Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ

УДК 579. 266. 68 (474)

ЕКОЛОГІЧНЕ ЗНАЧЕННЯ ЗЕЛЕНИХ СІРКОВИХ БАКТЕРІЙ В УТИЛІЗАЦІЇ СІРКОВОДНЮ

03.00.16 - екологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ГОРІШНИЙ МИРОСЛАВ БОГДАНОВИЧ

Київ 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, професор Гудзь Степан Петрович, Львівський національний університет імені Івана Франка, завідувач кафедри мікробіології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Козлова Ірина Панасівна, Інститут мікробіології та вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник відділу загальної та грунтової мікробіології

доктор сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник Шерстобоєва Олена Володимирівна, Інститут агроекології УААН, завідувач відділу біологічного моніторингу

Захист відбудеться “ 7 ” жовтня 2008 року об 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.371.01 Інституту агроекології УААН за адресою: 03143, м. Київ, вул. Метрологічна, 12.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології УААН за адресою: 03143, м. Київ, вул. Метрологічна, 12.

Автореферат розіслано “2 ” вересня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат сільськогосподарських наук Я.В. Чабанюк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Багаторічна промислова розробка Яворівського сіркового родовища порушила природні процеси мікробної трансформації сірки, що підтримували рівновагу її сполук у цьому районі. Відкритий спосіб видобутку сірки зробив її доступною для впливу атмосферного кисню, створив оптимальні умови для діяльності аеробних сіркоокиснюючих бактерій. Нагромаджувані продукти їх життєдіяльності -сульфати при заповненні колишніх копалень водою опинились в анаеробних умовах, і, як наслідок, активізували розвиток сульфатвідновлювальних бактерій, продуктом життєдіяльності яких є сірководень. Останній є небезпечною отруйною речовиною. Так, при концентрації 70-500 мг/м³ він спричиняє очні, неврологічні, серцевосудинні, метаболічні, та репродуктивні порушення. Летальний ефект настає при досить низькій концентрації сірководню в повітрі - 700 мг/м³. Наслідки ураження сірководнем можуть виявлятися навіть через 10-20 років після припинення його дії (Wahlund, 1991; Pfennig, 1967). На даний момент концентрація сірководню у воді озера “Яворівське” сягає 40-60 г/м³, що в сотні разів перевищує його гранично допустимі концентрації (Alexander, 2002).

Завдяки діяльності зелених та пурпурових сіркових бактерій, які використовують сірководень як донор електронів в процесі аноксигенного фотосинтезу, водойми очищуються від цієї токсичної сполуки. Фотосинтезувальні зелені сіркобактерії, котрі населяють глибинні шари водойм, у які ще проникає сонячне проміння, не дозволяють сірководню поширюватись у верхні водні шари, що забезпечує можливість розвитку там багатьох рослинних та тваринних організмів. Лише недавно стала відомою природа зелено - червоних матів які утворюються на дні сірчаних джерел. Зелені та пурпурові сіркобактерії розвиваються за рахунок діяльності сульфатвідновлювальних бактерій, які продукують сірководень, необхідний для здійснення процесу аноксигенного фотосинтезу (Горленко, 1977).

Певний закордонний досвід (Польща, Німеччина) показує, що екологічні проблеми, які виникали внаслідок припинення діяльності сіркових комбінатів можна вирішувати шляхом встановлення біофільтрів, створення штучних біокаталізаторів безперервної дії, або ж шляхом конструктивних геологічних перебудов (За ред. Ленгелера, Древса, Шлегеля, 2005). Слід відмітити, що всі перечисленні роботи не стосувались таких грандіозних масштабів, як територія озера “Яворівське”. У таких випадках позитивний результат може дати лише гірничо-геологічна рекультивація території з урахуванням біологічних процесів. Озеро “Яворівське” невпинно наповнюється карстовими водами з високим вмістом сульфатів та водами з навколишніх річок, збагачених органічними сполуками. Це стимулює розвиток сульфатвідновлювальних бактерій, і як наслідок, нагромадження сірководню.

Гірничо - геохімічні методи очистки води від сірководню є надзвичайно дорогими, тому використання фотосинтезувальних сіркобактерій з метою біологічного окислення сірководню є гострою необхідністю для відновлення рівноваги циклу сірки, у даній екосистемі природнім шляхом.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконана на кафедрі мікробіології Львівського національного університету імені Івана Франка і є частиною держбюджетної теми Бм-04Ф “Особливості мікробіологічних процесів метаболізму сірки у сірковидобувних районах” (№ ДР 0105U002213).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було з'ясувати екологічне значення зелених сіркових бактерій в утилізації сірководню та встановити основні чинники які впливають на цей процес.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

- дослідити хімічний склад води та проаналізувати характер мікрофлори озера “Яворівське”;

- виділити та ідентифікувати культуру зелених сіркобактерій що утилізує сірководень із води озера “Яворівське”;

- дослідити пігментний склад виділеного штаму сіркобактерій, що інтенсивно здійснює розщеплення сірководню;

- встановити закономірності росту виділеної культури;

- дослідити вплив чинників середовища на процес утилізації сірководню зеленими сіркобактеріями;

- дослідити залежність нагромадження та дисиміляції глюкози в клітинах виділеного штаму залежно від умов культивування;

- встановити природу та закономірності нагромадження і розщеплення поліцукриду у клітинах C. limicola Ya-2002.

Об'єкт дослідженнь - функціонування фотосинтезувальних зелених сіркових бактерій, що утилізують сірководень, у кар'єрних водоймах сірковидобувного регіону. озеро яворівське сіркобактерія мікрофлора

Предмет досліджень - фотосинтезувальні зелені сіркові бактерії C. limicola Ya-2002 виділені з кар'єрної водойми.

Методи дослідження - використані методи аналітичної хімії (для кількісного визначення карбонових кислот і сульфіду в середовищі культивування та глюкози в клітинах виділеного штаму), водної мікробіології (для відбору проб води та виділення з них зелених сіркових бактерій), загальної мікробіології (для вивчення мофологічних, культуральних і фізіологічних особливостей виділеного штаму та його ідентифікації), біохімії (для кількісного визначення глюкози в клітинах), інфрачервоної спектрометрії (для встановлення природи поліцукриду) елементного аналізу (для вставлення природи продуктів дисиміляції глюкози), хроматографічного розділення (для встановлення мономерного складу поліцукриду), виділення глікогену з клітин C. limicola Ya-2002, електронної мікроскопії (для одержання мікрофотографій клітин виділеного штаму, вивчення ультраструктури клітин та встановлення закономірностей нагромадження глікогену в клітинах), математичної статистики (для аналізу і оцінки достовірності отриманих результатів).

Наукова новизна одержаних результатів. Комплексними дослідженнями надана хімічна та мікробіологічна характеристика води озера “Яворівське”. Проведено хімічний аналіз та встановлено чисельність основних таксономічних та еколого-трофічних груп мікроорганізмів води озера “Яворівське”. З води досліджуваної водойми виділено штам фотосинтезувальних зелених сіркових бактерій Chlorobium limicola Ya-2002, який активно розщеплює високотоксичну сполуку сірководень, що утворюється у техногенних водоймах сірковидобувних регіонів.

Вперше встановлені закономірності утилізації сірководню виділеним штамом залежно від інтенсивності освітлення культури, концентрації вуглекислоти та наявності органічних джерел вуглецю в середовищі. Показано, що індуктором використання сірководню клітинами C. limicola Ya-2002 є світло. Виділені зелені сіркові бактерії використовують як донор електронів у процесі фотосинтезу лише сірководень і не використовують тіосульфат та сірку.

Виявлено, що клітини штаму C. limicola Ya-2002 в процесі аноксигенного фотосинтезу утворюють глюкозу, кількість якої змінюється залежно від умов, в яких розмножується штам. Показано, що клітини
C. limicola Ya-2002 на світлі нагромаджують глікоген, що використовується в трофічних ланцюгах живлення у озері “Яворівське”. Проведена його ідентифікація. Показано, що за умов темряви бактерії використовують глікоген для підтримання енергетичного та конструктивного метаболізму. Досліджена природа продуктів, що утворюються при його катаболізмі в умовах темряви.

Практичне значення одержаних результатів. Виділена культура зелених сіркових бактерій, інтенсивно розщеплює сірководень. Отримані результати дозволять розробити ефективні біотехнологіі очищення води від цієї токсичної сполуки у водоймах сірковидобувних районів. Це дасть можливість знизити рівень забрудненості навколишнього середовища сірководнем, що виявляє токсичну і мутагенну дію на живі організми, і суттєво погіршує екологічну ситуацію в цих регіонах. Виділені бактерії можуть бути використані для створення продуцентів глікогену, а також для виробництва дешевого “органічного вуглецю” на основі “СО₂+ Н₂S”.

Особистий внесок здобувача. Визначення загальної чисельності основних фізіологічних груп мікроорганізмів у воді озера “Яворівське”, виділення чистої культури, її ідентифікація, встановлення якісного пігментного складу виділеного штаму, дослідження росту та розщеплення сірководню виділеним штамом зелених сіркових бактерій за різних умов культивування, дослідження закономірностей утворення та дисиміляції внутрішньоклітинної глюкози C. limicola Ya-2002 виконано дисертантом самостійно.

Виділення та дослідження природи, ідентифікація та з'ясування умов нагромадження та розщеплення поліцукриду у клітинах C. limicola Ya-2002 проведено у співпраці з к.б.н. Д.В. Яновичем (Український Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів та харчових добавок) та к.х.н., доцентом В.С. Матійчуком (Львівський національний університет імені Івана Франка). Електронномікроскопічні дослідження ультраструктури клітин проведено у співпраці з к.б.н., с.н.с. О.Р. Кулачковським (Львівський національний університет імені Івана Франка). Планування експериментів, їх аналіз та узагальнення отриманих результатів виконані спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні положення і результати дисертації були представлені на III Міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2007); ІХ Всеукраїнській науковій конференції студентів, магістрів, аспірантів “Екологічні проблеми регіонів України” (Одеса, 2007); 11-й Пущинській міжнародній школі-конференції молодих вчених “Биология - наука ХХІ века” (Пущино, 2007); II Міжнародній конференції молодих вчених “Біологія: від молекули до біосфери” (Харків 2007); III Internation young scientists conference ”Biodiversity. Ecology. Adaptation” (Оdеssа 2007); The young scientists' and students' internation scientists conference ”Modern problem of microbiology and biotechnology”(Оdеssа 2007); на наукових конференціях професорсько-викладацького складу і наукових співробітників Львівського національного університету імені Івана Франка (2006, 2007); наукових семінарах кафедри мікробіології Львівського національного університету імені Івана Франка.

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 9 наукових праць, в тому числі у виданнях, рекомендованих ВАК України - 3 статті та 6 тез доповідей на міжнародних та регіональних конференціях.

Структура дисертації. Дисертація складається з вступу, 3 розділів, підсумку, висновків, списку використаних джерел (48 вітчизняних видань та 178 іноземних). Робота викладена на 129 сторінках друкованого тексту, ілюстрована 7 таблицями і 48 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

За даними аналізу результатів вітчизняних та іноземних авторів щодо розповсюдження та біогеохімічної діяльності зелених сіркових бактерій у штучних водоймах, що утворилися внаслідок промислового видобутку сірки, відмічено відсутність даних про вплив чинників середовища на процес детоксикації сірководню і природу внутрішньоклітинного поліцукриду який нагромаджують зелені сіркобактерії в процесі фотосинтезу. На основі аналітичного огляду наукової літератури обґрунтовано необхідність та перспективність проведення досліджень за темою дисертації.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Відбір проб води та мулу здійснювали з різних глибин водної товщі озера “Яворівське” та озера, природного заповідника “Розточчя”

Дослідження загальної чисельності мікроорганізмів основних таксономічних та еколого-трофічних груп водойм проводили за результатами посіву проб води та мулу на середовища Ешбі, Кравцова-Сорокіна, Виноградського, Гетченсона, Ван Ніля (Каравайко и др., 1972).

Визначення складових води проводили: фотометричним (Feзаг, SO4^2-, HCO3^-) методом (Лурье, 1984), а також полум'яно-емісійною спектрофотометрією (K⁺ і Na⁺) і титруванням (Ca²⁺ та Mg²⁺, Cl^-, H2S) (Крешков, 1961; Марченко, 1971).

Ідентифікацію виділених культур зелених сіркових бактерій проводили за морфо-фізіологічними і біохімічними ознаками, користуючись визначником бактерій Берджі (Хоулт и др., 1997).

Визначення концентрації карбонових кислот у середовищі проводили титруванням (Бабко, П'ятницький, 1974; Лурье, 1984), сульфату - турбідометрично (ГОСТ 26426-85, 1985).

Електронно-мікроскопічні дослідження проводили за Рейнольдсом (Reynolds, 1963).

Бактерії вирощували на рідкому або агаризованому мінеральному середовищі Ван Ніля (Каравайко та ін., 1972), і GSB (Postgate, 1984) в анаеробних умовах при температурі 28 ⁰С впродовж 7-14 діб. Для поглинання кисню використовували генератори GENbox anaer (Франція). При вивченні здатності зелених сіркових бактерій засвоювати органічні сполуки до середовища як джерело вуглецю вносили глюкозу, органічні кислоти у вигляді солей натрію - мурашину, оцтову, молочну, піровиноградну, пропіонову, фумарову, яблучну, лимонну, стеаринову, олеїнову і бензойну, амінокислоти - аланін, гліцин, глутамін, серин, аргінін.

Концентрацію сірководню визначали йодометрично (Heunisch, 1976) та фотоелектрокалориметрично використовуючи фотоелектрокалориметр КФК - 3 (Altenburger, 2003).

Кількісне визначення редукуючих цукрів здійснювали у безклітинних екстрактах. Двічі відмиті клітини руйнували ультразвуком на ультразвуковому дезінтеграторі УЗДН-2Т частотою 22 МГц протягом 5 хв. Інтактні клітини та їх уламки осаджували центрифугуванням при 15 тис. об./хв протягом 45 хв., а отриманий супернатант використовували для визначення вмісту редукуючи цукрів. Загальну кількість редукуючих цукрів визначали за Шомоді-Нельсона (Захарова, 1982).

Визначення глюкози проводили використовуючи ферментний набір “Діаглюк-2”

Виділення поліцукридів з клітин C. limicola Ya 2002 проводили за метод Захарової - Косенко (Захарова, 1982).

Інфрачервону спектрометрію глікогену проводили за методом (Баклановская, 1969) використовуючи Спекорд М - 80.

Статистичну обробку отриманих результатів проводили з використанням програми “Microsoft Excel 2003” (Тюрин, Макаров, 1995; Лапач, 2001). Вибір тактики статистичної обробки і підготовку даних для аналізу здійснювали, базуючись на загальноприйнятих методах (Лакин, 1990) при рівні достовірності Р < 0,05. Графічне відображення одержаних результатів, набір і макетування тексту здійснювали з допомогою програм “Microsoft Excel 2003” і “Microsoft Word 2003”

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Хімічний аналіз води озера “Яворівське”. В результаті промислової розробки Язівського сіркового родовища на Львівщині утворились великі, сильно мінералізовані штучні водойми. Мікробіологічні процеси, що протікають у них, не досліджувались і наслідки затоплення залишаються непередбачуваними. З часу припинення діяльності підприємства та технологічного комплексу, значна територія, а власне центральний зумпф та прилеглі рукави кар'єру затоплені і вже зараз на їхньому місці утворилось озеро “Яворівське” глибина якого сягає 100 метрів.

Після початку затоплення озера спостерігається процес „оживання” води, що виявляється в підвищенні її придатності, як середовища для існування мікроорганізмів та інших живих організмів. Тим не менш, на основі відомих значень гранично допустимих концентрацій певних сполук, та в порівнянні з природнім контрольним водоймищем, ще рано стверджувати, що така вода за своїми параметрами наближається до природних і придатна в повній мірі як середовище існування живих організмів. Найвагомішою для цього підставою є високі значення твердості води, які характеризуються сумарним числом мг еквівалентів Ca²⁺ та Mg²⁺ в 1л води. Серед сполук металів, які впливають на процеси самоочищення водойм, проаналізовані концентрації Mn²⁺, Fe²⁺, Mg²⁺, K⁺, Na⁺, Zn²⁺. Відомо, що іони Zn²⁺ гальмують біохімічні процеси самоочищення і всі ці елементи знижують біологічне використання кисню.

Привертає увагу висока концентрація сірководню у воді досліджуваної водойми. Оскільки наявність сірководню у верхніх шарах водойм неприпустима, виникає необхідність постійного контролю вмісту цієї сполуки.

У 2006 році концентрація сірководню у воді озера “Яворівське” становила 20 - 50 мг/л. Коливання цієї величини є результатом взаємовпливу різних факторів даної біосистеми і, певною мірою, унеможливлює точний розрахунок перспективи детоксикації.

Тим не менш, виходячи з того, що глибина кар'єру сягає 100 м, а площа затоплення 1080 га, беручи до уваги, що виділені зелені сіркобактерії утилізують в середньому 4 мМ сірководню протягом семи діб, приблизний час детоксикації сірководню у озері “Яворівське” становитиме декілька десятиліть. Звісно, необхідно постійно враховувати багатогранність і взаємопов'язаність багатьох чинників в окремій біосистемі під час процесу самоочищення водойми.

Чисельність та основні таксономічні групи мікроорганізмів у досліджуваних водоймах. Оскільки показник загальної чисельності мікроорганізмів служить індикатором екологічного стану окремих едафотопів нами проведені дослідження основних груп мікроорганізмів озера “Яворівське”. Для оцінки якісного складу мікрофлори та його зміни в досліджуваній водоймі обрано природню водойму на території заповідника „Розточчя", що на Яворівщині. Отримані дані з контрольної водойми ми порівнювали з даними техногенної водойми. Виявилось, що в озері “Яворівське” домінуючою мікрофлорою є сапрофіти. Привертає увагу висока чисельності сульфатвідновлюваних бактерій, що пояснюється, очевидно, підвищеним сульфатним забрудненням води. Особливою ознакою є присутність фототрофних, а власне зелених сіркових бактерій у воді озера “Яворівське”. Слід відмітити, що їх кількість у воді озера не є значною Висока кількість сульфатвідновлюваних бактерій тісно пов'язана з попередньою діяльністю підприємства та теперішніми роботами із затопленням озера. У контрольній водоймі, за яку служила природна водойма джерельного типу на території заповідника „Розточчя", склад мікрофлори відмічався характерною підвищеною кількістю сапрофітів та олігонітрофілів, та слідовими кількостями сульфатвідновлюваних бактерій та фототрофів.

Проведений нами аналіз загальної чисельності мікроорганізмів у досліджуваних водоймах вказує на створення своєрідного мікроценозу, який характеризується переважанням типових сапрофітів і олігонітрофілів. У мікробному ценозі озера “Яворівське”, що заповнюється водою, виявлені фотосинтезувальні зелені сіркові бактерії, які здатні здійснювати детоксикацію сірководню у воді.

Таким чином, встановлено, що домінуючими мікроорганізмами у воді та мулі озера “Яворівське” є типові сапрофіти та олігонітрофіли. Чисельність фототрофних сіркобактерій у воді та мулі озера значно перевищує кількість цих організмів у контрольній водоймі.

Одержання нагромаджувальних культур зелених сіркобактерій, виділення C. limicola Ya-2002. Із води озера “Яворівське” виділені нагромаджувальні культури зелених сіркобактерій. Найкращі ростові характеристики та стабільність при пересівах виявляла лише одна культура.

Для виділення чистої культури зелених сіркобактерій ми використали посів на чашки Петрі, які поміщали в анаеростати і культуру вирощували в присутності кисеньадсорбуючих генераторів при освітленні через інтерференційний фільтр і при температурі 28-30 С°. Посів здійснювали на поверхню агаризованого середовища Ван Ніля. Для отримання чистої культури відбирали окремі колонії з повторним їх посівом на агаризоване середовище Ван Ніля у чашки Петрі з використанням анаеростатів. На основі одержаних морфофізіологічних властивостей та їх порівнянням з даними визначника Берджі виділений штам ідентифікували як Chlorobium limicola Ya-2002* (рис. 1).

Ідентифікація пігментів зелених сіркобактерій C. limicola Ya-2002. Здатність мікроорганізмів використовувати енергію світла обумовлена наявністю у них специфічних пігментів - бактеріохлорофілів і каротиноїдів. Для вивчення природи фоторецепторних пігментів використовують адсорбційний аналіз, який ґрунтується на існуванні пропорційної залежності між світло поглинанням досліджуваної речовини, її концентрацією і товщиною шару що поглинає. На рис. 2. наведений спектр поглинання інтактних клітин
C. limicola Ya-2002. Його характер (максимум поглинання в області 400 - 450нм та 750нм) свідчить про наявність в клітинах каротиноїдів та бактеріохлорофілів

Хроматографічне розділення екстрактів показало чіткі забарвлені зони на хроматограмах. Виділено чотири переважаючих пігментних зони (рис. 3). Їх Rf подано в (табл. 1).

Таблиця 1

Властивості пігментів зелених сіркобактерій C. limicolа Ya-2002

Пігменти зелених сіркових бактерій C. limicolа Ya-2002	Забарвлення	Rf	Ідентифікація	Максимуми адсорбції пігментів у інтактних клітинах, нм	Максимуми адсорбції екстрагованих пігментів, нм
1	Яскраво-жовте	0,90	Хлоробактин	458	430
2	Коричнево-рожеве	0,86	Ізореріератин	512	466
3	Світло-зелене	0,60	Бактеріохлоро- філ d	725-745	650-655
4	Темно-зелене	0,46	Бактеріохлоро- філ с	745-760	660-668

Таким чином, в результаті проведених досліджень встановили природу фотосинтетичних пігментів C. limicola Ya-2002 та ідентифікували їх з бактеріохлорофілами с і d та каротиноїдами - хлоробактином та ізореніератином.

Вплив екологічних чинників на розвиток культури C. Limicola Ya2002. Максимуми поглинання більшості перелічених бактеріохлорофілів знаходяться в червоній та інфрачервоній областях спектру, тому вирощування зелених сіркобактерій, за умов освітлення лампами денного світла не є достатньо ефективним із-за неселективності світлових променів (Scheer, 1991). Виходячи з того, що в клітинах C. limicola Ya-2002 нами виявлені та ідентифіковані бактеріохлорофіли с та d, які поглинають світло з довжиною хвилі 745-760 та 725-745нм в наступних експериментах ми перевірили як впливають на ріст досліджуваної культури промені з різною довжиною хвилі. Для цього використовували інтерференційні фільтри (рис. 4).

Виявилось (рис. 4), що найбільш доцільно використовувати червоний світлофільтр, який пропускає світлові промені з довжиною хвилі 700-800 нм.

В наступних експериментах вирощування бактерій здійснювали за умов використання саме такого світлофільтра.

Процес нагромадження біомаси, зеленими сіркобактеріями залежить не лише від спектральної характеристики світлових променів, але і від інтенсивності світлового потоку. На рис. 5 показаний вплив інтенсивності освітлення на ріст клітин C. limicola Ya-2002.

Дані цього експерименту показують, що інтенсивність освітлення відіграє важливу роль у процесі росту досліджуваних бактерій. Найбільш інтенсивно ріст культури відбувався при слабкому освітленні, інтенсивність якого не перевищувала 40 лк.

Замість води в процесі фотосинтезу, зелені сіркобактерії використовують більш відновлені сполуки такі як, сірководень, тіосульфат, тритіонат та молекулярну сірку. При цьому за природою використання донора електронів, різні види суттєво відрізняються. Побічним продуктом у процесі фотосинтезу у цих бактерій є сірка або сульфати (Оvermann, 1997; Оvermann, 2001). На рис. 6 показано ріст C. limicola Ya-2002 на середовищі з різними відновленими сполуками сірки.

Таким чином виділені нами зелені сіркобактерії C. limicolа Ya-2002 найбільш ефективно використовують у процесі аноксигенного фотосинтезу сірководень. Молекулярна сірка та тіосульфат не використовуються виділеною культурою в якості донорів електронів.

Вплив чинників середовища на інтенсивність детоксикації H2S

C. limicola Ya 2002. Показано, що найбільший рівень нагромадження біомаси бактерій спостерігається в присутності у середовищі 3-5 мМ сірководню. Подальше зростання вмісту сульфіду в середовищі не сприяло збільшенню біомаси, а навпаки супроводжувалось пригніченням росту культури.

Встановили, що інтенсивність освітлення суттєво впливає на швидкість використання сірководню клітинами (рис. 8). Максимальна швидкість утилізації сірководню спостерігалась при інтенсивності освітлення у 40 лк. Збільшення цього показника призводило до зниження темпів використання сірководню. Швидкість його утилізації при інтенсивності освітлення в 40 лк становила 0,021 мМ/год/100мг клітин і була у сім раз вищою ніж, у контрольному варіанті.

В наступних експериментах було встановлено закономірності утилізації сірководню C. limicolа Ya-2002 за умов різної концентрації СО2 в середовищі культивування (рис. 9).

Виявилось, що за оптимальних умов освітлення і концентрації СО2 в середовищі (10г/л) культура повністю використовувала сірководень протягом 6 діб культивування. Швидкість утилізації сірководню за цих умов становила 0,028 мМ/год/100мг клітин, і була у дев'ять раз вищою, ніж у контрольному варіанті.

Результати цих експериментів показали, що за інтенсивності освітлення 40лк і максимальній концентрації вуглекислоти в середовищі, культура утилізувала 4 мМ Н2S протягом 6 діб культивування, що у 8 раз перевищувало контроль.

Внесення в середовище з гідрокарбонатом натрію, додаткових джерел вуглецевого живлення таких як глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза, піруват, ацетат не супроводжувалось зміною використання сірководню. І лише у випадку одночасного додаткового внесення у середовище пірувату та ацетату спостерігали посилення утилізації сірководню клітинами C. limicola Ya-2002 (рис. 10).

Таким чином, за оптимальних умов культивування: освітлення інтенсивністю 40лк, концентрації вуглекислоти 10 г/л і при додаванні пірувату та ацетату у середовище клітини C limicola Ya-2002 повністю використовують сірководень в кількості 4 мМ на 6-7 добу культивування.

У зв'язку з цим дослідили, як впливає на ріст культури і використання сірководню його додаткове внесення в середовище.

Виявилось (рис. 11), що додаткове внесення H2S до культури, що знаходиться в фазі сповільненого росту, причиною якого було вичерпання сірководню, відновлює ріст культури і інтенсивне використання сірководню.

На рис. 12, показано динаміку засвоєння сірководню відмитими клітинами C. limicola Ya-2002 за умов періодичної зміни світла і темряви. На світлі відбувається швидке використання Н2S, в той час як при інкубації в темряві рівень сірководню в інкубаційній суміші не змінюється.

Дані цього експерименту показують, що основним регулятором використання Н2S, як донора електронів є енергія світла.

Встановлено, що індуктором використання сірководню клітинами C. limicola Ya-2002 є світло.

Синтез та дисиміляція глюкози зеленими фотосинтезувальними сіркобактеріями C. limicolа Ya-2002. Виявилось, що сумарна кількість редукуючих цукрів визначених за методом Шомоді-Нельсона практично не відрізнялась від показника одержаного специфічно для глюкози.

З цього випливає, що редукуючі цукри C. limicolа Ya-2002 представлені виключно глюкозою, яка є першим вуглеводом, який утворюється в процесі фотосинтезу (рис. 13).

В наступних експериментах досліджували динаміку нагромадження внутрішньоклітинної глюкози бактеріями С. limicolа Ya-2002 в процесі росту. Виявилось (рис. 14), що утворення глюкози в клітинах спостерігається протягом усього періоду росту і завершується при переході культури у стаціонарну фазу.

Виділення, ідентифікація та закономірності нагромадження поліцукриду C. limicola Ya-2002. Щоб перевірити здатність C. limicola Ya-2002 утворювати поліцукриди, була проведена їх екстракція з клітин за методом (Frigaard, 1996 ). Вирощені за умов освітлення клітини суспендували в оцтовій кислоті. Осад поліцукриду отримували шляхом додавання до супернатанту концентрованого етанолу. Одержаний осад гідролізували 10Н Н2SO4, отриманий гідролізат розділяли за допомогою хроматографії. Як свідки використовували глюкозу, ксилулозу і галактозу. Після проявлення хроматограм виявлена лише одна пляма, яка повільно рухалась в системі бутанол - вода і за величиною Rf була ідентична глюкозі. З цього випливає, що поліцукрид, який нагромаджується в клітинах C. limicola Ya-2002, є поліглюкозидом.

Оскільки в літературі (Overmann, 1999; Гусев, 1999) зустрічаються повідомлення, що представники Chlorobium утворюють глікоген, ми екстрагували поліцукрид методом Захарової-Косенко (Захарова, 1982 ), що є специфічним для осадження бактерійного глікогену. Порівняльний аналіз виділеного поліцукриду та глікогену фірми “Sigma” показав, що отриманий зразок проявляє ідентичні хімічні та фізичні властивості: білий кристалічний порошок розчинний у воді, не розчинний у етиловому спирті, гідролізується у кислому середовищі з утворенням глюкози.

Інфрачервона спектрометрія етилацетатної витяжки досліджуваного зразка та глікогену фірми “Sigma” показала, що ці речовини є ідентичними (рис. 15).

Аналіз продуктів катаболізму глюкози, одержаних після їх осадження сумішю (ацетон - петролейний ефір) із середовища показав, що при інкубації клітин у темряві в середовищі нагромаджуються органічні сполуки про що свідчить їх елементний аналіз ( С- 40,25%, Н- 4,5%, N-0%).

Інфрачервона спектрометрія етилацетатної витяжки показала, що ці речовини характеризуються наявністю О-Н зв'язків (інтервал 3608 - 3056

см^-1), СН3-СН2 зв'язків (1456см^-1), і специфічним поглинанням в області карбонільної (1656 см^-1) та метильної групи ( 2920 см^-1), а також R-COOH груп (2700 см^-1) та інші, що свідчить про наявність в культуральній рідині карбонових кислот (рис. 16).

За умов інкубації відмитих клітин C. limicolа Ya-2002 на світлі утворення органічних сполук в культуральній рідині не спостерігалось, а загальний вміст глюкози, після гідролізу глікогену, суттєво не відрізнявся від контрольного варіанту.

На рис. 17 показано динаміку зміни концентрації глюкози (після гідролізу глікогену) і нагромадження карбонових кислот при інкубації клітин C. limicolа Ya-2002 у темряві.

Таким чином, синтезовані в процесі фотосинтезу клітинами C. limicolа Ya-2002 глюкоза та глікоген відіграють важливу роль у життєдіяльності цих бактерій при їх перебуванні на світлі і в темряві. У першому випадку у процесі фотоасиміляції СО2 спостерігається нагромадження глюкози та її перетворення в глікоген. В темряві глікоген деполімеризується до глюкози, катаболізм якої забезпечує енергетичний і конструктивний метаболізм зелених сіркових бактерій.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі теоретично обґрунтовано та комплексними дослідженнями показана екологічна роль фотосинтезувальних зелених сіркових бактерій в утилізації токсичного сірководню, концентрація якого в сотні разів перевищує ГДК у воді озера “Яворівське”.

1. Аналіз води озера “Яворівське”, показав, що вода містить підвищені кількості іонів К⁺ та Na⁺ в порівнянні з ГДК. Кількість сульфатів у 3,4 раза, а сірководню у 140 раз перевищує ГДК.

2. Чисельність мікроорганізмів основних таксономічних груп озера “Яворівське” бактерій і грибів, відповідно, становить 98,2 млн. КУО/мл та 16,5 млн КУО/мл води. Серед бактерій різних еколого-трофічних груп виявили олігонітрофіли 54,2 млн КУО/мл, нітрифікатори 3,5 млн КУО/мл, сульфатвідновлювальні бактерії 0,011 млн КУО/мл. Кількість фототрофних сіркобактерій становила 0,003 млн КУО/мл, що у 3 - 6 разів перевищує їхню кількість у контрольній водоймі.

3. Вперше із води озера виділена чиста культура зелених сіркобактерій, яка за морфофізіологічними ознаками ідентифікована як Chlorobium limicola Ya-2002. Бактерії не ростуть в темряві і за типом метаболізму є фотолітоавтотрофи, здійснюють аноксигенний фотосинтез, використовуючи сірководень як донор електронів. У клітинах бактерій містяться бактеріохлорофіли с і d, із пігментів каротиноїдної природи ідентифіковані хлоробактин і ізореніератин.

4. Вивчена аутекологія штаму C. limicola Ya-2002, оптимальні умови росту і розвитку якого: температура - 28-30⁰ С, рН - 6,8-7,0, відсутність вільного кисню у середовищі.

5. Найбільш інтенсивно в процесі фотосинтезу бактерії використовують промені світла з довжиною хвилі 700-800 нм. Донором електронів при цьому служить сірководень. Тіосульфат і сірка, як донори електронів не використовуються. Глюкоза, фруктоза, галактоза, мальтоза не використовуються бактеріями як джерело вуглецю. Піруват і ацетат стимулюють ріст бактерій. Як джерело азоту C. limicola Ya-2002 використовують амонійний і амінний азот. За їх відсутності бактерії здійснюють азотфіксацію. Нітрати пригнічують засвоєння атмосферного азоту.

6. Встановлено, що в процесі росту C. limicola Ya-2002 ефективно окислює сірководень. В присутності бактерій детоксикація Н₂S відбувалась у 7-8 разів швидше, ніж за їх відсутності. Найбільш ефективно окислення сірководню відбувається у середовищі з СО2, піруватом і ацетатом за невисокої інтенсивності освітлення. Додаткове внесення сірководню в процесі росту культури, стимулює її ріст. Концентрації сірководню більше 6мМ пригнічують ріст культури і викликають її відмирання.

7. Максимальна біомаса бактерій утворюється за наявності в середовищі 10 г/л СО2. Першим продуктом, асиміляції вуглекислоти, що нагромаджується в клітинах є глюкоза. ЇЇ присутність в клітинах виявлена протягом всього періоду росту. Максимальне нагромадження глюкози спостерігається за інтенсивності освітлення 40 лк та наявності донора електронів

8. В клітинах C. limicola Ya-2002 в процесі детоксикації сірководню, глюкоза перетворюється в глікоген, який нагромаджується як запасна речовина. За оптимальних умов фотосинтезу клітини нагромаджують до 120 мг глікогену / г клітин. Ступінь спорідненості глікогену C. limicola Ya-2002 з глікогеном печінки бика складає 90-95%.

9. Вперше встановлена, важлива регуляторна функція глікогену у підтриманні життєздатності клітин за різних екологічних умов. В дослідах з відмитими клітинами показано, що рівень глікогену в клітинах за умов темряви швидко понижується. В інкубаційному середовищі при цьому нагромаджуються - карбонові кислоти серед яких основним компонентом є ацетат. За умов освітлення рівень глікогену в клітинах не змінюється і карбонові кислоти у середовищі не виявляються.

Список опублікованих автором праць за темою дисертації

1. Горішний М.Б., Гудзь С.П., Федорович А.М Вплив факторів середовища на ріст і утворення полісахариду Chlorobium limicola // Вісн. Ужгород. ун-ту. Серія біологічна. 2007. Вип 20. С. 14-17 (Узагальнення літературних джерел, проведення експериментальної роботи, участь у написанні статті).

2. Горішний М.Б., Гудзь С.П., Гнатуш С.О Синтез та дисиміляція глюкози зеленими фотосинтезуючими сіркобактеріями Chlorobium limicolа // Вісн. Львів. ун-ту. Серія біологічна. 2007. Вип. 44. С. 115-120 (Проведення експериментальної роботи, аналіз та узагальнення літературних джерел, аналіз результатів, участь у написанні статті).

3. Горішний М.Б, Гудзь С.П, Гнатуш С.О. Вплив факторів середовища на швидкість використання H2S Chlorobium limicola // Агроекологічний журнал. 2007. Вип. 20. С. 22-27 (Аналіз та узагальнення літературних даних, проведення мікробіологічних досліджень, узагальнення та інтерпретація результатів, участь у написанні статті).

4. Горішний М.Б, Гудзь С.П. Вплив факторів середовища на швидкість використання сульфіду зеленими сіркобактеріями // Наукова конференція студентів аспірантів “Екологічні проблеми регіонів України''. Одеса, 2007. С. 121.

5. Горішний М.Б, Гудзь С.П. Про здатність Chlorobium limicola нагромаджувати полісахариди // Міжнародна конференція студентів і аспірантів”Молодь та поступ в біології”. Львів, 2007. С. 354.

6. Gorishniy M. Gudz C. Influence of environmental factors of the growth green sulfur bacteria Chlorobium limicola.//”Modern problem of microbiology and biotechnology”. Оdеsа, 2007. P 60.

7.Горішний М.Б, Гудзь С.П.Cинтез полісахаридів зеленими фотосинтезуючими сіркобактеріями Chlorobium limicola // ”Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution”. Оdеsа, 2007. P 40.

8. Горішний М.Б, Гудзь С.П Метаболізм СО₂ в клітинах зелених фотосинтезуючих сіркових бактерій Chlorobium limicolа Ya-2002 // 11-Пущінська школа конференція. Пущено Росія. 2007. С. 297.

9.Горішний М.Б, Гудзь С.П Синтез та дисиміляція глюкози зеленими фотосинтезуючими сіркобактеріями Chlorobium limicolа // Біологія: від молекули до біосфери. Харків 2007. С. 186.

АНОТАЦІЯ

Горішного М.Б. Екологічне значення зелених сіркових бактерій в утилізації сірководню. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.16 - екологія (біологічні науки). - Інститут агроекології УААН України, Київ, 2008.

Вперше досліджено антропогенний вплив на ситуацію в озері “Яворівське”. На основі відомих значень гранично допустимих концентрацій певних сполук, та в порівнянні з природним контрольним водоймищем, встановлено, що вода озера “Яворівське” за багатьма показниками є мало придатна для існування живих організмів.

Встановлено, що домінуючими мікроорганізмами у воді та мулі озера “Яворівське” є типові сапрофіти та олігонітрофіли. В мулі виявлена значна кількість сульфатвідновлюваних бактерій. Чисельність фототрофних сіркових бактерій у воді та мулі озера значно перевищує кількість цих організмів у контрольній водоймі. З води озера “Яворівське” виділено чисту культуру зелених фотосинтезувальних сіркобактерій які здійснюють детоксикацію сірководню. Виділені бактерії ідентифіковані як C. limicolа Ya-2002.

Досліджено, що клітини C. limicolа Ya-2002, містять наступні пігменти: бактеріохлорофіли с і d та каротиноїди хлоробактин і ізореніератин.

Показано, що максимальний ріст культури спостерігався при опроміненні червоним світлом довжиною хвилі 700-800нм за інтенсивності освітлення в 40лк. Інтенсивність освітлення культури викликає зміни у фотосинтетичному апараті клітин, зокрема у структурі хлоросом.

Встановлено, що клітини бактерій C. limicola Ya-2002 не використовують глюкозу, фруктозу, галактозу як джерело вуглецю та донор електронів. З усіх досліджуваних органічних джерел вуглецю, лише ацетат і піруват стимулюють ріст культури, за наявності СО2 та Н2S в середовищі.

C. limicola Ya-2002 здатні використовувати амонійний та амінний азот. За відсутності цих джерел бактерії здатні до азотфіксації. Нітратна форма азоту не використовується бактеріями. Додавання нітратів до середовища пригнічує процес азотофіксації.

Досліджено, що інтенсивність детоксикації сірководню зеленими сіркобактеріями зростала при одночасному внесенні у середовище пірувату та ацетату за умов наявності гідрокарбонату натрію. При культивуваннi C. limicola Ya-2002 в середовищі з вуглекислотою, піруватом та ацетатом і освітленні культури променями з довжиною хвилі 700-800 нм інтенсивністю 40 лк, спостерігалось максимальне використання сірководню 0,028 мМ/год/100мг клітин. Додаткове внесення Н2S у середовище культивування відновлювало ріст культури. Основним індуктором використання сірководню клітинами C. limicola Ya-2002 є світло.

Показано, що у C. limicola Ya-2002 першим вуглеводним продуктом в процесі асиміляції вуглекислоти є глюкоза, яка на світлі швидко перетворюється у глікоген, що був виділений з клітин C. limicola Ya-2002 та ідентифікований за допомогою інфрачервоної спектрометрії.

Вперше, досліджено умови нагромадження глікогену клітинами і показано, що ключову роль у цьому процесі відіграє освітлення культури, наявність СО2 та сірководню.

Вивчено, що синтезований клітинами глікоген відіграє важливу роль при зміні умов існування бактерій (світло-темрява). Відмиті клітини бактерій при інкубації на світлі не використовували глікоген, в той час як за умов темряви він швидко розщеплювався, а в середовищі нагромаджувались продукти його катаболізму - карбонові кислоти, серед яких переважав ацетат.

Ключові слова: водойма, зелені сіркові бактерії, сірководень, освітлення, вуглекислота, глікоген.

АННОТАЦИЯ

Горишного М.Б. Экологическое значение зеленых серных бактерий в утилизации сероводорода. - Рукопись.

Диссертация на получение научной степени кандидата биологических наук по специальноти 03.00.16 - экология (биологические науки). - Институт агроэкологии УААН Украины, Киев, 2008.

Впервые исследовано антропогенное влияние на ситуацию в озере “Яворовском”. На основе известных значений предельно допустимых концентраций определенных соединений, и по сравнению с естественным контрольным водоемом, установлено, что вода озера “Яворовского” по многим показателям мало подходящая для существования живых организмов.

Установлено, что доминирующими микроорганизмами в воде и муле озера “Яворовского” являются типичные сапрофиты и олигонитрофилы. В иле обнаруженное значительное количество сульфатвосстанавливающих бактерий. Численность фототрофных серных бактерий в воде и иле озера значительно превышает количество этих организмов в контрольном водойоме. Из воды озера “Яворовского” выделена чистая культура зеленых фотосинтезирующих серобактерий которые осуществляют детоксикацию сероводорода. Выделенные бактерии идентифицированы как C. limicolа Ya-2002.

Исследовано, что клетки C. limicolа Ya-2002, содержат следующие пигменты: бактериохлорофил с и d и каротиноиды хлоробактин и изорениератин.

Показано, что максимальный рост культуры наблюдался при облучении красным светом длиной волны 700-800нм при интенсивности освещения в 40лк. Интенсивность освещения культуры вызывает изменения в фотосинтетическом аппарате клеток, в частности в структуре хлоросом.

Установлено, что клетки бактерий C. limicola Ya-2002 не используют глюкозу, фруктозу, галактозу как источник углерода и донор электронов. Из всех исследуемых органических источников углерода, лишь ацетат и пируват стимулируют рост культуры, при наличии СО2 и Н2S в среде.

Исследовано, что интенсивность детоксикации сероводорода зелеными серобактериями росла при одновременном внесении в среду пирувата и ацетата при условиях наличия гидрокарбоната натрия. При культивировании C. limicola Ya-2002 в среде с углекислотой, пируватом и ацетатом и освещении культуры лучами с длиной волны 700-800 нм интенсивностью 40 лк, наблюдалось максимальное использование сероводорода 0,028 мМ/год/100мг клеток. Дополнительное внесение Н2S в среду культивирования возобновляло рост культуры. Основным индуктором использования сероводорода клетками C. limicola Ya-2002 является свет.

Показано, что у C. limicola Ya-2002 первым углеводным продуктом в процессе ассимиляции углекислоты является глюкоза, которая на свету быстро превращается в гликоген, что был выделен из клеток C. limicola Ya-2002 и идентифицированный с помощью инфракрасной спектрометрии.

Впервые, исследовано условия накопления гликогена клетками и показано, что ключевую роль в этом процессе играет освещение культуры, наличие СО2 и сероводорода.

Изучено, что синтезирований клетками гликоген играет важную роль при изменении условий существования бактерий (свет-темнота). Отмытые клетки бактерий при инкубации на свету не использовали гликоген, в то время как в условиях темноты он быстро расщеплялся, а в среде накапливались продукты его катаболизма - карбоновые кислоты, среди которых преобладал ацетат.

Ключевые слова: водойом, зеленые серные бактерии, сероводород, освещение, углекислота, гликоген.

ABSTRACT

Gorishniy M.B. Ecological Significance of Green Sulphur Bacteria in the Utilization of Sulphur Hydrogen. ? Manuscript.

...