Взаємодія трансгенних рослин картоплі з ґрунтовими мікроорганізмами

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Взаємодія трансгенних рослин картоплі з ґрунтовими мікроорганізмами

Автореферат

на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Картопля є цінною продовольчою, кормовою і технічною культурою в Україні. За обсягами виробництва картоплі наша країна займає четверте місце в світі (Куценко та ін., 2002). Разом з тим урожай і якість цієї культури в значній мірі лімітуються біотичними факторами, серед яких особливого значення набувають бур'яни, шкідники та збудники хвороб. Саме ці фактори вимагають застосування високого пестицидного пресу в агроекосистемах, що є причиною забрудненню навколишнього середовища ксенобіотиками (Kleter et.al., 2007). Тому, у всьому світі високими темпами розвиваються дослідження спрямовані на створення нових сортів картоплі, в тому числі і трансгенних, які характеризуються стійкістю до зазначених біотичних факторів. Але вирощування трансгенних сортів призводить до негативних екологічних наслідків, а саме: неконтрольованого поширення чужорідних генів та зменшення біорізноманіття ґрунтових мікроорганізмів (Nielsen et.al., 2000; Kay et.al., 2002), що в значній мірі може порушувати баланс корисних та шкідливих організмів в агроекосистемах і призводити до виникнення екологічних ризиків.

Контроль за такими ризиками є складним через недостатність знань про взаємодію трансгенних рослин з ґрунтовими мікроорганізмами. Аналіз літератури свідчить про відсутність методичних підходів по оцінці можливих ризиків та їх моніторингу при вирощуванні трансгенних рослин в агроекосистемах. Тому, вивчення особливостей їх взаємодії з мікробіотою ґрунту є актуальним і потребує створення спеціальних методичних підходів контролю за такими ризиками.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась згідно з тематичними планами Інституту агроекології УААН «Теоретично обґрунтувати і застосувати на практиці методи сільськогосподарської біотехнології для цілеспрямованого формування сталих агроекосистем» (номер державної реєстрації 0101U003296) та «Розробити науково методичне забезпечення оцінки рівня біологічної безпеки вирощування рослинної продукції в агроекосистемах» (номер державної реєстрації 0106U04046).

Мета і завдання дослідження. Метою нашої роботи було встановити особливості взаємодії трансгенних рослин картоплі з мікроорганізмами та дослідити можливі екологічні ризики при вирощуванні таких рослин.

Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні завдання:

· створити модельні трансгенні рослини картоплі сортів вітчизняної селекції для вивчення їх взаємодії з мікроорганізмами;

· удосконалити методи ідентифікації генетичних конструкцій в трансгенних рослинах;

· дослідити динаміку деградації рекомбінантної ДНК в рослинних рештках трансгенних рослин картоплі під впливом мікроорганізмів дерново-середньопідзолистого ґрунту;

· вивчити взаємодію трансгенних рослин картоплі та рекомбінантної бактерії A.tumefaciens з ґрунтовими мікроорганізмами.

Об'єкт дослідження - взаємодія трансгенних рослин картоплі з ґрунтовими мікроорганізмами.

Предмет дослідження - трансгенні рослини картоплі та ґрунтові мікроорганізми.

Методи дослідження - молекулярно-генетичні методи, а саме: методи культури тканин in vitro та генетичної трансформації рослин, методи виділення препаратів плазмідної і рослинної ДНК з проведенням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), рестрикційний аналіз; методи біоконтролю інтеграції генетичної конструкції в рослини; гістохімічні методи; мікробіологічні методи; методи статистичного аналізу.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше створено трансгенні рослини на основі перспективних сортів вітчизняної селекції Бородянська рожева, Сєднєвська рання, Радич, Чернігівська рання, Билина, Загадка, Червона рута для вивчення їх взаємодії з ґрунтовими мікроорганізмами в агроекосистемах.

Вперше виявлено взаємодію між рекомбінантним штамом A.tumefaciens GV2260 та фітопатогенною бактерією P.fluorescens 7769. Показано можливість виникнення екологічних ризиків у разі вивільнення персистентних рекомбінантних форм A.tumefaciens GV2260 з трансгенних рослин в навколишнє середовище.

Виявлено, що під впливом ґрунтової мікрофлори у дерново-середньопідзолистому ґрунті картопляної сівозміни в рештках трансгенних рослин картоплі відбувається деградація ДНК і генів конструкції npt II і 35S.

Встановлено диференціацію трансгенних клонів картоплі за впливом на чисельність гриба Fusarium oxysporum. Виявлено трансгенні клони, що здатні знижувати або підвищувати чисельність популяції фітопатогенного гриба на бульбах.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблені методичні підходи до створення трансгенних рослин картоплі за участю A.tumefaciens можуть бути використані в селекційних центрах України з метою створення трансгенних сортів картоплі вітчизняної селекції та вивчення їх взаємодії з ґрунтовими мікроорганізмами в агроекосистемах.

Основний зміст роботи

трансгенний деградація картопля генетичний

Огляд літератури. На підставі узагальнених даних літератури описано особливості отримання, ідентифікації та взаємодії трансгенних культур з мікроорганізмами. На основі аналітичного огляду наукової літератури виявлено ризики, які можуть виникати при вирощуванні трансгенних культур в агроекосистемах та обґрунтовано необхідність проведення досліджень за темою дисертації.

Матеріали і методи досліджень. Для дослідження взаємодії трансгенних рослин картоплі з ґрунтовими мікроорганізмами використовували перспективні сорти картоплі вітчизняної селекції - Бородянська рожева, Сєднєвська рання, Радич, Чернігівська рання (Інститут мікробіології УААН, м. Чернігів) Билина, Загадка, Червона рута (Інститут картоплярства УААН, с.м.т. Немішаєво), на основі яких створювали трансгенні рослини даних сортів. В експериментах з отримання трансгенних рослин також застосовано рекомбінантний бактеріальний штам Agrobacterium tumefaciens pGV2260, в клітинах якого підтримувалась плазміда p35SGUSINT з послідовністю ДНК інтроної ділянки в гені gus (Vanccanet et. al., 1990). У дослідженнях також використали культури: Pseudomonas fluorescens 7769 (колекція Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ), Methylobacterium radiotolerans ІМБГ290 (колекція культур Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ) та Fusarium oxysporum (колекція Інституту агроекології УААН).

Культивування рослин картоплі в умовах in vitro проводили на безгормональному середовищі МС (Murashige and Skoog, 1962). Рослини-регенеранти розмножували методом клонального мікророзмноження (Мусієнко та ін., 2001)

Наявність ферменту в-глюкуронідази (GUS) в тканинах трансгенних рослин, визначали за методикою (Jefferson et. al., 1987). Експресію гена nptII аналізували за загальноприйнятими методиками (Дрейпером та ін. 1991).

Плазмідну ДНК виділяли методом лужного лізису (Дрейпер та ін. 1991), а загальну бактеріальну ДНК - загально прийнятими методиками. Виділення тотальної ДНК з рослин картоплі культивованих в умовах in vitro та підготовку до аналізу проводили за методикою (Самбрук та ін., 1989). Виділення і очистку тотальної ДНК з рослинних решток трансгенних рослин картоплі проводили з використанням набору реактивів Genomic DNA Purification Kit (Ферментас, Латвія), а бактеріальної - за допомогою наборів реагентів UltraClean ^TM (MoБio Iнк., США).

Визначення наявності генів генетичної конструкції, яка входить до складу плазмідної ДНК A. tumefaciens pGV2260, проводили за допомогою праймерів до послідовності генів: nptII (Miguel et.al., 1999), gus (Mendes et.al., 2002) і промоторної ділянки 35S гену мозаїки цвітної капусти (Стороженко та ін., 1994).

Виявлення неспецифічного метилювання гену gus в продуктах ПЛР та гену gus з трансгенних рослин картоплі, проводили шляхом очищення даних продуктів з використанням набору реактивів UltraClean ^TM PCR Clean-up DNA (MoБio Iнк., США) та їх обробки ферментами Msp I і Hpa II (Fojtova, 2006).

Для виявлення можливості прямого горизонтального переносу гену nptII від трансгенних рослин картоплі до бактерій використовували інокуляцію рослин картоплі вирощених в умовах in vitro культурами P.fluorescens 7769, M.radiotolerans ІМБГ290 з титром клітин 1х10⁸-1х10⁹, час експозиції 5 хв. Рослини картоплі вирощували на агаризованому безгормональному поживному середовищі МС. Встановлення горизонтального переносу гену nptII від рослин до бактеріальних культур проводили шляхом висіву розтертих тканин трансгенних рослин картоплі на селективне середовище LB (Маниатис и др., 1984) для P.fluorescens 7769 та КВ (Романовская, 1996) для M.radiotolerans ІМБГ290. Середовища як селективний фактор містили канаміцин в концентрації 10 мг/л.

Антагоністичну активність культур P.fluorescens 7769 і A.tumefaciens pGV2260 визначали за методикою описаною Н.С. Єгоровим (Егоров, 1957).

Появу транскон'югатів серед бактеріальних культур P.fluorescens 7769 і A.tumefaciens pGV2260 визначали методом граничних розведень. Розведення розтертих тканин рослин (Аникиев, 1983; Звягинцев, 1991) і суспензію ґрунту висівали на селективне середовище LB (Маниатис и др., 1984), що містило 10 мг/л канаміцину (Км) і 10 мг/л цефотаксиму (Сх).

Для підтвердження того, що отримані транскон'югати P.fluorescens 7769, набули стійкості до канаміцину, проводили їх ідентифікацію з використанням специфічних праймерів до варіабельної ділянки гену 16S рРНК (Jonsen et.al., 1999). Для ідентифікації транскон'югатів A.tumefaciens pGV2260 проводили висів на селективне середовище LВ з додаванням рифампіцину в концентрації 50 мг/л (Пирузян, 1988).

Зразки ґрунту відбирали у картопляній сівозміні по попереднику озима пшениця на дослідному полі Інституту картоплярства УААН: тип ґрунту - дерново-середньопідзолистий (супіщаний, рН_KCl=4,8; гумус - 1%). Для визначення деструкції решток трансгенних рослин картоплі і деградації їх ДНК під впливом мікрофлори ґрунту, модифікували метод Крістенсена (Звягинцев, 1991). З цією метою целюлозу фільтрувальних дисків замінювали субстратом із рослинних решток. Кількісну оцінку деградації рослинної ДНК і генів nptII, 35S здійснювали на спектрофотометрі ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc., США).

Штучне зараження дисків бульб картоплі проводили грибом Fusarium oxysporum з титром конідій 6,25х10⁶ кл/мл (Куценко, 2002). Накопичення інфекційних структур гриба Fusarium oxysporum на дисках бульб картоплі визначали за масою міцелію та кількістю утворених конідій (ДСТУ 4138 - 2003).

Обробку одержаних результатів проводили методами математичної статистики (Доспехов, 1985; Лакин, 1990) та з використанням стандартних комп'ютерних програм Microsoft Excel i Statistica 6,0.

Особливості отримання трансгенних рослин картоплі та їх ідентифікація. Особливості регенерації пагонів із тканин картоплі сортів вітчизняної селекції. Доступних для проведення досліджень трансгенних сортів картоплі в Україні не існує, тому першим етапом роботи було створення колекції трансгенних рослин картоплі сортів вітчизняної селекції. Для отримання таких модельних трансгенних рослин на першому етапі були оптимізовані умови регенерації пагонів в культурі тканин in vitro для різних сортів картоплі.

З цією метою для індукції органогенезу і отримання рослин з експлантів тканин картоплі використовували базові середовища: Г.В. Рассадіної та ін., (1988); В.А. Сідорова та ін., (1985); В.А. Аветісова та ін., (1991). Найвища частота і ефективність регенерації пагонів спостерігалась на середовищах за прописами Рассадіної та ін. (1988) та Сидоровим та ін. (1991) (табл. 1).

Таблиця 1. Ефективність регенерації пагонів в культурі тканин картоплі за різних умов культивування^*

^*Примітка. А - контроль - умови регенерації за Рассадіної та ін.; B - умови регенерації за Сідоровим; D - оптимізовані умови регенерації рослин.

На основі відібраних середовищ були оптимізовані поживні середовища, що містили різні співвідношення фітогормонів: 0,5 мг/л БАП і 2 мг/л 2,4Д - для отримання первинного калюсу; 0,7 мг/л зеатину і 0,1 мг/л ІОК - для індукції органогенезу і отримання рослин. Як свідчать результати досліджень, частота та ефективність регенерації пагонів на модифікованих нами середовищах були вищими порівняно з відомими варіантами (табл. 1).

З метою створення трансгенних рослин для різних генотипів картоплі вітчизняної селекції використано A. tumefaciens GV 2260, що містила вектор на основі плазміди p35SGUSint. Ефективність трансформації оцінювали, після зняття рослин-трансформантів із експлантів листків і міжвузль, по рівню експресії гену gus. За отриманих результатів досліджень були оптимізовані умови регенерації, що забезпечують високий рівень трансформації генетичної конструкції (від 69% до 98%), який залежить від конкретного генотипу картоплі. Апробація способу створення трансгенних рослин картоплі на різних сортах картоплі показала його достатню ефективність (табл. 2).

Таблиця 2. Ефективність трансформації рослин-регенерантів сортів картоплі вітчизняної селекції

На основі підібраних нами умов культивування соматичного органогенезу було розроблено та запатентовано спосіб отримання трансгенних рослин з використанням A.tumefaciens GV 2260.

Виявлення інтеграції генів конструкції p35SGUSint до геному трансгенних рослин картоплі. Моніторинг присутності генетичних конструкцій в сільськогосподарських культурах здійснюється методами, які здатні детектувати і ідентифікувати послідовності чужорідної ДНК в досліджуваному зразку. Як правило це методи, що базуються на аналізі ДНК чи білків, як базових складових трансгенних рослин.

ПЛР-аналізом з використанням праймерів до генів 35S, gus і nptII підтверджено трансгенний статус отриманих рослин-трансформантів картоплі. Але, зазначений процес тривалий і займає приблизно 5 годин для визначення одного гену в зразку. Тому, нами розроблено умови проведення ПЛР з використанням праймерів, як до гену nptII так і 35S, тобто з виявленням двох генів в одній пробі одночасно. В результаті були розроблені умови виявлення двох генів в одній пробі за один цикл ПЛР.

Отже, ідентифікацію генетичних конструкцій в трансгенних рослинах картоплі можна здійснювати розробленим нами способом, який базується на ПЛР з одночасним визначенням 2-х генів в одній пробі, що скорочує термін проведення аналізу вдвічі та зменшує кількість реактивів на його проведення, а отже суттєво знижує собівартість процесу.

Біоконтроль прояву репортерного гена gus та селективного гена nptII при вегетативному розмноженні трансгенних рослин картоплі in vitro. Результати гістохімічного аналізу показали, що трансгенні рослини картоплі відрізняються за експресією гена gus. Так, в межах одного сорту спостерігали рослини з різною експресією гена gus. Найкращі показники експресії гена мали сорти картоплі Билина, Радич, Чернігівська рання. Крім того, серед отриманих рослин були виявлені клони трансгенних рослин, в яких інтеграція гену підтверджена, але його експресія відсутня.

З метою встановлення причин відсутності прояву гена проведено ПЛР аналіз на наявність гену gus з наступною рестрикцією продуктів ампліфікації. З цією метою були використані рестриктні ендонуклеази MspI і HpaII, які використовують для визначення метильованих сайтів ДНК.

Як свідчать результати досліджень, в процесі трансформації і подальшої регенерації досліджуваних рослин картоплі може відбуватись неспецифічне метилювання ДНК інтегрованих чужорідних генів в геномі трансгенних рослин. Це може призводити до зміни заданих фізіолого-біохімічних властивостей трансгенних рослин.

Отже, при отриманні трансгенних рослин необхідно проводити біоконтроль кожного створеного клону для виявлення відхилень у прояві інтродукованих генів.

Встановлено, що трансгенні рослини картоплі також відрізняються за експресією гена nptII, та диференціюються за здатністю утворювати корені на поживному середовищі з додаванням у якості селективного фактору канаміцину.

У межах одного генотипу клони відрізнялись за здатністю розвиватися на селективному поживному середовищі. Так, рослини клонів сортів Радич, Чернігівська рання, Билина, Загадка і Червона рута характеризувались високою здатністю розвиватися під селективним тиском порівняно з рослинами трансгенних клонів сортів Сєднєвська рання і Бородянська рожева. Даний факт свідчить про можливий різний характер інтеграції генів при трансформації, а також про знижену експресію інтегрованих в геном нових трансгенних рослин генів. Схожі приклади мозаїчного характеру експресії для гена npt II що проявляються у вигляді чергуванням ділянок рослинних тканин з активним і неактивним трансгеном в умовах селективного середовища показані на рослинах тютюну (Маренкова та ін, 2007)

Таким чином, на даному етапі створено колекцію клонів трансгенних рослин, що містять генетичну конструкцію p35SGUSint для семи сортів картоплі вітчизняної селекції. Отримані клони проаналізовано за інтеграцією генів та їх експресією. Відібрано трансгенні клони, які характеризуються високою та середньою експресією інтегрованих генів, для проведення подальших досліджень їх взаємодії з ґрунтовими мікроорганізмами.

Деградація ДНК в рослинних рештках трансгенних рослин картоплі під впливом целюлозоруйнівних мікроорганізмів дерново-середньопідзолистого ґрунту. Однією з умов природної трансформації ґрунтової біоти є присутність у ґрунті нативної рекомбінантної ДНК. Від її стабільності залежить здатність до обміну генетичним матеріалом між трансгенними рослинами і ґрунтовими мікроорганізмами. Така ДНК, як джерело для трансформації, може надходити в ґрунт із відмерлих решток трансгенних рослин або виділятися трансгенними рослинами в навколишнє середовище з ексудатами. Рештки трансгенних рослин, потрапляючи в ґрунт, також піддаються деструкції. За даними ряду авторів ДНК в рослинних рештках швидко руйнується (Widmer, 1996).

Виходячи з зазначеного вище дослідження були спрямовані на визначення деградації ДНК в рештках трансгенних рослин картоплі сорту Радич.

Встановлено, що деструкція решток трансгенних рослин картоплі уже на 30 добу складала 87,14±1,11%, що на 7% вище від контролю. Це свідчить про значний вплив мікробіоти дерново-середньопідзолистого ґрунту на деструкцію решток трансгенних рослин.

При визначені ДНК в таких рештках для картоплі сорту Радич, було виявлено поступове зменшення її концентрації. Так встановлено, що вже через 1 добу перебування решток під шаром дерново-середньопідзолистого ґрунту концентрація тотальної ДНК зменшилась майже на 28% (1128 нг/мг). Через 10 діб експозиції втрата ДНК становила 64% (569 нг/мг). На 30 добу - концентрація ДНК знизилась до 88% (186 нг/мг) сирої маси рослинних решток, в той час як в контролі її концентрація складала понад 66% (500 нг/мг).

Схожі результати отримано при визначенні концентрації гену nptII і 35S промотора, які входять до складу генетичної конструкції (рис. 5 б). Зокрема, деградація цих генів в рештках трансгенних рослин під впливом мікрофлори ґрунту відбувалась вже на 7 добу. Протягом цього періоду nptII ген деградував на 50,4% (74,7 нг/мг), а 35S ген після відповідного експонування - на 47,7% (49,9 нг/мг). Слід відмітити, що у контрольному варіанті деградацію цих генів спостерігали лише на 20 добу. При цьому ген nptII деградував на 33,2% (100,5 нг/мг), а ген 35S - 16,5% (39,7 нг/мг). На 30 добу деградація генів по варіантах сягала 90%.

Електрофоретичний розподіл в агарозному гелі продуктів ампліфікації генів nptII і 35S показав їх відсутність порівняно з контролем. Це свідчить про їх суттєву деградацію в ДНК на 20 добу експозиції.

Отримані результати свідчать, про важливу роль ґрунтової мікрофлори у процесі деструкції трансгених рослинних решток картоплі. Концентрація тотальної ДНК і генів nptII та 35S значно зменшуються вже на 20 добу експозиції. Через 30 діб перебування решток трансгенних рослин картоплі в дерново-середньо підзолистому ґрунті деградація генів nptII та 35S становить майже 90%.

Дослідження взаємодії трансгенних рослин картоплі і рекомбінантної бактерії A.tumefaciens pGV2260 з ґрунтовими мікроорганізмами.

Дослідження можливості прямого горизонтального переносу npt II гену від трансгенних рослин картоплі до культур P. fluorescens 7769 та M. radiotolerans ІМБГ 290. З літератури відомо, про можливе перенесення генів від транспластомних (трансгенних по хлоропластам) рослин тютюну до бактерій R.solanacearum і Acinetobacter sp. BD413, якими дані рослини були інокульовані (Kay et.al 2002). Відомо також, що тканини рослин в тому числі, і ті, що культивуються в умовах in vitro, заселені ендофітною мікрофлорою (Rosenblueth et.al, 2006). Ендофітні бактерії, порівняно з вільноіснуючими, утворюють стабільніші асоціації з рослиною і виживають у рослинних тканинах протягом всього часу вегетації (Козировська, 2001; Подоліч, 2008). Бактерія M.radiotolerans ІМБГ 290, яка тісно асоційована з рослинами картоплі, колонізує всі органи рослин (Подоліч О.В., та ін. 2007) і здатна тривалий час зберігатися у тканинах вегетативних органів рослин навіть після клонального мікророзмноження, утворюючи досить стійкий асоціативний зв'язок з рослинами картоплі. Тому ми вважали за доцільне дослідити можливість виникнення прямого горизонтального переносу (від рослин до бактерій) гену nptII від трансгенних рослин картоплі до культур M.radiotolerans ІМБГ 290 і P.fluorescens 7769.

Черенки рослин сорту Загадка, які культивувались в умовах in vitro були інокульовані суспензіями M.radiotolerans ІМБГ 290 та P.fluorescens 7769 з титром клітин 1х10⁹кл/мл. На 42 добу після висадки інокульованих експлантів картоплі на поживне середовище МС, проводили аналіз чисельності кожного з штамів інтродукованих бактерій в рослинах картоплі. В результаті мікробіологічного аналізу інокульованих тканин рослин встановлено, що колонізація їх культурою M.radiotolerans ІМБГ 290 складає 3,4х10³ КОУ/г сирої маси рослин, а культурою P.fluorescens 7769 - 5,3х10⁴ КОУ/г сирої маси рослин. Тоді, як при висіві рослинної суспензії на селективне середовище КВ, з внесенням 10 мг/л канаміцину, ріст культури M.radiotolerans ІМБГ 290 не виявлено. Схожі результати отримано при висіві культури P.fluorescens 7769 на селективне середовище LB з додаванням 10 мг/л канаміцину.

За результатами висіву розтертих тканин картоплі з рослинних решток сорту Билина, інокульованих M.radiotolerans ІМБГ 290, P.fluorescens 7769 на селективне середовище з 10 мг/л канаміцину, стійких колоній не виявлено. В той же час, на середовищах без антибіотику, спостерігали колонізацію тканин як культурами P.fluorescens 7769 так M.radiotolerans ІМБГ290. Титр цих культур у рослинних рештках картоплі становив 10⁸КУО/г сирої маси.

Як відомо, деякі фітопатогенні бактерії наприклад Ralstonia solanacearum та Erwinia chrysanthemi можуть захоплювати окремі ділянки ДНК з вегетуючих трансгенних рослин та їх решток (Ceccherini et.al., 2003). Тому, ми спробували також дослідити можливість прямого горизонтального переносу гену nptII з ДНК, виділеної з рослинних решток трансгенних рослин картоплі сорту Радич, які потрапили під дію комплексу факторів і, в.т.ч. мікроорганізмів дерново-середньопідзолистого ґрунту, до P.fluorescens 7769. Екстраговану ДНК з тканин трансгенних рослин картоплі, з концентрацією 3144,8±0,49 нг/мкл (0 год), 2256,8±3,80 нг/мкл (1 доба), 1135,6±2,94 нг/мкл (10 діб), обробляли суспензією клітин P.fluorescens 7769 титром 10⁸ кл/мл і культивували протягом трьох діб. Після висіву на селективне середовище LB з канаміцином, у всіх тестованих варіантах стійких до антибіотику колоній не виявлено.

Таким чином, дослідження взаємодії трансгенних рослини картоплі сортів Загадка, Билина, Радич та ДНК з рослинних решток сорту Радич з культурами P.fluorescens 7769 і M. radiotolerans ІМБГ 290 горизонтального переносу гену nptII не виявлено. Якщо горизонтальний перенос можливий то його ймовірність є мізерною і знаходиться в межах від 10^-12 до 10^-16.

Дослідження особливостей взаємодії бактеріальних клітин рекомбінаного штаму A.tumefaciens pGV2260 з фітопатогенним штамом P.fluorescens 7769 Понад половину трансгенних рослин у світі створюється з використанням методу агробактеріальної трансформації. Проте досить часто спостерігається неконтрольоване поширення бактеріальних клітин рекомбінантних форм агробактерій в рослинах після їх трансформації (Dominguez, 2004), що може призводити до вивільнення персистентних рекомбінантних форм агробактерій і їх генетичних конструкцій через рештки трансгенних рослин та рослинні ексудати до навколишнього середовища.

З метою вивчення взаємодії та виявлення горизонтального переносу гена nptII від рекомбінантної A. tumefaciens GV 2260 до інших мікроорганізмів використали культуру клітин ґрунтової бактерії P.fluorescens 7769. Дослідження проводили на рівні взаємодії культур з живими клітинами між собою та культур з живими і вбитими клітинами у різних середовищах існування для даних двох штамів мікроорганізмів, зокрема: при культивуванні на рідких і агаризованих поживних середовищах, в ризосферному ґрунті з вегетуючими рослинами, ризосферному ґрунті після вирощування трансгенних рослин та в трансгенних рослинах картоплі, що культивувались в умовах in vitro.

В результаті досліджень встановлено обмін генетичним матеріалом між A.tumefaciens GV2260 та P.fluorescens 7769 за різних умов існування цих мікроорганізмів. В результаті культивування живих клітин A.tumefaciens GV2260 з вбитими клітинами P.fluorescens 7769 на агаризованому поживному середовищі нами виявлено утворення транскон'югатів A.tumefaciens GV2260, стійкі до 30 мг/л цефотаксиму, з частотою 3,1х10^-4 клітин в мл (за умов внесення 10⁸ кл/мл клітин реципієнтів) (табл. 3) Транскон'югати A.tumefaciens GV2260, стійкі до цефотаксиму, утворювались в ризосферному ґрунті після вирощування трансгенних рослин картоплі з частотою 6,1х10^-4 клітин на 1 г сухого ґрунту (за умов внесення 10⁹ клітин реципієнтів) (див. табл. 3).

В результаті спільного культивування живих клітин A.tumefaciens GV2260 з живими клітинами P.fluorescens 7769 на агаризованих поживних середовищах утворювались транскон'югати A.tumefacience GV 2260, стійкі до цефотаксиму з частотою 7,5х10^-8 кл/мл (за умов внесення на 2х10⁸ кл/мл клітин реципієнтів) (див. табл. 3.)

Чутливість транскон'югатів A. tumefaciens GV 2260 до цефотаксиму відносно контролю коливалась в межах від 25 до 30 мг/л і залежала від умов і рівнів взаємодії з культурою P.fluorescens 7769. Слід відмітити, що при вирощуванні клітин A.tumefaciens GV2260 без цефотаксиму протягом двох пасажів та перенесенні на середовище з цефотаксимом, у транскон'югатів A. tumefaciens GV 2260 спостерігали стійке успадкування набутої ознаки.

В результаті інокуляції трансгенних рослин картоплі культурами P.fluorescens 7769 і A.tumefaciens GV2260 спостерігали утворення стійких до канаміцину транскон'югатів P.fluorescens 7769. Частота утворення таких клітин складала 9,4х10^-4 клітин на 1г сирої маси рослин (див. табл. 3). Слід відмітити, що при взаємодії живих культур в рідких та на твердих поживних середовищах не спостерігали утворення форм P.fluorescens 7769 стійких до канаміцину.

При сумісному культивуванні живих клітин P.fluorescens 7769 з вбитими клітинами A.tumefaciens GV2260 в ризосферному ґрунті після вирощування трансгенних рослин утворювались транскон'югати P.fluorescens7769 стійкі до канаміцину. Частота утворення складала 6,2х10^-4 клітин на 1 г сухого ґрунту, за умов внесення 10⁹ клітин реципієнтів P.fluorescens 7769 на 1 г сухого ґрунту. Утворення форм P.fluorescens 7769 стійких до канаміцину не виявлено при взаємодії живих клітин P.fluorescens 7769 з вбитими клітинами A.tumefaciens GV2260 на агаризованих поживних середовищах та в ризосферному ґрунті з вегетуючими трансгенними рослинами картоплі (див. табл. 3)

Культура P. fluorescens 7769 набувала стійкості до канаміцину в залежності від умов взаємодії. Набута ознака стійкості до канаміцину отриманими транскон'югатами не втрачались навіть після їх культивування без селективного тиску канаміцину.

Отримані результати свідчать про можливість горизонтального переносу генів від A.tumefaciens GV2260 до P.fluorescens 7769 в різних умовах навколишнього середовища.

Таблиця 3. Біоконтроль виникнення транскон'югатів A.tumefaciens GV 2260 і P.fluorescens 7769

^*Примітка. Сх - цефотаксим, Км - канаміцин.

Ідентифікацію транскон'югатів A.tumefaciens, здійснювали на селективному середовищі з додаванням рифампіцину (Пирузян, 1988).

Для ідентифікації транскон'югатів P.fluorescens 7769, здійснено ПЛР-аналізом ДНК бактерій з специфічними до варіабельної ділянки гену 16S рРНК праймерами PSM (Johnsen et.al., 1999). В результаті отримано специфічний продукт ампліфікації довжиною445 п.н.

Отже, між рекомбінантними бактеріями A. tumefaciens GV2260 і фітопатогенними бактеріями P. fluorescens 7769 при спільному їх культивуванні на різних середовищах взаємодії можливий обмін генетичним матеріалом, що може призводити до неконтрольованих процесів в агроекосистемах.

Диференціація трансгенних клонів картоплі за накопиченням інфекційних структур Fusarium oxysporum Аналіз літератури свідчить, що сорти сільськогосподарських культур є потужним фактором біоконтролю фітопатогенних мікроорганізмів в агрофітоценозах (Парфенюк та ін., 2004). Тому завданням наших досліджень було вивчення взаємодії модельних трансгенних клонів різних сортів картоплі вітчизняної селекції з фітопатогенним грибом F. oxysporum.

За результатами вирощування F. оxysporum на бульбах трансгенних клонів тестованих сортів виявлено їх диференціюю за накопиченням маси міцелію та інтенсивністю спороутворення гриба. Як свідчать дані представлені на рисунку 7 трансгенні клони від сорту Чернігівська рання можуть накопичувати міцелій гриба F.oxisporum в бульбах з різною інтенсивністю. Якщо при штучному зараженні на бульбах стандартного сорту Луговська на 30 добу після інокуляції маса міцелію в середньому становила 190 мг/г сирої маси, на бульбах рослин контролю - 120 мг/г, то на бульбах трансгену №27 - на 70 мг/г сирої маси міцелію менше порівняно з контролем. Це свідчить про те, що трансген №27 характеризується здатністю стримувати розвиток гриба в бульбах.

Разом з тим серед семи тестованих трансгенних клонів виявлено клон №23 на бульбах якого маса міцелію гриба F. oxysporum перевищувала вихідну форму на 160 мг/г сирої маси бульб. Отримані результати свідчать про значну ступінь диференціації трансгенних клонів від сорту Чернігівська рання за здатністю продукувати міцелій грибом F. oxysporum на бульбах.

Отримані результати було підтверджено при дослідженні п'ятнадцяти трансгенних клонів від сорту Радич (рис. 8). Як свідчать дані рисунка 8 з п'ятнадцяти тестованих трансгенних клонів лише на бульбах одного клону №21 маса міцелію була суттєво нижчою порівняно з контролем, а клону №18 була на рівні з контролем. На бульбах інших клонів маса міцелію суттєво перевищувала контроль але була нижчою за стандарт, а трансгенний клон №8 суттєво перевищував навіть стандарт за зазначеним показником. Таким чином, отримані дані свідчать, що трансгенні клони, як від соту Чернігівська рання так і від сорту Радич характеризуються високою здатністю накопичувати міцелій гриба. Лише не значна кількість трансгенних клонів цих сортів в певній мірі не здатна стримувати накопичення міцелію в бульбах. Отримані результати були підтверджені на бульбах сорту Сєднєвська рання. Аналіз шести трансгенних клонів сорту Сєднєвська рання за зазначеним показником показав подібну картину.

Аналіз інтенсивності спороутворення гриба F. oxisporum на уражених бульбах трансгенних клонів картоплі показав значну диференціацію. На уражених бульбах сорту стандарту Луговська інтенсивність спороношення складала 0,75х10⁸ конідій/мл, а на бульбах контролю сорту Чернігівська рання вона була суттєво вищою і складала 0,99х10⁸ конідій/мл. В той же час на бульбах трансгенних клонів сорту Чернігівська рання інтенсивність спороношення коливалась в межах 0,19 -1,39х10⁸ конідій/мл. Слід відмітити, що найнижчу інтенсивність спороутворення спостерігали на бульбах трансгенних клонів №29, №26 та №27.

При спостереженні за спороношенням міцелію на бульбах контролю сорту Радич було відмічено інтенсивність спороношення в межах 0,29х10⁸ конідій/мл, що на 0,46х10⁸ конідій/мл менше порівняно з стандартом (рис. 8). При тестуванні трансгенних клонів від цього сорту інтенсивність спороношення на уражених бульбах коливалась в межах 0,10х10⁸ конідій/мл - 1,55х10⁸ конідій/мл. Найменша кількість конідій утворювалась на бульбах клонів №9,7,8, 6.

На уражених бульбах контролю сорту Сєднєвська рання інтенсивність спороношення була на рівні 0,25 х10⁸ конідій/мл (рис. 9). В той же час на бульбах трансгенних клонів цього сорту інтенсивність спороношення коливалась в межах 0,10х10⁸ конідій/мл - 1,46х10⁸ конідій/мл. Найменшу інтенсивність спороношення спостерігали на бульбах клонів №33 та №35, а найвищу на лінії №32.

Встановлено диференціацію трансгенних клонів картоплі за впливом на накопичення інфекційних структур гриба F. oxysporum. Виявлені клони трансгенних рослин картоплі, які здатні понижувати чи підвищувати чисельність популяцій фітопатогенного гриба на бульбах. Але отримані дані є попередніми тому зазначений напрямок досліджень потребує подальшого розвитку.

Висновки

За результатами досліджень взаємодії трансгенних рослин картоплі з ґрунтовими мікроорганізмами показано виникнення екологічних ризиків пов'язаних з можливим неконтрольованим процесом горизонтального перенесення генів, які входять до складу генетичних конструкцій, від бактеріальних клітин рекомбінантних форм A.tumefaciens GV2260 до клітин інших ґрунтових мікроорганізмів, зокрема - до P.fluorescens 7769, і можливим підвищеним рівнем поширення та накопичення інфекційних структур фітопатогенного гриба F. oxysporum на бульбах трансгенних рослин картоплі.

1. Підібрано умови регенерації і агробактеріальної трансформації, що забезпечують високу ефективність трансформації для отримання трансгенних рослин картоплі сортів вітчизняної селекції.

2. Створено трансгенні клони сортів картоплі вітчизняної селекції Сєднєвська рання, Радич, Чернігівська рання, Билина, Загадка, Червона рута, що характеризуються достатнім проявом інтегрованих генів генетичної конструкції, що дозволяє використовувати їх для вивчення взаємодії трансгенних рослин з мікроорганізмами.

3. Проведений аналіз характеру метилювання ДНК трансгенних рослин свідчить про появу нестабільності функціонування введених генів, що може призводити не прогнозованих змін в популяціях трансгенних рослин.

4. Встановлено, що повна деструкція решток трансгенних рослин картоплі сорту Радич під впливом мікрофлори дерново-середньопідзолистого ґрунту картопляної сівозміни становить 30 діб за втрати сирої маси рослин до 87,1±1,11%.

5. Показано, що під впливом ґрунтової мікрофлори у дерново-середньопідзолистому ґрунті картопляної сівозміни відбувається деградація ДНК з рослин на 88% від початкової кількості тотальної ДНК, а деградація генів генетичної конструкції npt II і 35S - близько 90% від початкової їх кількості.

6. Виявлено, що при взаємодії бактеріальних клітин рекомбінантних форм A.tumefaciens GV2260 з P.fluorescens 7769 має місце горизонтальний перенос генів, що свідчить про можливість виникнення екологічних ризиків у разі неконтрольованого вивільнення персистентних рекомбінантних форм A.tumefaciens GV2260 з трансгенних рослин в навколишнє середовище.

7. Показано відсутність горизонтального переносу гену nptII від трансгенних рослин картоплі сортів Загадка, Радич, Билина та їх решток до бактерій P.fluorescens 7769 та M.radiotolerans ІМБГ 290.

8. Встановлено диференціацію трансгенних клонів картоплі за впливом на накопичення інфекційних структур гриба F. oxysporum. Виявлені клони трансгенних рослин картоплі, які здатні понижувати чи підвищувати чисельність популяцій фітопатогенного гриба на бульбах. Але отримані дані є попередніми тому зазначений напрямок досліджень потребує подальшого розвитку.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Карачинська Н.В. Індукція морфогенезу з листкових та стеблових експлантів для різних генотипів картоплі / Н.В. Карачинська Г.П. Петюх // Збірник наукових праць Уманського державного аграрного університету. - 2005 - Випуск 60. - С. 64-71 (збір літературних даних, проведення експериментальної роботи, участь у написанні статті).

2. Карачинська Н.В. Трансгенні рослини картоплі в системі моніторингових досліджень / Н.В. Карачинська, Г.П. Петюх // Агроекологічний журнал. - №4. - 2006. - C.44-52 (Проведення експериментальної роботи, інтерпретація результатів, формування висновків).

3. Деклараційний патент України на корисну модель №21370 від 15.03.2007. Спосіб генетичної трансформації для сортів картоплі вітчизняної селекції / Карачинська Н.В., Петюх Г.П.

4. Карачинська Н.В. Ідентифікація генетичних конструкцій у трансгенних рослинах картоплі. Методичні рекомендації / Петюх Г.П., Карачинська Н.В., Парфенюк А.І., Олійник Т.М. - Київ.: Діа, 2008. - 20с (Проведення експериментальної роботи, інтерпретація результатів).

5. Карачинська Н.В. Взаємодія персистентних форм Agrobacterium tumefaciens GV2260 с Pseudomonas fluorescens 7769 в умовах in vitro / Н.В. Карачинська, А.І. Парфенюк, Л.М. Буценко // Агроекологічний журнал. - 2008. - №2. - С. 88-91 (збір літературних даних, проведення експериментальної роботи, узагальнення та інтерпретація результатів, формування висновків).

6. Карачинская Н.В. Оцінка деградації ДНК з рослинних решток трансгенних рослин картоплі під впливом целюлозоруйнівних мікроорганізмів дерново-середньопідзолистого ґрунту / Н.В. Карачинская, А.І. Парфенюк, О.В. Подоліч, Г.П. Петюх // Електронний журнал Наукові доповіді Національного аграрного університету. - 2008. - №3 (11) - 11 с. - Режим доступу до журн.: http://www.nbuv.gov.ua./e-Journals/nd/2008-3/08knvsps.pdf (збір літературних даних, проведення експериментальної роботи, узагальнення та інтерпретація результатів, формування висновків).

7. Карачинська Н.В. Дослідження горизонтального переносу nptII гену трансгенних рослин картоплі до Methylobacterium radiotolerans ІМБГ 290 / Карачинська Н.В., Петюх Г.П. // Екологічні проблеми сільськогосподарського виробництва: II науково-практична конф. молодих вчених. - 9-11 вересня 2008 р: тези доп. - IX., 2008. - C.66-67.

8. Карачинська Н.В. Розробка системи генетичної трансформації для різних генотипів картоплі (Solanum tuberosum)/ Н.В. Карачинська, Г.П. Петюх // Сталий розвиток агроекосистем: міжн.наук. кон., 17-20 вер. 2002 р: тези доп. - Вінниця. - IX., 2002. - С. 135-137.

9. Карачинська Н.В. Пряма регенерація рослин із тканин картоплі / Н.В. Карачинська // Засади сталого розвитку аграрної галузі: всеукр. конф. молодих вчених., 28-30 жовт. 2002 р: тези доп. - Київ. - X., 2002. - С. 117-118.

10. Карачинская Н.В. Изучение стабильности експрессии чужеродных генов в трансгенных растениях картофеля /Карачинская Н.В., Петюх Г.П. // Трансгенные растения и проблемы безопасности: междунар. симпоз., Москва, 29 ноября - 3 октября 2004 г.: тезисы. докл. - Москва - X., 2004. - С. 39.

11. Карачинська Н.В. Особливості прояву генів gus i nptII в трансгенних рослинах картоплі / Н.В. Карачинська, Г.П. Петюх // Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології: конф. молод. вчен. 1-2 груд., 2005 р.: тези доп. - Ужгород. - XII., 2005. - C. 57.

12. Карачинська Н.В. Трансформація картоплі української селекції A. tumefaciens / Карачинська Н.В. // «Молодь і поступ біології»: перша міжнар. конф. студ та аспір., 11-14 квіт. 2005 р: тез. доп. - Львів: Сполом - IV., 2005. - С. 150

13. Karachinska N.V. Studying of gene expression for transgenic potato plants after A.tumefaciens transformation / N.V. Karachinska, G.P. Petjuch // Conference for young scientists, phd students and students on molecular biology and genetics dedicated to 120^th anniversary of M.I. Vavilov. 20-22 September 2007 Kiev, Ukraine: аbstract book - X. 2007. - P.18.

14. Карачинская Н.В. Изменение проявления активности репортерных генов у растений-трансформантов картофеля/ Н.В. Карачинская Г.П. Петюх // «Физиология трансгенного растения проблемы и биобезопасность»: 2-й Всеросийский симпозиум., 22-25 окт. 2007 г.: тез. докл. - X., 2007 - C.43.

15. Карачинська Н.В. Зміна прояву роботи генів у рослин-трансформантів картоплі / Карачинська Н.В., Петюх Г.П. // Х конференцію молодих дослідників «Сучасний стан і пріоритети розвитку фізіології рослин, генетики та біотехнології» 25-26 жов. 2007 р: тези доп. - Київ - X., 2007 - C.65.

Размещено на Allbest.ru