Використання клітинних біомаркерів рослинних і тваринних тест-організмів для оцінки токсичності води

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КОЛОЇДНОЇ ХІМІЇ ТА ХІМІЇ ВОДИ

ім. А.В. ДУМАНСЬКОГО

ВИКОРИСТАННЯ КЛІТИННИХ БІОМАРКЕРІВ РОСЛИННИХ І ТВАРИННИХ ТЕСТ-ОРГАНІЗМІВ ДЛЯ ОЦІНКИ ТОКСИЧНОСТІ ВОДИ

03.00.16 - екологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Вєялкіна Наталія Миколаївна

УДК 574.64.086(043.3):576.3.08(043.3)

Київ - 2011

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті колоїдної хімії та хімії води ім. А.В. Думанського Національної академії наук України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор хімічних наук, професор Гончарук Владислав Володимирович, Інститут колоїдної хімії та хімії води ім. А.В. Думанського НАН України, директор інституту

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Гвоздяк Петро Ілліч,

Інститут колоїдної хімії та хімії води ім. А.В. Думанського НАН України, головний науковий співробітник відділу сорбції і біології очистки води

кандидат біологічних наук

Дзюба Оксана Іванівна,

Національний ботанічний сад ім. М.М.Гришка НАН України, старший науковий співробітник відділу алелопатії

Захист відбудеться « 31 » травня 2011р. о 1530 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.183.01 в Інституті колоїдної хімії та хімії води ім. А.В. Думанського НАН України за адресою 03680, МСП, м. Київ-142, бульв. Академіка Вернадського, 42.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту колоїдної хімії та хімії води ім. А.В. Думанського НАН України за адресою 03680, МСП, м. Київ-142, бульв. Академіка Вернадського, 42.

Автореферат розісланий « 26 » квітня 2011р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат хімічних наук Т.І. Якимова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Оцінка якості природних вод біологічними методами в останні десятиліття набула особливої актуальності. Використання хіміко-аналітичних методів не дає повної інформації про можливу дію комплексу забруднювачів на живі організми. Біотестування передбачає цілеспрямоване використання стандартних тест-організмів і методів для визначення токсичності водних зразків. У широкому розумінні біотестування являє собою методичний прийом, що базується на оцінці впливу фактора середовища на організм, його окрему функцію або систему. У багатьох випадках біологічні методи є технічно простішими й значно дешевшими, обмежені у часі, більш чутливі у порівнянні з хімічним аналізом. У цілому це приводить до зменшення числа необхідних процедур, значному спрощенню дослідницького процесу.

Звичайно, біотестування не позбавлено певних недоліків, особливо при використанні поодиноких біотестів. У той же час, використання набору біотестів, який би включав тест-організми різних трофічних рівнів і тести для визначення токсичності на різних рівнях біологічної організації (організменному, клітинному та ін.), дозволить всебічно оцінити вплив досліджуваної речовини. Комплексний підхід на організменному рівні широко використовується в різних країнах, однак більшість методів дослідження на клітинному та субклітинному рівні не застосовуються для практичних цілей біотестування у зв'язку з їхньою високою вартістю і трудомісткістю.

В даній роботі при проведенні експериментів для визначення структурних і функціональних змін генома клітини внаслідок токсичного впливу запропоновані мікроядерний тест й ядерцевий біомаркер.

Мікроядерний тест є одним з найбільш поширених методів виявлення речовин з генотоксичними властивостями. Цей тест переважає по інформативності та оперативності тест на хромосомні аберації та має ряд інших переваг - менше число артефактів, можливість кращого обліку, окрім того, він є менш трудомістким та більш продуктивним.

Відомі роботи, у яких оцінка дії модифікуючих антропогенних факторів на генетичний апарат клітин виконувалася за допомогою аналізу ядерцевих характеристик, однак вони мали моніторинговий характер і не пропонували схеми проведення експерименту, що необхідно при біотестуванні. Запропонований нами метод передбачає аналіз морфологічних характеристик ядерець в умовах експерименту й дає можливість оцінити вплив досліджуваних факторів на клітини рослин і тварин.

У зв'язку з вищесказаним, актуальною є розробка технічно простого, дешевого та універсального комплексу біотестів і біомаркерів для виявлення токсичних факторів і речовин, для визначення забруднення оточуючого середовища, зокрема, оцінки якості природних і питних вод, як на рівні організму, так і на рівні клітини, її геному.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота включає дослідження, що виконані у відповідності до плану науково-дослідних робіт Інституту колоїдної хімії та хімії води ім. А.В. Думанського НАН України: за відомчою темою НАН України "Розробка наукових основ створення комплексних методів очищення та знезараження природних та стічних вод" (№ держ. реєстрації 0199U000598, 1999-2002 рр., виконавець); у рамках цільової наукової програми Відділення хімії НАН України за темою "Фізико-хімічні принципи управління хімічними реакціями в водних середовищах" (№ держ. реєстрації 0102U000940, 2002-2006 рр., виконавець); у рамках госпдоговірної теми “Дослідження на організменному і клітинному рівнях токсичності фармакологічних препаратів” (№ 9/2001/12-01, 2001-2002 рр., виконавець); за грантом у рамках міжнародної програми WATERTOX (1997 - 2001 рр.) за підтримки Міжнародного Центру Сприяння Науковим Дослідженням (Отава, Канада) (1997-2001 рр., виконавець).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи була розробка ядерцевого біомаркеру та оптимізація мікроядерного тесту для біотестування водних розчинів органічних і неорганічних речовин, аналіз використання цих методів, як окремо, так і в сукупності зі стандартними токсикологічними методами для визначення цитотоксичності та генотоксичності проб води.

Відповідно до поставленої мети було сформульовано такі задачі:

Адаптувати методи мікроядерного тесту та аналізу ядерцевих характеристик для використання їх в біотестуванні при комплексному дослідженні проб на організменному та клітинному рівні.

Дослідити первинні зміни ядерець клітин тест-організмів при впливі розчинів токсичних речовин.

Розробка оптимальної схеми оцінки цитотоксичності за допомогою ядерцевого біомаркеру на рослинних і тваринних клітинах.

Розробка мікроядерного тесту на клітинах хвостового плавця риб.

Апробація запропонованого набору методів для оцінки генотоксичних та цитотоксичних властивостей як модельних розчинів, так і природних, та питних вод.

Об'єкт дослідження - динаміка зміни цитогенетичних показників рослинних і тваринних тест-організмів при впливі на них розчинів органічних і неорганічних речовин та зразків природних і питних вод.

Предмет дослідження - рослинні (цибуля - Allium cepa, салат посівний - Lactuca sativa) і тваринні (дафнія - Daphnia magna, гідра - Hydra attenuata, карась - Carasius auratus gibelio) тест-організми, цитогенетичні характеристики клітин рослинних і тваринних організмів, модельні розчини органічних та неорганічних речовин та зразки природних і питних вод.

Методи дослідження. Для виконання поставлених завдань використовували стандартизовані методи дослідження токсичності, оригінальний метод дослідження цитотоксичності (ядерцевий біомаркер), модифікований метод дослідження генотоксичності (мікроядерний тест), стандартні та модифіковані методи приготування цитологічних препаратів, стандартні методи статистичної обробки результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше прослідковано динаміку первинних змін ядерцевих показників клітин тест-організмів при впливі завідомо токсичних для даних тест-організмів речовин та інших речовин органічної та неорганічної природи. Результати аналізу морфо-функціональних характеристик клітин тест-організмів вказують на неспецифічність реакції ядерець на дію токсичних речовин.

Розроблено схему дослідження цитотоксичності водних проб за допомогою ядерцевого біомаркеру на клітинах рослин і тварин.

Модифіковано метод приготування та забарвлення цитологічних препаратів із клітин хвостового плавця риб для мікроядерного аналізу.

Вперше досліджено вплив розчинів генотоксичних речовин на клітини хвостового плавця риб за допомогою мікроядерного тесту.

На основі експериментальних даних обґрунтовано доцільність комплексного використання мікроядерного тесту та ядерцевого біомаркеру для оцінки цитотоксичності та генотоксичності водних зразків поряд зі стандартними методами визначення гострої і хронічної токсичності.

Практичне значення одержаних результатів. Комплексний підхід, тобто набір клітинних біомаркерів, додатково до стандартизованих тестів, може бути використаний для об'єктивної і всебічної оцінки токсичності органічних та неорганічних речовин та різних типів вод. Комбінація мікроядерного тесту та ядерцевого біомаркеру може бути застосована для визначення цитогенотоксичних властивостей води. Використання мікроядерного тесту на плавцях риб дозволяє проводити прижиттєву оцінку токсичності на рибах (отримано патент України). За допомогою ядерцевого біомаркеру можна проводити дослідження вод з низьким рівнем забруднення, наприклад, природних і питних. Розроблений комплекс методів оцінки цитогенотоксичності води за допомогою клітин риб впроваджено в лабораторії тепловодного рибництва Інституту рибного господарства УААН та лабораторії промислової токсикології та гігієни праці при використанні хімічних речовин ДУ «Інститут медицини праці АМН України».

Особистий внесок здобувача. Аналіз літератури за темою досліджень, основний обсяг експериментальної роботи: експерименти з вивчення цитотоксичності та генотоксичності, приготування і аналіз цитологічних препаратів, обробка отриманих результатів проведено здобувачем особисто. Постановка мети та задач досліджень, аналіз результатів, їх узагальнення, інтерпретацію та формулювання основних положень і висновків проведено спільно з науковим керівником - академіком НАН України, д.х.н. професором Гончаруком В.В та к.б.н. Архипчуком В.В. Експерименти по визначенню токсичності на гідрах Hydra attenuata та дафніях Daphnia magna проведено спільно з к.б.н. Малиновською М.В. Аналіз впливу іонів важких металів на цитогенетичні показники риб проведено спільно з к.б.н. Верголяс М.Р. Друковані роботи підготовлено при безпосередній участі автора спільно зі співавторами.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень та положення дисертації доповідались та обговорювались на симпозіумах і конференціях: 9th International Symposium on Toxicity Assessment (Pretoria, South Africa, 1999), Міжнародна науково-практична конференція «Проблеми і перспективи очищення та повторного використання води» (м. Харків, Україна, 2000 р.), 10th International Symposium on Toxicity Assessment (Quebec City, Quebec, Canada, 2001), ІІІ з'їзд Гідроекологічного товариства України «Гідроекологія на межі тисячоліть» (м. Тернопіль, Україна, 2001 р.), l'Universite Europeenne d'Ete (Nancy, France, 2002), Науково-практична конференція «Імунотоксиканти, канцерогени, мутагени навколишнього середовища» (м. Київ, Україна, 2002 р.), Конференція молодих вчених ІКХХВ НАН України (м. Київ, Україна, 2003 р.), Міжнародна науково-практична конференція «Водні ресурси на рубежі ХХІ століття. Проблеми раціонального використання, охорони та відтворення» (м. Київ, Україна, 2003 р.), Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы экологии» (м. Гродно, Бєларусь, 2008 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 робіт: 8 статей, з них - 6 статей у фахових наукових виданнях, тези 6 доповідей у збірниках праць конференцій; отримано 1 патент України на винахід.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, 3 розділів, висновків, додатків та списку використаних джерел літератури. Робота викладена на 135 сторінках друкованого тексту, вміщує 28 рисунків, 19 таблиць, 2 додатки на 2 сторінках та список використаних джерел літератури з 180 найменувань на 21 сторінці.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність роботи, її зв'язок з науковими програмами та темами, сформульовано мету, об'єкт, предмет і завдання дослідження, визначено наукову новизну та практичне значення отриманих результатів, а також особистий внесок здобувача.

У першому розділі проаналізовано літературні дані щодо використання біотестування як методу оцінки якості води. Розглянуто аналіз ядерцевих характеристик та мікроядерний тест в аспекті їх застосування при оцінці цитогенотоксичної дії різноманітних хімічних сполук.

У другому розділі описано об'єкти і методи дослідження. В експериментах по дослідженню токсичності на організменному рівні як тест-організми використовували: представників тварин - дафній Daphnia magna, гідру Hydra attenuata та представників рослин - цибулю Alium cepa, салат посівний Lactuca sativa. При дослідженні цитотоксичності за зміною ядерцевих характеристик клітин тест-організмів використовували: гідру H. attenuata, цибулю A. cepa і салат посівний L. sativa, а в експериментах по дослідженню генотоксичності за мікроядерним аналізом - цибулю A. cepa, салат посівний L. sativa та представника риб - карася Carasius auratus gibelio.

Схеми проведення експериментів. У першій частині експериментів дослідження цитотоксичності проводилось паралельно з тестами на токсичність, тобто тест-організми після аналізу токсичності досліджуваних проб фіксували для приготування цитологічних препаратів.

В подальшому була розроблена схема аналізу зі значно меншою експозицією. За добу до початку експерименту гідр для адаптації переносили з культурального середовища в планшетки з контрольною водою. У кожен відділ планшетки поміщали по 6 гідр, при цьому враховували, що для кожної точки фіксації буде використано 3 відділи (усього - 18 гідр). Перед початком експерименту контрольну воду у відділах, призначених для досліджуваних розчинів, відбирали й заміняли експериментальним розчином, приготовленим на контрольній воді, а в контрольних - контрольним. Відбір матеріалу в контрольних і експериментальних відділах проводили після 30, 90 і 180 хвилин експозиції.

Для дослідження ядерцевих характеристик клітин кореневої меристеми цибулі чи салату рослини попередньо пророщували при 20°С протягом 5 днів у темряві. Перед початком експерименту воду в пробірках із цибулинами, призначених для досліджуваних розчинів, відбирали й заміняли експериментальним розчином, а в контрольних - контрольним. Корінці салату переносили із чашок Петрі в бюкси з досліджуваними чи контрольними розчинами. Відбір матеріалу в контрольних і експериментальних варіантах проводили після 30, 90 і 180 хвилин експозиції, так само, як при дослідженні на клітинах гідри. Для кожної проби використовували корінці з 5-ти цибулин та 2 чашки Петрі з пророщеним насінням салату, в середньому - 40 корінців салату.

Розробку мікроядерного тесту на клітинах хвостового плавця риб проводили на карасях C. auratus gibelio. Використовували клітини крові, зябер та хвостового плавця. За добу до експерименту риб відсаджували по дві особини в окремі акваріуми, заповнені контрольною водою, для їх адаптації. Під час експерименту піддослідним рибам надрізали тканину хвостового плавця для того, щоб викликати регенерацію, а отже, і мітоз у слабомітотично-активній тканині плавця. Одночасно воду в акваріумах заміняли на досліджуваний розчин, контрольним рибам також надрізали хвостовий плавець, а воду заміняли на свіжу контрольну. Забій риб і відбір проб крові, тканини зябер і хвостового плавця проводили через 2, 3, 4 та 5 діб після початку експерименту. Кров відбирали із хвостової вени, робили мазки.

Речовини, що досліджувались в роботі. У дослідах були використані сполуки органічної та неорганічної природи (всі речовини були марковані як аналітичний стандарт, виробництва компанії SIGMA-ALDRICH).

Було проаналізовано токсичність, цитотоксичність та генотоксичність речовин органічної та неорганічної природи в концентраціях: пентахлорфенолу - 0,8 мг/дм3, хлориду ртуті (HgCl2) - 2 мг/дм3 ( по Hg2+), сульфату міді (CuSO4 ·5H2O) - 4 та 8 мг/дм3 (по Cu2+), 4-нітрохінолін-N-оксиду - 1,2 мг/дм3, p,p'-ДДТ - 0,4 мг/дм3, нонілфенолу - 20 мг/дм3, альдрину - 8 мг/дм3, сульфату цинку (ZnSO4) - 20 мг/дм3 (по Zn2+), миш'яку - 20 мг/дм3, ліндану - 20 мг/дм3, метолахлору - 20 мг/дм3.

При розробці схеми дослідження дії токсичних речовин на ядерцевий апарат клітин тест-об'єктів для оцінки розчинів органічних та неорганічних речовин досліджували розчини, що містили: іони ртуті (Hg2+) в концентраціях для рослин - 5, 50, 100 мг/дм3, для гідри - 0,3, 0,4, 0,7 мг/дм3; металохлор в концентраціях для рослин - 10, 50, 100 мг/дм3, для гідри - 12, 50, 80 мг/дм3; 4-нітрохінолін-N-оксид в концентраціях для рослин - 20, 50, 100 мг/дм3, для гідри - 6, 18, 25 мг/дм3.

Концентрації досліджуваних речовин в даній частині роботи підбирали, спираючись на попередні дослідження їх гострої та хронічної токсичності. Тобто, відбирались завідомо токсичні для даного тест-організму речовини в найменших діючих концентраціях (НДК) та летальних концентраціях (ЛК50), тому вони були різними для рослин і тварин.

Розчин хлоралгідрату в концентраціях 400 та 800 мг/дм3 використовували в якості позитивного контролю при розробці мікроядерного тесту на клітинах хвостового плавця риб. Для апробації нового методу використовували розчин сульфату міді CuSO4·5H2O з концентрацією Сu2+ 0,1 та 2,5 мг/дм3 та розчин хлориду кадмію CdCl2 з концентрацією Сd2+ 0,005 та 1,0 мг/дм3 Концентрації полігексаметиленгуанідину (ПГМГ) в розчині складали: 0,1; 0,5; 1; 10; 20; 50 мг/дм3. Були використані зразки води з трьох артезіанських свердловин Києва (умовно позначених як К1, К2, К3) та чотирьох свердловин Одеси (умовно позначених як Г1, Г2, Г3, Г4), а також водопровідна вода м. Києва (р-н “Святошин”) та бутильована вода "Кристал" (м. Одеса).

Дослідження гено- та цитотоксичності проводили паралельно з тестами на токсичність, де визначались: гостра та хронічна токсичність - на дафніях D. magna; гостра токсичність - на гідрі H. attenuata; гостра токсичність на рослинах - на цибулі A. cepa та салаті L. sativa.

Дослідження цитотоксичності проводили за допомогою ядерцевого біомаркеру на клітинах кореневої меристеми цибулі A. cepa та салату L. sativa, ектодермальних клітинах гідри H. attenuata та клітинах хвостового плавця риб C. auratus gibelio.

Ядерцевий біомаркер представляє собою набір ядерцевих характеристик (відсоток гетероморфних парних ядерець - ГПЯ, середня кількість ядерець на клітину - Я/КЛ та об'єм поодиноких ядерець - О1Я), які характеризують ядерцеву активність клітин і, водночас, відображають різні механізми її регуляції.

Генотоксичність оцінювалась за мікроядерним тестом на клітинах кореневої меристеми цибулі та салату, на клітинах риб: еритроцитах крові, клітинах зябер і хвостового плавця.

На заключному етапі досліджень проводили аналіз та статистичну обробку результатів за допомогою стандартного пакету програм Excel і STATISTICA (StatSoft Inc., USA, 1995). Статистичну достовірність зміни ядерцевих характеристик і мітотичного індексу оцінювали за параметричним t-критерієм Ст'юдента. Для оцінки вірогідності розходжень між групами експериментальних даних у мікроядерному тесті використовували непараметричний U-критерій Манна-Уітні.

У третьому розділі представлено результати досліджень впливу водних розчинів органічних та неорганічних речовин і проб води на тест-організми та їх клітини.

Розробка комплексного підходу до сумісного використання клітинних біомаркерів і біотестів. Проведено порівняльний аналіз чутливості набору біотестів запропонованого міжнародною програмою “WaterTox” та запропонованих мікроядерного тесту та аналізу ядерцевих характеристик при визначенні гострої токсичності, цитотоксичності та генотоксичності водних розчинів сполук органічної та неорганічної природи.

Реакція рослин та тварин на токсичність тих чи інших речовин суттєво відрізнялась, що свідчить про їх різну чутливість і робить необхідним комплексне використання в біотестах як рослин, так і тварин.

Токсичність на рослинах досліджували шляхом вимірювання довжини корінців, що безпосередньо пов'язано з мітотичним індексом. Тому часто ефекти на токсичність у рослин і на цитотоксичність за мітотичним індексом співпадали.

Ефекти досліджуваних речовин щодо токсичності та генотоксичності не співпадали. Так, ртуть, проявляючи сильний ефект токсичності на тваринах і середній на рослинах та впливаючи на мітотичний індекс, значимого генотоксичного впливу не виявляла.

Ліндан, являючись однією з найменш токсичних речовин, проявляв найбільш виражену генотоксичну дію, розчини ліндану 10 мг/дм3 для цибулі й 15 мг/дм3 для салату викликали зростання рівня клітин з мікроядрами в кореневій меристемі даних тест-об'єктів до 10,67‰ й 8,61‰ відповідно (рівень значимості р < 0,05).

Результати мікроядерного тесту свідчать про його досить високу чутливість та інформативність поряд з тестами на токсичність і про можливість його сумісного використання зі стандартними тестами.

При дослідженні цитотоксичної дії даних речовин за допомогою аналізу ядерцевих характеристик було відмічено різні зміни цих показників, які не корелювали між собою. Такий результат, можливо, пов'язаний із тим, що ядерця є дуже чутливою структурою, яка однією з перших відповідає на шкідливий вплив. Для того, щоб зафіксувати цю відповідь, потрібна значно менша експозиція (час впливу досліджуваного розчину на тест-об'єкт), ніж вона є в звичайних тестах на токсичність. Про швидку реакцію ядерець на зовнішні впливи свідчать також літературні дані. До того ж при аналізі токсичності речовин, наприклад, на гідрах, за час перебування в досліджуваному розчині можуть проявлятися сублетальні ефекти, і в клітинах їх тіла починається розвиток незворотних процесів деструкції. В цьому випадку ядерця вже не дадуть інформації про вплив на них досліджуваних речовин.

Розробка схеми дослідження цитотоксичності на клітинах тварин і рослин за ядерцевим біомаркером. Було досліджено динаміку первинних змін ядерцевих характеристик при цитотоксичних впливах на клітини тест-об'єктів впродовж перших шести годин трьох речовин органічної та неорганічної природи.

Розчини метолахлору та іонів ртуті в усіх трьох концентраціях викликали суттєве (р<0,05) збільшення кількості клітин салату з гетероморфними парними ядерцями: від 68,20?3,71% в контролі до 83,69?2,93% при дії розчину метолахлору в концентрації 45,0 мг/дм3 (табл. 1).

Розчини 4-нітрохінолін-N-оксиду достовірно змінювали середнє значення (за весь експериментальний період) відсотку клітин із гетероморфними парними ядерцями лише в найбільшій концентрації 2,0 мг/дм3.

При дії кожної з досліджуваних речовин на клітини кореневої меристеми салату відмічається достовірне (p<0,05) зменшення об'єму поодиноких ядерець у середньому на 11,9-31,9 мкм3 (див. табл. 1). У найбільшій мірі це проявляється при дії 4-нітрохіноліну, до того ж при всіх його концентраціях.

У клітинах цибулі при впливі досліджуваних речовин збільшувався відсоток клітин із ГПЯ на 19,7-32,4% (табл. 2).

Таблиця 1

Значення ядерцевих характеристик клітин кореневої меристеми салату L. sativa при впливі досліджуваних розчинів

Досліджувані розчини	Ядерцеві характеристики
	ГПЯ, %	Я/КЛ	О1Я, мкм3
Контроль	68,20?3,71	1,51?0,02	82,61?4,47
Ртуть (по Hg2+)	0,25 мг/дм3	76,25?3,38*	1,48?0,01	70,66?4,27*
	0,5 мг/дм3	80,69?3,19*	1,56?0,02	65,21?4,43*
	5,0 мг/дм3	77,68?3,25*	1,57?0,02	63,93?4,70*
Метолахлор	4,5 мг/дм3	82,37?3,05*	1,65?0,02*	64,90?4,83*
	22,5 мг/дм3	82,30?3,00*	1,51?0,01	67,55?3,93*
	45,0 мг/дм3	83,69?2,93*	1,56?0,01	60,08?4,84*
4-нітрохінолін-N-оксид	0,4 мг/дм3	75,69?3,40	1,52?0,01	50,74?4,78*
	1,0 мг/дм3	74,74?3,50	1,54?0,01	54,89?3,56*
	2,0 мг/дм3	82,14?3,00*	1,58?0,02*	51,35?4,21*

Примітка: * - відмінність від контролю достовірна при р< 0,05.

Таблиця 2

Значення ядерцевих характеристик клітин кореневої меристеми цибулі A. cepa при впливі досліджуваних розчинів

Досліджувані розчини	Ядерцеві характеристики
	ГПЯ, %	Я/КЛ	О1Я, мкм3
Контроль	50,20?3,97	1,41?0,01	118,50?5,11
Ртуть (по Hg2+)	0,25 мг/дм3	75,77?3,40*	1,44?0,01	78,66?4,67*
	0,5 мг/дм3	76,61?3,37*	1,40?0,01	78,54?4,50*
	5,0 мг/дм3	79,25?3,14*	1,49?0,01*	74,79?4,44*
Метолахлор	4,5 мг/дм3	69,89?3,61*	1,37?0,01*	78,21?4,03*
	22,5 мг/дм3	71,85?3,49*	1,41?0,01	80,34?3,93*
	45,0 мг/дм3	79,52?3,19*	1,42?0,01	75,13?4,54*
4-нітрохінолін-N-оксид	0,4 мг/дм3	82,57?2,94*	1,43?0,01	76,52?3,08*
	1,0 мг/дм3	71,06?3,66*	1,41?0,01	66,62?3,93*
	2,0 мг/дм3	73,97?3,42*	1,46?0,01	72,27?5,06*

Примітка : * - відмінність від контролю достовірна при р< 0,05.

Об'єм поодиноких ядерець у клітинах цибулі виявився найбільш чутливим параметром щодо токсичних впливів. Середні значення за весь дослідний період (див. табл. 2) значно відрізнялися від контрольних (р< 0,05).

У представника тварин гідри, на противагу рослинним тест-об'єктам, токсичний вплив досліджуваних речовин зменшував кількість клітин із ГПЯ (табл. 3).

Таблиця 3

Значення ядерцевих характеристик клітин гідри H. attenuata при впливі досліджуваних розчинів

Досліджувані розчини	Ядерцеві характеристики
	ГПЯ, %	Я/КЛ	О1Я, мкм3
Контроль	70,85?3,63	1,14?0,01	64,66?4,27
Ртуть (по Hg2+)	0,25 мг/дм3	58,50?3,92*	1,16?0,01	52,26?4,31*
	0,5 мг/дм3	55,75?4,00*	1,14?0,01	50,43?4,65*
	5,0 мг/дм3	63,57?3,76*	1,14?0,01	49,32?4,26*
Метолахлор	4,5 мг/дм3	61,56?3,89*	1,16?0,01	55,64?3,95
	22,5 мг/дм3	60,42?3,85*	1,15?0,01	59,49?4,21
	45,0 мг/дм3	56,85?3,94*	1,13?0,01	48,73?4,84*
4-нітрохінолін-N-оксид	0,4 мг/дм3	68,16?3,71	1,12?0,01	56,62?4,78*
	1,0 мг/дм3	56,46?4,00*	1,13?0,01	51,91?3,59*
	2,0 мг/дм3	55,26?3,89*	1,13?0,01	54,01?4,21*

Примітка: * -відмінність від контролю достовірна при р< 0,05.

Середній об'єм поодиноких ядерець у клітинах гідри при впливі досліджуваних речовин значно зменшувався - на 4,4-15,2 мкм3 (див. табл. 3). Зменшення об'єму поодиноких ядерець у клітинах гідри при впливі досліджуваних розчинів мало дозозалежний характер. Найбільше пригнічення поодиноких ядерець було викликане іонами ртуті й проявлялось в зменшенні середнього об'єму поодиноких ядерець на 11,6-13,5 мкм3.

Найбільш чутливими виявилися показники ГПЯ та середнього об'єму поодиноких ядерець, в той час як кількість ядерець на клітину, тобто кількість активних ядерцеутворюючих районів, в експерименті суттєво не змінювалась.

Токсичні (як було показано в експериментах з біотестування) концентрації іонів ртуті, метолахлору та 4-нітрохінолін-N-оксиду впливають на клітини рослинних та тваринних тест-об'єктів подібним чином, змінюючи, відсоток клітин з ГПЯ та об'єм поодиноких ядерець. Кількість активно функціонуючих ядерцеутворюючих районів практично не змінювалась.

Середній об'єм поодиноких ядерець у клітинах гідри при впливі досліджуваних речовин значно зменшувався - на 4,4-15,2 мкм3 (див. табл. 3). Зменшення об'єму поодиноких ядерець у клітинах гідри при впливі досліджуваних розчинів мало дозозалежний характер. Найбільше пригнічення поодиноких ядерець було викликане іонами ртуті й проявлялось в зменшенні середнього об'єму поодиноких ядерець на 11,6-13,5 мкм3.

Найбільш чутливими виявилися показники ГПЯ та середнього об'єму поодиноких ядерець, в той час як кількість ядерець на клітину, тобто кількість активних ядерцеутворюючих районів, в експерименті суттєво не змінювалась.

Токсичні (як було показано в експериментах з біотестування) концентрації іонів ртуті, метолахлору та 4-нітрохінолін-N-оксиду впливають на клітини рослинних та тваринних тест-об'єктів подібним чином, змінюючи, відсоток клітин з ГПЯ та об'єм поодиноких ядерець. Кількість активно функціонуючих ядерцеутворюючих районів практично не змінювалась.

Отже, запропонована схема є ефективною при визначенні цитотоксичної дії досліджуваних сполук за ядерцевим біомаркером, вона дозволяє фіксувати вплив токсичних сполук в водних розчинах як при високих (НДК та ЛК50), так і при низьких (які не проявляють токсичних властивостей на організменному рівні) концентраціях за досить короткий термін часу за допомогою клітин рослинних та тваринних тест-об'єктів.

Розробка мікроядерного тесту на клітинах хвостового плавця риб. Клітини крові (еритроцити) і клітини зябер найчастіше використовують при дослідженні генотоксичності водних проб за допомогою мікроядерного аналізу на рибах. Ці методики передбачають забій риб. З метою збереження риб живими і можливістю їх періодичного використання в експериментах було запропоновано метод прижиттєвого мікроядерного аналізу на клітинах хвостового плавця риб. До цього часу така тканина не використовувалась з цією метою тому, що вона не є мітотично активною. В той час як мікроядерний тест передбачає фіксацію порушень, що відбуваються саме під час мітозу. Для вирішення даної проблеми тканину плавця перед експериментом надрізали, внаслідок чого викликали регенерацію даної тканини, а отже - активний мітотичний поділ клітин в досліджуваному середовищі.

В результаті експериментальних досліджень виявлено, що вже через 2-3 доби кількість регенерованої тканини (смужка шириною 1-3 мм) є достатньою для приготування цитологічних препаратів і подальшого аналізу. Для фіксації була відібрана оцтово-гліцеринова суміш. Ця суміш одночасно фіксує і мацерує тканину, при цьому отримували суспензію цілих клітин, з якої легко приготувати цитологічні препарати. Для забарвлення клітин використовували стандартний розчин азур-еозину за Романовським. Даний метод також покращує якість цитологічних препаратів, що приготовлені з клітин зябер.

Проведена апробація мікроядерного тесту на клітинах хвостового плавця риб. Паралельно проводили аналіз на клітинах крові та зябер. Для експериментів використовували розчини речовин, які відомі своїми генотоксичними властивостями: хлоралгідрату в концентраціях 400 та 800 мг/дм3, сульфату міді в концентраціях 0,1 та 2,5 мг/дм3 по іону Сu2+ та хлориду кадмію в концентраціях 0,005 та 1,0 мг/дм3 по іону Сd2+.

На клітинах зябер та хвостового плавця було зафіксовано гострий генотоксичний вплив розчинів хлоралгідрату (рис. 1), чого не було відмічено на клітинах крові.

Обидві концентрації хлоралгідрату викликали достовірне (p<0,05) збільшення кількості клітин із порушеннями мітозу в тканинах хвостового плавця та зябер, чого не було відмічено на клітинах крові.

Рівень клітин з порушеннями мітозу, ‰

Клітини крові Клітини зябер Клітини хвостового плавця

Рис. 1. Загальний рівень порушень мітозу в різних тканинах карася під впливом розчинів хлоралгідрату:

1 - контроль;

2 - 400 мг/дм3;

3 - 800 мг/дм3;

* - досягнутий рівень значимості р < 0,05.

Сумарний рівень клітин крові з порушеннями мітозу достовірно зростав (р<0,05) при дії обох концентрацій іонів міді та кадмію (рис. 2. та рис. 3.).

В клітинах зябер лише найвищі концентрації міді та кадмію викликали достовірне (р<0,05) підвищення рівня клітин з порушеннями мітозу.

В клітинах хвостового плавця обидві концентрації іонів міді, а також і найвища концентрація іонів кадмію (1,0 мг/дм3) призводили до достовірного підвищення загального рівня клітин з порушеннями мітозу (див. рис. 2. та рис. 3.).

Отже, запропоновано та апробовано оригінальний метод проведення мікроядерного аналізу на клітинах хвостового плавця риб. Розроблено методику проведення аналізу, а також методику приготування та фарбування цитологічних препаратів. Дослідження генотоксичної дії розчинів хлоралгідрату, міді та кадмію на клітини риб довели, що тканина хвостового плавця не поступається чутливістю тканинам, які стандартно використовуються для мікроядерного аналізу (еритроцити та клітини зябер).

Рівень клітин з порушеннями мітозу, ‰

Клітини крові Клітини зябер Клітини хвостового плавця

Рис. 2. Загальний рівень порушень мітозу в різних тканинах карася під впливом розчинів міді:

1 - контроль;

2 - 0,1 мг/дм3;

3 - 2,5 мг/дм3;

* - досягнутий рівень значимості р < 0,05.

Рівень клітин з порушеннями мітозу, ‰

Клітини крові Клітини зябер Клітини хвостового плавця

Рис. 3. Загальний рівень порушень мітозу в різних тканинах карася під впливом розчинів кадмію:

1 - контроль;

2 - 0,005 мг/дм3;

3 - 1,0 мг/дм3;

* - досягнутий рівень значимості р < 0,05.

Оцінка цитотоксичності та генотоксичності полігексаметиленгуанідину. В останні роки для водопідготовки все частіше застосовують високомолекулярні флокулянти. Наприклад, сполуки гуанідинового ряду запропоновані в якості флокулянтів та знезаражуючих агентів. В роботі були проаналізовані водні розчини полімеру полігексаметиленгуанідину - полімеру з молекулярною масою 10 000.

На клітинному рівні не виявлено впливу різних концентрацій ПГМГ на структуру генетичного апарату тест-об'єктів. Розчини ПГМГ викликали зниження проліферативної та біосинтетичної активності клітин рослин та тварин, що виявлялося головним чином у дозозалежному зниженні мітотичного індексу та зменшенні розміру ядерець (рис. 4).



Рис. 4. Ядерця в клітинах гідри (Мікрофотографія. Збільшення 10х90. Забарвлення азотнокислим сріблом.): 1 - контроль; 2 - через 90 хвилин після впливу полігексаметиленгуанідину в концентрації 1 мг/дм3; 3 - через 90 хвилин після впливу полігексаметиленгуанідину в концентрації 50 мг/дм3.

Відзначена більш висока чутливість клітин тварин (гідри) до досліджуваних розчинів у порівнянні з клітинами рослин. Виявлена різна чутливість рослин до препарату. Зокрема, для салату найбільш ефективними були концентрації ПГМГ 20-50 мг/дм3, тоді як для цибулі достовірні відмінності спостерігалися, починаючи з 10 мг/дм3 ПГМГ. Полімер викликав у тваринних клітинах достовірне зменшення об'єму ядерець та зміну їх структури вже в концентрації 1 мг/дм3 (див. рис. 4).

Оцінка якості питної води за допомогою методів біотестування. За допомогою запропонованого набору біотестів перевірено якість води з трьох артезіанських свердловин Києва (К1, К2, К3) та чотирьох свердловин Одеси (Г1, Г2, Г3, Г4), а також водопровідної води в м. Києві (р-н “Святошин”) та бутильованої води "Кристал" (м. Одеса). Водні проби досліджували на предмет токсичності, цитотоксичності та генотоксичності.

Серед артезіанських свердловин м. Києва тільки проба К3 проявляла хронічну токсичність в тесті на дафніях. З артезіанських свердловин м. Одеси проба Г3 проявляла гостру токсичність на гідрах та хронічну на дафніях. Водопровідна вода мала гостру та хронічну токсичність на всіх біотестах. Цитотоксичний ефект на клітинах рослин і тварин проявляла проба К3, всі проби артезіанських свердловин Одеси викликали достовірне збільшення об'єму ядерець в клітинах гідри на 40,1-65,9%, а в клітинах цибулі цей показник збільшувався лише в пробі Г3 на 25,0% (р<0,05). Проба бутильованої води викликала достовірне збільшення об'єму поодиноких ядерець в клітинах гідри. Водопровідна вода викликала достовірне (р<0,05) зменшення об'єму ядерець в клітинах обох тест-об'єктів, що є проявом її гострого цитотоксичного впливу. Генотоксичні властивості за мікроядерним тестом серед усіх досліджуваних проб проявляла тільки водопровідна вода, що можливо викликано вмістом хлору та хлорвмісних сполук. Отже, проби К3 та Г3 проявляли токсичний ефект на рівні організму та на рівні клітини. Водопровідна вода на всіх біотестах проявляла чіткі токсичний, цитотоксичний та генотоксичний ефекти.

Одержані результати дозволяють зробити обґрунтований висновок стосовно можливості використання даних методів, як високочутливих та інформативних критеріїв цитогенотоксичності, поряд зі стандартними методами біотестування. Для більш повної оцінки якості питної води потрібен підхід з застосуванням комплексу біотестів, що дозволить максимально дослідити спектр дії досліджуваної проби. Доцільно використовувати весь перелік проаналізованих методів для одержання об'єктивних результатів щодо наслідків впливу як на рівні організму, так і на рівні клітини і геному.

Узагальнення отриманих результатів. Вперше досліджено динаміку первинних змін ядерцевих характеристик тест-організмів при дії розчинів токсичних речовин. Показано, що достовірно змінюються відсоток ГПЯ та об'єм поодиноких ядерець, найсуттєвіші зміни цих параметрів відбуваються в часовому проміжку 30-180 хв. Реакція відповідь ядерець на токсичні впливи є неспецифічною, тому є можливим використання ядерцевого біомаркеру для оцінки токсичності водних розчинів.

Біотестування передбачає цілеспрямоване використання стандартних тест-об'єктів та методів для визначення токсичності водних зразків. Використання клітинних біомаркерів самих по собі чи разом з традиційними методами є необхідним на сучасному етапі біотестування.

Суть комплексного підходу, що запропонований в даній роботі, полягає в наступному. Токсичність водних проб оцінюється за допомогою тест-організмів різних систематичних груп і трофічних рівнів. Паралельно використовуються тести для дослідження різних видів токсичності, як на організменному, так і на клітинному рівнях. Зокрема, на рівні організму аналізується загальна та гостра токсичність, а на рівні клітини - структурні і функціональні зміни клітини, її геному.

В результаті представлених в даній роботі досліджень був апробований наступний набір тест-об'єктів для аналізу токсичного впливу на організм та його клітини: рослини - салат L. sativa, чи цибуля A. cepa; безхребетні - гідра H. attenuata та хребетні тварини - риби, наприклад, карась C. auratus gibelio. На всіх цих тест-організмах паралельно проводиться оцінка гострої токсичності (за смертністю тварин та темпом росту корінців рослин), а на клітинах цих же організмів проводиться оцінка цитотоксичності (за зміною ядерцевих характеристик та мітотичним індексом) і генотоксичності (за зміною рівня клітин з мікроядрами, подвійними ядрами та іншими порушеннями мітозу). Доведено чутливість даних методів та доцільність використання всього переліку біотестів і біомаркерів для отримання повної та об'єктивної оцінки токсичності води.

У додатках наведено акти впровадження запропонованого комплексу методів оцінки цитогенотоксичності води за допомогою клітин риб в лабораторії тепловодного рибництва Інституту рибного господарства УААН та лабораторії промислової токсикології та гігієни праці при використанні хімічних речовин ДУ «Інститут медицини праці АМН України».

ВИСНОВКИ

У дисертації вирішено важливе екологічне завдання щодо розробки та адаптації клітинних біомаркерів рослинних і тваринних тест-організмів для біотестування проб води, що дозволило обґрунтувати необхідність і доцільність використання цих методів для всебічної оцінки токсичності, цитотоксичності та генотоксичності модельних розчинів органічних і неорганічних речовин, проб природних і питних вод. Проведені дослідження дозволяють зробити наступні висновки:

Досліджено динаміку первинних змін морфологічних показників ядерець клітин тест-об'єктів при дії розчинів токсичних речовин в концентраціях ЛК50 та НДК протягом перших трьох годин. Спостерігали статистично достовірні зміни кількості клітин з гетероморфними парними ядерцями (на 10-15%) та зменшення об'єму поодиноких ядерець (у середньому на 20%).

Запропоновано схему дослідження змін ядерцевих параметрів клітин рослин та тварин в перші години впливу токсичної речовини, яка включає набір ядерцевих характеристик та період проведення аналізу (30-180 хвилин експозиції). Доведено ефективність даної схеми при дослідженні цитотоксичної дії органічних і неорганічних сполук за ядерцевим біомаркером на клітини рослинних та тваринних тест-об'єктів.

Вперше розроблено оригінальний метод мікроядерного аналізу на клітинах хвостового плавця риб, який дозволяє проводити прижиттєву діагностику генотоксичності водних проб (метод захищено патентом України).

Визначено, що хлоралгідрат, іони міді (Сu2+) та кадмію (Сd2+) впливають на епітеліальні клітини хвостового плавця, клітини зябер та еритроцити периферичної крові риб C. auratus gibelio, викликаючи зростання кількості клітин з порушеннями мітозу до 10 ‰ у порівнянні з контролем (1 ‰).

Доведено доцільність використання запропонованого набору рослинних і тваринних біотестів і клітинних біомаркерів для оцінки вод з низьким рівнем забруднення, на прикладі проб з артезіанських свердловин, водопровідної та бутильованої води, а також з розчину для знезараження питної води (полігексаметиленгуанідину).

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Arkhipchuk V.V. Cytogenetic study of organic and inorganic toxic substances on Allium cepa, Lactuca sativa and Hydra attenuata cells / V.V. Arkhipchuk, M.V. Malinovskaya, N.N. Garanko (N.N. Veyalkina) // Environmental Toxicology and Water Quality. - 2000. - V. 15, N 4. - P. 338-344.

Аналіз цитологічних препаратів, підготовка мікрофотографій для ілюстрацій до статті.

2. Гончарук В.В. Некоторые характеристики цитотоксичности и генотоксичности водных растворов полигексаметиленгуанидина / В.В. Гончарук, Н.Н. Гаранько (Н.Н. Веялкина), В.В. Архипчук // Доповіді НАН України. - 2002. - № 3. - С. 167-170.

Участь в плануванні та проведенні експерименту, гістологічній обробці матеріалу, статистичній обробці даних та написанні статті.

3. Arkhipchuk V.V. A novel nucleolar biomarker in plant and animal cells for assessment of substance cytotoxicity / V.V. Arkhipchuk, N.N. Garanko (N.N. Veyalkina) // Environmental Toxicology. - 2002. - V. 17, N 3. - P. 187-194.

Дослідження цитотоксичності на клітинах кореневої меристеми цибулі і салату та на клітинах гідри, аналіз літератури, участь у написанні статті.

4. Cavas T. Induction of micronuclei and binuclei in blood, gill and liver cells of ?shes subchronically exposed to cadmium chloride and copper sulphate / T. Cavas, N.N. Garanko (N.N. Veyalkina), V.V. Arkhipchuk // Food and Chemical Toxicology. - 2005. - V. 43. - P. 569-574.

Літературний пошук, планування та проведення експерименту, гістологічна обробка матеріалу та написання статті.

5. Arkhipchuk V.V. Using the nucleolar biomarker and the micronucleus test on in vivo fish fin cells / V.V. Arkhipchuk, N.N. Garanko (N.N. Veyalkina) // Ecotoxicology and Environmental Safety. - 2005. - V. 62, N 1. - P. 42-52.

Аналіз літератури, участь в проведенні експерименту, гістологічній обробці матеріалу та в написанні статті.

6. Верголяс М.Р. Вплив іонів міді на гематологічні та цитогенетичні показники прісноводних риб Carassius auratus gibelio / М.Р. Верголяс, Н.М. Вєялкіна, В.В. Гончарук // Цитологія і генетика. - 2010. - T. 44, № 2. - C. 124-128.

Аналіз літератури, виконано дослідження впливу іонів міді на цитогенетичні показники риб, участь в статистичній обробці даних та написанні статті.

7. Пат. 67315 А Україна, МПК G 01 N 33/18. Спосіб оцінки генотоксичності водного середовища / В.В. Архипчук, Н.М. Гаранько (Н.М. Вєялкіна), В.В. Гончарук; заявник та патенто-власник Інститут колоїдної хімії та хімії води ім. А.В. Думанського Національної академії наук України. - № 2003088029; заявл. 28.08.2003, опубл. 15.02.2006, Бюл. N 2.

Участь в розробці методики, виконання практичної частини досліджень, цитологічного та статистичного аналізу.

8. Гаранько Н.М. (Н.М. Вєялкіна) Оцінка якості питної води за допомогою методів біотестування / Н.М. Гаранько (Н.М. Вєялкіна), В.О. Ісламов // Екологія довкілля та безпека життєдіяльності. - 2003. -№ 5. - С. 34-37.

9. Гончарук В.В. Оценка генотоксического влияния тяжелых металлов на клетки рыб / В.В. Гончарук, М.Р. Верголяс, Н.Н. Веялкина // Вісник Вінницького державного аграрного університету. - 2008.- С. 45-50.

В роботах [8-9] проведення експерименту, гістологічна обробка матеріалу, участь в написанні статті.

10. Arkhipchuk V.V. Cytogenetic consequences of a toxic impact on cells of Allium cepa, Lactuca sativa and Hydra attenuata / V.V. Arkhipchuk, M.V. Malinovskaya, N.N. Garanko (N.N. Veyalkina) // 9th International Symposium on Toxicity Assessment, Pretoria, South Africa, 26 September - 1 October 1999.: book of abstracts. - Pretoria, South Africa, 1999. - P. 2-3.

11. Стойка Ю.О. Розробка прижиттєвого мікроядерного тесту на рибах / Ю.О. Стойка, Н.Н. Гаранько (Н.М. Вєялкіна), В.В. Архипчук // Наук. записки Тернопільського педуніверситету. Серія: біологія: матеріали ІІІ з'їзду Гідроекологічного товариства України „Гідроекологія на межі тисячоліть”. - 2001. - Т. 15., № 4. - С. 153-154.

12. Гаранько Н.М. (Вєялкіна Н.М.) Аналіз цитогенотоксичної дії водних розчинів органічних та неорганічних речовин за допомогою мікроядерного тесту та ядерцевого біомаркеру / Н.М. Гаранько // Наук. записки Тернопільського педуніверситету. Серія: біологія: матеріали ІІІ з'їзду Гідроекологічного товариства України „Гідроекологія на межі тисячоліть”. - 2001. - Т. 15., № 4. - С. 121-122.

13. Arkhipchuk V.V. Mercury, metolachlor, and 4-nitroquinoline-N-oxide cytotoxicity for Allium cepa, Lactuca sativa and Hydra attenuata cells / V.V. Arkhipchuk, N.N. Garanko (N.N. Veyalkina), Yu.A. Stoika // 10th International Symposium on Toxicity Assessment Quebec City, Quebec, Canada, 26 - 31 Аugust, 2001.: book of abstracts. - Quebec, Canada, 2001. - P. 24.

В роботах [10-13] участь в плануванні та проведенні експериментів по оцінці токсичного впливу досліджуваних розчинів на клітини тест-організмів, аналізі цитотоксичності та генотоксичності на клітинах кореневої меристеми цибулі і салату та на клітинах гідри, обговоренні отриманих результатів та написанні тез.

14. Гаранько Н.М. (Вєялкіна Н.М.) Комплексний підхід до визначення генотоксичності і цитотоксичності водного середовища / Н.М. Гаранько (Н.М. Вєялкіна) // Довкілля та здоров'я: матеріали науково-практичної конференції «Імунотоксиканти, канцерогени, мутагени навколишнього середовища». - 2003. - № 2. - С. 37.

15. Веялкина Н.Н. Цитогенетические характеристики тест-организмов в комплексной оценке токсичности методами биотестирования / Н.Н. Веялкина // Актуальные проблемы экологии - 2008: материалы Междунар. науч.-практ. конф., Гродно, 29-31 октября 2008 г.: ГрГУ им. Я. Купалы. - Гродно: ГрГУ, 2008. - С. 128-132.

АНОТАЦІЇ

клітинний біомаркер токсичність тест

Вєялкіна Н.М. Використання клітинних біомаркерів рослинних і тваринних тест-організмів для оцінки токсичності води. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.16 - екологія. - Інститут колоїдної хімії та хімії води ім. А.В. Думанського НАН України, Київ, 2011.

Дисертацію присвячено розробці ядерцевого біомаркеру та оптимізації мікроядерного тесту для біотестування водних розчинів органічних та неорганічних речовин, природних і питних вод.

В роботі доведено необхідність використання клітинних біомаркерів поряд зі стандартними методами визначення токсичності водних зразків. Запропоновано набір біомаркерів, який включає мікроядерний тест та ядерцевий біомаркер для дослідження впливу токсичних речовин на структурні і функціональні показники клітин тест-об'єктів. Розроблено схему дослідження цитотоксичності проб води за допомогою ядерцевого біомаркеру. Апробовано дану схему при дослідженні впливу розчинів метолахлору, 4-нітрохінолін-N-оксиду та ртуті. Розроблено метод мікроядерного аналізу на клітинах хвостового плавця риб. При дослідженні генотоксичної дії розчинів хлоралгідрату, міді і кадмію доведено, що тканина хвостового плавця не поступається чутливістю еритроцитам та клітинам зябер. Проаналізована гостра токсичність, цито- та генотоксичность полігексаметиленгуанідину (ПГМГ): різні концентрації ПГМГ не проявили генотоксичних ефектів, а при дослідженні цитотоксичності викликали зниження проліферативної та біосинтетичної активності клітин. Перевірено якість води з артезіанських свердловин міст Києва і Одеси, водопровідної та бутильованої води. Водопровідна вода мала найгірші показники щодо токсичних властивостей, тоді як інші типи питної води не проявили гострого токсичного впливу. Доведено доцільність використання запропонованого набору біотестів і біомаркерів для оцінки як модельних водних розчинів органічних і неорганічних сполук, так і природних і питних вод.

Ключові слова: біотестування води, генотоксичність, цитотоксичність, ядерцевий біомаркер, мікроядерний тест, клітинні біомаркери, природні та питні води.

Веялкина Н.Н. Использование клеточных биомаркеров растительных и животных тест-организмов для оценки токсичности воды. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.16 - экология. - Институт коллоидной химии и химии воды им. А.В. Думанского НАН Украины, Киев, 2011.

В работе обоснована необходимость использования клеточных биомаркеров наряду со стандартными методами оценки токсичности водных проб. Предложен набор биомаркеров, который включает микроядерный тест и ядрышковый биомаркер. При комплексном анализе веществ органической и неорганической природы показано высокую чувствительность этих методов в сравнении со стандартными тестами на токсичность. Разработана схема оценки цитотоксичности при помощи ядрышкового биомаркера на клетках растений и животных. Определен оптимальный набор ядрышковых характеристик (количество ядрышек на клетку, процент гетероморфных парных ядрышек и объем одиночных ядрышек) для анализа, а также наиболее показательный период (30-180 минут экспозиции). Эта схема апробирована при оценке воздействия растворов метолахлора, 4-нитрохинолин-N-оксида и ртути на ядрышковые характеристики клеток растений и животных; показано, что метод эффективен при оценке цитотоксичности органических и неорганических веществ как в высоких, так и низких концентрациях. Разработан оригинальный метод микроядерного анализа на клетках хвостового плавника рыб, который позволяет проводить прижизненную диагностику генотоксичности водных проб. При исследовании воздействия растворов хлоралгидрата, меди и кадмия на клетки рыб показано, что ткань хвостового плавника не уступает по чувствительности другим тканям рыб, которые используются в качестве стандартных в микроядерном тесте (клетки крови и жабр). С помощью микроядерного теста и ядрышкового биомаркера на растительных и животных клетках проведен анализ некоторых характеристик цитотоксичности и генотоксичности растворов полигексаметиленгуанидина (ПГМГ). Достоверного влияния растворов исследуемого вещества на структуру генетического аппарата тест-организмов микроядерным анализом не выявлено. При исследовании цитотоксичности растворы ПГМГ вызывали снижение пролиферативной и биосинтетической активности клеток растений и животных, что проявлялось главным образом в дозозависимом снижении митотического индекса и уменьшении размера ядрышек. Проведена оценка качества воды артезианских колонок Киева и Одессы, водопроводной и бутилированной воды. Водопроводная вода проявляла острую токсичность, цитотоксичность и генотоксичность. Остальные пробы не проявляли острой токсичности на организменном и клеточном уровне. Доказана эффективность предложенного набора биотестов и биомаркеров для оценки как модельных водных растворов, так и природных, в том числе питьевых вод.

...