Цитогенетические реакции лиственных древесных растений на стрессовые условия и перспективы их использования для оценки генотоксичности окружающей среды

3,1±0,3

[2,4 ; 3,8]

В качестве контроля для цитогенетического мониторинга среды с использованием проростков желудей дуба черешчатого были выбраны результаты, полученные при цитологическом анализе клеток проростков, зафиксированных в 22 часа (табл. 4).

Для целей мониторинга с использованием в качестве тест-объекта березы повислой мы рекомендуем использовать контрольные данные, полученные именно в год исследований опытной территории, т.к. обычно деревья березы повислой плодоносят ежегодно и проблем со сбором семенного материала с экологически чистых территорий не возникает (у дуба плодоношение происходит не каждый год). Это позволит нивелировать возможную погодную компоненту при проведении такого рода исследований.

5.2. Математические модели суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства древесных растений, произрастающих на территориях с различной антропогенной нагрузкой

Математическое моделирование позволяет прогнозировать циркадные ритмы цитогенетических показателей древесных растений. При анализе цитогенетических показателей возможно использовать различные регрессионные модели. Для математического описания суточных ритмов цитогенетических характеристик (митотической активности, патологических митозов, ядрышковых характеристик) дуба черешчатого и березы повислой мы предлагаем следующие формулы:

(1)

(2),

где N - степень полинома, j=1..M, где M - число точек наблюдения, a_i - коэффициенты полинома, полученные в рамках метода наименьших квадратов, y_j - значения экспериментально полученных цитогенетических показателей, x_j - моменты времени, в которые проводится наблюдение, y_n - значение прогнозируемого цитогенетического показателя, x_n - момент времени, в который проводится прогноз. Значения коэффициентов определяются отдельно для каждого из цитогенетических показателей на основе метода наименьших квадратов.

Формула (1) универсальна и позволяет анализировать суточные ритмы практически любой сложности, формула (2) дает более точный результат в случаях зависимостей, где увеличение и уменьшение показателя в течение суток происходит не менее 3 раз. Для каждой из цитогенетических характеристик была подобрана полиномиальная модель и определены коэффициенты при независимых переменных.

Использование указанных подходов дает возможность по одному экспериментально полученному значению цитогенетического показателя проводить его расчет в любое заданное время суток. Метод позволяет значительно снизить как временные, так и финансовые затраты и решить проблему невозможности выявления суточного ритма из-за гибели особи при фиксации.

Кроме того, использование математических моделей ликвидирует или снижает влияние групповой компоненты в определении показателя (обычно в течение суток материал от нескольких сотен биообъектов фиксируют с определенным интервалом и рассчитывают среднее значение цитогенетических показателей в данный момент времени).

Используя адекватные уравнения, описывающие суточные колебания исследуемого показателя, возможно корректно сравнивать результаты исследований, выполненных на материале, зафиксированном в разное время суток.

На основании разработанных подходов и моделей были созданы 4 компьютерные программы.

5.3. Цитогенетические характеристики семенного потомства берёзы повислой в экологически безопасных условиях

Средние значения митотического индекса в корневой меристеме проростков берёзы повислой в экологически благоприятных условиях в разные годы изменялись незначительно, что может рассматриваться как свидетельство сохранения генетического гомеостаза популяции. Высокая канализированность процесса клеточного деления подтверждалась также отсутствием достоверных различий между долями клеток на стадиях профазы, метафазы и анафазы-телофазы митоза в течение всех лет исследования.

Невысокие значения частоты встречаемости патологических митозов, по-видимому, отражали уровень спонтанного мутационного процесса, что подтверждалось отсутствием влияния фактора года сбора семян на данный показатель. В спектре патологических митозов преобладали мосты. Появление остаточного ядрышка в митозе в нестрессовых условиях не имело чёткой закономерности и, возможно, связано с компенсаторным синтезом белка для поддержания нормального прохождения митоза в пики митотической активности.

Наибольшим колебаниям в течение всех лет исследования подвергались характеристики ядрышкового аппарата, что, по-видимому, отражает зависимость метаболических процессов, происходящих при прорастании семян, от условий, влияющих на качество семян при их формировании. Преобладали высокофункциональные ядрышки типа «кора-сердцевина», характерные для активной меристематической ткани. Так же отмечено присутствие вакуолизированных ядрышек типа «кора-сердцевина». Появление в ядрышке вакуоли свидетельствует о снижении его функциональной активности (Челидзе, 1988). Наибольшие площади поверхности наблюдались у вакуолизированных ядрышек типа «кора-сердцевина», и они статистически достоверно превышали таковой показатель у ядрышек типа «кора-сердцевина» (P<0,05). Увеличение площади поверхности ядрышек типа «кора-сердцевина с вакуолью», возможно, компенсировало их пониженную функциональную активность и отражало переходы между вакуолизированными и невакуолизированными ядрышками. Достоверных различий во встречаемости гетероморфных парных ядрышек в течение всех лет исследования не обнаружено. Средние суммарные площади поверхности гетероморфных ядрышек изменялись по годам более значительно, чем гомоморфных. В клетках с гетероморфными парными ядрышками размеры «большого» ядрышка превышали размеры «маленького» в 2,7 - 3,3 раза.

Таким образом, выявленная степень изменчивости цитогенетических показателей позволяет рекомендовать использование семян берёзы повислой, собранных в районе Биологического учебно-научного центра Воронежского госуниверситета «Веневитиново», в качестве контрольных для исследований, в частности, по цитогенетическому мониторингу.

5.4. Цитогенетические характеристики семенного потомства берёзы повислой в условиях антропогенного загрязнения

5.4.1. Цитогенетические характеристики семенного потомства берёзы повислой в условиях г. Воронеж

Было установлено, что в клетках корневой меристемы проростков семян берёзы повислой на антропогенно загрязнённых территориях наблюдалась значительная изменчивость средних величин цитогенетических характеристик, в то время как их пределы варьирования (95 %-й доверительный интервал) не отличались от контрольных (табл. 4).

В большинстве случаев достоверные различия MИ как с контрольными показателями, так и с показателями в других опытных районах отсутствовали, что можно связать с высокой резистентностью митотической активности к воздействию поллютантов. В некоторых случаях митотическая активность на опытных территориях достоверно превышала контрольные значения (P<0,05), что было обусловлено задержкой клеток на стадии анафазы-телофазы митоза или стимулирующим действием загрязнителей среды, не приводящим к изменению скорости прохождения клетками стадий митоза. Только в Советском и Коминтерновском районах в 2003 г. значения митотической активности (с учётом и без учёта профаз) были достоверно ниже контрольного (P<0,05), что возможно, обусловлено присутствием загрязнителей-ингибиторов митотической активности или сдвигом пика митозов на другие часы. Кроме того, анализ распределения клеток по стадиям митоза позволил установить, что в 2001 г. в Советском районе г. Воронеж наблюдалась задержка клеток на стадии профазы, а в Коминтерновском районе - на стадии метафазы.

На большинстве опытных территорий в течение всех лет исследования наблюдалось статистически достоверное превышение контрольных значений встречаемости патологических митозов (как с учётом, так и без учёта профазных клеток) (P<0,05), в то время как достоверные различия между опытными районами существовали не всегда, что можно объяснить сравнительно одинаковой их загрязненностью или инертностью этого показателя. Т.о., уровень патологических митозов мог оставаться постоянным в широком интервале уровней загрязнения за счёт изменчивости других показателей (например, ядрышковых характеристик). Обращает на себя внимание факт устойчивого сохранения высоких значений частоты патологических митозов в Советском районе г. Воронеж, который считается экологически благополучным.

Спектр патологических митозов на опытных территориях г. Воронеж был представлен отставанием хромосом в метакинезе и в анафазе, хромосомными мостами в ана- и телофазе, агглютинацией хромосом в метафазе, асимметричными митозами, полыми метафазами, трёхгрупповыми метафазами, многополюсными митозами. В 2001 г. отмечено появление микроядер и фрагментаций ядра во всех опытных районах г. Воронеж. Расширение спектра аномальных клеточных митозов можно объяснить значительным загрязнением атмосферного воздуха поллютантами по сравнению с контрольной территорией.

Чёткой зависимости в изменении частоты встречаемости остаточных ядрышек на стадии метафазы-телофазы митоза на антропогенно загрязнённых территориях не выявлено. Однако на опытных территориях доля проростков, у которых обнаружено остаточное ядрышко в митозе (80,9 %), была выше таковой на экологически чистой территории (66,9 %).

Анализ ядрышковых характеристик позволил установить снижение площадей поверхности ядрышек в 1999 - 2001 гг. и их рост в 2003 г. Однако в ряде районов г. Воронеж в 1999 - 2001 гг. площади поверхности ядрышек были больше контрольных значений, что связано с возможной амплификаций рибосомальных генов, которая направлена на поддержание нормальной концентрации белка в клетках в условиях подавления активности многих генов поллютантами. В 2002 - 2003 гг. в большинстве опытных районов г. Воронеж площади поверхности ядрышек были ниже таковых в контроле, что могло быть вызвано накоплением на указанных территориях загрязняющих веществ, ингибирующих работу ядрышкового аппарата.

В норме для берёзы повислой характерна 1 пара хромосом с вторичными перетяжками (Макарова, 1989). На опытных территориях отмечено присутствие клеток с 3, 4, 5 ядрышками в ядре. Это свидетельствует об активации латентных ядрышкообразующих районов хромосом, что способствует обеспечению клеток необходимым количеством продукции ядрышек в условиях подавления синтетической активности загрязнителями среды.

Чётких закономерностей в изменении частот встречаемости гетеро- и гомоморфных парных ядрышек в клетках корневой меристемы проростков семян берёзы, подвергавшихся действию загрязнителей среды, не обнаружено. В клетках с гетероморфными парными ядрышками размеры «большого» ядрышка превышали размеры «маленького» в 1,8-4,1 раза, т.е. диапазон изменчивости данных показателей на опытных территориях был значительно шире, чем в контроле. Кроме того, установлено, что в условиях загрязнения окружающей среды площади поверхности «маленьких» ядрышек меняются более значительно, чем «больших», и в связи с этим можно предположить, что активация транскрипции рибосомальных генов происходит не за счёт равномерной активации двух ядрышкообразующих районов, а за счёт дополнительного усиления работы менее активного.

Так же, как и на контрольной, на всех опытных территориях в клетках корней проростков семян берёзы повислой преобладали ядрышки типа «кора-сердцевина». В ряде опытных районов выявлялась тенденция к выравниванию частот встречаемости ядрышек типа «кора-сердцевина» без вакуоли и с вакуолью. Увеличение доли ядрышек с низкой функциональной активностью, вероятно, обусловлено присутствием поллютантов, подавляющих функционирование рибосомных генов.

Площади поверхности ядрышек типа «кора-сердцевина» на загрязнённых территориях были в большинстве случаев достоверно ниже контрольных значений (P<0,05). Это свидетельствовало о снижении синтетической активности в меристеме в условиях антропогенного загрязнения, что в свою очередь указывало на присутствие в окружающей среде загрязнителей, ингибирующих синтетическую активность ядрышек. Бьльшая изменчивость площади поверхности ядрышек типа кора-сердцевина по сравнению с изменчивостью площади поверхности вакуолизированных ядрышек «кора-сердцевина» позволяет предположить ведущую роль ядрышек первого из указанных типов в изменении синтетической активности на загрязнённых территориях, в то же время второй показатель является более стабильным.

Таким образом, показано, что вследствие антропогенного загрязнения происходили изменения цитогенетического гомеостаза семенного потомства берёзы повислой по сравнению с контролем, при этом степень изменчивости цитогенетических характеристик семенного потомства берёзы повислой отражала уровень антропогенной нагрузки и позволила сделать заключение о сопоставимости уровней загрязнения в исследованных районах города.

5.4.2. Цитогенетические характеристики семенного потомства березы повислой в условиях г. Старый Оскол

Было показано, что митотическая активность во всех опытных точках возрастала по сравнению с контролем (опыт - от 3,1 % до 5,1 %; контроль - 2,7 % (Р<0,01)). Это происходило за счет увеличения времени прохождения клетками стадии профазы, а в отдельных районах - стадии ана- и телофазы, что может быть обусловлено повреждением хромосом, нарушением цитотомии и невозможностью перехода клеток из одной стадии митотического цикла в другую. На большинстве опытных территорий отмечен рост встречаемости патологических митозов (опыт - 1,9 % до 6,0 %; контроль - 0,1 % (Р<0,05)). Это свидетельствовало об увеличении числа нарушений хромосом и митотического аппарата на опытных участках. Спектр патологий митоза был значительно шире, чем на контрольной территории (где 100 % нарушений составляли мосты) и включал отставание хромосом в метафазе и анафазе, мосты, трехполюсные митозы. На двух опытных территориях в чистом и среднезагрязненном районах происходило уменьшение площади поверхности одиночных ядрышек, что свидетельствовало об угнетении метаболических процессов в клетках березы повислой. Исследование других ядрышковых характеристик (числа двухядрышковых клеток, долей разных типов ядрышек, частоты встречаемости остаточных ядрышек на стадии метафазы - телофазы митоза) не выявило достоверных различий с контролем. По-видимому, ядрышковые характеристики - это наиболее чувствительный критерий в условиях незначительного загрязнения. При высоких концентрациях загрязняющих веществ более информативны такие критерии, как митотическая активность и патологии митоза.

5.5. Цитогенетические реакции семенного потомства лиственных древесных растений, произрастающих около крупных ядерных объектов и на территориях, подвергшихся радиоактивному загрязнению в результате аварии на Чернобыльской АЭС

5.5.1. Цитогенетические показатели семенного потомства лиственных древесных растений , произрастающих в 1-км зоне Нововоронежской АЭС

Была предпринята попытка провести оценку влияния крупного объекта атомной энергетики - Нововоронежской АЭС - на цитогенетические показатели дуба черешчатого, березы повислой и установить уровень загрязнения исследуемой территории. В результате проведенных исследований у семенного потомства дуба выявлено увеличение митотической активности, подсчитанной без учета профазных клеток (до 25,1 %), по сравнению с контролем (13,9±1,1 %), что связано с увеличением числа клеток (задержкой) на стадии (до 32,9 %, контроль - 13,7±1,4 %), у березы возросло время прохождения клетками стадии анафазы-телофазы (до 45,6 %, контроль - 30,3±4,6 %). Указанные изменения связаны с нарушением формирования веретена деления, задержкой процессов цитотомии, запуском системы checkpoint-репарации генетического материала. У дуба отмечался рост числа патологий митоза при подсчете нарушений с учетом профазных клеток (до 4,6 %, контроль - 1,4±0,3 %), что обусловлено ростом доли метафаз, анафаз, телофаз - стадий, на которых возможно выявить нарушения методом световой микроскопии. Подсчет аномалий на стадии метафазы, анафазы, телофазы не выявил изменений данного показателя. У березы увеличения числа нарушений митоза не отмечалось, что, возможно, связано с большей резистентностью данного вида к загрязнению. Спектр патологий митоза значительно расширился, появились нехарактерные для контроля агглютинация, многополюсные митозы, асимметричные митозы, трехгрупповые метафазы, рассеивание хромосом. Возросла доля мостов по сравнению с отставанием хромосом в метакинезе и анафазе-телофазе митоза, что свидетельствует об усилении работы систем репарации. У дуба увеличилось число многоядрышковых клеток (до 7,4 %, контроль - 3,1±0,3 %), что обусловлено активацией «спящих» ядрышкообразующих районов и рассматривается как один из механизмов адаптации к стрессовому воздействию. У березы доля многоядрышковых клеток по сравнению с контролем снижалась (до 1,9 %, контроль - 5,4±1,4 %), однако, возрастала площадь поверхности одиночных ядрышек (до 177,4 мкм², контроль - 124,4±7,5 мкм²) и появлялись высокоактивные компактные ядрышки, что связано с усилением транскрипции ранее работающих ядрышкообразующих районов. Возможно, наблюдаемые феномены связаны с синергическими эффектами выбросов АЭС и поллютантов среды. Показано неоднородное загрязнение 1-км зоны АЭС. Пользуясь шкалой для оценки влияния стрессовых факторов на генетическую систему организма, можно говорить о среднем уровне загрязнения 1-км зоны станции. Предложено использовать древесные растения для оценки загрязнения окружающей среды в районах атомных электростанций.

5.5.2. Цитогенетические характеристики семенного потомства берёзы повислой в условиях г. Нововоронеж

Были исследованы цитогенетические показатели семенного потомства березы повислой в г. Нововоронеж, расположенном вблизи Нововоронежской АЭС. Была выявлена стимуляция митотической активности только в районе № 1, т.к. не отмечалось изменения времени прохождения клетками стадий митоза по сравнению с контролем.

В районах №№ 2 и 3 выявлено возрастание числа нарушений митоза. Различий по частоте патологических митозов между семенным потомством берёзы повислой из районов г. Воронеж и г. Нововоронеж, не обнаружено (среднее значение в г. Воронеж с учётом профаз - 4,7±0,6 %, без учёта профаз - 6,7±0,9 %, в г. Нововоронеж - 5,3±0,8 % и 7,6±1,0 % соответственно). Это свидетельствует о сравнительно одинаковой загрязненности территорий (максимальный вклад вносит автотранспортный комплекс) и, возможно, о высокой инертности данного критерия к воздействию поллютантов. Спектр нарушений митоза на опытных территориях был более широким по сравнению с контрольным.

Доля остаточных ядрышек в клетках семенного потомства берёзы повислой из районов г. Нововоронеж в 2000 г. была достоверно ниже данного показателя в контроле (P<0,01) и в районах г. Воронеж (P<0,001). Отмечалось уменьшение площади поверхности одиночных ядрышек, доли клеток с двумя и более ядрышками в ядре и высокоактивных ядрышек типа «кора-сердцевина».

Анализ цитогенетических характеристик семенного потомства берёзы повислой позволил предположить достаточно высокий уровень антропогенного загрязнения г. Нововоронеж, соизмеримый с таковым в г. Воронеж.

5.5.3. Цитогенетические реакции семенного потомства лиственных древесных растений, произрастающих на территориях, подвергшихся радиоактивному загрязнению в результате аварии на Чернобыльской АЭС

Авария на Чернобыльской АЭС привела к широкомасштабному загрязнению лесных экосистем. После нормализации радиационного фона на территориях, подвергшихся радиационному загрязнению, встал вопрос о выявлении отдаленных последствий облучения и установлении возможных синергических эффектов радиоактивного воздействия и химических поллютантов, поступающих в среду в результате деятельности человека, в формирование цитогенетических эффектов у древесных растений.

У дуба в отдельные годы исследований происходило увеличение митотического индекса до 28 % (контроль - 10 %) за счет возрастания доли профазных клеток до 80 % (контроль - 68 %), что можно рассматривать как патологию митоза, обусловленную блокированием перехода клеток на следующую стадию деления. Из-за повреждения хромосом возможно возрастание митотического индекса без изменения времени прохождения клетками стадий митоза, что рассматривается как стимуляция митотической активности, обусловленная воздействием мутагенов. В течение ряда лет выявлялось снижение митотической активности (до 7,5±0,3 %). Уровень патологий митоза также значительно колебался по годам. Частота нарушений митоза могла не отличаться от контроля (1,4±0,3 %), быть выше и ниже его. Причем с увеличением митотического индекса возрастала доля патологических митозов, что можно рассматривать как механизм компенсации гибели части клеток большим числом делений.

Спектр нарушений митоза на опытных территориях был представлен мостами, отставанием хромосом в метакинезе и анафазе, агглютинациями и не отличался от контрольного, однако, частота мостов была выше, а частота агглютинаций ниже. Это свидетельствовало о том, что у исследуемых проростков преобладали процессы «разрыв-воссоединение» и образование дицентрических хромосом по сравнению с нормой, где преобладали процессы слипания хромосом. Соотношение в спектре нарушений фрагментов и мостов отражает репарационные способности объектов при воздействии радиации (Акопян, 1967; Симаков, 1983). С увеличением времени, прошедшего с момента радиоактивного загрязнения, встречаемость мостов снижалась и приближалась к контрольным значениям. Другим объяснением падения доли мостов является уменьшение пострадиационной составляющей в образовании нарушений. С увеличением расстояния от автомагистрали, являющейся источником химического загрязнения среды, число нарушений митоза снижалось, их спектр сужался.

Изменения встречаемости клеток с двумя ядрышками, появление которых свидетельствует об активации ядрышкообразующих районов, а также клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы, анафазы-телофазы по сравнению с контролем не было выявлено. Однако происходило уменьшение доли высокоактивных ядрышек «кора-сердцевина» и увеличение площади поверхности умеренноактивных вакуолизированных ядрышек и ядрышек типа «кора-сердцевина вакуолизированные».

На опытных территориях отмечалось возрастание гетерогенности семенного потомства дуба черешчатого по показателю MИ. Дисперсия этого показателя достигала 39,2, в контроле - 5,7 (различия достоверны (P<0,001)). Это свидетельствовало о присутствии в исследованной выборке чувствительных и резистентных к влиянию поллютантов форм.

Исследования березы повислой проводили в 2 населенных пунктах, подвергшихся радиоактивному загрязнению (п. Землянск и п. Уразово).

На большинстве опытных территорий был выявлен рост митотической активности за счет увеличения времени прохождения клетками метафазы и анафазы-телофазы митоза, что, возможно, связано с нарушениями веретена деления, процессов цитотомии и работой систем checkpoint-репарации генетического материала. Возрастала доля нарушений митоза, среди которых наиболее часто встречалось отставание хромосом в анафазе и метафазе. Также отмечались мосты, агглютинации и трехгрупповые метафазы. Преобладание в спектре патологий митоза отставаний хромосом в метакинезе и анафазе свидетельствовало о том, что в корневой меристеме проростков семян березы повислой происходили преимущественно процессы повреждения веретена деления, а не разрыва и воссоединения хромосом. Это подтверждалось высокими значениями долей метафаз в клеточном цикле, количество которых значительно превышало число профаз. Преобладание нарушений, связанных с повреждением веретена деления, характерно для территорий, подвергающихся значительному химическому загрязнению.

На опытных площадях в п. Уразово отмечалось уменьшение площади поверхности одиночных ядрышек по сравнению с контролем, а в п. Землянск - рост значений этого показателя, что свидетельствовало, соответственно, о снижении транскрипционной активности рибосомальных генов или же об их активации. Однако в п. Уразово выявлено значительное возрастание доли клеток с высокоактивными ядрышками типа «кора-сердцевина», а в п. Землянск в клетках семенного потомства березы повислой обнаружены в основном клетки с умеренноактивными ядрышками типа «кора-сердцевина вакуолизированные». Это, вероятно, объясняется тем, что у березы повислой возможна компенсация активности рибосомальных генов за счет перехода количественных изменений в качественные. Т. о., происходило или возрастание числа активных ядрышек («кора-сердцевина»), или увеличение размеров малоактивных ядрышек («кора-сердцевина с вакуолью»). На всех опытных территориях отмечались клетки с 3 и 4 ядрышками в ядре, хотя в норме для березы повислой характерно наличие 1-2 ядрышек. На препаратах проростков семян березы повислой в п. Уразово были обнаружены клетки с 2, 3, 4 ядрышками в ядре. Таким образом, происходила активация дополнительных ядрышкообразующих районов. В п. Землянск была выявлена противоположная тенденция: отмечалось снижение в общем пуле доли многоядрышковых клеток. Т.о., высокая транскрипционная активность может поддерживаться как за счет уже активно работающих ядрышкообразующих районов (увеличение площади поверхности ядрышка или замена умеренноактивного типа ядрышек на высокоактивный), так и за счет активации дополнительных ядрышкообразующих районов. У семенного потомства березы повислой на опытных территориях появлялись клетки с остаточными ядрышками на стадиях метафазы, анафазы, телофазы митоза. Это явление можно рассматривать как пуфинг рибосомальных генов в результате стрессового воздействия, вызванного загрязнением окружающей среды радионуклидами и химическими веществами. Их частота колебалась по сравнению с контрольными значениями. Это, скорее всего, обусловлено взаимной компенсацией, обеспечивающей высокий уровень транскрипционной активности и, как следствие, интенсивный метаболизм в стрессовых условиях. С увеличением расстояния от химического источника загрязнения цитогенетические эффекты у семенного потомства березы нивелировались.

В результате проведенных исследований выявлены общие и специфические реакции 2-х обследованных видов лиственных древесных растений. Так, у березы и дуба в отдаленные сроки после радиоактивного облучения возможно возрастание митотического индекса. Наиболее значимо оно у дуба (в 2 - 2,5 раза по сравнению с контролем). Это может быть связано как с задержкой клеток на различных стадиях митотического цикла (у дуба - профазы, у березы - метафазы и анафазы-телофазы), так и с истинной стимуляцией митотической активности. Возможно возрастание числа патологических митозов и повышение доли мостов, что свидетельствует об активации репаративных процессов в меристеме. У дуба черешчатого не отмечалось увеличения встречаемости числа клеток с 2-я и более ядрышками в ядре и с остаточным ядрышком на стадии метафазы, анафазы, телофазы митоза по сравнению с контролем. Однако происходило изменение доли разных типов ядрышек и площади их поверхности. У березы могло происходить увеличение/снижение числа многоядрышковых клеток по сравнению с контролем, что обусловлено активацией/деактивацией ядрышкообразующих районов. Изменялись площадь поверхности одиночных ядрышек и их типы. Указанные явления связаны с влиянием поллютатнтов на метаболизм ткани и обусловлены взаимно компенсирующими друг друга механизмами - включением дополнительных ядрышкообразующих районов или изменением синтетической активности уже работающих.

Варьирование по годам цитогенетических характеристик древесных растений может быть связано с одной из причин: 1) волновой кинетикой мутационного процесса, на которую указывает Дмитриева (2000), на территориях, подвергшихся загрязнению вследствие аварии на Чернобыльской АЭС; 2) изменением объема и качественного состава химических поллютантов.

Обнаруженные изменения цитогенетических показателей свидетельствуют о ведущем вкладе химических соединений, образующихся в результате производственной деятельности человека, в модификацию наследственного аппарата клеток лиственных древесных растений после нормализации радиационного фона на территориях, подвергшихся радиоактивному загрязнению.

5.5.4. Цитогенетические показатели семенного потомства деревьев дуба черешчатого, произрастающих на территориях с незначительным уровнем антропогенной нагрузки

У семенного потомства материнских деревьев дуба черешчатого, подвергшихся радиоактивному облучению, в отдаленные сроки после воздействия радиации наблюдалось изменение цитогенетических показателей: митотической активности (этот показатель подвержен сильным колебаниям в зависимости от погоды), времени прохождения клетками стадий митоза, что обусловлено нарушениями процессов цитотомии и образования веретена деления. Несмотря на нормализацию радиационного фона, у семенного потомства наблюдалась повышенная репаративная активность в клетках меристемы, о чем свидетельствует увеличение доли мостов в спектре нарушений по сравнению с отставаниями хромосом в метакинезе и анафазе (рис. 2). Активировались «спящие» ядрышкообразующие районы. В отдельные годы повышался уровень патологических митозов. Данные изменения согласуются с концепцией о волновой кинетике мутационного процесса у растений в отдаленные сроки после радиоактивного облучения. Все это, на наш взгляд, свидетельствует о нецелесообразности применения семенного потомства дуба черешчатого из районов, подвергшихся радиоактивному загрязнению, для целей лесовосстановления или же использование его должно проводиться с большой осторожностью (после проверки цитогенетических показателей), т.к. такой семенной материал может ухудшить качество лесонасаждений.

Опираясь на созданную нами шкалу чувствительности к стрессовым факторам цитогенетических показателей, можно оценить цитогенетические эффекты у семенного потомства, обусловленные отдаленными последствиями радиоактивного облучения материнских деревьев, в 1996, 1998 г.г. на опытной территории Кашара как средней степени повреждения генетического аппарата (т.к. происходило возрастание патологических митозов и изменение митотической активности), на других опытных площадях эффекты были менее выражены.

Рис. 2 Спектр патологических митозов в корневой меристеме проростков желудей дуба черешчатого, собранных на опытных территориях в районе населенного пункта Старый Курлак в 1996 - 1998 г.г. Обозначения: 1 - отставание хромосом в метакинезе; 2 - мосты; 3 - отставание хромосом в анафазе; 4 - "редкие" патологии; 5 - агглютинация

5.6. Цитогенетические характеристики семенного потомства деревьев березы повислой, произрастающих в различных лесорастительных условиях Хреновского бора

На всех опытных территориях с различными лесорастительными условиями в Хреновском бору отмечалась низкая всхожесть семян: наибольшая - в сухом (40 %), наименьшая - в свежем бору (7,8 %). Высокая всхожесть соответствовала участку леса с низкой полнотой, низкая всхожесть - загущенной территории. Возможно, это один из механизмов регуляции численности потомства у березы повислой. Наименьшая доля пустых семян встречалась в сухом бору - 54 %, в свежем и влажном - 60 и 62 % соответственно. Предполагается, что проанализированные показатели в большей мере связаны с эндогенными (генетическими) причинами, чем с почвенно-климатическими. Низкая всхожесть семян в свежем и влажном бору, возможно, является механизмом регуляции численности потомства путем самоизреживания.

Показано отсутствие различий между семенным потомством деревьев, произрастающих на опытных площадях, по митотической активности, что, возможно, связано с высокой консервативностью этого важного для онтогенеза организмов показателя. Выявлена задержка клеток на стадии анафазы-телофазы митоза в корневой меристеме проростков семян материнских деревьев, произрастающих в сухом (50,5±3,2 %) и влажном бору (47,7±2,0 %), по сравнению со свежим бором (35,4±5,4 %) вследствие нарушения цитотомии. Отмечена наибольшая частота патологических митозов в условиях травяного сосняка с высокой плотностью древостоя (9,3±2,0 %) и преобладание в спектре аномальных клеточных делений отставаний хромосом на стадии метафазы и анафазы. Это свидетельствует о низкой активности репаративных процессов и может рассматриваться как механизм, ведущий к самоизреживанию березы в условиях затенения. Установлены отличия семенного потомства березы повислой из влажного бора от такового из других типов лесорастительных условий по ядрышковым характеристикам: наблюдается возрастание площадей одиночных ядрышек, увеличение доли клеток с двумя и более ядрышками в ядре, что обусловлено активацией латентных ядрышкообразующих районов и свидетельствует о процессах компенсаторного синтеза белка в стрессовых условиях, вызванных повышенным увлажнением почвы, уменьшение доли ядрышек типа «кора-сердцевина» и возрастание доли ядрышек типа «кора-сердцевина» с вакуолью, которые компенсируют свою низкую функциональную активность увеличением площади поверхности.

5.7. Цитогенетика лиственных древесных растений в стрессовых условиях (заключение)

На основании проведенных исследований цитогенетических показателей семенного потомства двух видов лиственных древесных растений (березы повислой и дуба черешчатого), произрастающих на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения, разработанной шкалы чувствительности к неблагоприятному воздействию цитогенетических показателей и анализа литературных данных мы предлагаем следующую схему цитогенетических реакций лиственных древесных растений на воздействие, обусловленное как экзогенными (антропогенным воздействием, лесорастительными условиями и т.д.), так и эндогенными (суточные ритмы) факторами (рис. 3).

Выявлены следующие типы цитогенетических реакций исследованных видов в стрессовых условиях: 1) изменение циркадных ритмов митотической активности, патологических митозов, ядрышковых показателей, которые обеспечивают нормальный морфогенез ткани; 2) повышение или понижение митотической активности по сравнению с контрольными значениями, 3) задержка прохождения клетками стадий митоза, 4) рост числа и расширение спектра патологических митозов, 5) изменение частоты встречаемости остаточных ядрышек в митозе, 6) варьирование ядрышковых характеристик в интерфазных клетках (изменение площадей поверхности одиночных ядрышек, пределов изменчивости суммарной площади поверхности ядрышек в клетках с парными гомоморфными ядрышками; увеличение разницы между размерами «большого» и «маленького» ядрышек в клетках с гетероморфными парными ядрышками, а также изменение частоты встречаемости ядрышек различных типов и уровня клеток с двумя и более ядрышками в ядре).

Установлены механизмы адаптации этих видов к стрессовым условиям:

1) усиление репаративных процессов в клетках меристемы (цитологическим признаком этого явления может служить увеличение встречаемости в спектре нарушений митоза мостов по сравнению с нарушениями, связанными с отставанием хромосом при расхождении к полюсам и потерей хромосом в митозе) и запуск механизмов chekpoint-репарации генетического материала, что выражается в пролонгировании отдельных стадий митоза; 2) повышение числа ядрышкообразующих районов (в тканях появляется большое количество клеток с двумя и более ядрышками в ядре), активация транскрипции ранее работавших ядрышковых организаторов (увеличение размеров и появление высокоактивных типов ядрышек, нарастание ядрышкового гетероморфизма) и появление остаточного ядрышка в метафазе, анафазе, телофазе митоза, обусловленное пуфингом рибосомальных генов на этих стадиях; 3) возрастание числа делящихся клеток (при увеличении числа клеток с нарушениями митоза) и изменение времени прохождения клетками стадий митоза.

Подобного рода данные могут быть использованы для отбора резистентных генотипов и материнских деревьев, продуцирующих семена с такими генотипами, для создания устойчивых насаждений в экстремальных условиях произрастания, а также позволят заложить основы цитогенетического мониторинга загрязнения окружающей среды с использованием древесных растений.

Установлено, что репером изменения длительности стадий митоза является митотический индекс, подсчитанный без учета профаз. Его увеличение по сравнению с контролем указывает на задержку прохождения клетками митоза на стадии метафазы или анафазы-телофазы, а уменьшение - на задержку на стадии профазы.

Рис. 3 Схема цитогенетических реакции семенного потомства лиственных древесных растений на стрессовые условия

Размещено на http://www.allbest.ru/

Подсчет патологий митоза с учетом профаз является экспресс-методом оценки состояния митотического аппарата, т.к. позволяет диагностировать изменение в его функционировании (возрастание патологий митоза и/или изменение времени прохождения клеткой стадий митоза). Для более точного определения причины нарушения митотического аппарата необходимо проводить подсчет патологий митоза без учета профазных клеток и распределение по клеток стадиям цикла.

Глава 6. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК СЕМЕННОГО ПОТОМСТВА ЛИСТВЕННЫХ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ ДЛЯ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА ОКРУЖАЮЩЕЙ ЧЕЛОВЕКА СРЕДЫ

Один из основных недостатков использования древесных растений для оценки генотоксичности окружающей среды - трудность переноса полученных результатов на человека. В то же время изучение цитогенетических эффектов антропогенного загрязнения в популяции человека имеет ряд ограничений в основном методического характера, связанных со сложностями при сборе и подготовке материала для анализа. Поэтому возникает необходимость разработки методов экстраполяции данных по определению загрязнения окружающей среды, полученных на древесных растениях, на человека.

Нами были исследованы эффекты воздействия антропогенного загрязнения на наиболее чувствительные цитогенетические показатели - ядрышковые характеристики - семенного потомства березы повислой (B. pendula Roth) и проведен микроядерный тест в соматических клетках человека, установлены зависимости между исследованными показателями указанных тест-объектов и показана возможность экстраполяции результатов цитогенетического мониторинга, полученных на растительном объекте, на человека.

6.1. Анализ результатов микроядерного теста в буккальном эпителии детей

Результаты микроядерного теста, выполненного в буккальном эпителии 339 детей в возрасте 2 - 6 лет, проживающих в районах г. Воронеж и Воронежской области, представлены в табл. 5.

Было установлено, что в 1999 г. у детей из Советского района г. Воронеж уровень клеток с микроядрами статистически достоверно превышал данный показатель у детей из других районов города. В 2000 - 2001 гг. наблюдалось статистически достоверное (P<0,01) уменьшение показателя частоты встречаемости клеток с микроядрами в буккальном эпителии детей, однако, в 2001 г. в Советском и Коминтерновском районах частота встречаемости клеток с микроядрами была выше, чем в Ленинском. Одной из возможных причин повышения уровня клеток с микроядрами у детей в Советском и Коминтерновском районах г. Воронеж может являться загрязнение атмосферного воздуха формальдегидом и бенз(а)пиреном. Их концентрация в данных районах превышала показатели на остальных опытных площадках, а также ПДК. При ингаляционном поступлении в организм человека указанные вещества способны индуцировать образование микроядер в клетках эпителия слизистой оболочки ротовой полости, в первую очередь подвергающейся действию мутагенов. Подобные факты были выявлены рядом исследователей (Арутюнян, 1990; Микроядерный анализ …, 1992; Нерсесян, 1996; Цитогенетические нарушения…, 1998).

В 2002 г. в Ленинском районе частота встречаемости клеток с микроядрами оставалась на уровне 2001 г., в Коминтерновском - снизилась в 3,1 раза по сравнению с показателем предыдущего года, а в Советском - возросла в 1,8 раза и статистически достоверно превышала значения в двух других районах (P<0,01). В то же время среднее значение частоты встречаемости клеток с микроядрами в эпителиоцитах ротовой полости детей в г. Воронеж оставалось на уровне 2000 - 2001 гг. Таким образом, напряжённая экологическая ситуация сохранялась на территории Советского и Ленинского районов.

Таблица 5

Частота встречаемости клеток с микроядрами в эпителиоцитах ротовой полости детей, %

Обозначения:

* - различия с Советским районом г. Воронеж достоверны (P<0,05);

** -различия с Советским районом г. Воронеж достоверны (P<0,01);

*** - различия с районом № 2 г. Нововоронеж достоверны (P<0,05);

**** - различие с районом № 2 с. Землянск достоверно (P<0,05)

В г. Нововоронеж уровни встречаемости клеток с микроядрами в слизистом эпителии ротовой полости детей в районах №№ 1 и 3 статистически достоверно превышали данный показатель в районе № 2 и были практически равны друг другу (табл. 5). Полученные результаты свидетельствуют о худшем качестве окружающей среды в районах №№1 и 3. Несмотря на то, что, по данным Государственной службы санитарно-эпидемиологического надзора, территория района № 1 считается «экологически благополучной», высокая частота встречаемости клеток с микроядрами у детей, скорее всего, свидетельствует о значительном загрязнении воздуха выбросами от автотранспорта и промышленных предприятий, сосредоточенных в основном в северо-восточной части города. Более того, частота встречаемости клеток с микроядрами у детей в г. Нововоронеж не отличается от таковой в двух районах г. Воронеж (Коминтерновском и Советском) в 2000 г. Следовательно, загрязненность атмосферного воздуха небольшого города Нововоронеж сопоставима с загрязненностью районов крупного промышленного центра.

В с. Землянск наибольшая частота встречаемости клеток с микроядрами наблюдалась у детей, проживающих на территории района № 1 (табл. 5), что позволяет говорить о худшей экологической ситуации на данной территории по сравнению с другой опытной площадью. Однако невысокие показатели уровня аберрантных клеток в буккальном эпителий детей, проживающих в с. Землянск (различия с данным показателем у детей из г. Воронеж в 2001 г. достоверны, Р<0,001), свидетельствуют о сравнительно благоприятной экологической обстановке на территории указанного населенного пункта по сравнению с г. Воронеж, в частности, состоянии атмосферного воздуха.

6.2. Прогнозирование генотоксичности окружающей среды для человека по цитогенетическим показателям растительных тест-объектов

Были установлены сходные тенденции в изменении частоты встречаемости клеток с микроядрами в слизистом эпителии ротовой полости детей и морфологических характеристик ядрышек в клетках семенного потомства берёзы повислой на опытных территориях трех населённых пунктов. Нами выявлено наличие положительной корреляционной связи между площадью поверхности одиночных ядрышек в клетках семенного потомства берёзы повислой и частотой встречаемости клеток с микроядрами в буккальном эпителии ротовой полости детей (r_s=0,3122 (P<0,05)). Этот факт создает предпосылки для возможной экстраполяции данных, полученных на растительном тест-объекте, на человека.

По данным цитогенетического анализа, выполненного в 1999-2001 гг., с использованием методов регрессионного анализа нами была предложена формула, позволяющая установить зависимость между показателями ядрышковой активности (площадь поверхности одиночных ядрышек) семенного потомства берёзы повислой и частотой цитогенетических нарушений у человека (частота встречаемости эпителиоцитов с микроядрами в ротовой полости детей):

Y = - 2,482 + 0,603ln(X),

где X - площадь поверхности одиночных ядрышек в клетках корневой меристемы проростков семян берёзы повислой; Y - частота встречаемости клеток с микроядрами в буккальном эпителии ротовой полости детей.

Безусловно, указанная формула, опирающаяся на цитогенетические показатели березы повислой, не отражает всего многообразия процессов, происходящих в организме человека под влиянием мутагенов. Однако факт установления такой зависимости заслуживает внимания, т.к. показывает возможность оценки генотоксичности окружающей среды для человека по цитогенетическим показателям древесных растений.

Адекватность разработанной нами математической модели проверяли по результатам цитогенетического анализа, выполненного в 2002 г. В Ленинском и Коминтерновском районах наблюдалось хорошее совпадение полученных в ходе вычислений и экспериментальных значений. Расхождение теоретических данных с опытными в Советском районе г. Воронеж можно обосновать расчётной ошибкой коэффициентов в формуле регрессионного уравнения. Следует отметить также, что разработанная математическая модель показала хорошие результаты при прогнозировании генотоксичности окружающей среды для человека в г. Старый Оскол (Калаев, 2006).

Указанная формула позволяет проводить экстраполяцию данных цитогенетического мониторинга, полученных на растительном тест-объекте, на человека и прогнозировать качество окружающей среды для здоровья человека по состоянию цитогенетического аппарата древесных растений.

6.3. Интегральная оценка состояния окружающей среды по цитогенетическим характеристикам семенного потомства древесных растений

Применение нескольких цитогенетических характеристик одного тест-объекта при проведении мониторинговых исследований, несмотря на положительные результаты, получаемые при качественной оценке загрязнения, приводит к затруднениям в интерпретации результатов при количественной оценке, т.е. при выявлении уровня загрязнения обследуемой территории. Это обусловлено разной чувствительностью отдельных цитогенетических критериев как к уровню, так, возможно, и к типу загрязнения. Взаимная компенсация изменений, приводящая в итоге к нормальному результату (канализованность признака), не позволяет дать точную оценку степени загрязнения. Для решения проблемы предложено применять методы кластерного анализа, которые по совокупности цитогенетических характеристик позволяют выявить сходство исследованных территорий. Ниже представлены дендрограммы кластерных расстояний между опытными территориями в 1-км зоне Нововоронежской АЭС и контролем, построенные по цитогенетическим показателям семенного потомства деревьев дуба черешчатого (рис. 4).

Данные кластерного анализа показали, что в 1996 и 1998 гг. опытные территории в районе станции группировались в четкий единый кластер, отделенный от контроля. Это подтверждает предположение о влиянии выбросов АЭС на цитогенетические показатели проростков желудей дуба черешчатого. Наибольшее кластерное расстояние (соответственно, наибольшие различия с контролем) в 1996 г. отмечено между опытной территорией № 5 (район шламоотвала) и контролем, в 1998 г. - между опытной территорией № 4 (район дороги) и контролем. Наименьшее расстояние от контроля имели опытные территории № 4 (1996 г.) и № 2 (1998 г.) (территория за шламоотвалом).

С использованием кластерного анализа выявлены наиболее загрязненные территории в г. Воронеж, г. Нововоронеж, г. Старый Оскол, пос. Землянск, пос. Уразово, а также сходное влияние лесорастительных условий сосняка злаково-лишайникового и сосняка травяного на генетический гомеостаз семенного потомства деревьев березы повислой, произрастающих в Хреновском бору.

Изложенное выше позволяет сделать вывод о том, что семенное потомство дуба черешчатого и березы повислой может применяться, как и разработанные ранее тест-объекты - виды хвойных из родов Pinus, Larix, Picea, Abies (Индикация загрязнения окружающей …, 1999; Калашник, 2000; 2008; 2009; Квитко, 2009; Мазурова, 2008; Миронов, 2002; Сенькевич, 2007), для адекватной оценки степени загрязнения окружающей среды как в комплексе с хвойными, так и самостоятельно, а применяемые нами цитогенетические методы могут быть рекомендованы для широкомасштабного внедрения в целях ранней диагностики состояния флоры в частности и окружающей среды в целом, так как позволяют выявить повреждения наследственного аппарата организмов и установить их глубину еще до момента фенотипического проявления.

Выводы

1. Выделены чувствительные цитогенетические показатели (ядрышковые характеристики и время прохождения клетками стадий митоза), модификации которых выявляются при незначительных отклонениях условий среды от оптимальных, и устойчивые (появление клеток с микроядрами, депрессия митотической активности), которые изменяются только при сублетальных стрессовых воздействиях. Создана шкала чувствительности цитогенетических показателей к стрессовым факторам.

2. В качестве эталона при проведении цитогенетического мониторинга и для сравнительной оценки семенного потомства деревьев разных селекционных категорий предложены пределы изменчивости цитогенетических показателей проростков семян деревьев березы повислой (по 17 показателям) и дуба черешчатого (по 10 показателям), собранных на экологически «чистой» территории.

3. Представлено математическое описание суточных ритмов цитогенетических показателей дуба черешчатого и березы повислой с использованием полиномиальных функций. Показана необходимость увеличения степени полинома при описании динамики изменения основных характеристик митотического аппарата в условиях антропогенного загрязнения.

4. Разработанные нами математические модели позволяют прогнозировать значения цитогенетических показателей в любое время суток по единственному экспериментально полученному в определенный час, а также корректно сравнивать результаты цитогенетических исследований, выполненных на проростках семян, зафиксированных в разное время.

5. У потомства материнских деревьев дуба черешчатого, подвергшихся радиоактивному облучению, в отдаленные сроки после воздействия радиации наблюдались изменения цитогенетических показателей (мутационный процесс), характеризующиеся волновой кинетикой.

6. В 1-км зоне Нововоронежской АЭС происходит изменение цитогенетических показателей семенного потомства дуба черешчатого и березы повислой по сравнению с контролем, связаное с функционированием атомной станции. У исследованных тест-объектов наиболее чувствительным к загрязнению оказались ядрышковые характеристики (площадь поверхности одиночных ядрышек, встречаемость многоядрышковых клеток) и время прохождения клетками стадий митоза, что связано с активацией механизмов checkpoint-репарации генетического материала.