0,12 2 = 0,08	18,40,6
Desulfovibrio thervophilus шт.22	1 = 0,72 2 = 0,09	16,20,4
Desulfovibrio sp. шт. 114	1 = 0,13 2 = 0,06	3,60,08
Pseudomonas sp. шт. 8	= 0,12	19,80,6
Pseudomonas sp. шт. 139	= 0,09	64,22,5
Thiobacillus thioparus шт. 61	= 0,1	2,70,1
Arthrobacter sp. шт. 102	1 = 0,32 2 = 0,1	56,42,8
Rhodotorulaglutinis шт. 141	1 = 0,15 2 = 0,07	7,61,2
Desulfovibrio desulfuricans шт. 45 + Pseudomonas sp. шт. 8	1 = 0,12 2 = 0,04	40,82,3
Природна асоціація + Desulfovibrio desulfuricans шт. 45	= 0,17	36,31,4
Природна асоціація	1 = 0,17 2 = 0,04 3 = 0,06	29,61,2



Рис. 4 Зміна сумарної гідрогеназної активності компонентів корозійно активного угруповання мікроорганізмів в часі

Унаочнення цього твердження наведено на рис.5. Як видно з рисунку, відхилення значення сумарної гідрогеназної активності всіх ідентифікованих нами індивідуальних компонентів корозійно активного угруповання мікроорганізмів, коливаються в межах статистичної похибки і не перевищують 10% протягом всього часу спостереження за процесом.

Такий характер залежності надає підстави стверджувати, що гідрогеназа є ферментом, активність якого регулює загальну інтенсивність біокорозійного процесу.

Безпосередній вплив корозійно небезпечних бактерій на металеві конструкції в реальних підземних умовах можливий лише у випадку руйнування пасивуючої плівки катодного захисту. З суто теоретичних міркувань можливо припустити, що гідрогеназа здатна брати участь в цьому процесі, або передаючи електрони на природні клітинні акцептори, і в такий спосіб забезпечувати енергетичні потреби мікробного угруповання, або сприяти зменшенню захисного ефекту за рахунок вилучення надлишку протонів з реакційного середовища у вигляді молекулярного водню. Інтенсивність накопичення водню, яку ми спостерігали під час досліду, залежала від концентрації іонів Fe2+ і стимулювалася в 1,5 - 2 рази в присутності сталевих пластин (Рис.).

Рис. 5 Інтенсифікація виділення молекулярного водню в присутності сталевих пластин

Нами було проведено дослідження кількісного розподілу гідрогеназної активності в клітинах СВБ Dsv. desulfuricans шт.10В. Близько 76% загальної гідрогеназної активності було зосереджено в розчинних клітинних фракціях.

Кінетичні характеристики гідрогеназної реакції були визначені нами для надосадової фракції. Константа насичення (Ks,) дорівнює 6х10-6 М. Таке значення Кs свідчить про високу спорідненість досліджуваної гідрогенази до молекулярного водню.

З метою отримати прямі докази важливості іонів нікелю для розвитку корозійних процесів, ми вважали за доцільне вивчити вплив цих іонів на ферментну активність. Задля цього в тест-систему додатково вносили іони Ni2+ в діапазоні концентрацій від 0,2 до 1,0 мг/см3. Дослідження проводили як на високоактивних індивідуальних культурах СВБ, так і на штучних корозійноактивних асоціаціях, до складу яких вносили ТБ та їх супутник Stenotrophomonas maltophilia.

Отримані результати дозволяють стверджувати, що при додаванні іонів нікелю до поживного середовища, на якому вирощуються корозійно небезпечні бактерії, спостерігається скорочення лаг-фази, а питома швидкість росту залишається незмінною як у випадку індивідуальних культур СВБ, так і у випадку штучних асоціацій. Наявність в культуральному середовищі іонів нікелю скорочувала тривалість лаг-фази росту СВБ в 2-3 рази, а штучних асоціацій в 3-3,5 рази в залежності від концентрації.

Водночас паралельне вивчення впливу іонів нікелю на гідрогеназну та корозійну активність досліджуваних культур показало, що обидва ці параметри активуються. Як гідрогеназна активність, так і швидкість корозії досліджуваних металевих зразків (Рис.7) збільшувались майже вдвічі за умови присутності в культуральному середовищі іонів нікелю в концентрації 0,5 мг/см3. Подальше збільшення концентрації нікелю не призводило до суттєвого підвищення зазначених показників.

Рис. 6 Вплив іонів нікелю на гідрогеназну активність СВБ



Рис. 7 Інтенсифікація корозії за рахунок доданої гідрогенази

Прямі докази впливу гідрогенази на процеси мікробно індукованої корозії були отримані нами при проведенні дослідження впливу різних клітинних структур, що виявляли гідрогеназну активність, на швидкість корозії. До корозійно активної культури Desulfovibrio sp. шт.10В додавали однакову за вмістом білку кількість клітинних мембран або надосадової фракції. Результати досліду наведено на рис.8. Максимальна швидкість корозії спостерігалась у варіанті, де до клітинної суспензії додавали концентровану надосадову фракцію - 49,4 мг/дм2 * добу. Додавання фракції мембран практично не впливало на швидкість корозії, тобто швидкість складала 17,9 мг/дм2 * добу. В контролі швидкість корозії складала 12 мг/дм2 * добу. Цей процес має лінійну залежність від концентрації гідрогенази. При проведенні рентгенофазових досліджень було виявлено, що основними продуктами корозії були - Fe3O4H2O i NiSO4, при цьому, виходячи з інтенсивності спектру, встановлено, що співвідношення Ni i Fe = 70:30. Окрім того, в активній надосадовій фракції було знайдено Ni в концентрації 0,04 мкг/мг білку. Виходячи з отриманих результатів можна зробити висновок, що безпосередню участь в процесах мікробної корозії бере гідрогеназа [Ni-Fe] - типу. Додаткові докази на користь цього висновку було отримано в дослідах коли в тест-систему в різних концентраціях додатково вносили іони Ni2+. Отримані результати дозволяють стверджувати, що наявність в культуральному середовищі іонів нікелю зменшувала тривалість лаг - фази росту СВБ в 2-3 рази, а штучних асоціацій - в 3-3,5 рази в залежності від концентрації.

...