Особливості метаболічних адаптацій риб до нафтового забруднення водного середовища

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

УДК [636.064+57.017.7+591.525](639.215.2):[665.61+665.75](504.45)

03.00.10. - іхтіологія

Дисертацією є рукопис антропогенний нафта короп

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор АРСАН Орест Михайлович, Інститут гідробіології НАН України, завідувач відділу екотоксикології, м. Київ

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Гандзюра Володимир Петрович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри зоології, м. Київ

кандидат біологічних наук, доцент Шевченко Петро Григорович, Національний університет біоресурсів і природокористування України, завідувач кафедри загальної зоології та іхтіології, м. Київ.

Захист відбудеться «15» жовтня 2009 р. о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.213.01 Інституту гідробіології НАН України за адресою: 04210, м Київ, просп. Героїв Сталінграда, 12

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук Гончаренко Н. І.

Актуальність проблеми. Антропогенний вплив на водні об'єкти, інтенсивність якого з кожним роком зростає, призвів до їх забруднення токсичними речовинами різної хімічної природи. Однак серед цих токсикантів, які негативно впливають на гідробіонтів, включно риб, на першому місці стоять нафта та продукти її переробки [Адаменко, 1998 і 2005; Вуль, 1999; Колодій, 1999, Спринський, 2000; Патін, 1976].

Вміст нафтопродуктів у прісних водах України коливається в досить широких межах - від сотих і навіть до десятків мг на 1 дм3, перевищуючи значною мірою не тільки рибогосподарські (0,05 мг/дм3), а й санітарно-гігієнічні (0,3 мг/дм3) гранично допустимі концентрації (ГДК), що створює несприятливі умови для життєдіяльності риб. Особливо високі концентрації нафтопродуктів зареєстровано у воді Запорізького водосховища (2,6-10,7 мг/дм3), а дещо менші - у воді Дніпродзержинського і Каховського водосховищ (0,3-0,4 мг/дм3) та у річці Південний Буг (0,24 мг/дм3) [Осадча, 2000, Осадчий, 2000, Генріх, 2001]. Підвищенні концентрації нафтопродуктів відмічаються у прибережних зонах, поверхневому і придонному шарах прісноводних об'єктів та морях [Кирюхіна, 1988, Недоступ, 1998, Хімко, 2003, Коновалова, 1998, Максимов, 2004]. Необхідно наголосити, що така проблема є актуальною і для Західної України через розміщення на її території Передкарпатської нафтогазоносної провінції, яка охоплює Івано-Франківську, Чернівецьку та Львівську області [Хімко, 2003, Недоступ, 1998, Кундельська, 2004, Спринський, 2000, Адаменко, 2005].

Потрапивши у воду, нафта і її похідні зазнають хімічного перетворення та біодеградації, що призводить до появи широкого спектру токсичних речовин. Це ускладнює оцінку забруднення води нафтопродуктами і часто не дозволяє об'єктивно прогнозувати їх вплив на організм гідробіонтів в хронічно забруднених акваторіях [Черкашин, 2005, Стом, 2003, Кухар, 1991, Давидова, 1995, Євдокимова, 1990].

Доречно зауважити, що перші повідомлення щодо впливу нафти та нафтопродуктів на риб з'явилися в кінці XIX на початку XX століття [Купцис, 1901, Веселов, 1948, Журавель, 1968, Беспамятнов, 1985]. І лише, починаючи із 60-х років минулого століття, у звязку зі зростаючим забрудненням морів та океанів вуглеводнями нафтового походження відмічається підвищений інтерес до цієї проблеми. Однак дослідження проводились переважно на прісноводних обєктах і обмежувались виживанням їх в короткотривалих періодах дії нафтопродуктів, морфологічними, анатомічними, гістологічними змінами у риб за цих умов [Таусон, 1947, Алякринская, 1966, Зубрицький, 1960, Левченко, 1982, Мазманіді, 1974, Миронов, 1985]. Щодо вивчення метаболічних процесів адаптацій риб до різних концентрацій нафтопродуктів у водному середовищі, то такими питанням приділялось порівняно недостатньо уваги.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження за темою дисертаційної роботи проводились в Інституті гідробіології НАН України протягом 2005-2008 рр. в межах держбюджетних тем «Вивчити закономірності формування еколого-токсикологічного стану екосистем водойм урбанізованих територій та розробити прогноз його можливих змін» (№ держреєстрації 0102U000859) та «Дослідити роль донних відкладів різного типу в міграції та трансформації токсичних речовин у водній екосистемі» (№ держреєстрації 0107U000790).

У зв'язку з вищезазначеним було сформульовано мету і завдання досліджень.

Мета та завдання дослідження. Метою досліджень було з'ясування особливостей метаболічних адаптацій риб до змін концентрації сирої нафти (СН) і дизпалива (ДП) у водному середовищі.

Досягнення мети здійснювалось вирішенням наступних завдань:

- встановити особливості білкового обміну (на підставі вмісту білку, активності аланінамінотрансферази (АлАТ) і аспартатамінотрансферази (АсАТ) та активності глутаматдегідрогеназної системи) в тканинах коропа за дії різних концентрацій дизпалива і сирої нафти водного середовища;

- дослідити динаміку вмісту глікогену в печінці і м'язах риб при їх адаптації до змін концентрації нафтопродуктів водного середовища;

- з'ясувати роль гліколізу і циклу трикарбонових кислот (за вмістом пірувату, лактату та співвідношенням вільних НАД-пар) в енергозабезпеченні адаптації риб до різних концентрацій дизпалива і сирої нафти водного середовища;

- вияснити процеси термінального окиснення (на підставі активності сукцинатдегідрогенази та цитохромоксидази) в тканинах коропа за дії нафтопродуктів водного середовища;

- оцінити адаптивну спроможність коропа до різних концентрацій нафтопродуктів водного середовища за вмістом аденілових нуклеотидів в печінці і зябрах.

Об'єкт дослідження: печінка, зябра, м'язи та кров дворічок коропа (Cyprinus carpio L.).

Предмет дослідження: особливості білкового, вуглеводного та енергетичного обміну у коропа в умовах нафтового забруднення водного середовища.

Методи досліджень: іхтіологічні, гідрохімічні, біохімічні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено особливості білкового, вуглеводного та енергетичного обміну в тканинах коропа за дії різних концентрацій дизпалива та сирої нафти водного середовища. Показано, що величини показників, які характеризують білковий (загальний білок, активність АлАТ і АсАТ), вуглеводний (вміст глікогену, пірувату і лактату) та енергетичний (активність сукцинатдегідрогенази, цитохромоксидази та вміст аденілових нуклеотидів) обмін в тканинах коропа залежать від виду нафтопродуктів, і їх концентрації у воді. Вперше з'ясовано, що енергозабезпечення процесів адаптації риб до змін концентрацій нафтопродуктів водного середовища здійснюється різними шляхами: гліколітичним, чи за рахунок посиленого функціонування циклу трикарбонових кислот. На підставі величин досліджуваних показників дана оцінка адаптивної спроможності риб до різних концентрацій нафтопродуктів у водному середовищі та їх виду.

Практичне значення одержаних результатів. Основні показники обміну білків і вуглеводів в тканинах коропа, зокрема активність АлАТ, АсАТ, СДГ та вміст глікогену, є інтегральними для характеристики стану риб в умовах забруднення водного середовища дизпаливом і сирою нафтою та можуть використовуватися для оцінки ступеню їх інтоксикації, а також для з'ясування оптимальних умов вирощування риб. Вони дають можливість прогнозувати ріст, розвиток і біопродуктивність риб в умовах нафтового забруднення водного середовища.

Особистий внесок здобувача. Дисертанткою самостійно проаналізовано інформацію, наявну у фаховій літературі за темою роботи, проведено експериментальні дослідження, зроблено аналіз одержаних результатів, їх статистичну обробку та обговорення. Формулювання завдань та інтерпретація отриманих результатів проведені за участю наукового керівника - доктора біологічних наук, професора О. М. Арсана.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи доповідались на наукових конференціях: VI Всеукраїнській конференції «Біологічні дослідження молодих вчених в Україні» (м. Київ, 2006 р.); III Міжнародній науковій конференції «Молодь та поступ біології» (м. Львів, 2007 р.); II-й научной конференции с участием стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (г. Петрозаводск, 2007 г.); V Международной научно-практической конференции молодых ученых по проблемам водных экосистем "Pontus Euxinus" (г. Севастополь, 2007 г.); II Міжнародній конференції молодих вчених «Біологія: від молекули до біосфери» (м. Харків, 2007 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 13 наукових праць, із них 8 статей у фахових наукових виданнях, затверджених ВАК України, та 5 - у матеріалах і тезах наукових конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури (один розділ), матеріалів та методів досліджень (один розділ), експериментальної частини (чотири розділи), узагальнення, висновків, списку використаних джерел і додатків. Робота викладена на 156 сторінках комп'ютерного набору, містить 30 таблиць і 6 рисунків, налічує 261 літературних джерел, включно 72 латиною.

Наведено аналіз основних літературних джерел щодо забруднення водного середовища нафтою та її міграції у водних екосистемах, шляхів перерозподілу нафтопродуктів у воді, фракційного складу нафти та її концентрації у водних об'єктах. Особлива увага приділяється з'ясуванню механізмів адаптації гідробіонтів до нафтопродуктів, особливості їх дії на ікру риб та біохімічні показники водяних тварин.

Об'єктом досліджень були дволітки коропа (Cyprinus carpio L.), вирощені на Білоцерківській експериментальній гідробіологічній станції Інституту гідробіології НАН України.

До початку дослідів риб протягом місяця утримували у басейні об'ємом 1 м3 при температурі води 18?20 єC. Вміст кисню в воді акваріумів підтримували на рівні 5,8-6,4 мг/дм3. У цей період її годували гранульованим рибним кормом К-ІІІ-10.

По 5 екземплярів риб поміщали у 100 - літрові акваріуми з відстояною водопровідною водою, обладнаних термо- та газорегуляторами для підтримання стандартного рівня гідрохімічних показників (вміст О2 у воді акваріумів становив 5,8-6,4 мг/дм3, СО2 - 2,2?2,8 мг/дм3, рН 7,7?7,9). Температуру води в акваріумах під час проведення дослідів підтримували автоматично на рівні 20?22єС.

Було проведено 2 серії досліджень. В першій - вивчали вплив на риб сирої нафти в концентраціях 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5 мг/дм3; у другій - дизпалива в цих же концентраціях, що відповідали 5, 10, 15, 20 та 30 ГДК [Беспамятнов, 1985]. Нафтопродукти вносили безпосередньо у воду, інтенсивно перемішуючи, для запобігання утворення плівки на поверхні води та для збільшення розчинених форм вуглеводнів нафтового походження. Контролем слугували величини досліджуваних показників у тканинах риб, що перебували у воді акваріумів без додавання нафтопродуктів.

Період адаптації риб становив 14 діб. Такий час є достатнім для формування адаптивних механізмів до дії абіотичних чинників водного середовища [Хлебович, 1981]. З метою запобігання впливу на риб власних екзаметаболітів і для підтримання постійної концентрації нафтопродуктів воду в акваріумах змінювали що два дні з додаванням відповідної кількості нафтопродуктів.

Згідно поставлених завдань для дослідження відбирали тканини білих м'язів спини, печінку, зябра та кров. Після препарації органів живих риб проби миттєво заморожували в рідкому азоті і розтирали в порошок.

Вміст білку (мг/г) у плазмі крові, печінці, зябрах та м'язах риб визначали за Лоурі та співавт. [Lowry et al, 1951].

Активність аланін - та аспартатамінотрансферази (КФ 2.6.1.2 і 2.6.1.1) визначали за Пасхіною Т.С. (1974) і виражали в мкмоль пірувату на 1 мг білку за 1 хв.

Активність глутаматдегідрогенази (L-глутамат: НАДФ-оксиредуктаза, КФ 1.4.1.3) визначали спектрофотометричним методом на СФ-46 за швидкістю окиснення НАД або НАДН в реакційній суміші і виражали в мкмоль НАДН (НАДФН)/мг білку·хв [Glock, 1955].

Активність сукцинатдегідрогенази (СДГ) (КФ 1.3.99.1) визначали фериціанатним методом [Современные методы в биохимии, 1977] та розраховували в нмоль сукцинату/мг білку хв.

Активність цитохромоксидази (ЦО) (цитохром С: О2-оксидоредуктаза; МКФ 1.3.99.1) визначали за методом Штрауса [Straus, 1954]. Результати виражали в мкг індофенолу синього на мг білку за час інкубації (20 хв.).

Вміст глікогену (мг/г) в тканинах визначали за допомогою антронового реактиву [Практикум по биохимии, 1989].

Вміст метаболітів гліколізу та трикарбонового циклу в тканинах риб визначали загальноприйнятими ферментними методами. Для визначення вмісту пірувату в тканинах риб, який виражали в мкмолях на 100 г сирої тканини, використовували методику [Hohorst, Beim, 1963].

Визначення лактату в тканинах риб проводили згідно методу [Hohorst, 1963] і виражали в мкмоль на 1 г сирої тканини.

Значення [НАД]/[НАДH] в цитоплазмі клітин тканин розраховували за формулою [НАД]/[НАДH]=1/КЛДГЧ[піруват]/[лактат], де КЛДГ - константа лактатдегідрогеназної системи, що дорівнює 0,9Ч10-4 [Великий, Пархомец, 1976].

Концентрацію аденіннуклеотидів (АТФ, АДФ, АМФ) у тканинах риб визначали згідно методики, описаною в роботі [Маляревская и др., 1985] і виражали в мкмоль на 1 г сирої тканини, використовуючи коефіцієнт молярної екстинції, що становить для АТФ - 14,3Ч10-3, а для АДФ і АРФ - 14,5Ч10-3 [Справочник по биохимии, 1979].

Отримані результати досліджень оброблено статистично з використанням t-критерію Стьюдента [Лакин, 1990].

Роль білкового обміну в адаптації коропа до змін концентрації нафтопродуктів у водному середовищі

Зміна вмісту загального білку в тканинах коропа за дії сирої нафти та дизпалива водного середовища. Отримані нами результати показали, що вміст загального білку плазми крові за дії всіх досліджуваних концентрацій (0,25, 0,5, 0,75, 1 і 1,5 мг/дм3) сирої нафти підвищується. Так, під впливом сирої нафти в концентрації 0,25 мг/дм3 загальний вміст білку у плазмі крові зростає на 57% і досягає максимального рівня за дії 0,5 мг/дм3 (на 114%) та 1 мг/дм3 (на 163%) відносно контролю. Слід наголосити, що загальний вміст білку плазми крові за дії 1,5 мг/дм3 нафти практично не відрізняється від контролю. У зв'язку з цим можна припустити, що регуляція стану білкової системи крові у цьому випадку не порушується.

Щодо вмісту загального білку в тканинах риб (табл. 1), то відмічено певні особливості його змін у печінці, зябрах та м'язах риб в умовах нафтового забруднення водного середовища. Підвищення вмісту загального білку в сироватці крові за дії сирої нафти в концентрації - 0,25, 0,5, 0,75 та 1 мг/дм3 відбувається за рахунок зростання синтезу білків в печінці та зябрах риб.

Таблиця 1. Зміни вмісту загального білку в тканинах коропа під впливом сирої нафти, мг/г (М±m, n=5)

Примітка: Тут та на інших табл. і рис.* - результат вірогідний (Р<0,05).

Вплив дизпалива на вміст загального білку у плазмі крові коропа також залежить від його концентрації. Причому, в наших дослідах спостерігали вищий ступінь зростання загального вмісту білку крові при інтоксикації саме дизпаливом, ніж нафтою.

Так, за дії 0,5 мг/дм3 дизпалива вміст білку у крові зростає в 13 раз. Зі збільшенням концентрації дизпалива до 1,5 мг/дм3 вміст білку в крові залишається вищим за контрольну величину при 0,75 мг/дм3 - в 5 раз, при 1 мг/дм3 - в 9 рази і досягає максимального рівня (в 15 разів) за дії 1,5 мг/дм3.

Отже, значне зростання вмісту загального білку в сироватці крові відбувається за дії на коропа дизпалива в концентрації 0,5, 1 та 1,5 мг/дм3, дещо менше - 0,75 мг/дм3. Це є наслідком згущення крові, катаболізму білків м'язів та зябер і гемолізу власне фрагментів крові, тоді як за дії сирої нафти - переважно посиленого синтезу їх у печінці риб.

Динаміка активності ферментів трансамінування в тканинах коропа за дії дизпалива водного середовища. Аналіз результатів досліджень щодо впливу дизпалива в концентраціях 0,25, 0,5, 0,75, 1 та 1,5 мг/дм3 на активність АлАТ та АсАТ в печінці, зябрах та м'язах коропа показав, що такі його концентрації викликають у риб фазну зміну активності цих ферментів (рис. 1-3). Починаючи з найнижчої концентрації (0,25 мг/дм3) дизпалива активність АлАТ та АсАТ знижується в усіх тканинах риб, за умов впливу 0,5 мг/дм3- активність АлАТ в тканинах зростає, а активність АсАТ змінюється в різних тканинах по-різному. Активність ферментів переамінування за дії 0,75 мг/дм3 змінюється залежно від виду тканини.

Рис. 1. Активність АлАТ та АсАТ в печінці коропа за дії дизпалива, мкмоль ПВК/мг білку·хв·10-3 (М±m, n=4).

Рис. 2. Активність АлАТ та АсАТ в зябрах коропа за дії дизпалива, мкмоль ПВК/мг білку·хв·10-3 (М±m, n=4).

Рис. 3. Активність АлАТ та АсАТ в м'язах коропа за дії дизпалива, мкмоль ПВК/мг білку·хв·10-3 (М±m, n=4).

Активність трансаміназ в тканинах коропа за дії сирої нафти водного середовища. За дії нафти на організм коропа в концентраціях 0,25, 0,5, 0,75, 1 та 1,5 мг/дм3 спостерігається дещо інша картина змін активності АлАТ та АсАТ у печінці, зябрах і м'язах порівняно з активністю цих ферментів за умов впливу дизпалива.

Слід відзначити, що активність АлАТ і АсАТ у печінці риб обернено пропорційно залежить від концентрації нафти у водному середовищі. Так, в печінці за дії сирої нафти в досліджуваних концентраціях активність АлАТ і АсАТ знижується відповідно на 28?41% та 23?60% відносно контролю. Разом з тим, найбільше інгібування активності ферментів (на 91 і 97% для АлАТ та 87 і 88% для АсАТ) у печінці зафіксовано під впливом нафти в концентраціях 1 і 1,5 мг/дм3. Звідси випливає, що вищевказані концентрації нафти водного середовища спрямовують протікання процесів переамінування в бік утворення вільних амінокислот, зокрема аспарагінової та аланіну.

Отже, токсичність нафтопродуктів для риб залежить від їх виду та концентрації у водному середовищі. Зі збільшенням вмісту нафти у воді (від 0,25 до 1,5 мг/дм3) активність ферментів переамінування зменшується, а за дії дизпалива - зростає.

Глутаматдегідрогеназна активність в тканинах коропа за дії сирої нафти водного середовища. В результаті проведених досліджень нами виявлено зміни активності в печінці, зябрах та м'язах риб обох форм глутаматдегідрогенази за дії досліджуваних концентрацій нафти. При цьому найбільші зміни активності ГДГ характерні для печінки та м'язів, а менші - для зябер коропа, що пов'язано з функціональними особливостями цих тканин.

Слід зазначити, що активність НАД(Н) і НАДP(Н)-залежної ГДГ в печінці риб за дії нафти в концентрації 0,25 мг/дм3 не змінюється прорівняно з контролем, тоді як 0,75, 1 та 1,5 мг/дм3 скеровують протікання ГДГ-них реакцій в бік амінування б-кетоглутарату до глутамату, який надалі використовується в процесах трансамінування та обміні білків. Це підтверджується значним зростанням активності саме НАДP(Н)-залежної ГДГ порівняно з НАД(Н)-залежною, а також інгібуванням активності АлАТ і АсАТ.

У зябрах риб спостерігається інша картина змін активності ГДГ. Так, зниження активності мітохондріальної НАДP(Н)-ГДГ (на 44 %) за дії 0,5 мг/дм3 нафти та цитоплазматичної НАДP(Н)-ГДГ (на 33 %) за дії 0,75 мг/дм3 в зябрах риб свідчить або про зменшення вмісту б-кетоглутарату та аміаку, або про зростання вмісту глутамату. В той же час під впливом нафти в концентрації 1 мг/дм3 НАДP(Н)- залежна ГДГ в мітохондріях зябрового апарату зростає на 50% відносно контролю, а за дії - 1,5 мг/дм3 викликає в зябрах риб активування НАД(Н)-ГДГ в 2,3 рази.

В м'язах риб 0,25 мг/дм3 сирої нафти інгібує активність мітохондріальної НАДР(Н)- залежної ГДГ на 68% порівняно з контролем без зміни активності НАД(Н)-ГДГ. Поряд з цим, за дії на риб 0,75 мг/дм3 активується мітохондріальна НАД(Н)-ГДГ на 65% та цитоплазматична НАДР(Н) на 33% відносно контролю. Відмічений факт свідчить про одночасне посилення процесів амінування та дезамінування у м'язах коропа за дії 0,75 мг/дм3. Слід зазначити, що нафта в концентрації 1 та 1,5 мг/дм3 у м'язах коропа інгібує активність мітохондріальної НАД(Н)- та НАДР(Н)-ГДГ відповідно на 70 і 24% відносно контролю.

Особливості вуглеводного обміну у риб в умовах забруднення нафтопродуктами водного середовища

Динаміка вмісту глікогену в тканинах коропа за дії сирої нафти водного середовища. Дослідження показали, що нафта в концентраціях 0,25, 0,5, 1 та 1,5 мг/дм3 не викликає вірогідних змін вмісту глікогену в м'язах риб, за винятком 0,75 мг/дм3, під впливом якої в м'язах коропа спостерігається вірогідне зниження його вмісту на 35%.

В печінці риб спостерігається дещо інша картина. Так, за дії 0,25 мг/дм3 нафти вміст глікогену в печінці риб не змінюється, в той час як при 0,5 мг/дм3 відмічено збільшення вмісту глікогену на 46% відносно контролю. Під впливом вищих концентрацій сирої нафти (0,75, 1 та 1,5 мг/дм3) кількість глікогену в печінці риб зростає відповідно на 28, 68 та 33% відносно контролю.

Зміни вмісту глікогену в тканинах коропа за дії дизпалива водного середовища. Результати досліджень показали, що вміст глікогену в тканинах коропа за дії досліджуваних концентрацій дизпалива зростає. Так, дизпаливо в концентраціях 0,5, 1 та 1,5 мг/дм3 викликає в печінці риб вірогідне зростання вмісту глікогену в 5, 6 та 6,5 рази відносно контролю. При цьому максимальне збільшення його вмісту зафіксовано за дії 1,5 мг/дм3. Концентрація дизпалива 0,75 мг/дм3 в печінці риб вірогідних відхилень у вмісті глікогену не спричиняє. Таким чином, енергетичне забезпечення адаптивних реакцій до дії дизпалива здійснюється через активацію глікогенезу та глюконеогенезу в печінці риб.

В м'язах риб за дії досліджуваних концентрацій дизпалива, вміст глікогену як і в печінці, зростає. Так, під впливом 0,5, 0,75, 1 та 1,5 мг/дм3 дизпалива вміст глікогену в м'язах риб збільшується відповідно в 4, 2, 5 та 6 раз відносно контролю, сягаючи максимальної величини при 1,5 мг/дм3.

Вміст пірувату та лактату в тканинах риб за дії сирої нафти водного середовища. Встановлено, що вміст метаболітів гліколізу та ЦТК в організмі коропа залежить від концентрації нафтопродуктів у воді та виду тканини.

В печінці за дії 0,25, 0,5 та 1,5 мг/дм3 сирої нафти вміст пірувату не змінюється, тоді як при 0,75 і 1 мг/дм3 - зростає на 60 та 187%. Вміст лактату в цьому органі залишається на рівні з контролем за дії 0,25, 1 та 1,5 мг/дм3 нафти, тоді як при 0,5 мг/дм3 - спочатку зростає на 66%, а потім знижується на 25% під впливом 0,75 мг/дм3.

В зябрах риб вміст пірувату зростає в середньому в 2 рази за дії 0,25, 0,5 та 0,75 мг/дм3 сирої нафти, знижуючись до контрольного рівня за дії 1,5 мг/дм3. Щодо лактату, то його концентрація за дії вищих (1 і 1,5 мг/дм3) концентрацій не змінюється, а при найнижчій (0,25 мг/дм3) - зростає на 42%. Отже, енергозабезпечення процесів адаптації риб при цьому здійснюється за рахунок одночасної інтенсифікації аеробних процесів та гліколізу в зябрах і печінці коропа.

В м'язах риб за дії 0,25 і 0,75 мг/дм3 сирої нафти вміст пірувату зростає відповідно 2,2 та 2 рази, а вміст лактату знижується - на 39 та 36% від контролю. Співвідношення НАД/НАДН відповідно зростає в 3,6 та 3,1 рази. Це свідчить про переважання в м'язах аеробних процесів над гліколізом.

За дії нафти в концентрації 0,5 і 1 мг/дм3 в м'язах риб вміст пірувату знижується відповідно на 29 і 43%, а вміст лактату не змінюється.

За дії 1,5 мг/дм3 нафти у м'язах риб вміст пірувату зменшується на 62%, а вміст лактату зростає на 21% від контролю. За цієї концентрації значно знижується співвідношення НАД/НАДН на 69% відносно контрольної величини. Це можна пояснити переважанням гліколітичних процесів над аеробними.

Вплив дизпалива на вміст пірувату, лактату та співвідношення вільних НАД - пар в тканинах коропа. За дії на риб дизпалива в концентраціях 0,5, 0,75, 1,5 мг/дм3 у воді вміст пірувату в їх печінці не відрізняється від контролю, тоді як за дії 1 мг/дм3 - зростає на 60% від контролю. В той же час під впливом за дії 0,25, 0,5 та 1 мг/дм3 дизпалива вміст лактату зростає відповідно на 67, 42 та 115% від контролю. Разом з тим за усіх досліджуваних концентрацій дизпалива спостерігається зниження співвідношення вільних НАД-пар, що свідчить про зменшення окиснювальної здатності цитоплазми клітин цієї тканин та посилення процесів гліколізу.

Щодо зябер, то за дії на риб дизпалива в концентрації 0,25 мг/дм3 змін в співвідношенні нікотинамідних коферментів в них не спостерігається, тоді як вміст пірувату та лактату відповідно знижується на 46 і 42% відносно контролю. Це може свідчити про одночасне пригнічення як гліколітичних, так і аеробних процесів в зябрах риб за таких умов водного середовища.

За дії на риб дизпалива в концентрації 0,75 мг/дм3 процеси енергозабезпечення роботи зябер коропа забезпечуються за рахунок гліколізу. Про це свідчить той факт, що в зябровому апараті на фоні незмінності вмісту лактату, рівень пірувату та співвідношення вільних НАД-пар зменшуються на 63% порівняно з контролем. В той же час за дії на риб 1 мг/дм3 дизпалива вміст пірувату в зябрах знижується на 48%, а співвідношення вільних НАД-пар - на 34% відносно контролю.

Дизпаливо в концентрації 1,5 мг/дм3 спричиняє зниження в зябрах риб вмісту пірувату на 53% та зменшення співвідношення вільних НАД - пар на 46% відносно контролю. Це свідчить про пригнічення реакцій ЦТК та переважання гліколізу у вказаному органі риб.

Активність ферментів енергетичного обміну в тканинах коропа за дії різних концентрацій нафтопродуктів у водному середовищі

Зміна активності СДГ в печінці та зябрах риб за дії дизпалива водного середовища. За досліджуваних (0,25, 0,5, 1 та 1,5 мг/дм3) концентрацій дизпалива активність СДГ в печінці риб зростає відповідно на 128, 61, 106 та 33% (табл. 2).

Таблиця 2 Активність сукцинатдегідрогенази в тканинах коропа за дії дизпалива, нмоль сукцинату/мг білку•хв·10-3 (M±m, n=5 і 4)

Вплив сирої нафти на активність СДГ в тканинах риб. За дії досліджуваних концентрацій сирої нафти у печінці риб спостерігається дещо інша картина у зміні активності СДГ порівняно з впливом дизпалива.

Так, за дії на риб нафти в концентрації 0,25 мг/дм3 активність СДГ в печінці знижується на 33% порівняно з контролем. З підвищенням її концентрації у воді від 0,5 до 1,5 мг/дм3 в печінці також інгібується окиснення сукцинату, про що свідчить зниження рівня активності СДГ відповідно на 40, 40, 36 та 34 % відносно контролю.

Слід відмітити, що в зябрах риб концентраційна залежність активності СДГ від вмісту сирої нафти у водному середовищі не виявлено, окрім концентрації 0,75 мг/дм3. Лише за цієї концентрації активність ферменту в зябрах риб зростає на 68% порівняно з контролем, що свідчить про значне утворення сукцинату у цій тканині.

Активність цитохромоксидази у тканинах коропа за дії різних концентрацій дизпалива. Так, в печінці риб під впливом дизпалива в концентрації 0,25, 0,5 та 1 мг/дм3 активність ЦО зростає відповідно на 176, 32 та 64%, що свідчить про посилення процесів термінального окиснення в цій тканині. В той же час активність ЦО в печінці риб за дії концентрацій 0,75 і 1,5 мг/дм3 не відрізняється від контролю.

На відміну від печінки, тканина залозистого апарату зябер характеризується нижчою активністю ЦО, що пов'язано з видовими особливостями вказаних тканин. Так, лише за дії 0,25 мг/дм3 дизпалива на коропа активність ЦО в зябрах зростає на 21%.

В умовах дії на риб 0,5 мг/дм3 дизпалива активність ЦО не відрізняється від контролю, тоді як при вищих концентрацій (0,75 та 1,5 мг/дм3) її активність зменшується (на 28 та 31%).

Динаміка активності цитохромоксидази в тканинах риб за дії сирої нафти водного середовища. Щодо дії сирої нафти в досліджуваних концентраціях на активність ЦО, то її вплив проявляється вже при найнижчій концентрації - 0,25 мг/дм3. Так, в зябрах активність цього ферменту знижується на 44%. Однак в печінці за таких умов водного середовища вона не відрізняється від контрольних значень. Відмічений факт вказує на те, що ці органи виконують різну фізіологічну функцію. За дії на риб 0,5, 0,75, 1 та 1,5 мг/дм3сирої нафти, в печінці коропа, спостерігається зниження активності ЦО на 69, 68, 48 та 49%, що свідчить про інгібувння процесів термінального окиснення. Водночас в зябрах коропа активність її також зменшується відповідно на 39, 44, 40 та 51% відносно контрольних значень.

На особливу увагу заслуговує той факт, що в печінці риб за дії концентрацій сирої нафти від 0,5 до 1,5 мг/дм3 знижується активність ЦО та СДГ. Очевидно, наявність спряження між функціонуванням цих ферментів пояснюється співвідношенням відновлених і окиснених нуклеотидів НАДН/НАД, яке виступає основним регулятором ЦТК. Очевидно, компоненти нафти блокують дихальний ланцюг на рівні цитохромів, що запобігає окисненню в дихальному ланцюгу як піридиннуклеотидів, так і флавопротеїдів. Зниження ж активності ЦО в зябрах риб за дії досліджуваних концентрацій без змін активності СДГ, свідчить про те, що за таких умов уповільнюється функціонування дихального ланцюга мітохондрій цього органу, однак окиснення сукцинату не порушується. Частина флавопротеїдів дихального ланцюга залишаються окисненими в зябрах риб, що в свою чергу зберігає здатність до утворення АТФ клітинами зябер сукцинатдегідрогеназним шляхом.

Енергетичні аспекти адаптації риб до нафтопродуктів водного середовища

Вплив дизпалива на вміст аденілових нуклеотидів в тканинах коропа. Встановлено, що вміст аденілатів в тканинах коропа залежить від виду нафтопродукту та їх концентрації у водному середовищі. Так, вміст АТФ в печінці риб за дії дизпалива в концентрації 0,25 мг/дм3 не відрізняється від контролю (табл. 3). Відмічений факт може свідчити про те, що підтримання гомеостатичного рівня АТФ у клітинах печінки здійснюється шляхом алостеричної регуляції швидкості окисного фосфорилювання в мітохондріях, що підтверджується зростанням активності ЦО на 176% відносно контролю.

Таблиця 3 Вміст аденінових нуклеотидів в печінці коропа за дії дизпалива, мкмоль/г сирої маси (М ± m, n=4)

В той же час за дії на риб 0,5 мг/дм3 дизпалива спостерігається зниження в печінці вмісту АТФ на 34% порівняно з контролем (табл. 3). Це зумовлено зниженням інтенсивності дихання мітохондрій. Однак за дії на риб дизпалива в концентрації 0,75 мг/дм3 відмічено більш істотні зміни АТФ в печінці риб, ніж за дії 0,5 мг/дм3. При цьому вміст АТФ в печінці знижується на 46%, АДФ - на 39%, а АМФ - на 44%. Це свідчить про значні затрати енергії на процеси адаптації не тільки в результаті ресинтезу АТФ, але й АДФ і АМФ. Зниження вмісту АМФ можна пояснити функціонуванням АМР-дезаміназного механізму, згідно якого зниження аденілатного енергетичного заряду компенсується дезамінуванням АМР.

Щодо дії на риб дизпалива в концентрації 1 мг/дм3, то за таких умов в печінці риб різко (на 46%) знижується вміст АТФ та АМФ. Поясненням значного зниження вмісту макроергів у печінці коропа може бути роз`єднання окиснення і фосфорилювання за таких умов. Крім того, вірогідне зменшення АМФ можна пояснити дефосфорилюванням його до аденозину, за рахунок якого може відбуватись активація гліколізу. Таким чином, зазначений факт свідчить про використання енергії цих сполук на пристосування риб до таких умов водного середовища або зменшення їх синтезу. Величина енергетичного заряду при цьому не знижується.

Необхідно відмітити, що за дії на риб дизпалива в концентрації 1,5 мг/дм3 в їх печінці відмічено менші зміни величин досліджуваних показників, ніж при 1 мг/дм3. При цьому спостерігається вірогідне зниження (на 19%) вмісту АТФ, тоді як вірогідних відхилень вмісту АДФ і АМФ від контролю не спостерігалось. В цьому випадку можна говорити про використання енергії макроергічних зв'язків АТФ на адаптацію риб до таких умов водного середовища або пригнічення синтезу самого АТФ, однак не за рахунок АДФ і АМФ. Крім того, підтримання показника аденілатного енергетичного заряду (АЕЗ) на контрольному рівні свідчить про те, що у печінці відбувається достатній ресинтез макроергів і цей процес проходить не за рахунок окисного фосфорилювання (оскільки активність ЦО за цих умов не змінюється), який може забезпечити необхідну кількість АТФ, а за рахунок посилення гліколітичного шляху перетворення вуглеводів. Перемикання на анаеробні метаболічні шляхи призводить до того, що запаси АТФ знижуються, оскільки останній перетворюється в АДФ та АМФ з обмеженою здатністю рефосфорилювання.

Таким чином, на підставі отриманих результатів досліджень можна стверджувати, що концентрації дизпалива 0,5, 0,75, 1 і 1,5 мг/дм3 у водному середовищі є токсичними для риб, адаптація яких до таких умов вимагає затрат енергії, що міститься у макроергічних зв'язках АТФ, АДФ і АМФ. При цьому більша частина енергозалежних процесів сповільнюється чи інгібується. Останнє призводить до значних порушень функцій клітин, втрати здатності підтримувати іонну рівновагу, що в кінцевому результаті може призвести до загибелі клітин. За умов порушення клітинної біоенергетики вуглеводнями дизпалива в першу чергу може зазнати ураження нервова та м'язова тканини, оскільки їх функціонування є енергозалежним.

Дещо інша картина в енергозабезпеченні процесів адаптації риб до дії досліджуваних концентрацій дизпалива спостерігається в зябрах. Так, дизпалива в концентраціях 0,25, 0,5 та 0,75 мг/дм3 вірогідних відхилень вмісту аденілових нуклеотидів від контролю в зябрах риб не викликає (табл. 4).

Підтримання в зябрах риб за дії дизпалива в концентрації 0,25 мг/дм3 енергетичного статусу на контрольному рівні відбувається за рахунок зростання окисного фосфорилювання, оскільки активність ЦО за цих умов підвищується на 21%. Незмінність вмісту аденілатів за дії 0,5 і 0,75 мг/дм3 дизпалива можна пояснити тим, що ці концентрації не є токсичними для коропа.

Таблиця 4 Вміст аденінових нуклеотидів в зябрах коропа за дії дизпалива, мкмоль/г сирої маси (М ± m, n=4)

Водночас за дії 1 і 1,5 мг/дм3 вміст АТФ в зябрах риб зростає відповідно на 44 і 56%, АДФ - на 159 та 94%. Це може свідчити про посилення в зябрах риб окиснювального фосфорилювання шляхом збільшення швидкості переносу електронів через мембрану, енергія якого акумулюється в АТФ і АДФ. Ця енергія використовується на роботу зябрового апарату, як осморегуляційного органу, для абсорбції дизпалива з водного середовища.

Динаміка вмісту аденілових нуклеотидів в тканинах риб в умовах забруднення водного середовища сирою нафтою. Згідно наших досліджень, наявність нафти у водному середовищі також спричиняє зміни енергетичного обміну в організмі риб. Про це свідчить вміст аденілових нуклеотидів в печінці риб.

Так, за дії на риб сирої нафти в концентрації 0,25 мг/дм3 вміст АМФ в їх печінці знижується на 31%. Цей факт можна пояснити зменшенням синтезу АМФ за таких умов, або його дезамінуванням, внаслідок чого аденілатний енергетичний заряд підтримується на рівні контролю.

В той же час вищі концентрації (0,5 мг/дм3) нафти водного середовища призводять до різкого зменшення (на 32%) вмісту АТФ у печінці риб. Встановлений факт свідчить про роз'єднання окисного фосфорилювання в мітохондріях печінки, в результаті чого енергія не накопичується у вигляді АТФ. Підтвердженням цього висновку може служити вміст АДФ і АМФ в печінці риб, який не відрізняється від контрольного, а також зниження активності ЦО за дії 0,5 мг/дм3 сирої нафти на 69%. В даному випадку витрати АТФ переважають над його синтезом з АДФ і АМФ.

За дії на риб сирої нафти в концентрації 1,5 мг/дм3 в їх печінці не виявлено вірогідних змін вмісту аденілових нуклеотидів порівняно з контролем.

На відміну від печінки, в зябрах риб при їх адаптації до різних концентрацій нафти водного середовища спостерігається інша картина змін вмісту аденілових нуклеотидів (табл. 5).

В даній тканині за дії на риб нафти в концентрації 0,25 мг/дм3 зростає (в два рази) рівень всіх аденінових нуклеотидів (АТФ, АДФ і АМФ) без змін АЕЗ. Це свідчить про те, що така концентрація сирої нафти не є токсичною для риб. Щодо дії на риб СН в концентрації 0,5 мг/дм3, то можна відзначити збільшення у зябрах (на 106%) лише вмісту АДФ. Величини інших показників (АТФ і АМФ) залишаються на рівні контролю. Отримані результати досліджень можуть бути свідченням загальмованого процесу фосфорилювання АДФ в АТФ. При цьому АДФ не фосфорилюється в АТФ. Слід зазначити, що зовсім інша картина змін величин досліджуваних показників в зябрах риб спостерігається за дії на них значно більших (1,5 мг/дм3) концентрацій нафти (табл. 5). За таких умов водного середовища в зябрах риб різко підвищується вміст АТФ і АМФ (відповідно на 161 і 63%), порівняно з контролем. Поряд з цим, в досліджуваній тканині зросла сума аденілових нуклеотидів (на 82%) та величина АЕЗ (на 20%) відносно контролю. Це свідчить про активацію генерування енергії за таких умов, яка акумулюється в АТФ і АМФ та може використовуватись для процесів адаптації риб до наявності нафтопродуктів у воді.

Таблиця 5 Вміст аденілових нуклеотидів в зябрах коропа за дії сирої нафти, мкмоль/г сирої маси (М ± m, n=4)

У дисертації наведено результати досліджень показників, які характеризують білковий, вуглеводний та енергетичний обмін у риб за умов дії сирої нафти та дизпалива водного середовища. Встановлено кількісні зміни вмісту загального білку, глікогену, пірувату, лактату, аденілових нуклеотидів (АТФ, АДФ, АМФ), активності ферментів аланінамінотрансферази (АлАТ), аспартатамінотрансферази (АсАТ), сукцинатдегідрогенази (СДГ) і цитохромоксидази (ЦО), співвідношення вільних НАД-пар та величини аденілатного енергетичного заряду в печінці, зябрах та м'язах, а також вмісту загального білку в крові риб. Отримані результати досліджень дозволяють дати оцінку ступеню інтоксикації організму риб нафтопродуктами та прогнозувати їх ріст, розвиток і біопродуктивність за цих умов.

1. Інтоксикація організму коропа сирою нафтою призводить до зростання вмісту загального білку в печінці (на 86 - 94%) та зябрах (на 21 - 58%) риб, тоді як за дії дизпалива вміст його в цих тканинах практично не змінюється, а в м'язах, навпаки, знижується (на 26 - 72%).

2. Виявлено високу чутливість білкової системи сироватки крові коропа до наявності сирої нафти та дизпалива у воді, яка проявляється у збільшенні сумарного вмісту білків (в 2 - 15 рази). Збільшення їх кількості в крові коропа за дії дизпалива є наслідком катаболізму білків в м'язах риб, згущення крові та гемолізу власне фрагментів крові, тоді як за дії нафти - переважно внаслідок посиленого синтезу білків у печінці і зябрах риб.

3. Вміст сирої нафти (в концентраціях від 0,25 до 1,5 мг/дм3) у воді інгібує переамінування амінокислот в АлАТ (на 26 - 95%) та АсАТ (на 19 - 90%) реакціях в печінці, зябрах та м'язах риб. Тоді як дизпаливо, навпаки, викликає активування АлАТ (переважно в концентраціях 0,5, 1 і 1,5 мг/дм3 в 1,4 - 4 рази) та АсАТ (в концентраціях 1, 1,5 мг/дм3 на 15 - 150%) в цих тканинах.

4. Зміна активності різних форм глутаматдегідрогенази в організмі риб за дії сирої нафти водного середовища залежить від її концентрації, специфіки тканин та функціонального значення ферменту. Зростання мітохондріальної НАД(Н), НАДФ(Н) та цитоплазматичної НАДФ(Н) відмічено в печінці риб в концентраціях 0,75, 1 та 1,5 мг/дм3. В зябрах активність цих ферментів практично не змінюється, тоді як в м'язах, навпаки, знижується, особливо при концентраціях 1 та 1,5 мг/дм3.

5. За дії дизпалива в концентрації від 0,5 до 1,5 мг/дм3 зростає вміст глікогену як в печінці (в 5 - 6,5 раз), так і в м'язах (в 2 - 6 раз) риб. Тоді як за дії сирої нафти його вміст зростає лише в печінці (на 28 - 68%) риб.

6. Вміст пірувату, лактату та співвідношення вільних НАД-пар в печінці, зябрах та м'язах риб залежить від виду нафтопродукту та його концентрації у воді. Так, за дії сирої нафти вміст пірувату та співвідношення НАД-пар переважно зростає: в печінці за дії 0,75 і 1 мг/дм3, а в зябрах та м'язах - за дії 0,25 і 0,75 мг/дм3. Ці концентрації сирої нафти викликають інтенсифікацію анаеробного обміну. За дії ж дизпалива спостерігається активування гліколізу, про що свідчить зростання вмісту лактату, зниження вмісту пірувату та співвідношення вільних НАД-пар, особливо в печінці та зябрах риб в концентраціях дизпалива від 0,5 до 1,5 мг/дм3.