Оценка санитарного состояния антропогенно измененных почв (урбаноземов) промышленных городов Иркутской области

Как правило, используют следующие углеводы: арабинозу, глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, фруктозу, и спирты - глицерин и маннит. Углеводы и спирты добавляют к основному фону среды в количестве 1 г основной фон готовят на водопроводной воде; он включает 0,5 г пептона и 0,1 г K₂HPO₄. Чтобы обнаружить изменения рН, к среде добавляют индикатор - бромтимолблау - из расчета 2 мл 1,6%-ного спиртового раствора на 1 л среды. При рН 6,0 индикатор имеет желтый цвет, а при рН 7,6 синий. Чтобы обнаружить образование газа, в среду опускают поплавки. Пробирки с поплавками стерилизуют при 1 атм. Все среды с углеводами и спиртами засеивают одновременно 1 мл суспензии клеток и ставят в термостат. Если изучаемый микроорганизм развивается быстро, то результат можно регистрировать через 48-96 часов, а если медленно - через 7-10 суток.

Визуально по помутнению среды, образованию пленки, осадка отмечают рост или его отсутствие на всех используемых средах. Отмечают изменение цвета индикатора и делают заключение о том, чем сопровождается использование субстратов: подкислением или подщелачиванием среды, или изменение рН среды не происходит. О газообразовании свидетельствует накопление газа в поплавке.

Образование ацетилметилкарбинола.

Этой способностью обладают микроорганизмы, сбраживающие глюкозу с образованием кислот, которые в дальнейшем участвуют в биосинтезе нейтральных продуктов - ацетилметилкарбинола, диацетила, 2,3-бутиленгликоля.

Используя среду состава: глюкозу 1,0 г, пептон 0,5 г, K₂HPO₄ 0,1 г, вода. Среду разливают в пробирки по 8-10 мл в каждую, стерилизуют при 0,5 атм и засевают культурами микроорганизмов. Продолжительность культивирования 7-10 дней. После окончания культивирования к 2 мл культуры добавляют 1 мл 10%-ного раствора КОН и энергично встряхивают на воздухе. Если организм образует ацетоин, то начинает медленно развиваться окраска; через 18-24 ч наблюдается интенсивное красное окрашивание.

Гидролиз крахмала.

Гидролиз крахмала осуществляется микроорганизмами, образующими амилазу и использующими пролукты гидролиза крахмала как источник углерода и энергии. Для выявления этой способности используют среду следующего состава: пептон 1,0 г, K₂HPO₄ 0,5 г, растворимый крахмал 0,2 г, агар-агар 1,5 г; рН среды 6,8-7,0. Среду стерилизуют при 1 атм и разливают по чашкам Петри. Когда среда застынет, делают посев штрихом по диаметру чашки. Продолжительность культивирования 7-10 дней. Гидролиз крахмала обнаруживают по зоне просветления среды вдоль штриха. Особенно четко она видна после обработки агаровой пластинки раствором Люголя. Так как йод - индикатор на крахмал, то вся среда окрашивается в синий цвет, за исключением зоны гидролиза крахмала, которая остается бесцветной или может приобрести красно-бурую окраску, если крахмал гидролизуется до декстрина.

Разжижение желатина.

Разжижать желатину способны микроорганизмы, выделяющие в среду протеолитические ферменты. Для выявления этой способности, исследуемый организм высевают на мясо-пептонную желатину (МПЖ), приготовленную следующим образом: к мясо-пептонному бульону (МПБ), состоящему из мясной воды, NaCl 0,5г, пептон 1,0 г, добавляют 10-15 г желатины. Оставляют на 20-30 мин, чтобы желатина набухла, затем смесь нагревают на водной бане до полного растворения желатины и разливают полученную МПЖ в пробирки по 8-10 мл. Стерилизуют при 0,5 атм 15 мин. Посев проводят уколом. Продолжительность культивирования 7-10 дней при комнатной температуре. Разжижение желатины или его отсутствие отмечают визуально.

Образование аммиака.

Образование аммиака свойственно микроорганизмами, дезаминирующим аминокислоты. Эту способность микроорганизмов выявляют при их росте в МПБ. Для этого МПБ разливают в пробирки по 8-10 мл в каждую, стерилизуют при 1 атм и засевают клетками изучаемого организма. Образование аммиака обнаруживают по изменению лакмусовой бумаги. Для этого после посева помещают в пробирку над средой стерильную полоску красного лакмуса, зажимая ее между пробкой и горлышком пробирки, пробку пробирки заворачивают целлофаном. При образовании аммиака полоска красного лакмуса синеет.

Образование индола.

Многие микроорганизмы в процессе развития образуют из триптофана индол, тогда как другие этой способностью не обладают. МПБ с 0,01 г триптофана разливают по пробиркам, стерилизуют при 0,5 атм и засевают клетками изучаемого организма. Через 5-7 суток после посева на поверхность среды, не перемешивая, вносят 1-3 мл реактива Эрлиха; появление красной окраски свидетельствует о наличии индола.

Образование сероводорода.

Образование сероводорода свойственно микроорганизмам, использующим в процессе метаболизма серосодержащие аминокислоты (цистеин, цистин, метионин). Эту способность выявляют при выращивании микроорганизмов в МПБ, разливают в пробирки по 8-10 мл в каждую, стерилизуют при 1 атм и засеивают клетками изучаемого организма. После посева над средой помещают полоску бумаги, пропитанную раствором уксусного свинца, зажав ее между пробкой и горлышком пробирки. Пробку пробирку заворачивают целлофаном, чтобы затруднить улетучивание сероводорода. Продолжительность культивирования 7-10 дней. Выявление сероводорода при развитии микроорганизмов в МПБ обнаруживают по почернению бумаги вследствие образования сульфида свинца.

Восстановление нитратов.

Восстанавливать нитраты до нитритов способны микроорганизмы, образующие ферменты нитратредуктазу и использующие нитраты в качестве источника азота. Способность к восстановлению нитратов выявляют на среде, состоящей из МПБ и 0,2 г KNO₃. Среду разливают в пробирки и стерилизуют при 1 атм. Среду засеивают клетками изучаемого организма, выдерживают в термостате 7-10 дней. Нитриты обнаруживают реактивом Грисса, т.к. в кислой среде в присутствие нитритов и ароматических аминов образуется азотсоединение, окрашенное в красно-розовый цвет. Для выполнения реакций к капле реактива Грисса добавляют каплю культуры. Появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитритов.

Рост на синтетической среде.

На синтетической среде растут микроорганизмы, которые в качестве источника азота используют азот минеральных солей и не требуют внесения в среду готовых витаминов или других факторов роста. Эту способность выявляют на среде состава: глюкоза 3,0 г, NH₄NO₃ 0,3 г, KH₂PO₄ 0,1 г, K₂HPO₄ 0,1 г, MgSO₄ 0,05 г, NaCl 0,05 г, CaCO₃ 0,5 г, FeSO₄ следы, агар-агар 15 г, вода. Разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм и после стерилизации скашивают. Посев проводят штрихом, продолжительность культивирования 7-10 дней. После этого визуально отмечают рост или его отсутствие.

Воздействие на молоко.

Молоко содержит углеводы (лактозу), белки (казеин), витамины, минеральные соли, поэтому многие микроорганизмы хорошо растут на молоке. Рост микроорганизмов в молоке может быть связан со сбраживанием лактозы, протеолизом казеина или с двумя этими процессами одновременно. Для определения воздействия микроорганизмов на молоко поступают следующим образом молоко обезжиривают сепарированием или центрифугированием в течение 15 мин при 2-3 тыс. об/мин. Обезжиренное молоко разводят водой в соотношении: 4 части молока + 1 часть воды, добавляют индикатор бромкрезолпурпур (2 мл 1,6%-ного спиртового раствора на 1 л молока), разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм. Результаты воздействия микроорганизмов на молоко регистрируют спустя 6-14 суток после посева.

Использование лактозы с образованием кислот отмечают по изменению цвета индикатора. Если степень подкисления достаточно велика, наблюдается коагуляция казеина (образование сгустка), часто сопровождаемая отделением сыворотки. Образование углекислоты хорошо видны по сгустку, который в этом случае пронизан пузырьками. Воздействие микроорганизмов на казеин молока тоже вызывает коагуляцию, но она имеет место при нейтральной или слабощелочной реакции среды и является результатом образования микроорганизмами казеинолитических ферментов. При высокой активности этих ферментов отмечается просветление молока, называемое пептонизацией, что связано с протеолизом казеина.

Отношение к кислороду.

Потребности микроорганизмов в свободном кислороде достаточно разнообразны. По отношению к кислороду микроорганизмы делятся на 4 большие группы: облигатные анаэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы и облигатные анаэробы. Для описания микроорганизмов и дальнейшей идентификации ограничиваются наблюдением роста изучаемого организма после посева уколом в агаризованную среду или после посева в расплавленную агаризованную среду. Строгие аэробы растут на поверхности среды и в самом верхнем его слое, микроаэрофилы - на некотором расстоянии от поверхности среды, факультативные анаэробы развиваются во всей толще среды, облигатные анаэробы развиваются во всей толще среды, облигатные анаэробы только в глубине среды.

Каталазная активность.

Она свойственна большинству аэробных микроорганизмов. Облигатные анаэробы и микроаэрофилы каталазу не образуют. Каталаза разлагает перекись водорода с образованием кислорода в соответствии с реакцией:

Н₂О₂ = Н₂О + О₂.

Каталазную активность выявляют следующим образом. Исследуемый микроорганизм выращивают на поверхности плотной среды. Наносят каплю 10%-ного раствора Н₂О₂ на колонию или суспензируют клетки исследуемого микроорганизма в небольшом объеме этого раствора. Выделение кислорода хорошо заметно по образованию пузырьков газа, свидентельствует о наличии в клетках каталазы.

Отношение к концентрации хлористого натрия.

Большинство бактерий чувствительны к концентрации солей в среде. Однако устойчивость различных видов бактерий к этому фактору заметно варьирует. Большую или меньшую чувствительность бактерий к концентрации соли в среде оценивают по их способности расти в МПБ с 2,5% и 6,5% NaCl. Среду разливают в пробирки и стерилизуют при 1,0 атм. Через 6-10 суток после посева регистрируют рост микроорганизмов и его интенсивность или отсутствие роста.

Оксидазная активность.

Этот тест используют обычно для дифференциации представителей рода Pseudomonas от других палочковидных бактерий, не окрашивающихся по Граму.

Для определения оксидазной активности наносят несколько капель 1%-ного раствора тетраметил-р-фенилендиамина на колонию в чашки Петри. Колонии организмов, обладающих оксидазной активностью, приобретают красную окраску, которая через 10-30 мин переходит в черную.

Методы выделения и идентификации бактерий группы кишечной палочки.

Для учета бактерий группы кишечной палочки различные разведения почвы по 1 мл засеивают в среду Кесслер (определяет бродильный титр). В состав среды Кесслер входит: пептон 10г, желчь 50 мл, лактоза 10 г, 1%-ный водный раствор генциана фиолетового 4 мл, вода. Среду разливают в пробирки с поплавками и стерилизуют. Посев проводят из разведений 1:10, 1:100, 1:1000, и исходную почву (1 г). Пробирки с засеянной средой Кесслер помещают в термостат при 37?С, ингибируют 24 часа. По истечению срока культивирования учитывают результаты посевов. Помутнение среды с образованием кислоты и газа является положительным результатом на наличие БГКП. Из пробирок, в которых наблюдается брожение, делаем высев на среду Эндо.

Среда Эндо состоит из: МПА 100 мл, лактоза 1 г, вода, фуксин 1 мл, раствор сульфида натрия. Посев проводят с таким расчетом, чтобы получились отдельные колонии. Чашки с посевом помещают в термостат при 37?С на 18-24 часа. При наличии на среде Эндо колоний, типичных для БГКП (красных с металлическим блеском, розовых, бледно-розовых) их описывают и изучают.

Из суточной культуры микроорганизмов готовят препараты: «раздавленная капля» для определения подвижности клетки, фиксированный препарат окрашивают по Граму, для описания морфологических признаков. Для изучения физиолого-биохимических признаков используют тесты ТИМАЦ и некоторые дополнительные тесты.

ТИМАЦ:

1. Температурный тест (рост на среде с глюкозой при температуре 44?С). Среда состоит из: ПЕПТОН 10 Г, NaCl 5 г, глюкоза 10 г, вода. Разливают среду в пробирки с поплавками, стерилизуют. Вносят одну петля культуры с изолированной колонии в среду с глюкозой. Посевы поставить в термостат при указанной температуре на 48 часов. Рост на этой среде может приводить к накоплению органических кислот, нейтральных продуктов, газа. Образование кислот регистрируют по изменению активной кислотности (рН) среды, образование газа - вытеснению среды из поплавков. Термотолерантные колиформные бактерии, свидетельствующие о свежем фекальном загрязнении, дают положительную реакцию.

2. Образование индола (способность расщеплять триптофан). В приготовленную среду внести 1 каплю БГКП и поставить в термостат при 37?С на 48 часов.

3. Реакция с метиленовым красным (реакция Кларка). Реакция показывает интенсивность кислотообразования при сбраживании глюкозы. Среда Кларка следующего состава: пептон 0,2 г, K₂HPO₄ 0,03 г, агар-агар 0,3 г, 1%-ный водный раствор бромтимолблау 0,3 мл, глюкоза 1 г, вода. В приготовленную среду Кларка внести 1 петлю изучаемых микроорганизмов и выдержать в термостате при 37?С на 48 часов. После культивирования к среде добавить несколько капель индикатора метиленового красного. При рН 5,0 и ниже индикатор изменяет цвет на красный.

4. Образование ацетилметилкарбинола. В приготовленную среду внести 1 каплю изучаемых микроорганизмов и выдержать в термостате при 37?С 48 часов.

5. Цитратный тест. Основан на способности некоторых микроорганизмов усваивать лимонную кислоту и ее соли в питательной среде, в то время как на другие микроорганизмы эти вещества действуют угнетающе. Для цитратотрицательных разновидностей характерно отсутствие роста и изменения цвета среды. В приготовленную среду Козера (K₂HPO₄ 1 г, MgSO₄ 0,2 г, натрий аммоний фосфорнокислый 1,5 г, лимоннокислый натрий 2,5-3,0 г, бромтимоловый синий 10 мл) внести 1 каплю изучаемых микроорганизмов и выдержать в термостате при 37?С 48 часов.

Дополнительный тесты:

6. Уреазная активность (способность расщеплять мочевину). В приготовленную среду (МПБ +2 г мочевины) внести 1 каплю изучаемых микроорганизмов и выдержать в термостате при 37?С 48 часов. Способность расщеплять мочевину обнаруживают при добавлении фенолфталеина, при положительной реакции среда окрашивается в ярко-оранжевый цвет.

7. Образование сероводорода БГКП изучают при посеве в пробирки с 2%-ной пептонной водой и полосками фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. Культивируют в термостате 3 суток при 37?С.

8. Оксидазная активность.

К общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные, не образующие спор палочки, не обладающие оксидазной активностью, ферментирующие лактозу и манит (или глюкозу), при 37?С в течение 24 часов.

Для учета лактозоположительных форм можно использовать среды Эндо и Кесслер, содержащие лактозу. Прописи сред приведены выше. Можно использовать подтверждающую жидкую среду, содержащую лактозу, приготовленную также как среды с глюкозой.

При идентификации бактерий группы кишечной палочки, кроме определителей бактерий Берджи (Хоуптон, 1980, 38) нами использовались другие литературные источники: «Санитарная микробиология» (21), «Санитарная микробиология почвы» (Мишустин, 1979).

Из-за отсутствия в настоящее время нормативной документации по методам санитарно-микробиологического анализа почвы, использованы рекомендации, изложенные в «Руководстве по санитарной охране почвы» (Лоранский, 1972) и «Методические указания по санитарно-микробиологическому исследованию почвы» (МУК, 1999).



4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1 Количественный состав гетеротрофных сапрофитных бактерий, как показатель санитарного состояния урбаноземов промышленных городов Иркутской области

Количественный и качественный состав микробного сообщества урбаноземов изучался сразу после взятия образцов в асептических условиях. Образцы отбирались студентами-микробиологами, проживающими на территории Иркутской области во время летней учебно-производственной практики в период 2006 г., а также же лично старшим научным сотрудником Института географии СО РАН Напрасниковой Е.В., за что выражаем им глубокую признательность.

Результаты определения количественного состава гетеротрофных сапрофитных бактерий, как показателя санитарного состояния урбаноземов промышленных городов Иркутской области, приведенеы в таблице 4.

Результаты количественного анализа параллельных высевов обработаны математически, согласно указаниям Гречушкиной Н.Н. с соавторами, приведенным в «Практикуме по микробиологии» (Егоров, 1976).

Таблица 4.

Количественный состав гетеротрофных сапрофитных бактерий в урбаноземах промышленных городов Иркутской области.

№ образца	Место взятия образца	МПА, млн. КОЕ/г почвы
	г. Ангарск
1а	ж/д вокзал, рядом с тропинкой. Травянистый покров, тополь, сосна.	1,0±0,06
2а	Центральный парк имени Ленина, скошенная лужайка. Скошенный травянистый покров.	0,9±0,06
3а	Швейная фабрика; остановка трамвая; много мусора; газон. Разнотравье.	1,56±0,06
4а	29 м/н; открытая местность, жилой квартал из девятиэтажных домов, замусорено. Разнотравье.	1,8±0,1
6а	Жилой массив у трамвайной линии. Полынь, тысячелистник, мятник.	0,7±0,09
8а	Трамвайное кольцо. Клён, тополь, доминирует полынь.	1,2±0,06
10а	12 м/н; жилой квартал пятиэтажных домов, много гравия. Разнотравье.	0,19±0,01
14а	Частный сектор; гаражи. Доминирует полынь, подорожник.	0,95±0,06
20а	Химический комбинат; 12 км от автотрассы, грунтовая дорога. Разнотравье.	0,7±0,09
23а	Старая АЗС. Клён, мощный травяной покров, люцерна. Злаки. полынь.	0,6±0,09
г. Усолье-Сибирское
1у	Московский тракт; АЗС на въезде в Усолье-Сибирское со стороны Черемхово.	0,03±0,006
2у	Картофельное поле, напротив Т1.	0,04±0,006
3у	Придорожный лес; 30 метров от тракта, 100 м от трубы химпрома.	0,8±0,09
4у	Торговая точка; магазин, отдельный жилой дом.	0,75±0,09
5у	Частный сектор; от дороги 8 м.	1,0±0,06
6у	Жилой массив; напротив стадион, около подъезда дома.	0,5±0,02
7у	Стадион. Вокруг территории асфальт, проба взята с газона, 18 м от дороги. Почва сухая.	0,73±0,09
9у	Недалеко от АЗС, 15 км от тракта. Почва задернована, пронизана корнями.	3,6±0,06
10у	Жилой массив, старые двухэтажные дома, строительный мусор.	0,5±0,02
14у	Остановка трамвая. Сквер, травянистый покров, много песка.	0,94±0,06
15у	Гаражи, мусор.	1,2±0,06
16у	Склон оврага, 100 м от частного чектора.	1,9±0,1
17у	Парковая зона (центр города).	1,4±0,06
18у	Больница, 12 м от дороги, замусорено.	0,66±0,09
19у	Промышленная зона, клевер, донник.	0,5±0,02
20у	Жилой массив двухэтажных домов, внутри квартала.	0,2±0,01
21у	Перекресток, светофор. Торговый комплекс, мусор.	0,2±0,01
22у	Частный сектор, водоколонка	1,7±0,1
г. Саянск
Ic	Въезд в город, газон.	0,16±0,01
IIc	Жилой массив, мало растений.	0,14±0,01
IIIc	Химпром, мало растений.	0,12±0,003
1c	Автовокзал.	0,1±0,003
2c	Около мэрии города.	0,06±0,003
3c	Приусадебные участки, деревянный сектор.	0,19±0,01
4c	Сквер, тропа.	0,2±0,01
5c	Теплорасса.	0,11±0,003
6c	ТЭЦ.	0,1±0,003
7c	Дачный участок.	0,16±0,01
8c	Химпром, столовая.	0,09±0,003
9c	Химпром, цех №22 «Каустик».	0,084±0,003
10c	Химпром, цех №21 «Ртуть».	0,09±0,003
г. Шелехов
1ш	Квартал №3.	0,43±0,02
2ш	Пос. Ленина, разнотравье.	0,94±0,06
3ш	ИрКАЗ	0,069±0,003
4ш	Детский сад	0,06±0,003
5ш	Автобусная остановка.	0,8±0,09
7ш	Улица Ленина	0,1±0,003
8ш	Место выгула собак.	0,02±0,006
9ш	Автомагистраль	0,18±0,01
12ш	Посев овса	0,1±0,003

Результаты таблицы 4 свидетельствуют о том, что наибольшее количество гетеротрофных сапрофитных бактерий обнаружено в урбаноземах городов Усолье-Сибирское и Ангарск. В отдельных пробах (жилые массивы, а особенно частный сектор, трамвайные и автобусные остановки, парковые зоны) количество бактерий образующих колонии на МПА достигало 1,6-1,9 млн. КОЕ/г почвы. Эти показатели превышали количество гетеротрофных сапрофитных бактерий в контрольных зональных почвах. В пробах из Усть-Ордынского округа количество бактерий было 1,5 млн. КОЕ/г почвы. Этот факт мы объясняем тем, что в урабноземах Ангарска и Усолье-Сибирское достаточный привнос органических веществ за счет бытовых выбросов и фекальных загрязнений. По количественному составу бактериального комплекса урбаноземы можно оценить как умеренно загрязненные.

В урбаноземах Саянска и Шелехова наблюдается совершенно иная картина. Количество сапрофитных гетеротрофных бактерий даже в наиболее загрязненных участках (жилые массива, автобусные остановки, места выгула собак, посевы культурных растений) не превышали в основном 0,1-0,2 млн. КОЕ/г почвы. Этот факт мы объясняем не только более высокой санитарной культурой населения или более высоким уровнем санитарно-гигиенических мероприятий в этих городах, но и ингибирующим воздействием токсических выбросов расположенных в городе Шелехове алюминиевого завода и химпрома в городе Саянске. Это подтверждается цифрами, приведенными в таблице 4. Урбаноземы, прилежащие к Саянскому ХимПрому, содержат 0,09±0,08 млн. КОЕ/г почвы, т.е. в сотни раз меньше, чем в урбаноземах Усолья-Сибирского и Ангарска.

4.2 Качественный состав бактериального комплекса урбаноземов промышленных городов Иркутской области

Микробиоценозы различных почв, т.е. сообщества микроорганизмов, состоящие из функционально взаимосвязанных, немногих или многих видов, характеризуются определенным не только количественным, но и качественным составом.

Для проведения научной классификации (таксономии) бактерий мы пользовались Определителем бактерий Берджи (23, 38).

После изучения морфологических, тинкториальных, культуральных и некоторых физиолого-биохимических признаков была установлена родовая принадлежность доминирующих форм бактерий.

Доминирующие формы бактерий отсевали на косяки МПА. Для идентификации были отобраны культуры хемоорганотрофных бактерий, доминирующих на мясо-пептонном агаре.

В результате проведенных исследований доминировали представители родов Bacillus, Pseudomonas, Mycobacterium, Micrococcus, принадлежащие к царству прокариот и согласно Определителю бактерий Берджи (38) категории I «Грамотрицательные бактерии, имеющие клеточную стенку» (род Pseudomonas); категории II «Грамположительные бактерии, имеющие клеточную стенку» (род Bacillus, Mycobacterium, Micrococcus). Представителей III категории «Бактерий, лишенных клеточной стенки (микоплазм)» и IV категории «Архебактерий», обнаружить нашими методами исследований не удалось, хотя известно широкое распространение архебактерий в почве.

Бактерии рода Bacillus, относящиеся к группе 18 «Грамположительные палочки и кокки», образующие эндоспоры, характеризовались следующими признаками: по морфологии - это прямые палочки с закругленными концами в парах или коротких цепочка. Подвижные. Эндоспоры овальные, не более одной в клетке. Бактерии каталазо- и оксидазоположительные. Факультативные анаэробы, мезофиллы. Нитраты в нитриты восстанавливали, желатину разжижали, молоко пептонизировали. После 10-минутного прогревания при 80?С культуры давали рост на мясо-пептонном агаре, благодаря терморезистентности эндоспор.

Бактерии рода Pseudomonas, относящиеся к группе 4 «грамотрицательные аэробные палочки и кокки», представляли собой прямые, подвижные палочковидные клетки. Бактерии каталазо- и оксидазоположительные. На мясо-пептонном агаре росли в виде голубоватых, флюоресцирующих колоний с диффундирующим пигментом. Факультативные анаэробы. Нитраты в нитриты восстанавливали, желатину разжижали, молоко пептонизировали.

Для представителей рода Mycobacterium, относящихся к группе 21 «Микобактерии», было характерно наличие в микроскопических препаратах слегка изогнутых, слабо грамположительных палочек, неподвижных, неспоробразующих. По Граму клетки окрашивались с трудом. Видимые глазом колонии (желтые, белые, рыжевато-коричневые, редко розовые появились лишь через 10 суток из-за медленного роста бактерий. Пигмент не диффундировал в питательную среду. Поверхность колоний была шероховатая, складчатая, матовая. Проба на каталазу и оксидазу положительная. Аэробы. Нитраты в нитриты восстанавливали, желатину разжижали, молоко подщелачивали, придавая ему грязноватый, жето-коричневый цвет.

Бактерии рода Micrococcus, относящиеся к группе 17 «Грамположительные кокки», обладали сферической формой клеток, не образовывали спор, были неподвижными, клетки в пространстве располагались в виде скоплений неправильной формы. Культуры давали положительную реакцию на каталазу и оксидазу. На мясо-пептонном агаре вырастали в виду сочных, круглых, приподнятых блестящих колоний белого, реже оранжевого цвета. Желатину не разжижали или разжижали медленно и поверхностно, нитраты не редуцировали. По отношению к кислороду вели себя как факультативные аэробы.

В результате идентификации гетеротрофных сапрофитных бактерий к роду Bacillus отнесены 52 штаммы. Бациллы доминировали в бактериоценозах Ангарска, Саянска, Шелехова и Усолья-Сибирского.

К роду Pseudomonas отнесено 10 штаммов, к роду Mycobacterium - 8 штаммов, выделены они, в основном, из урбаноземов Усолья-Сибирского и Ангарска.

Бактерии рода Micrococcus обнаружены лишь в 5 штаммах в городе Усолье-Сибирское.

В урбаноземах городов Шелехова и Саянска микрококки встречались спорадически. Это свидетельствует о том, что наиболее устойчивыми к техногенным воздействиям оказались бакетрии рода Bacillus, так как они обладают способностью образовывать стойкие к экстремальным условиям эндоспоры.



4.3 Санитарно-показательные бактерии урбаноземов промышленных городов Иркутской области

Идея использования кишечной палочки, постоянно обитающей в кишечнике человека, для характеристики санитарно-гигиенического состояния внешней среды принадлежит Массе.

До настоящего времени санитарно-показательные бактерии группы кишечной палочки (БГКП) используются, как косвенные показатели возможного обсеменения исследуемых объектов патогенными микробами кишечного происхождения.

В фекальных массах, поступающих в городские и прилегающие к ним почвы, могут содержаться болезнетворные микробы - возбудители дизентерии, сальмонеллеза, холеры и другие. Одним из направлений санитарно-микробиологического контроля за состоянием почвы является определение титра санитарно-показательных бактерий группы кишечной палочки (БГКП). Являясь типичным обитателем кишечника человека и домашних животных, указанные микроорганизмы выделяются с фекальными массами во внешнюю среду и обладают ограниченной способностью к размножению в почве. Длительность сохранения цитратотрицательной кишечной палочки в почве совпадает с такими же свойствами патогенных бактерий. Они легко дифференцируются, встречаются в организме хозяина и в почве значительно большем количестве, чем патогенные бактерии. Чистым зональным почвам, удаленным от населенных пунктов, БГКП, свидетельствующие о свежем фекальном загрязнении, как правило, не свойственны. Резкое увеличение их численности в урбаноземах и прилегающих к ним территорий косвенно может свидетельствовать о санитарно-гигиеническом и эпидемиологическом неблагополучии территории.

Краткий санитарно-микробиологический анализ почвы, кроме определения общего количества сапрофитных бактерий, включает определение титра бактерий группы кишечной палочки.

Титром кишечной палочки принято называть то наименьшее весовое количество почвы, в котором находят кишечную палочку.

При анализе суспензии мы использовали суспензии ее в разведении от 1:10¹ до 1:10⁵, которые высевали по 1 мл в 9 мл среды Кесслер с глюкозой и поплавками (первичная бродильная проба). После культивирования при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов при наличии помутнения и газообразования проводили высев на среду Эндо с лактозой с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии (рис. 3).

Типичные для кишечной палочки розовые с красным центром или красные с металлическим блеском колонии отсевали на глюкозо-пептонную среду с поплавками и культивировали при 44 градусах Цельсия 24 часа (вторичная бродильная проба), позволяющая выявить свежие фекальные загрязнения, типичные для кишечной палочки, на косяки мясо-пептонного агара для последующей идентификации бактерий.

Оценку санитарного состояния по титру кишечной палочки проводили по схеме Мишустина Е.Н., Перцовской М.И. (Мишустин, 1979), т.к. утвержденных нормативов, которые служили бы критерием для оценки санитарно-микробиологического состояния почвы, в доступной нам литературе не обнаружено.

В результате проведенных исследований установлено, что урбаноземы городов Ангарск, Шелехов, Саянск в большей степени соответствуют санитарно-гигиеническим нормам и являются слабо или практически незагрязненными БГКП. В большинстве случаев кишечная палочка не обнаруживалась. В местах традиционного загрязнения объектов окружающей среды продуктами метаболизма человека и домашних животных титр БГКП был незначительным. Он не превышал 0,1 в районах детских площадок, автобусных остановок, в местах выгула собак.

Иная картина наблюдалась в Усолье-Сибирском. Титр кишечной палочки колебался от 0,01-0,001 в зависимости от места отбора проб. Скорость роста кишечной палочки в среде Кесслер - 18-24 часа, т.е. в два раза быстрее, чем в пробах урбаноземов других городов.

Этот факт мы объясняем, как и в случае с гетеротрофными сапрофитными бактериями, не только более высокой санитарной культурой населения или более высоким уровнем санитарно-гигиенических мероприятий в гг. Шелехов, Саянск, Усолье-Сибирское, но и ингибирующим воздействием токсических выбросов расположенных в этих городах химических предприятий на кишечную палочку - основной санитарно-показательный микроорганизм (МУК, 1999).

Таблица 5.

Оценка санитарного состояния урбаноземов г. Ангарска.

№ образца	Место взятия образца	Титр БГКП	Рост в среде с глюкозой при 44?С (свежее фекальное загрязнение	Оценка санитарного состояния почвы
1а	ж/д вокзал , рядом с тропинкой. Травянистый покров	0,1	-	Слабое загрязнение
2а	Центральный парк имени Ленина; скошенная лужайка. Скошенный травянистый покров	0,01	-	Умеренное загрязнение
3а	Швейная фабрика; остановка трамвая, много мусора; газон. Разнотравье	0,01	-	Умеренное загрязнение
4а	29 м/н; открытая местность; жилой квартал из девятиэтажных домов; замусорено. Разнотравье	0,1	-	Слабое загрязнение
6а	Жилой массив у трамвайной линии. Полынь. Тысячелистник, мятник	0,1	-	Слабое загрязнение
8а	Трамвайное кольцо. Клен, тополь, доминирует полынь.	0,001	+	Слабое загрязнение
10а	12 м/н; жилой квартал пятиэтажных домов; много гравия. Разнотравье.	0,1	-	Слабое загрязнение
14а	Частный сектор; гаражи. Доминирует полынь, подорожник	0,1	-	Слабое загрязнение
20а	Химический комбинат; 12 км от автотрассы; грунтовая дорога. Разнотравье	0,1	-	Слабое загрязнение
23а	Старая АЗС. Клен, мощный травяной покров, люцерна, злаки, полынь	0,01	-	Умеренное загрязнение

Таблица 6.

Оценка санитарного состояния урбаноземов г. Усолье-Сибирское

№ образца	Место взятия образца	Титр БГКП	Рост в среде с глюкозой при 44?С (свежее фекальное загрязнение	Оценка санитарного состояния почвы
1у	Московский тракт; АЗС на въезде в Усолье-Сибирское со стороны Черемхово.	0,1	-	Слабое загрязнение
2у	Картофельное поле, напротив Т1.	0,01	-	Умеренное загрязнение
3у	Придорожный лес; 30 метров от тракта, 100 м от трубы химпрома.	0,01	-	Умеренное загрязнение
4у	Торговая точка; магазин, отдельный жилой дом.	0,001	+	Сильное загрязнение
5у	Частный сектор; от дороги 8 м.	0,0001	+	Сильное загрязнение
6у	Жилой массив; напротив стадион, около подъезда дома.	0,001	+	Сильное загрязнение
7у	Стадион. Вокруг территории асфальт, проба взята с газона, 18 м от дороги. Почва сухая.	0,001	+	Сильное загрязнение
9у	Недалеко от АЗС, 15 км от тракта. Почва задернована, пронизана корнями.	0,00001	+	Сильное загрязнение
10у	Жилой массив, старые двухэтажные дома, строительный мусор.	0,001	+	Сильное загрязнение
14у	Остановка трамвая. Сквер, травянистый покров, много песка.	0,001	+	Сильное загрязнение
15у	Гаражи, мусор.	0,001	+	Сильное загрязнение
16у	Склон оврага, 100 м от частного чектора.	0,01	-	Умеренное загрязнение
17у	Парковая зона (центр города).	0,001	+	Сильное загрязнение
18у	Больница, 12 м от дороги, замусорено.	0,01	-	Умеренное загрязнение
19у	Промышленная зона, клевер, донник.	0,01	-	Умеренное загрязнение
20у	Жилой массив двухэтажных домов, внутри квартала.	0,001	+	Сильное загрязнение
21у	Перекресток, светофор. Торговый комплекс, мусор.	0,001	+	Сильное загрязнение
22у	Частный сектор, водоколонка	0,01	-	Умеренное загрязнение

Таблица 7

Оценка санитарного состояния урбаноземов г. Саянска

№ образца	Место взятия образца	Титр БГКП	Рост в среде с глюкозой при 44?С (свежее фекальное загрязнение	Оценка санитарного состояния почвы
Ic	Въезд в город, газон.	0,1	-	Слабое загрязнение
IIc	Жилой массив, мало растений.	0,1	-	Слабое загрязнение
IIIc	Химпром, мало растений.	0,1	-	Слабое загрязнение
1c	Автовокзал.	0,01	-
2c	Около мэрии города.	-	-	Нет загрязнения
3c	Приусадебные участки, деревянный сектор.	0,1	-	Слабое загрязнение
4c	Сквер, тропа.	0,1	-	Слабое загрязнение
5c	Теплотрасса.	0,01	-	Нет загрязнения
6c	ТЭЦ.	-	-	Нет загрязнения
7c	Дачный участок.	0,1	-	Слабое загрязнение
8c	Химпром, столовая.	0,1	-	Слабое загрязнение
9c	Химпром, цех №22 «Каустик».	-	-	Нет загрязнения
10c	Химпром, цех №21 «Ртуть».	-	-	Нет загрязнения



Таблица 8

Оценка санитарного состояния урбаноземов г. Шелехова

№ образца	Место взятия образца	Титр БГКП	Рост в среде с глюкозой при 44?С (свежее фекальное загрязнение	Оценка санитарного состояния почвы
1ш	Квартал №3.	-	-	Нет загрязнения
2ш	Пос. Ленина, разнотравье.	0,1	-	Слабое загрязнение
3ш	ИрКАЗ	-	-	Нет загрязнения
4ш	Детский сад	0,1	-	Слабое загрязнение
5ш	Автобусная остановка.	0,1	-	Слабое загрязнение
7ш	Улица Ленина	-	-	Нет загрязнения
8ш	Место выгула собак.	-	-	Нет загрязнения
9ш	Автомагистраль	-	-	Нет загрязнения
12ш	Посев овса	-	-	Нет загрязнения

4.4 Видовой состав санитарно-показательных микроорганизмов в урбаноземах промышленных городов Иркутской области

Таблица 9

Количество штаммов БГКП, изолированных из урбаноземов промышленных городов Иркутской области

Город	Число выделенных штаммов	Количество штаммов, принадлежащих к видам:
		E. coli	Ent. cloaceae	C. freundii
Ангарск	10	1	2	7
Усолье-Сибирское	18	4	10	4
Саянск	9	0	2	7
Шелехов	3	0	1	2
Общее количество штук	40	5	15	20

Видовая принадлежность изолированных 40 штаммов бактерий группы кишечной палочки установлена по совокупности морфологических, культуральных, тинкториальных и физиолого-биохимических признаков по Определителю бактерий Берджи (38), «Санитарной микробиологии почвы» (Мишустин, 1979) и «Руководство по санитарной охране почвы» (Лоранский, 1972).

Все изолированные нами грамотрицательные, подвижные, палочковидные бактерии, сбраживающие глюкозу в среде Кесслер и дающие типичный рост на среде Эндо отнесены к семейству Enterobacteriaceae; родам Enterobacter, Citrobacter, Eschericia; видам E. coli (5 штаммов), C.freundii (20 штаммов), E. cloaceae (15 штаммов). В таблице 10 представлены дифференциальные признаки изолированных штаммов бактерий группы кишечной палочки, которые наглядно подтверждают принадлежность их к видам Citrobacter freundii. Enterobacter cloaceae, Escherichia coli.

Таблица 10

Дифференциальные признаки санитарно-показательных бактерий, изолированных из урбаноземов промышленных городов Иркутской области

Признак	Citrobacter freundii (20 шт.)	Enterobacter cloaceae (15 шт.)	Escherichia coli (5 шт.)
Окраска по Граму	-	-	-
Температурный тест (на среде с глюкозой при 44?С)	+	+	-
Образование Индола	+/-	+/-	+/-
Реакция с метиленовым синим	+	-	+
Образование ацетилметилкарбинола	-	+	+/-
Цитратный тест	+	-	-
Образование H2S	+	-	-
Оксидазная активность (24 ч)	-	-	-
Уреазная активность	-	-	+



ВЫВОДЫ

1. Исследование по санитарно-микробиологическим показателям 52 пробы урбаноземов промышленных городов Иркутской области.

2. В урбаноземах городов Ангарск и Усолье-Сибирское численность сапрофитных гетеротрофных бактерий значительно выше, чем в урбаноземах Саянска и Шелехова, на основании чего урбаноземы промышленных городов Иркутской области оценены, в основном, как умеренно и слабо загрязненные.

3. Гетеротрофный бактериальный комплекс урбаноземов промышленных городов Иркутской области представлен родами Bacillus, Pseudomonas, Mycobacterium, Micrococcus, при этом во всех образцах доминировали представители рода Bacillus.

4. Санитарно-показательные бактерии группы кишечной палочки в небольшом количестве (титр 0,1) обнаружены в почвах городов Саянск и Шелехов и представлены видами Enterobacter cloaceae, Citrobacter freundii; данные урбаноземы оценены как слабо загрязенные.

5. В урбаноземах г. Ангарска титр бактерий группы кишечной палочки был от 0,1 до 0,001 в зависимости от места отбора проб. Наибольшее количество кишечной палочки выявлено на трамвайно-автобусных остановках и жилом секторе. В связи с этим урбаноземы характеризуются как умеренно и слабо загрязненные.

6. В урбаноземах Усолья- Сибирского титр бактерий группы кишечной палочки был достаточно высоким (0,01-0,00001); кроме видов Enterobacter cloaceae и Citrobacter freundii здесь обнаружены представители вида Escherichia coli. Урбаноземы по санитарно-гигиеническому состоянию оценены как умеренно и сильно загрязненные.



СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Агаркова М.Г. Особенности городских почв и их систематика., Автореф.дис.канд.биол.наук, - М.: МГУ, 1991, с. 24.

2. Агаркова М.Г., Целищева Л.К., Строганова М.Н. Морфологические особенности городских почв и их систематика. //Вестн. МГУ, Сер17, Почвоведение, 1991, №2, с. 11-16.

3. Алексеева С.А. Геохимическая экология микроорганизмов, обитающих в почвах с разным уровнем содержания меди и цинка. - М.: Автореф.канд.дис.; 1986, с. 15-18.

4. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. - М.: МГУ, 1989, с. 336.

5. Барыкова Ю.Н. Микробиологическая характеристика лессированных урбаноземов (Ирк. обл.) //География и природные ресурсы, 1992, №2, с. 72-78.

6. Барыкова М.Н. Влияние техногенных выбросов БЦБК на почвенные микроорганизмы//География и природные ресурсы, 1992, №2, с. 72-78.

7. Билетова Н.В. и другие. Санитарная микробиология. - М.: Пищевая промышленность, 1980, с. 123-136.

8. Вольпе И.М., Кучеренко В.Д. Практическое руководство по санитарной микробиологии. М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1990, с. 50-90.

9. Геннадиев А.Н., Солнцева Н.П., Герасимова М.И. О принципах группировки и номенклатуры техногенно-измененных почв //Почвоведение, 1992, №2, с. 49-60.

10. Головчченко А.В., Полянская Л.М., Добровольская Т.Г. и др. Особенности пространственного распределения и структуры микробных комплексов болотно-лесных экосистем //Почвоведение, 1993, №10, с. 79.

11. Государственный доклад о состоянии окружающей природной среды Иркутской области в 1995 г. - Иркутск, 1996.

12. Добровольская Т.Г., Лысак Л.В., Звягинцев Д.Г. Почвы микробное разнообразие //Почвоведение, 1996, №6, с. 699-704.

13. Добровольская Т.Г., Чернов И.Ю., Звягинцев Д.Г. О показателях структуры бактериальных сообществ //Микробиология, 1997, №3, с. 408-414.

14. Добровольский Т.В., Никитин Е.Д. Функции почв в биосфере и экосистемах. М.: Наука, 1990, с. 261.

15. Добровольский Т.В. Почва, город, экология. Фонд «За экологическую грамотность», 1997, с. 320.

16. Джувеликн Х.А. Техногенное загрязнение черноземов тяжелыми металлами //Природные ресурсы Воронежской области, их мониторинг и охрана. - Воронеж, 1995, с. 174-176.

17. Евдокимова Г.В. Методологические подходы и методы оценки структурно-функционального состояния почвенной микробиоты в естественных и техногенных условиях. - Апатиты, 1992, с. 20.

18. Звягинцев Д.Г., Добровольская Т.Г., Полянская Л.М. и др. Теоретические основы экологические основы экологической оценки микробных ресурсов почв//Почвоведение, 1994, №4, с. 65-73.

19. Звягинцев Д.Г., Добровольская Т.Г., Лысак Л.В. Вертикальный континуум бактериальных сообществ в наземных биогеоценозах //Журн. Общей биологии, 1991, Т.52, с. 162-171.

20. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. М.: Изд-во МГУ, 1987, с. 256.

21. Калина Г.П. Бактерии группы кишечной палочки. Санитарная миробиология. М.: Медицина, 1969, с. 20-40.

22. Красильников Н.А. Методы изучения почвенных микроорганизмов и их метаболитов. М.: МГУ, 1966, с. 215.

23. Краткий определитель бактерий Берджи (под ред. Дж. Хоуптона). М.: Мир, 1980.

24. Матвеев А.Н., Самусёнок В.П., Юрьев А.Л. Оценка воздействия на окружающую среду. Изд. Иркутского госуниверситета, 2007.

25. Куличева Н.Н., Лысак Л.В. и др. Бактерии в почве, опаде и фитоплане городской экосистемы. М.: МГУ, 1995, с. 65-72.

26. Лоранский Д.Н. Руководство по санитарной охране почв. М., 1972, с. 90-94.

27. Марфенина О.Е. Микробиологический мониторинг почв: возможности и перспективы //Почвоведение, 1994, №1, с. 75-80.

28. Макарова А.П., Напрасникова Е.В. Сравнительная микробиологическая характеристика урбаноземов гг. Иркутск и Шелехов //Биоразнообразие микроорганизмов Восточно-Сибирского региона и их научно-практическое использование: Тез. докл. науч. конф. - Иркутск, 1999, с. 41-42.

29. Методические указания по санитарно-микробиологическому анализу почвы. - М.: Федеральный центр госэпиднадзора Минздрава России, 1999, с. 73.

30. Методы санитарно-микробиологического анализа воды (МУК 4.2.671-97 Минздрав России, 1997).

31. Мишустин Е.В., Перцовская М.И., Горбов В.А. Санитарная микробиология почвы. М., Наука, 1979, с. 304-324.

32. Мирчинк Т.Г. Почвенная микология. - М.: МГУ, 1991.

33. Напрасникова Е.В., Макарова А.П. Санитарно-микробиологическая м биохимическая характеристика почв в условиях техногенеза и урбанизации //Гигиена и санитария, 1999, №3, с. 15-17.

34. Напрасникова Е.В. Биодиагностика почв антропогенных геосистем //География и природные ресурсы, 2001, №1, с. 55-59.

35. Напрасникова Е.В. Основные подходы, методы и результаты изучения биогенныз свойств почв Шарыповского промузла (зона КАТЭКа)//Экологические проблемы урбанизированных территорий. Иркутск, 1998, с. 105-113.

36. Напрасникова Е.В., Макарова А.П. Санитарно-экологическое состояние почвенного покрова рекреационных зон г. Иркутска, 2002.

37. Напрасникова Е.В., Снытко В.А. Щелочно-кислотные условия и биохимическая активность как показатели антропогенной изменчивости почв Прибайкалья//География и природные ресурсы, 2001, №3, с. 139-141.

38. Определитель бактерий Берджи. Том 1. Изд-во Мир, М., 1997.

39. Осипов В.И. Зоны геологического риска на территории Москвы//Вестн. РАН. 1994, Т.64. №1, с. 32-45.

40. Практикум по микробиологии /под ред. Егорова Н.С./М., Из-во Моск. Ун-та, 1976, с. 56-118.

41. Прокофьева Т.В., Седов С.Н. и др. Опыт микроморфологической диагностики городских почв//Почвоведение, 2001, №7, с. 879-890.

42. Рохмистров В.П., Иванова Т.Г., Жихарева А.М. Оценка загрязнения почвенного покрова крупными промышленными предприятиями//Регион и география: тез. докл. межд. науч. прак. конф., Пермь, 1995, май.

43. Сараев В.Г. Экологический риск воздействия фтора алюминиевого завода в Прибайкалье//Экологический риск: анализ, оценка, прогноз. - Иркутск, 1998.

44. Строганова М.Н., Мягкова А.Д., Прокофьева Т.В. роль почв в городских экосистемах//Почвоведение, 1992, №7, с. 16-25.

45. Строганова М.Н., Агаркова М.Г. Городские почвы: опыт изучения и систематики (на примере почв юго-западной части г. Москвы) //Почвоведение, 1992, №7, с. 16-25.

46. Строганова М.Н. Городские почвы: генезис, систематика и экологическое значение (на примере г. Москвы). Автореф. дис. канд. биол. наук. М.: МГУ, 1998, с. 71.

47. Сизов А.П., Медведева О.Е., Клюев Н.Н. и др. о новом подходе к исчислению ущерба, вызываемого захламлением, загрязнением и нарушением городских земель//Почвоведение, 2001, №6, с. 732-740.

48. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. М.: Изд-во «Дрофа», 2004.

49. Хавина Л.Н. Экологическая ситуация в городе Шелехове (Ирк. обл.)//География и природные ресурсы, 2001, №3, с. 136-139.

50. Хазиев Ф.К. Системно-экологический анализ ферментной активности почв. М.: Наука, 1982, с. 202.

51. Хазиев Ф.К, Методы почвенной энзимологии. М.: Наука, 1990, с. 186.

52. Soils in ...