Исследование качественной и количественного состава бактериальных сообществ урбаноземов промышленных городов Иркутской области

Размещено на http://www.allbest.ru/

6

Введение

При социальной оценке окружающей среды, наряду с различными характеристиками, исследуются санитарно-гигиенические условия (Матвеев, 2007).

Обнаружение санитарно-показательных микроорганизмов во внешней среде свидетельствует о загрязнении ее выделениями человека и животных. Так как с этими же выделениями во внешнюю среду могут поступать патогенные микроорганизмы - возбудители заболеваний, обнаружение того или иного санитарно-показательного микроорганизма, специфического для данного объекта или для данного экскрета, косвенно указывает на возможность поступления в исследуемый объект и патогенных микроорганизмов (Калина, 1969).

В задачи моей работы входило:

1. Исследование качественной и количественного состава бактериальных сообществ урбаноземов промышленных городов Иркутской области.

2. Дифференциация бактерий, доминирующих в исследуемых объектах.

3. Количественное определение в исследуемых почвах бактерий группы кишечной палочки.

4. Идентификация бактерий группы кишечной палочки и оценка санитарного состояния урбаноземов промышленных городов Иркутской области.

Работа выполнена на базе кафедры микробиологии биолого-почвенного факультета Иркутского Государственного Университета под руководством доцента кафедры микробиологии, кандидата биологических наук Макаровой Альбины Павловны.

1. Обзор литературы

1.1 Роль почв в городских экосистемах

Экосистема (как и человек) может функционировать лишь при определенном качестве окружающей среды (Хавина, 2001).

На рубеже тысячелетий проблема совершенствования оценки состояния земель, почв и процессов их изменения (как правило, ухудшения) обретает новое значение. На первый план выходят те почвы, изучение которых ранее не считалось приоритетной задачей, в частности, почвы городов и близлежащих населенных пунктов (Сизов, 2001).

Рост городов-гигантов приводит к интенсивному воздействию человека на окружающую среду, как самого мегаполиса, так и обширных пространств вокруг него (Строганова, 1998).

Городские почвы формируются при совместном воздействии зонально-климатических факторов и средообразующего антропогенного фактора, который воздействует на почвы как прямо в виде способа землепользования, так и косвенно - изменяя факторы почвообразования (Прокофьева, 2001, Берджи, 1994).

В широком понимании городская почва - это любая почва или почвоподобное тело, функционирующее в окружающей среде города. В узком смысле этот термин подразумевает почвы и почвоподобные тела, находящиеся по «прессом» города (Строганова, 1992).

Специфические особенности городских почв обусловлены чрезвычайно сильным воздействием антропо-техногенных процессов: загрязнение разнообразными химическими веществами и обломками строительных материалов, интенсивная рекреационная нагрузка, накопление культурного слоя, использование почвы в качестве основания для строительства домов, промышленных объектов, прокладки автомагистралей и энергосистем (Прокофьева, 2001).

Возникает проблема необеспеченности городов природно-ресурсным потенциалом, что выражается в недостаточных площадях зеленых насаждения, развитии опасных геодинамических процессов. Происходит изменение уровня грунтовых вод. Идет постепенное подтопление некоторых частей города, поскольку нарушается естественный круговорот воды. В местах интенсивно застройки осушаются болота, засыпаются русла рек. Также происходит изменение форм рельефа. С одной стороны, наблюдается нивелирование форм рельефа: засыпание оврагов, заключение мелких речек в трубы и подземные коммуникации, засыпание пойм, срезание холмов и склонов. С другой стороны, в центрах городов рельеф приподнят за счет накопления культурного слоя. Все это приводит к потере устойчивости территорий, увеличивая абиотичности системы, повышении степени экологического риска для всех компонентов окружающей среды: воздуха, почвы, воды и грунтов (Осипов, 1994, Строганова, 1992, Строганова, 1997).

Таким образом, изменения качества среды обитания человека в городе ведет к снижению комфортности жизни населения, подтверждением чего являются медико-демографические показатели городов, в частности, высокий уровень заболеваемости, рост генетических болезней, появление новых и, как результат, - снижение продолжительности жизни. По прогнозам ученых эти тенденции будут усиливаться, особенно в мега- и мегалополисах (Строганова, 1998, Сизов, 2001).

Рассматривая городские почвы, мы исходим из того, что вся территория города представлена: 1 - открытыми, частично озелененными территориями; 2 - закрытыми - застроенными и заасфальтированными участками. Поверхностные тела территорий первого типа разделяются на группы естественных нарушенных почв, поверхностно преобразованных урбопочв, антропогенных глубокопреобразованных - урбаноземов и искусственно созданных - техноземов. Также на открытых поверхностях город могут залегать непочвенные образования - техногенные и насыпные, намывные, перемешанные природные грунты. На заасфальтированных территориях второго типа под асфальтобетоном или другими дорожными покрытиями формируется особая группа тел - запечатанные почвы «экраноземы» и запечатанные грунты (Добровольский, 1997, Прокофьева, 2001, Строганова, 1998).

В крупных городах и промышленных центрах до 70-90% поверхности почвы запечатано асфальтобетоном или жилыми и промышленными постройками, следствием чего большая доля загрязненных осадков минует почвенное тело и непосредственно уходит через канализацию в водоемы и речную сеть. Таким образом, асфальтобетонное покрытие защищает почву от основной массы загрязнителей и препятствует проникновению в нее дождевых осадков, изменяет водно-воздушный режим; в ней продолжается жизнедеятельность микроорганизмов, что свидетельствует о газообмене почвы с воздухом атмосферы. Еще одним негативным последствием является парниковый эффект, создающийся в результате запечатывания почвы. Без естественной аэрации почва переувлажняется, что способствует повышению влажности в подвалах и разрушению фундаментов. В результате страдает здоровье жителей нижних этажей: наблюдается повышенная влажность помещения, развитие патогенной и грибковой микрофлоры, борьба с которой практически невозможна. Излишнее покрытие почвы асфальтом в лесопарках, скверах, на бульварах и прочих территориях также неблагоприятно: корни, распространяющиеся под асфальт, гибнут в анаэробных условиях. Поэтому необходимо заменять непроницаемое покрытие экологически чистой брусчаткой или другими проницаемыми материалами.

Почвы или почвоподобные тела, формирующиеся в урбоэкосистеме, аналогично природным почвам выполняют роль базисной составляющей, в них замыкаются биогеохимическое преобразование культурного насыпного слоя, трансформация поверхностных вод в грунтовые, они являются питательным субстратом для растений. Почва служит банком семян, регулятором газового обмена и т.д. (Бабьева, 1989, Сараев, 1998)

Городские почвы выполняют в городе разнообразные экологические функции (Добровольский, 1997). Главными их характеристиками являются плодородие, пригодность для произрастания зеленых насаждений, способность сорбировать в толще загрязняющие вещества, и удерживать их от проникновения в почвенно-грунтовые воды, а также от поступления пыли в городской воздух. Роль почвы в городе существенна и разнообразна. Выполняя важные средообразующие функции, почва изменяет химический состав атмосферных осадков и подземных вод, она является универсальным биологическим адсорбентом, поставщиком и регулятором содержания СО₂, О₂, N₂ в воздухе. Почва является хорошим поглотительным барьером газовых примесей, в том числе она также регулирует газовый состав атмосферы путем выделения и поглощения газов (метана, аммиака и др.).

Благодаря определенным биогеохимическим свойствам и огромной активной поверхности тонкодисперсной части почва превращается в «депо» токсических соединений и одновременно становится одним из важнейших биогеохимических барьеров для большинства соединений (минеральных удобрений, пестицидов, нефтепродуктов и т.д.) на пути их миграции из атмосферы города в грунтовые воды и речную сеть. Почва переводит поверхностные сточные воды в грунтовые и очищает их, а также выполняет функцию защитного сорбционного барьера от загрязнения пресных вод и водоемов (Звягинцев, 1987, Строганова, 1997).

Почва - одно из необходимых условий произрастания зеленых насаждений. Экологически неорганизованные, неозелененные городские территории являются дополнительным источником твердого вещества, поступающего в атмосферу и усиливающего эффект запыленности воздуха токсическими веществами. Одно из основных требований к почвам в городах - обеспечение оптимальных условий произрастания зеленой растительности в системах урбанофитоценозов (Bullock, 1991).

Современные проблемы городской экологии разнообразны и включают в себя изучение роли почв в городских экосистемах. Изменение городских ландшафтов в результате землепользования приводит к трансформации почвенных свойств и, в результате, - к смене почвенно-экологического ядра. Для разрешения данных проблем должны быть изучены свойства почв и степень их загрязнения (Строганова, 1997).

Для сохранения и восстановления городских экосистем необходимо систематическое санитарно-микробиологическое изучение урбаноземов, как одно из направлений экологического контроля окружающей среды. Это позволит в комплексе с другими интегральными показателями санитарной функции почв выработать соответствующие подходы к санации городских почв.

Становится очевидным, что в условиях городов, а тем более крупных городских агломераций, жизненно необходимо принимать особые меры по обеспечению охраны почв (Сизов, 2001).

1.2 Краткая характеристика урбаноземов

Одной из проблем современности является урбанизация стран с высокой долей городского населения. Эта проблема затрагивает и РФ, где в городах и населенных пунктах проживает около ѕ населения, т.е. более 100 млн. человек на территории, равной 0,65% от общей площади. Быстро растущая урбанизация и прогрессивное увеличение площадей под городами и населенными пунктами приводит к тому, что городская среда постоянно развивается, подвергаясь воздействию внутренних и внешних факторов.

Современная урбанизация сопровождается значительным отчуждением продуктивных земель под городские застройки и промышленные объекты, и площадь таких земель повсеместно увеличивается. По данным Организации экономического сотрудничества и развития, за последние 20 лет площадь под застройки росла в два раза быстрее, чем население. Численность населения, проживающего в городах в 90 гг. 20 в. Составляла 2,3 млрд. человек, а урбанизированные земли, по оценке Исполкома ЮНЕП, составляют 60 млн. га, или 0,46% всей площади земель мира. К 2001 г. в городах проживало 3,2 млрд. человек, а площадь урбанизированных земель превысила 100 млн. га. К 2005 г. 50% населения планеты жили в урбанизированном мире (Строганова, 1997, Сизов, 2001).

Урбаноземы - генетически самостоятельные почвы, обладающие как чертами зональных почв, так и специфическими свойствами (Строганова, 1997).

Согласно классификации Агарковой (Агаркова, 1991), урбаноземы предлагается подразделять на:

1) собственно урбаноземы, которые характеризуются отсутствием генетических горизонтов до глубины 0,5 см. обычно они представлены культурными отложениями, состоящими из своеобразного пылевато-гумусного субстрата разной мощности и качества с примесью городского мусор; могут подпираться какой-либо преградой;

2) культуроземы - городские почвы фруктовых и ботанических садов, старых парков или бывших хорошо окультуренных пашен; отличаются большой мощностью гумусного горизонта и перегнойно-торфокомпостного слоя разной мощности, развиваются на нижней иллювиальной части почвенного профиля исходной природной почвы;

3) индустриоземы - почвы промышленных зон, сильно техногеннозагрязенные и уплотненные;

4) некроземы - почвы, входящие в комплекс почв городских кладбищ.

Наряду с искусственно созданными урбаноземами в городе выделяются и естественные почвы разной степени нарушенности. Они сочетают в себе ненарушенную нижнюю часть профиля и антропогенно нарушенные верхние слои. В слабонарушенных почвах нарушения затрагивают гумусово-аккумулятивные горизонты (до глубины 10-25 см). К подгруппе погребенных относятся почвы, сохранившие под антропогенной толщей весь почвенный профиль или какую-либо его верхнюю часть (Строганова, 1992).

Несмотря на нарушенность или искусственное создание почвенного профиля, большую засоренность его разного рода включениями и изменения общих экологический условий функционирования, в урбаноземах протекают процессы гумусообразования,, выноса и перераспределения минерального вещества (Агаркова, 1991).

Между тем основные трансформации почв и почвенного покрова так или иначе связанные с человеком, вызваны, строго говоря, его производственной деятельностью - теми или иными орудиями труда (примитивными или современными), т.е. техникой в ее широком понимании. К таким почвам относятся индустриоземы, т.е. почвы промышленных зон, находящиеся под действием техногенеза.

Техногенез стал в настоящее время мощным фактором почвообразования, воздействие которого на почвы приобретает глобальный масштаб.

Техногенноизмененные почвы целесообразно определить как почвы, являющиеся в той или иной степени продуктом технопедогенеза - такого почвообразовательного процесса, который испытывает на себе влияние деятельности человека. Техногенноизмененные почвы отражают это влияние на своих свойствах (Геннадиев, 1992).

По прогнозным оценкам экологов состояние урбаноземов будет ухудшаться под действием растущих негативных процессов. Поэтому необходимо применять меры по санитарной охране почв:

1. Охрана зональных, естественных почв, борьба с эрозией, предотвращение вырубок деревьев и кустарников.

2. Содержание в порядке канализационной системы.

3. Очистка населенных пунктов и захоронение отходов в строго определенном месте.

4. Охрана водоемов от проникновения в них сточных вод и предотвращение выбросов канцерогенных веществ (Агаркова, 1991, Строганова, 1998).

1.3 Особенности состояния микробиоценозов городских почв под влиянием техногенеза и урбанизации

В настоящее время почва рассматривается как банк, котором хранятся самые разнообразные виды микроорганизмов (Звягинцев, 1994).

Населенность почвы микроорганизмами - показатель ее биогенности (Барыкова, 1992).

Почва благодаря своей трехфазности способна обеспечивать условия для существования в ней разнообразных микроорганизмов, одни из которых находятся на почвенных частицах, другие - в водных пленках, капиллярах или почвенном растворе. Для адсорбции на почвенных частицах у бактерий существуют специальные приспособления: капсулы, простеки, фимбрии и др. Большая часть микроорганизмов в естественных условиях адгезированы на твердофазном субстрате (Звягинцев, 1991).

Микрозональность распределения микроорганизмов в почве с адгезией клеток на твердых поверхностях имеет принципиальное значение, так как в адсорбированном состоянии у микроорганизмов меняются морфология клеток, циклы развития, продолжительность лаг-фазы, скорость размножения. В отдельных микрозонах создаются совершенно различные условия, появляется возможность развития в почве - чрезвычайно структурированном биотопе - самых различных по своим свойствам групп микроорганизмов (Головченко, 1993).

Почва является средой обитания бактерий, актиномицетов, грибов, простейших, микроскопических водорослей, вирусов. Все эти организмы составляют сложные и весьма изменчивые ассоциации. Преобладают при этом аэробные, анаэробные бактерии и грибы (Барыкова, 1992, Добровольская, 1997).

Считается, что микробный компонент, биомасса которого в почвах может достигать 3-9 т/га, выполняет одну из важнейших в наземных экосистемах функцию стабилизации, так как полифункциональность микробиоты позволяет участвовать ей в реакциях, определяющих метаболическое равновесие в природе (Красильников, 1966).

Все возможные органические соединения растительного и животного происхождения, попадая в почву, аккумулируются в верхних ее слоях (0-25 см), где обуславливают более высокий показатель микробного населения. Количество сапрофитных бактерий в загрязненных органическими веществами почве достигает иногда 10-15 млн. в 1 г. В относительно чистых почвах оно не превышает 1,5-2 млн. в 1 г. (Геннадиев, 1992, Макарова, 1999)

Хорошо известно, что микроорганизмы относительно устойчивы к воздействию окружающей среды по сравнению с другими представителями живой природы. Однако исследования последних лет показали, что данный компонент любой экосистемы при усиленно возрастающем техногенезе и урбанизации уязвим. Иными словами, в микробиоценозах происходит изменение количественного и качественного состава микроорганизмов, меняется их разнообразие и энзиматическая активность. Нарушения могут быть столь серьезными, что микроорганизмы окажутся не в состоянии осуществлять деструкцию органических остатков и высвобождать минеральные вещества для растений (Барыкова, 1992, Напрасникова, 1999).

Анализ работ Джувеликяна и Рохмистрова, по влиянию тяжелых металлов на микробные комплексы позволяет сказать, что длительное загрязнение почв вызывает изменение в численности основных групп почвенной микрофлоры (Джувеликян, 1995). Уменьшается содержание бактерий и актиномицетов. Более устойчивы к загрязнению микроскопические грибы (Рохмистров, 1995).

Интересные данные находим в работе С.А.Алексеевой, где при изучении микробных сообществ с различным содержанием меди цинка, марганца было установлено, что наибольшей устойчивостью к ним характеризуются микроскопические грибы, наименьшей - бактерии (Алексеева, 1986).

Структура сапрофитного бактериального комплекса (СБК) городской экосистемы изучена недостаточно. Известно, например, что в наземном ярусе и опаде доминируют грамотрицательные бактерии, а в почвенном ярусе на первый план выходят грамположительные бактерии родов Bacillus, Artrobacter и актиномицеты рода Streptomyces. Это характерно как для нарушенных экосистем, так и для городских урбанизированных территорий.

На современном этапе урбанизации жизни населения особое значение имеет санитарное состояние почв. В настоящее время, когда внимание экологов направлено на глубокие исследования экологических функций почв, показано, что санитарная функция и есть одна из экологических (Добровольский, 1990).

В урбанизированных экосистемах сохраняются закономерности пространственной организации бактериальных комплексов, характерные для естественных экосистем, однако, при этом выявляется и некоторая перестройка в таксономической структуре сапрофитного бактериального комплекса. В условиях города происходит перераспределение таксонов в пользу увеличения удельного веса бактерий, тесно связанных с человеком (род Micrococcus), а также приспособленных к существованию в условиях города (пигментированные родококки) (Куличева, 1995).

В работах Мишустина показано существенное превышение показателей численности сапрофитных бактерий в городских почвах, как свидетельство об их загрязненности теми или иными органическими веществами. Снижение количества сапрофитных бактерий говорит о высокой токсичности и загрязнении ядовитыми промышленными выбросами (Мишустин, 1979).

В работах указанных выше авторов приводятся данные об индикационном показателе на загрязненность городских почв спорообразующих бактерий - Bacillus mesentericus subtilis (Напрасникова, 1998).

Индикаторами загрязнения можно считать и энтерококки. Они несвойственны почве, поэтому могут служить показателями фекального загрязнения окружающей среды. Энтерококки не обнаруживаются в незагрязненных почвах и в почвах, удаленных от жилья (Мишустин, 1979).

В фекальных массах могут находиться и болезнетворные микробы - возбудители дизентерии, холеры, сибирской язвы и др. они обладают ограниченной способностью к размножению в почве и могут использоваться как индикаторы на загрязнение окружающей среды (Калина, 1969).

В условиях города практически везде возрастает значимость представителей группы кишечной палочки. Возрастание численности БГКП в городских экосистемах вполне закономерно, поскольку высокая плотность населения как основного источника микробного загрязнения сочетается с наличием городских отходов, в которых бактерии группы кишечной палочки (БГКП) могут выживать и накапливаться.

Кроме способности участвовать в самоочищении почвы, БГКП являются санитарно-показательными микроорганизмами. По их количественному и качественному составу судят о санитарном состоянии почвы. Резкое увеличение их численности в почвах косвенно может свидетельствовать об эпидемиологическом неблагополучии (Напрасникова, 2002).

1.4 Бактерии группы кишечной палочки (БГКП), как показатели санитарного состояния почв

Бактерии группы кишечной палочки (БГКП), населяющие фекальные массы, не свойственны незагрязненным (чистым) почвам, вследствие чего их удобно использовать для оценки санитарного состояния почвы (Лоранский, 1972, Мишустин, 1979).

Санитарно-показательное значение бактерий группы кишечной палочки (БГКП) обусловлено тем, что по своим свойствам они близки к тифозно-паратифозной группе. Это позволяет распространять выводы, получаемые при работе с кишечной палочкой на патогенную и дизентерийную микрофлору, выявление которой в почве представляет значительные трудности (Билетова, 1980).

Связь между загрязнением почвы и содержанием в ней БГКП отмечена давно. Проникновение кишечной палочки на глубину зависит от структуры почвы и состояния поверхностного слоя. В сильно загрязненных, нарушенных почвах кишечная палочка обнаруживается даже на глубине 1 м, хотя в основном, как и другие бактерии, она может быть сосредоточена в поверхностном слое (до 30-40 см). Однако долго существовать в условиях почвы БГКП не могут, и со временем количество их уменьшается через несколько месяцев, т.е. даже сильно загрязненные почвы самоочищаются от бактерий группы кишечной палочки (Калина, 1969).

К бактериям группы кишечной палочки (БГКП) относятся микроорганизмы, входящие в семейство Enterobacteriaceae. Это подвижные грамположительные, неспороносные палочковидные бактерии, факультативные анаэробы, сбраживающие углеводы при 35-37 градусах Цельсия с образованием кислоты и газа, растущие на фуксинсульфитном агаре (агар Эндо) с образованием красных с металлическим блеском, темно-красных или розовых колоний. На МПА через сутки образуются прозрачные с серовато-голубым отливом, сочные колонии, при росте на МПБ исходит образование осадка. Биохимические свойства непостоянны в отношении сбраживания углеводов, поэтому при дифференциации их учитывают не самостоятельно, а в комплексе с другими тестами.

Основными санитарно-показательными микроорганизмами являются представители родов Esherichia, Citrobacter, Enterobacter, которые удовлетворяют требованиям, предъявляемым к санитарно-показательным микроорганизмам:

1. могут выделяться во внешнюю среду из организма хозяина в количествах больших, чем соответствующие патогенные бактерии;

2. обладают довольно ограниченной способностью к активному размножению во внешней среде;

3. сохраняют жизнеспособность в среде такой же период времени, как и патогенные бактерии;

4. устойчивость их к естественным и искусственным воздействиям не ниже, чем у соответствующих патогенных микроорганизмов;

5. легко и просто, в отличие от возбудителей дизентерии, тифа, паратифа, сальмонеллеза, обнаруживаются и дифференцируются;

6. присутствие других микроорганизмов в исследуемом объекте не влияет на их рост в элективных средах.

При оценке санитарного состояния почв учитывается общее количество БГКП (бродильный титр) и отдельно количество сапрофитных хемоорганотрофных бактерий. Чистыми считаются почвы, бродильных титр которых 1,0; слабо загрязненными - 0,1-0,01;умеренно загрязненными - 0,01-0,001; сильно загрязненными - 0,001 и более. Однако данная оценка санитарного состояния почв не является официальной. В отличие от воды, почва не имеет нормативных актов, жестко регламентирующих содержание в ней БГКП и сапрофитных микроорганизмов (Билетова, 1980).

1.5 Классификация бактерий группы кишечной палочки

Кишечным палочкам присуща изменчивость, в результат которой возникают разнообразные варианты этих бактерий. Эти особенности усложнили таксономию всей группы бактерий кишечной палочки и привели к созданию многочисленных классификаций, основанных на случайных признаках и имеющих в настоящее время лишь исторический интерес (Вольпе, 1990).

Многие ранние классификации Enterobacteriaceae учитывали случайные, не имеющие экологического и эволюционного значения признаки - подвижность, способность к сбраживанию большого числа углеводов и т.п. Многочисленные варианты бактерий, образующиеся в этой мало стабильной группе, считали самостоятельными видами и давали им особое название. Позднее были выдвинуты принципы классификации бактерий кишечной группы, основанные на экологических представлениях. Комплекс признаков был выражен формулой ЛИМАЦ (сбраживание лактозы при 44 градусов Цельсия; образование индола; интенсивность сбраживания глюкозы, определяемая реакцией с метиленовым красным; образование ацетилметилкарбинола, использование цитратных солей как единственного источника углеродного питания), которая позволяла дифференцировать фекальные типы кишечной палочки от «почвенных» (таблица 1).

Таблица 1. Дифференциальные признаки видов санитарно-показательных бактерий группы кишечной палочки.

Названия родов	Названия видов	Дифференциальные признаки
		Сбраживание лактозы	Образование индола	Реакции с метиленовым красным	Образование ацетилметилкарбинола	Использование цитратов	Образование H2S	Разжижение желатина
Esherichia	E. coli E. coli var coli forne E. coli var aurens	+ - +/-	+/- +/- +/-	+ + +	+/- - -	- - -	- - -	- - -
Citrobacter	C. freundii C. freundii var parafreundii C. freundii var intermedium	+ - +	+/- +/- +/-	+ + +	- - -	+ + +	+ + -	- - -
Enterobacter	Ent. aerogenes Ent. aerogenes var aerogenoides Ent. cloacae Ent. alginlyticus	+ - + +	+/- +/- - -	- - - +	+ + + +	+ + + +	- - - +	- - - -

Наиболее ярко экологический подход был выражен в классификации И.Е.Мицкевича, оказавшей заметное влияние на последующее развитие таксономии бактерий группы кишечной палочки.

В 1960 г. Международным номенклатурным комитетом учреждена новая классификация семейства Enterobacteriaceae, разработанная Эвингом и Эдвардсом (Ewing&Edwards).

По классификации Эвинга и Эдвардса (Ewing&Edwards) семейство Enterobacteriaceae разделено на 4 трибы: Escherichiae, Salmonellae, Klebsielleae, Proteae. Каждая триба включает по 2-3 рода, которые в свою очередь делятся на виды. Достоинство данной классификации - распространение на семейство Enterobacteriaceae широко используемого в санитарной бактериологии комплекса ТИМАЦ с учетом некоторых дополнительных биохимических показателей (Калина, 1969).

Во всех ранее существовавших классификациях уделялось большое внимание способности кишечных палочек сбраживать лактозу. Этот признак был дифференцирующим при определении санитарно-показательного значения изучаемых микроорганизмов. Считалось, что лактозоотрицательные варианты отличаются от лактозоположительных тем, что средой обитания их является почва, вода, растения.

Особенностью новой классификации является игнорирование лактозного признака при дифференциации триб и ограниченное значение, придаваемому ему при межродовой дифференциации. Авторы этой классификации исходили из лабильности этого признака и целесообразности объединения микробов в один ряд на основании только отношения к лактозе (Калина, 1969).

В предложенной системе классификации предусматривается комплекс признаков, выраженный формулой ТИМАЦ, где:

Т - температурный тест. Он основан на способности сбраживать глюкозу при 44-46 градусах Цельсия;

И - тест индолообразования. Суть метода сводится к тому, что некоторые кишечные палочки способны расщеплять аминокислоту триптофан, водящую в состав белков и пептонов, с выделением ряда продуктов, в том числе индола;

М - реакция с метиленовым красным (реакция Кларка). Она служит для определения интенсивности кислотообразования при сбраживании глюкозы в питательной среде;

А - реакция на ацетилметилкарбинол. С помощью этой реакции определяют способность микроорганизмов образовывать в среде с глюкозой ацетилметилкарбинол;

Ц - цитратный тест. Он основан на способности некоторых видов микробов, усваивать лимонную кислоту и ее соли в питательной среде, на другие виды эти вещества действуют угнетающе.

Позже для дифференциации были положены дополнительные признаки - уреазная активность (способность расщеплять мочевину), образование сероводорода, оксидазная активность.

Наиболее распространенные культуры БГКП можно дифференцировать, используя таблицу 2.

Таблица 2. Основные дифференциальные признаки родов санитарно-показательных бактерий группы кишечной палочки.

Признак	Escherichia	Citrobacter	Enterobacter
Температурный	-	+	+
Образование индола	+	+/-	+
Реакция с метиленовым красным	+	+	-
Образование ацетилметилкарбинола	+/-	-	+
Цитратный	-	+	+
Образование H2S	-	+	-
Уреазная активность	+	-	-

Определитель бактерий Берджи девятое издание (Берджи, 1997), содержит сведения по идентификации бактерий, в частности бактерий группы кишечной палочки.

Определитель бактерий Берджи предназначен для идентификации бактерий по фенотипическим признакам. Это издание создается в практических целях и не претендует на эволюционизм и формально таксономические построения.

Девятое издание Определителя бактерий Берджи, по-видимому, завершает период определения бактерий на основании морфологических и физиологических признаков. Сейчас идентификация бактерий развивается на основе использования молекулярно-генетических методов (нуклеотидный состав ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот и т.д.) и анализ фрагмента гена 16S рРНК.

рРНК - древняя молекула, консервативная по своей структуре и имеющая строго определенные размеры 1400-1500 н.п. Нуклеиновые последовательности также консервативны и неизменны в пределах царства прокариот. рРНК легко выделяются, ее содержание в клетке значительно. Ген представлен несколькими копиями. Например, у E. coli 7 копий. Число генов, кодируемых высокомолекулярной рРНК от 7 у E. сoli до 200 у низших эукариот (микроскопических грибов) и нескольких сотен у высших эукариот. Гены рРНК устойчивы к антибиотикам, что также используется при идентификации. Таким образом, метод анализа гена 16S рРНК в определенной мере отражает эволюционные отношения между организмами. В девятом издании Определителя бактерий Берджи, завершающего определение бактерий на основании морфологических и физиологических признаков, бактерии группы кишечной палочки помещают в группу 5, подгруппу 1, семейство Enterobacteriaceae.

Эта группа грамотрицательных бактерий включает традиционные семейства Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Pasteurellaceae. Бактерии имеют вид прямых палочек, кроме представителей рода Vibrio, для которых характерна изогнутая или вибриоидная форма. Организмы данной группы могут встречаться как свободноживущие или в ассоциациях с хозяевами - животными или растениями. Многие виды патогенны для человека и животных, а некоторые для насекомых и растений.

Подгруппа 1. Семейство Enterobacteriaceae.

Прямые палочки, обычно 0,3-1,8 нм. По Граму окрашиваются отрицательно. Подвижные за счет перитрихиальных жгутиков или неподвижные. Факультативные анаэробы, хемоорганотрофы, обладающие и дыхательными, и бродильными типами метаболизма. Оптимальная температура 30-37 градусов Цельсия. D-глюкозу и другие углеводы катаболизируют с образованием кислоты, а многие видов, кроме того, и газа. Оксидазоотрицательные и каталазоположительные, за исключением Shigella dysenteriae. Все представители восстанавливают нитраты в нитриты, за исключением Arsenophorus, ряда видов Erwinia, большинства видов Xenirhabdus и некоторых штаммов Klebsiella pneumonia sub ep ozaenae, Pantoea, Yersinia. Распространены повсеместно. Присутствуют в почве, воде, на фруктах, овощах, зерне, цветковых растениях и деревьях, у животных (от червей и насекомых до млекопитающих) и человека.

Входящие в эту группу микроорганизмы весьма разнообразны по особенностям экологии, кругу хозяев, а также патогенности для человека и животных, насекомых и растений. Ряд видов вызывает желудочно-кишечные заболевания, включая тиф и бактериальную дизентерию. Большинство видов может вызывать разнообразные внекишечные инфекции, такие как бактеремия, менингит, а также инфекции мочевыводящих путей, дыхательных путей и раневые инфекции. Бактерии семейства Enterobacteriaceae служат причиной 50% случаев внутрибольничных инфекций, наиболее часто их вызывает Escherichia coli, представители родов Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Providencia, Serratia marcescens.

Семейство Еnterobacteriaceae включает в себя 30 родов (таблица 3).

Таблица 3 Классификация семейства Enterobacteriaceae (Берджи, 1997)

Род	Типовой вид	Примечание
1	2	3
Arsenophonus	Arsenophonus nasoniae	Встречается у самок ос
Budvicia	Budvicia aquatia	Выделены из пресной воды, кала человека и животных
Buttiauxella	Buttiauxella agrestis	Выделены из пресной воды
Cedecea	Cedecea davisae	Источник выделения клинический материал, причем более 50% штаммов выделено из дыхательных путей
Citrobacter	Citrobacter freundii	Встречаются в фекалиях человека и животных, в почве, воде, сточных водах и пищевых продуктах. Выделяют из клинического материала как возбудителей оппортунистических инфекций
Edwardsiella	Edwardsiella tarda	Встречаются в кишечнике пойкилотермных животных и в их среде обитания, особенно в пресной воде, но обнаружены также и у гомойотермных животных и человека
Enterobacter	Enterobacter cloaceae	Широко распространены в природе, встречаются в почве, воде, сточных водах, на растениях, овощах, а также в фекалиях человека и животных.
Edwinia	Edwinia amylovora	Ассоциированы с растениями, очень редки у человека
Escherichia	Escherichia coli	Встречается в нижнем отделе кишечника у гомойотермных животных, а в случае E. Blatte - у тараканов
Ewingella	Ewingella americana	Источник выделения - клинический материал, наиболее часто в мокроте, ранах и крови
Hafnia	Hafnia alvi	Встречаются в фекалиях человека и животных, в т.ч. птиц, сточных водах, почве, воде и молочных продуктах
Klebsiella	Klebsiella pneumoniae	Встречаются в фекалиях человека и клиническом материале, почве, воде, зерне, на фруктах, овощах
Kluyvera	Kluyvera ascorbata	Встречаются на пищевых продуктах, в сточных водах и клиническом материале (мокрота, фекалии, реже в крови)
Leclercia	Leclercia adecarboxylata	Встречаются в мокроте и крови; а также на пищевых продуктах, воде
Moellerella	Moellerella wisconsensis	Встречаются в кале человека и в воде
Morganella	Morganella morganii	Встречаются в фекалиях человека, собак, других млекопитающих и рептилий
Obesumbacterium	Obesumbacterium proteus	Встречаются как примесь в пиве
Pantoea	Pantoea agglomerans	Выделены с поверхности растений, семян, из почвы, а также из ран, крови и мочи человека и животных
Pragia	Pragia fontium	Встречаются в питьевой воде, один штамм выделен из кала человека
Proteus	Proteus vulgaris	Встречаются в кишечнике человека и разнообразных животных, а также в навозе, почве и загрязненных водах
Providensia	Providensia al califaciens	Выделены при желудочно-кишечных расстройствах из кала; при инфекциях мочевых путей; из ран и ожогов, при бактеремии, а также из пингвинов
Rahnella	Rahnella aquatilis	Встречаются в пресной воде. Иногда источников выделения служит клинический материал. Встречаются у человека, гомойотермных и пойкилотермных животных, пищевых продуктах
Salmonella	Salmonella cholerarsuis	Встречаются в пресной воде. Иногда источником выделения служит клинический материал
Serratia	Serratia marcescens	Встречается в клиническом материале, почве, воде, на поверхности растений и других природных источниках, а также в пищевом тракте грызунов и насекомых
Shigella	Shigella dysenteriae	Возбудители кишечных инфекций у человека и приматов
Tatumella	Tatumella ptyseon	Источники выделения - клинический материал (мокрота, кровь)
Xenorhabdus	Xenorhabdus nematophilus	Естественные места обитания - просвет кишечника у энтомопатогенных нематод и внутренние полости тела у насекомых, инфицированных этими нематодами
Yersinia	Yersinia pestis	Встречаются в разных местах, включая человека, животных, грызунов, и птиц, а также в почве, воде, в молочных и других пищевых продуктах
Yokenella	Yokenella regensburgei	Источники выделения раны, моча, мокрота и кал человека, а также кишечник насекомых

2. Состояние почвенного покрова промышленных городов Иркутской области в связи с экологической ситуацией в регионе

В системе взаимоотношений природа и человек городам всегда уделялось большое внимание. Однако в последнее время их техногенное давление на природную среду неизмеримо усилилось, и экологические проблемы приобрели социальное значение, поскольку они связаны с образом жизни человека и тем или иным видом производственной деятельности.

Загрязняющее влияние города столь велико, что не кончается на границе практически видимого воздействия. Города по степени детериорирующего влияния на среду далеко не одинаковы. Особенно сильное загрязнение вызывают промышленные города, в том числе и небольшие, в которых расположены химические, металлургические и нефтеперерабатывающие предприятия (Хавина, 2001).

Существуют весьма важное обстоятельство; многие города Иркутской области расположены и вблизи крупных химических комплексов (Ангарск, Саянск, Усолье-Сибирское) и алюминиевых заводов (Шелехов, Братск). В данной ситуации изменение свойств почвенного покрова неизбежно, что делает актуальным и своевременным его всестороннее изучение (Напрасникова, 2001).

Одной из важнейших экологических функций почвы является санитарная, которая может выражаться в деструкции органических остатков, подавлении развития болезнетворных бактерий, разрушении продуктов обмена живых организмов и дезинтоксикации техногенных загрязнителей (Добровольская, 1996).

Осуществление санитарной функции почвой зависит от ее механического состава, физико-химических свойств, водно-воздушного режима и жизнедеятельности почвенной биоты (Евдокимова, 1992).

Для оценки санитарной функции наиболее распространенных в городах, антропогенно измененных почв - урбаноземов, могут быть использованы количественные и качественные показатели структуры микробных сообществ (Макарова, 1999).

Как известно, в почвах наряду с природными токсическими продуктами в промышленных районах содержатся и техногенные загрязнители, разные по составу и свойствам, прямое определение каоторых весьма затруднительно. Трудности диагностики не позволяют четко их дифференцировать, показать степень и долю влияния каждого (Хазиев, 1982).

Общими наиболее значительными загрязнителями воздушной и почвенной сред промышленных городов Иркутской области являются золоотвалы, выбросы автотранспорта и различных промышленных предприятий, продукты жизнедеятельности человека и домашних животных.

Большое количество выбросов городов Ангарск, Саянск, Усолье-Сибирское, Шелехов дает негативный эффект в районном, региональном и зачастую глобальном масштабах.

Воздушная миграция загрязнителей продолжается в других звеньях круговорота - биогенном, водном и конечно почвенном. Большинство выбросов городов проходит многозвеньевой цикл миграции. Загрязняются воздух и воды рек, разрушаются почвы. Многие растения и животные организмы, в том числе относящиеся к пищевым ресурсам, становятся накопителями металлов и стойких химических соединений, вредных для живой природы и человека.

Современный Шелехов - город с высокой концентрацией промышленных предприятий. Такие предприятия, как ИркАЗ, ТЭЦ-5, ЖБИ, кабельный, известковый, трактороремонтный завод, ухудшают экологическую ситуацию и в городе, и в его окрестностях. К тому же промышленные предприятия расположены чрезвычайно близко к жилым массивам, и, таким образом, к производственным выбросам добавляются выбросы от печей частных домов и автотранспорта, создающего на основных магистралях недопустимо высокое загрязнение воздуха выхлопными газами.

Географическое положение Шелехова оценивается экологами как крайне неблагоприятное для рассеивания выбросов. Город расположен в котловине, откуда очень трудно удаляются выбросы предприятий, как его самого, так и близлежащих Ангарска и Иркутска.

Город Шелехов входит в число наиболее загрязненных городов России, а в области по этому показателю он занимает треть место. В образцах почвы Шелехова присутствуют практически все элементы таблицы Д. И. Менделеева (Хавина, 2001).

Из химических элементов в почвах больше всего накапливается фтор - элемент первого класса опасности. Однако, в г. Шелехов в составе фторсодержащих эмиссий в большем количестве выявлены растворимые фториды и фтористый водород. Способность поглощать фтор даже у сформировавшихся здесь загрязненных почв очень высока (Макарова, 1999, Сараев, 1998).

Похожая картина наблюдается и в остальных городах Иркутской области. На территории Саянска распространены дерновоподзолистые и серые лесные почвы, в которых формируется гумусовый горизонт мощностью 5-10 см (Напрасникова, 2001).

Химическое предприятие АО «Саянскхимпром», поставляющее основной объем промышленных отходов, дает сильную техногенную нагрузку на природные комплексы. Наиболее распространенными загрязнителями на урбанизированных территориях являются: пыль поливинилхлоридов, диоксид серы, оксид углерода, окислы азота, дихлорэтан, этилен, винилхлорид. Количество выбросов в атмосферу только предприятиями Саянско-Зиминского промышленного узла достигает 45 тысяч тонн в год.

На современном этапе изучение воздействия городов на окружающую среду представляет научно-практическую проблему. При этом особенно актуально изучение влияния конкретных городов, поскольку масштабы, спектр загрязняющих эмиссий и их влияния на среду различны, а, следовательно, неодинаков и характер мероприятий по уменьшению их вредного воздействия. Отсутствие рационального подхода к сохранению окружающей среды постоянно приводит к обострению экологических проблем, затрагивающих жизненно важные интересы населения.

Таким образом, способом сохранения общества становится ориентация не столько на изменение природной среды, благоприятной для всего живого, сколько на обеспечение совместимости среды и всех направлений человеческой деятельности. Другими словами, в истории человечества наступил момент, когда решение любой социальной проблемы обусловлено задачей сохранения биосферы и ее компонентов (Марфенина, 1994).

3. Объекты и методы исследования

3.1 Объекты исследования

Объектами исследования явились образцы почв урбанизированных территорий городов Иркутской области. В частности, были исследованы урбаноземы городов Ангарска, Саянска, Усолье-Сибирское и города Шелехова.

Отбор материалов проводился студентами кафедры микробиологии, проживающими в различных городах Иркутской области, в летний период 2008 г., потому что в это время года особенно интенсивно техногенное воздействие на почвенный покров города.

Пробные площадки выбирались с учетом антропогенной нагрузки, характера застройки, плотности жилых массивов, воздействия промышленных предприятий, автотранспорта. С каждой площадки размером 25 м² отбиралось 10 проб, которые освобождались от мусора, включений; перемешивались, т.е. формировался средний образец, характеризующий территорию площадью в 10 га. Контролем служили почвы, взятые вдали от населенным пунктов в Усть-Ордынском округе.

Всего было исследовано 52 пробы урбаноземов промышленных городов Иркутской области. Выделено в чистую культуру 40 штаммов бактерий группы кишечной палочки и 75 штаммов гетеротрофных сапрофитных микроорганизмов.

Учет и идентификация микроорганизмов проводились общепринятыми микробиологическими методами (Егоров, 1976, Теппер, 2004).

3.2 Методы исследования.

Методы идентификации бактерий.

Для определения культуральных, морфологических и физиолого-биохимических признаков использовались методы, описанные в «Практикуме по микробиологии» под редакцией Егорова Н.С. (Егоров,1976).

Систематическое положение микроорганизмов устанавливали по Определителям бактерий Берджи (Хоуптон, 1980, Берджи, 1994).

Изучение морфологических признаков.

Форму и соединение клеток определяют при микроскопировании препаратов живых и окрашенных клеток: первые просматривались с фазово-контрастным устройством, вторые с иммерсионной системой.

Выявление подвижности клеток.

Подвижность клеток лучше всего наблюдается в препарате «раздавленная капля». Если клетки подвижны, то они оживленно перемещаются в разных направлениях в поле зрения микроскопа. С возрастом даже хорошо подвижные клетки теряют подвижность, поэтому необходимо посмотреть клетки более молодого возраста (24-часовая культура).

Следует отличать подвижность клеток от броуновского движения. Броуновское движение - это пассивное перемещение клеток в довольно узких пределах, оно особенно заметно в густых суспензиях. Если движение клеток напоминает броуновское, то, чтобы убедиться в собственной подвижности клеток, в каплю исследуемых организмов , в каплю исследуемых организмов добавляют каплю 5%-ного водного раствора фенола.

Окраска по Граму.

Все бактерии по способности окрашиваться красителями трифенилметанового ряда с йодом делятся на две большие группы. К одной относятся бактерии, в клетках которых комплекс, образуемый генциановым фиолетовым и йодом, удерживается при обработке их спиртом. Такие бактерии называются грамположительными. К другой группе относятся бактерии, не обладающие свойством удерживать комплекс и обесцвечивающиеся при обработке их спиртом. Их называют грамотрицательные.

На обезжиренном стекле делают мазки микроорганизмов. Их высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. Мазки окрашивают в течение 1-2 минут карболовым генциановым фиолетовым, затем краситель сливают и, не промывая препарат водой, обрабатывают его 1-2 минуты раствором Люголя до почернения. Сливают раствор Люголя и обрабатывают препарат до обесцвечивания 1 минуту 96%-ным этиловым спиртом. Затем препарат промывают водой и дополнительно окрашивают 1-2 минуты фуксином. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. При окрашивании грамположительные бактерии имеют сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные - красный.

Изучение культуральных признаков.

Рост на плотной среде.

Микроорганизмы, развиваясь на поверхности плотных сред, образуют характерные для данного вида колонии. Поэтому описание колоний - один из признаков, который необходим для идентификации исследуемого микроорганизма. При описании колоний отмечают следующие признаки: форму, размеры, цвет, поверхность, профиль, край колонии, структура колонии, консистенцию. В качестве плотной питательной среды обычно используют МПА.

Рост на картофеле.

Многие микроорганизмы растут на ломтиках картофеля и образуют налеты, характерные для представителей данного вида. Ломтики готовят следующим образом: картофель очищают, разрезают на дольки, погружают на час в 1%-ный раствор NaHCO₃. После этого кусочки картофеля помещают в пробирки, на дно которых предварительно положена вата, смоченная водой. Стерилизуют картофель при 1,5 атм. Посев производят петлей. Отмечают рост или его отсутствие.

Рост в жидкой среде. Для характеристики роста в жидкой среде мною был использован МПБ. Рост микроорганизмов сопровождался помутнением среды, образованием пленки или осадка.

Изучение физиолого-биохимических признаков.

Использование углеводов и сахаро-спиртов.

Микроорганизмы характеризуются неодинаковой способностью использовать различные углеводы и спирты в качестве единственных источников углерода и энергии. Для идентификации большинства гетеротрофных микроорганизмов, необходимо определить какие углеводы и спирты обеспечивают рост изучаемого организма, и какими изменениями среды сопровождается его рост.

Как правило, используют следующие углеводы: арабинозу, глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, фруктозу, и спирты - глицерин и маннит. Углеводы и спирты добавляют к основному фону среды в количестве 1 г основной фон готовят на водопроводной воде; он включает 0,5 г пептона и 0,1 г K₂HPO₄. Чтобы обнаружить изменения рН, к среде добавляют индикатор - бромтимолблау - из расчета 2 мл 1,6%-ного спиртового раствора на 1 л среды. При рН 6,0 индикатор имеет желтый цвет, а при рН 7,6 синий. Чтобы обнаружить образование газа, в среду опускают поплавки. Пробирки с поплавками стерилизуют при 1 атм. Все среды с углеводами и спиртами засеивают одновременно 1 мл суспензии клеток и ставят в термостат. Если изучаемый микроорганизм развивается быстро, то результат можно регистрировать через 48-96 часов, а если медленно - через 7-10 суток.

Визуально по помутнению среды, образованию пленки, осадка отмечают рост или его отсутствие на всех используемых средах. Отмечают изменение цвета индикатора и делают заключение о том, чем сопровождается использование субстратов: подкислением или подщелачиванием среды, или изменение рН среды не происходит. О газообразовании свидетельствует накопление газа в поплавке.

Образование ацетилметилкарбинола.

Этой способностью обладают микроорганизмы, сбраживающие глюкозу с образованием кислот, которые в дальнейшем участвуют в биосинтезе нейтральных продуктов - ацетилметилкарбинола, диацетила, 2,3-бутиленгликоля.

Используя среду состава: глюкозу 1,0 г, пептон 0,5 г, K₂HPO₄ 0,1 г, вода. Среду разливают в пробирки по 8-10 мл в каждую, стерилизуют при 0,5 атм и засевают культурами микроорганизмов. Продолжительность культивирования 7-10 дней. После окончания культивирования к 2 мл культуры добавляют 1 мл 10%-ного раствора КОН и энергично встряхивают на воздухе. Если микроорганизм образует ацетоин, то начинает медленно развиваться окраска; через 18-24 ч наблюдается интенсивное красное окрашивание.

Гидролиз крахмала.

Гидролиз крахмала осуществляется микроорганизмами, образующими амилазу и использующими продукты гидролиза крахмала как источник углерода и энергии. Для выявления этой способности используют среду следующего состава: пептон 1,0 г, K₂HPO₄ 0,5 г, растворимый крахмал 0,2 г, агар-агар 1,5 г; рН среды 6,8-7,0. Среду стерилизуют при 1 атм и разливают по чашкам Петри. Когда среда застынет, делают посев штрихом по диаметру чашки. Продолжительность культивирования 7-10 дней. Гидролиз крахмала обнаруживают по зоне просветления среды вдоль штриха. Особенно четко она видна после обработки агаровой пластинки раствором Люголя. Так как йод - индикатор на крахмал, то вся среда окрашивается в синий цвет, за исключением зоны гидролиза крахмала, которая остается бесцветной или может приобрести красно-бурую окраску, если крахмал гидролизуется до декстрина.

...