Действие некоторых пестицидов на дождевых червей

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДЕЙСТВИЕ НЕКОТОРЫХ ПЕСТИЦИДОВ НА ДОЖДЕВЫХ ЧЕРВЕЙ

03.02.08 - Экология (биология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Воронцов Вадим Валерьевич

Москва - 2013

Работа выполнена на кафедре общей и биологической химии в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Каменёк Людмила Кирилловна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, доцент кафедры биотехнологии и биоэкологии биологического факультета Астраханского государственного университета, главный научный сотрудник лаборатории биотехнологий

Ведущая организация:

Защита состоится «___» ___________ 2012 г. в «______» часов на заседании диссертационного совета Д ______________ при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет» по адресу: ул. Набережной реки Свияги, 106, корп.1, ауд.703.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ульяновского государственного университета, с авторефератом - на сайте ВУЗа www.uni.ulsu.ru.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 432000, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42, Ульяновский государственный университет, Отдел послевузовского и профессионального образования.

Автореферат разослан _____________ 20_____ г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук С.В. Пантелеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сельскохозяйственное производство входит в число основных загрязняющих факторов почвенного покрова, что связано с применением средств защиты возделываемых культур. К сожалению, множество используемых в прошлом и настоящем препаратов обладают выраженным отрицательным действием на сельскохозяйственные культуры, проявляющемся в мутагенном, кластогенном (Гиляров, 1974; Голиков, 1986; Голованова, 2003; и др.), гаметоцидном (Добровольский, 1997; Карташев, 2006) и общем токсическом действии, что в итоге приводит к снижению продуктивности растений (Курдюков, 1982; Кузнецова, 2005). Исследования ряда ученых показали, что отказ от использования средств защиты растений снижает рентабельность сельскохозяйственного производства в связи с резким падением урожайности агрокультур (Соколов, 1994; Попов, 2003; и др.). В данном аспекте совершенно ясно, что отказаться от использования пестицидов не представляется возможным, поэтому определение среди применяемых и предлагаемых к производству препаратов наименее токсичных для биотического компонента агроэкосистем является актуальным экологическим направлением, имеющим большую практическую ценность.

Пестициды являются биологически активными веществами, в той или иной мере оказывающими отрицательное воздействие на биоту, в том числе на фауну беспозвоночных животных агроэкосистем и представителей почвенной биоты, имеющих важное значение в почвообразовательном процессе (Малевич, 1950; Чекановская, 1960; Перель, 1959, 1977, 1979; Матвеева, 1982; Криволуцкий, 1987). Дождевые черви принимают активное участие в процессах утилизации растительной биомассы, минерализации органических веществ, при этом они аккумулируют пестициды и другие химические вещества, в количествах в сотни раз превышающих их содержание в почве (Чернышев, 1989; Козлов К.С., 2003; Тиунов, 2007). Это дает предпосылку для использования их в эколого-токсикологических исследованиях влияния пестицидов на почвенную биоту (Лунев, 2005; и др.). Данному направлению посвящены работы П.В. Терещенко (1996, 1997), Ф.В. Атощенкова (1999), Butt Kevin R. (2000), К.С. Козлова (2003), Е.В. Головановой (2003), А.Г. Карташева с соавторами (2006), Н.П. Битюцкому с соавторами (2008), В.В. Смольникова (2011), Д.Э. Эмировой с соавторами (2011) и ряда других ученых. В тоже время в научных публикациях практически отсутствуют данные о сравнительной оценке действия различных классов пестицидов, в том числе биогенного происхождения, на дождевых червей. Актуальность и недостаточная изученность данного вопроса послужила предпосылкой для настоящего исследования.

Цель настоящего исследования - исследовать влияние загрязнения почвы различными классами пестицидов на представителей почвенной мезофауны на примере дождевых червей Lumbricus terrestris L.

Для достижения данной цели решались следующие задачи:

- исследовать поведенческие реакции и морфофизиологические изменения дождевых червей в условиях влияния разных классов пестицидов в лабораторных и полевых условиях;

- оценить влияние острой и хронической токсичности исследуемых пестицидов на выживаемость и жизнедеятельность дождевых червей;

- изучить репродуктивную способность червей в зависимости от класса и концентрации препаратов в лабораторных и полевых условиях.

Научная новизна.

впервые проведены исследования по влиянию пестицидов классов триазиновых, неоникотиноидов и препарата на основе белкового дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на дождевых червей;

установлены эколого-токсикологические характеристики исследуемых препаратов для дождевых червей;

изучены поведенческие реакции и морфофизиологические изменения дождевых червей при загрязнении почвы исследуемыми пестицидами;

установлены дозозависимый и дозовременной эффекты действия исследуемых препаратов на смертность дождевых червей;

выявлен характер токсичного влияния исследуемых пестицидов на репродуктивные способности особей дождевых червей, отражающий неконкурентный кооперативный тип зависимости.

Теоретическая значимость работы. Изучение особенностей физиологического реагирования гумусообразующей мезофауны почвы расширяют теоретические представления о характере воздействия биологических и химических препаратов на биоту, а также вносят большой вклад в экологию наземных экосистем.

Практическая значимость работы. Результаты проведенного исследования, отражающие эколого-токсикологическое действие пестицидов на дождевых червей Lumbricus terrestris, могут быть использованы для создания системы экологического мониторинга наземных систем в зонах использования данных препаратов, так как на основании изменения физиологических, поведенческих, биохимических реакций одного вида можно прогнозировать воздействие загрязнителей на другие виды.

Связь темы диссертации с плановыми исследованиями. Работа выполнена в ходе научного направления кафедры общей и биологической химии в области экологического мониторинга.

Декларация личного участия автора. Автором определена цель и поставлены задачи, подобраны основные методы исследований. Автор непосредственно участвовал в выполнении экспериментальных лабораторных полевых исследований, проведении статистического анализа, обсуждения и обобщения данных. Написание текста диссертации, формулирование основных теоретических положений и выводов осуществлено по плану, согласованному с научным руководителем. Доля личного участия автора в совместных публикациях пропорциональна числу авторов.

Достоверность результатов и обоснованность выводов обеспечивается применением современных методов, значительным объемом проведенных лабораторных и полевых исследований, использованием статистических методов обработки и анализа полученных результатов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1) Эколого-токсикологическая характеристика пестицидов различных классов для дождевых червей;

2) Применение биологического препарата на основе дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis не оказывает влияния на жизнедеятельность дождевых червей;

3) Малые дозы химических препаратов из группы неоникотиновых и триазиновых пестицидов токсичны для дождевых червей, снижая их репродуктивную способность и вызывая иммобилизацию.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на международных и всероссийских конференциях: II Международной научной конференции «Наука в современном обществе» (Ставрополь, 2012); XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2010» (Москва, 2010); XIX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2012» (Москва, 2012); I Международной научно-практической конференции «Перспективные инновации в науке, образовании, производстве и транспорте '2012» (Одесса, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов, материалов и методов исследования, экспериментальной главы, выводов общим объёмом 177 страниц компьютерного набора. Работа иллюстрирована 51 таблицей и 73 рисунками. Список литературы состоит из 115 наименований, в том числе 21 наименование на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

червь дождевой почва загрязнение

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель, задачи, научная новизна и практическая значимость работы, приведены положения, выносимые на защиту, изложена структура диссертации.

Глава I содержит обзор литературы по изучаемой проблеме и состоит из 4 подразделов, которые содержат информацию об экологических аспектах действия пестицидов на педосферу и использовании дождевых червей как объектов биоиндикации почв. Представлена подробная характеристика используемых пестицидов и биология дождевых червей.

В настоящее время существует несколько причин широкого распространения химических средств защиты растений. Сравнительная дешевизна, высокая техническая эффективность, быстрота действия, вызывающая 80-100 % гибель вредителей в течение нескольких часов или даже минут, способствовали быстрому внедрению пестицидов в сельскохозяйственное производство.

Пестициды как тонкодисперсные вещества в почве подвержены многочисленным воздействиям биотического и небиотического характера, определяющие их поведение, преобразование и минерализацию. Тип и скорость преобразований зависят от химической структуры действующего вещества и его устойчивости, механического состава и строения почв, химических свойств почв, состава флоры и фауны почв, интенсивности влияния внешних воздействий и системы ведения сельского хозяйства.

По скорости разложения в почве пестициды предложено разделить на следующие шесть групп.

1) препараты с продолжительностью действия более 18 месяцев (большинство хлорорганических пестицидов);

2) препараты с продолжительностью действия около 18 месяцев (некоторые производные мочевины, пиклорам, симазин и другие триазины);

3) пестициды с продолжительностью сохранения в почве до 12 месяцев (производные бензойной кислоты, амиды кислот);

4) препараты с продолжительностью сохранения в почве до 6 месяцев (нитроанилины, акрилоксиалканкарбоновые кислоты и другие);

5) пестициды с продолжительностью сохранения в почве более 3 месяцев (производные карбаминовой кислоты, алифатические карбоновые кислоты и другие);

6) пестициды с продолжительностью сохранения в почве менее 3 месяцев (органические соединения фосфора и другие).

Такое деление носит условный характер, так как персистентность пестицидов зависит не только от их строения, но и от активности почвенных микроорганизмов и других факторов.

Адсорбция пестицидов в почве - комплексный процесс, зависящий от многочисленных факторов. Она играет важную роль в перемещении пестицидов и служит для временного поддержания в парообразном или растворенном состоянии или в виде суспензии на поверхности почвенных частиц. Особо важную роль в адсорбции пестицидов играют ил и органическое вещество почвы, составляющие «коллоидальный комплекс» почвы.

Передвижение пестицидов в почве происходит с почвенным раствором или одновременно с перемещением коллоидных частиц, на которых они адсорбированы. Это зависит как от процессов диффузии, так и массового тока (разжижение), которые представляют собой обычный способ вымывания.

Современная диагностика почв использует достижения всех разделов почвоведения, применяя данные по морфологии, химии, физике и минералогии почв. Биология почв располагает показателями, характеризующими динамические свойства («почва-момент», «почва-жизнь») и являющимися индикаторами современного режима почвы. Поэтому использование биологических методов диагностики и индикации необходимо для общей характеристики состояния почвы и оценки ее плодородия

Глава II посвящена описанию объектов, материалов и методов исследований. Представлена характеристика агроклиматических условий Ульяновской области, схема проведения почвенно-экологических и лабораторных исследований.

Почвенно-экологические исследования проводились в период 2008-2010 гг. на территории областной станции «Опытная» (п. Тимирязевский, Ульяновская область) на участках агрокультур картофеля (сорт Ильинский) и моркови (сорт Королева осени), обрабатываемых пестицидами. На контрольных участках обработка не производилась. Для оценки влияния острой токсичности различных доз пестицидов на поведение и выживаемость дождевых червей в естественном агробиоценозе были заложены по единой методике модельные площадки по 1 м² с дозированным внесением пестицидов:

- «Актара» (д.в. тиаметоксам) - 0,05; 0,5; 1; 10 г/м²;

- «Гезагард» (д.в. концентрат суспенции 500 г/л прометрина) - 0,05; 0,5; 1; 10; 50 г/м²;

- «Дельта-2» (на основе дельта-эндотоксин B. Thuringiensis) - 0,05; 0,5; 1; 10; 50 г/м².

Каждый вариант был представлен в 5-кратной повторности. Всего было заложено 65 модельных площадок, три из которых были контрольными. Наблюдения и учеты на площадках проводились через 3, 10, 30, 60 и 90 дней.

Полученный материал обрабатывался в лаборатории кафедры общей и биологической химии УлГУ, согласно стандартной методике (Парель, 1979; Количественные методы в почвенной зоологии, 1987). Определялся видовой состав, проводился анализ коконов дождевых червей, количественных и морфометрических характеристик (Зоология беспозвоночных…, 2000).

Учет дождевых червей в почвенном покрове проводили по стандартной методике (Зоология беспозвоночных…, 2000).

В лабораторных условиях изучались закономерности поведенческих реакций и изменения численности дождевых червей под влиянием различных классов пестицидов в зависимости от концентрации и времени экспозиции. Были проведены опыты по исследованию острой и хронической токсичности препаратов для дождевых червей с использованием естественной (условно чистой) почвы, в которую искусственно вносили определенные концентрации пестицидов; опыты по определению репродуктивной способности червей в загрязненной почве (EPS 1/RM/43, 2007); цитологический анализ проводили по стандартным методикам морфометрии (Быков, 2002; Голованова, 2009). Исследования были проведены по модифированной методике, разработанной на основе стандартных методик (OECD 207, 1984; ISO 11268-1, 1995; ISO 11268-2, 1998; ISO 11268-3, 1999; EPS 1/RM/43, 2007), с учетом практических выводов 2-го международного симпозиума по экотоксикологии дождевых червей (EPS 1/RM/43, 2007).

В экспериментах использовались половозрелые особи дождевого червя Lumbricus terrestris из маточной популяции. В первом опыте червей вносили через сутки после подготовки субстрата по 10 особей в контейнер, содержали 7 дней при T _{воздуха} = 20±2 °С. Во втором - по 10 особей на контейнер, содержали 28 дней при T _{воздуха} = 20±2 °С.

В качестве контроля использовали почву с навозом, но без загрязнителей. Была зафиксирована 93% выживаемость червей в течение 28 дней. Таким образом, исходный субстрат соответствовал требованиям используемых методик и был пригоден для использования в экспериментах.

На каждую концентрацию пестицида ставилось по 5 кювет. Опыты проводились при комнатной температуре +20 °С. В экспериментах использовались 100 половозрелых особей дождевых червей на каждую концентрацию препарата.

Все полученные данные подвергали математической обработке: вычисляли средние арифметические рядов, ошибки средних арифметических, стандартные отклонения, доверительные интервалы, соответствующие корреляционные отношения на основе линейного корреляционного анализа, определяли коэффициент достоверности по Стьюденту (Румшинский, 1971; Фаддеев, 2002). В работе использованы также методы системного и дисперсионного анализов.

Статистическую обработку результатов исследования проводили на персональной ЭВМ типа IBM «Pentium-IV», графическая обработка материалов выполнена с помощью пакета прикладных программ Exсel-2003. При математической обработке данных использовали пакет СSS3.1 «Компьютерная биометрия». Проверка на нормальность распределения экспериментальных данных осуществлялась с использованием пакета программы Statplus 2009.

Глава III включает 4 раздела и посвящена изложению и обсуждению собственных результатов, полученных в ходе исследования.

Раздел 3.1. Исследование влияния модельного загрязнения почвы пестицидами на дождевых червей в лабораторных условиях.

Для создания модельного загрязнения в лабораторных условиях была использована дерново-подзолистая почва с территории станции «Опытная» (верхний 10 см слой), затем просушена и просеяна через сито с ячейкой 3 мм. Влажность доводили дистиллятом до 70%. К почве (pH=6,85) для питания червей добавляли ферментированный навоз из расчета 20% от общей массы (pH=8,3).

Степень токсичности исследуемых пестицидов устанавливалась с помощью верхней и нижней границ диапазона их токсического действия, т.е. испытывались концентрации, приводящие к гибели 100% дождевых червей (LD₁₀₀), а также дозы, не вызывающие иммобилизацию ни одного тест-организма в опытной группе (LD₀).

С помощью пробит-анализа кривых летальности и метода Прозоровского установлены медианные дозы препаратов LD₅₀ по результатам 7 дневных опытов для популяции дождевых червей (таблица 1). Пробит-анализ позволяет расчетным методом определить токсикологические характеристики пестицидов для дождевых червей, отражающие колебания индивидуальной чувствительности организмов.

Таблица 1 - Токсикологические характеристики исследуемых препаратов для дождевых червей (7-дневный эксперимент), г/кг (на 1 кг почвы)

Наименование препарата	LD16	LD84	LD50	Верхняя граница LD50	Нижняя граница LD50	Станд. ошибка LD50	LD100
«Актара» (д.в. тиаметоксам)	0,66	5,32	1,82	4,13	0,83	1,1_	7,_6
«Гезагард» (суспензия концентрата прометрина)	1,69	38,26	18,28	28,84	7,73	5,16	48,25
«Дельта-2» (на основе дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis)	70,61	212,65	141,63	213,48	69,78	31,76	248,16

Примечание. Использовалось программное обеспечение StatPlus 2009 Professional 5.8.4 AnalystSoft

Таким образом, можно сделать вывод о безопасности применения инсектицидного препарата на основе белкового дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на представителей мезофауны на примере дождевых червей.

Результаты тестов на репродуктивную способность дождевых червей представлены в таблице 2 (EPS 1/RM/43, 2007).

Таблица 2 - Влияние загрязненного субстрата на репродуктивные показатели дождевых червей

Вид загрязнителя в субстрате	Концентрация загрязнителя	Общее число коконов	Количество коконов, отложенных 1 червем за 7 дней	Количество ювенильных особей в коконе	Количество живых коконов от общего числа коконов, %
Контроль	200±4,5	0,81±0,40	2,04±0,16	92,0±4,0
препарат «Актара»	0,01 г/кг	88,2±2,4	1,10±0,14	1,87±0,20	66,2±3,8
	0,1 г/кг	59,5±2,9	1,63±0,24	2,35±0,38	48,7±4,0
	1,0 г/кг	22,7±2,0	0,53±0,08	0,65±0,08	38,0±2,5
	10,0* г/кг	-	-	-	-
препарат «Гезагард»	0,01 г/кг	70,6±3,4	0,83±0,20	2,01±0,4	68,3±1,6
	0,1 г/кг	62,4±2,5	0,98±0,38	1,44±0,31	60,0±2,0
	1,0 г/кг	56,8±4,0	0,90±0,20	1,55±0,17	56,4±2,4
	10,0* г/кг	53,2±3,2	0,31±0,14	1,33±0,20	38,7±1,8
	50,0* г/кг	-	-	-	-
препарат «Дельта-2»	0,01 г/кг	186,2±3,8	1,90±0,20	2,01±0,20	81,5±2,6
	0,1 г/кг	180,6±3,0	1,00±0,12	1,44±0,20	66,1±3,1
	1,0 г/кг	150,5±2,8	0,90±0,30	1,55±0,15	60,4±2,9
	10,0 г/кг	56,2±4,0	0,31±0,42	1,33±0,16	48,3±2,0
	50,0 г/кг	33,2±3,8	0,83±0,35	1,01±0,10	42,5±1,9

* При данных концентрациях загрязнителя черви переставали откладывать коконы. В загрязненный субстрат вносили коконы червей маточной популяции.

Примечание: курсивом показаны достоверные различия с контролем при р0,05

Тест на репродуктивную способность показал, что хлорорганический неоникотиновый препарат «Актара» в почве в дозах 1,0 г/кг и 0,1 г/кг снижает процент живых коконов на 67,4 % и 28,0 % соответственно. Триазиновый пестицид «Гезагард» в дозе 10,0 г/кг уменьшает процент живых коконов на 73,4 %; количество коконов, отложенных одним червем за неделю, на 62,5 %. При концентрации в субстрате препарата «Дельта-2» 50,0 г/кг общее количество коконов меньше контрольной группы на 83,4 %, причем при такой же дозе «Гезагарда» особи не образовывали коконы.

Для определения характера влияния исследуемых пестицидов на репродуктивные способности особей дождевых червей в лабораторных условиях применили экспериментальное математическое моделирование, используя модифицированное уравнение Иерусалимского, включающее в себя параметр логарифма концентрации (дозы) lnI (lnС) и вспомогательного параметра (по данным из таблицы 6).

Для указанных концентраций исследуемых препаратов определены необходимые кинетические параметры, характеризующие их влияние на процесс размножения дождевых червей (рисунок 1).

Рисунок 1 - Угнетение репродуктивной функции в зависимости от концентрации исследуемых препаратов в модельном субстате (в соответствии с модифицированным уравнением Иерусалимского)

Как видно из рисунка, эта зависимость отражает неконкурентный кооперативный тип ингибирования и может описываться модифицированным уравнением Иерусалимского, отражающего угнетение репродуктивной способности дождевых червей под влиянием ингибитора (токсиканта) (Евдокимов, 2001):

,

где n - коэффициент нелинейности ингибирования;

К - константа ингибирования (угнетения), численно равная той концентрации токсиканта, при которой значение функции уменьшается вдвое;

I - концентрация исследуемого пестицида;

r₀ - количество коконов при нулевой концентрации пестицида;

r_I - количество коконов при концентрации пестицида, равной I.

Рисунок 2 - Определение параметров уравнения Иерусалимского (Евдокимов, 2001)

Параметры уравнения определили на основе линейного преобразования уравнения Иерусалимского. Построенный по рассчитанным вспомогательным переменным lnС и график (рисунок 2) свидетельствует о нелинейном характере процесса ингибирования (угнетения функции), где значение коэффициента нелинейности ингибирования n найдено по тангенсу угла наклона регрессионной прямой, проведенной через экспериментальные точки. Константа ингибирования K_I определяется из ее натурального логарифма, который определяется из точки пересечения регрессионной прямой с осью абсцисс (рисунок 2): lnK_I для препарата «Актара»= 0,34 г/кг, n= 2,05; lnK_I для препарата «Гезагард»= 0,98 г/кг, n=0,60; lnK_I для препарата «Дельта-2»= 53,14 г/кг, n= 0,36.

Таким образом, тенденция угнетения репродуктивной функции при увеличении концентрации пестицидов подтверждается модифицированным уравнением Иерусалимского, описывающий дозозависимый эффект. Согласно найденной константе ингибирования, можно судить о токсичном воздействии на репродуктивную функцию исследуемых препаратов. Анализ полученных результатов позволяет провести градацию по способности пестицидов угнетать способность к воспроизводству потомства: «Актара» > «Гезагард» > «Дельта-2».

Раздел 3.2. Цитологическое исследование гемолимфы дождевых червей в условиях загрязнения почв пестицидами.

Диагностическое цитологическое исследование кровяных элементов дождевых червей проводили по стандартным методикам цитологии, представляющие собой совокупность приемов количественной оценки параметров клеточных структур. Объектом исследования являлись амебоциты дождевых червей как индикаторы изменений их физиологического состояния. Дождевые черви имеют отделенную замкнутую сосудистую систему, не сообщающейся с полостями тела и тканевой жидкостью (Верещагина, 2007).

Амебоциты дождевых червей были разделены на виды:

- Одноядерные амебоциты с нормальной формой ядра;

- Одноядерные амебоциты с измененной формой ядра;

- Двуядерные амебоциты;

- В стадии кариопикноза;

- В стадии кариорексиса.

Были проанализированы клетки крови дождевых червей непосредственно в полевых условиях на 3, 10, 30 и 60 день почвенно-экологических исследований в течение 2008-2010 гг.

Анализ амебоцитов гемолимфы дождевых червей на 3, 10, 30 и 60 день полевых почвенно-экологических исследований в 2008 году указывает на тенденцию увеличения одноядерных клеток с измененной формой ядра при повышении дозы внесения пестицидов в почву. Это подтверждается корреляционным анализом, выборочный линейный коэффициент корреляции для исследуемых препаратов и периода экспозиции представлен в таблице 3.

Таблица 3 - Параметрические показатели корреляции

Наименование препарата	Период экспозиции	Линейный коэффициент корреляции R	Оценка по шкале Чеддока
«Актара» (д.в. тиаметоксам)	3 день	0,96	0,9 < R <1 весьма высокая
	10 день	0,94	0,9 < R <1 весьма высокая
	30 день	0,86	0,7 < R < 0,9 высокая
	60 день	0,92	0,9 < R <1 весьма высокая
«Гезагард» (суспензия концентрата прометрина)	3 день	0,57	0,5 < R < 0,7 заметная
	10 день	0,64	0,5 < R < 0,7 заметная
	30 день	0,82	0,7 < R < 0,9 высокая
	60 день	0,63	0,5 < R < 0,7 заметная
«Дельта-2» (на основе дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis)	3 день	0,88	0,7 < R < 0,9 высокая
	10 день	0,74	0,7 < R < 0,9 высокая
	30 день	0,84	0,7 < R < 0,9 высокая
	60 день	0,80	0,7 < R < 0,9 высокая

Анализ клеток гемолимфы дождевых червей на 3, 10, 30 и 60 день полевых почвенно-экологических исследований в 2009 году подтверждает влияние токсикантов на клеточные структуры. Количество одноядерных клеток с измененной формой ядра увеличивается с повышением дозы внесения пестицидов в почву, на что указывает корреляционный анализ, выборочный линейный коэффициент корреляции которого представлен в таблице 4.

Таблица 4 - Параметрические показатели корреляции

Наименование препарата	Период экспозиции	Линейный коэффициент корреляции R	Оценка по шкале Чеддока
«Актара» (д.в. тиаметоксам)	3 день	0,82	0,7 < R < 0,9 высокая
	10 день	0,90	0,9 < R <1 весьма высокая
	30 день	0,86	0,7 < R < 0,9 высокая
	60 день	0,74	0,7 < R < 0,9 высокая
«Гезагард» (суспензия концентрата прометрина)	3 день	0,53	0,5 < R < 0,7 заметная
	10 день	0,64	0,5 < R < 0,7 заметная
	30 день	0,87	0,7 < R < 0,9 высокая
	60 день	0,58	0,5 < R < 0,7 заметная
«Дельта-2» (на основе дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis)	3 день	0,95	0,9 < R <1 весьма высокая
	10 день	0,94	0,9 < R <1 весьма высокая
	30 день	0,85	0,7 < R < 0,9 высокая
	60 день	0,63	0,5 < R < 0,7 заметная

Примечание: курсивом показаны достоверные различия с контролем при р0,05

Результаты анализа клеток гемолимфы дождевых червей на 3, 10, 30 и 60 день полевых почвенно-экологических исследований в 2010 году указывают на влияние токсикантов на клеточные структуры. Количество одноядерных клеток с измененной формой ядра увеличивается с повышением дозы внесения пестицидов в почву, что подтверждается корреляционным анализом, выборочный линейный коэффициент корреляции которого представлен в таблице 5.

Таблица 5 - Параметрические показатели корреляции

Наименование препарата	Период экспозиции	Линейный коэффициент корреляции R	Оценка по шкале Чеддока
«Актара» (д.в. тиаметоксам)	3 день	0,76	0,7 < R < 0,9 высокая
	10 день	0,82	0,7 < R < 0,9 высокая
	30 день	0,86	0,7 < R < 0,9 высокая
	60 день	0,92	0,9 < R < 1 очень высокая
«Гезагард» (суспензия концентрата прометрина)	3 день	0,74	0,7 < R < 0,9 высокая
	10 день	0,69	0,5 < R < 0,7 заметная
	30 день	0,82	0,7 < R < 0,9 высокая
	60 день	0,70	0,5 < R < 0,7 заметная
«Дельта-2» (на основе дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis)	3 день	0,92	0,7 < R < 0,9 высокая
	10 день	0,86	0,7 < R < 0,9 высокая
	30 день	0,80	0,7 < R < 0,9 высокая
	60 день	0,77	0,7 < R < 0,9 высокая

Результаты цитологического анализа клеток гемолимфы дождевых червей указывают на нарушение функциональной активности, а также на морфологические, физико-химические и биохимические изменения. Главными признаками поражающего фактора были уменьшение степени дисперсности коллоидов протоплазмы, увеличение вязкости и кислотности протоплазмы. В гемолимфе дождевых червей могут образовываться двухядерные клетки в результате нарушения функции митотического деления и задержки цитотомии. Также причиной этого явления может быть слияние двух клеток.

Наличие зависимости изменения формы ядра амебоцитов гемолимфы дождевых червей от доз исследуемых пестицидов было проверено с помощью однофакторного дисперсионного анализа. При уровне значимости б=0,05 была проверена гипотеза о значимости влияния этих факторов на исследуемый признак. Различия между значениями количества клеток с патологией на 100 клеток гемолимфы достоверны по годам исследования при б = 0,05. При дозе внесения биопрепарата «Дельта-2» 0,05 г/м² различия между значениями количества клеток с патологией недостоверны.

Раздел 3.3. Исследование действия пестицидов на дождевых червей в полевых условиях на участке, засеянном картофелем.

Действие загрязнения почв пестицидами на дождевых червей определяется интенсивностью загрязнения. Тип почвы - черноземы выщелоченные среднегумусные среднемощные тяжелосуглинистые на карбонатных лессовидных суглинках. Оценку влияния исследуемых пестицидов на смертность дождевых червей определяли по количеству разлагающихся червей на площадках с внесением загрязнителей на 3, 10, 30 и 60-ый день в течение вегетационного периода 2008-2010 гг.

На участке, засеянном картофелем, использовали инсектицид «Актара» и «Дельта-2» (на основе дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis). Их разводили согласно инструкциям по применению. Использовали следующие концентрации: «Актара» (д.в. тиаметоксам) - 0,05, 0,5, 1,0, 10,0 г/м² (при норме расхода от 0,05-1,0 г/м²); «Дельта-2» (на основе дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis) - 0,05, 0,5, 1,0, 10,0, 50,0 г/м² (при норме расхода 2-3 г/м²).

По истечении 60 дней эксперимента наблюдалось сокращение разлагающихся червей на анализируемых участках по сравнению с контролем. На глубине до 5 см наблюдалось наибольшее число разлагающихся особей, которое уменьшалось к 10-20 см в 1,12-2,89 раза. Следовательно, воздействие неоникотинового пестицида «Актара» (д.в. тиаметоксам) на дождевых червей в почвенном горизонте до 5 сантиметров происходит интенсивнее биологического препарата «Дельта-2» (на основе дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis). Анализируя вертикальное распределение численности особей, снижение их количества происходило за счет гибели педобионтов в верхнем 10-сантиметровом слое почвы, где наиболее высокая концентрация пестицидов. Сравнивая численность дождевых червей на границе загрязнения, можно сделать вывод о горизонтальном перемещении особей в зону с наименьший концентрацией токсикантов. Однако судя по экспериментальным данным, в случае с неоникотиновым препаратом «Актара» с дозой внесения 10,0 и 50,0 г/м² особи погибали, не доходя до границы загрязнения. Напротив, препарат на основе продукта жизнедеятельности Bacillus thuringiensis не оказывает острого токсического эффекта, обусловленного его химическим строением и физико-химическими свойствами, что в первую очередь может указывать на интенсивность токсического действия.

Для получения сведений о токсическом влиянии изучаемых пестицидов полевых условиях в динамике исследования также были проведены в 2009 и 2010 годах по той же методике и схеме. Концентрации препаратов «Актара» и «Дельта-2» использованы те же. Отбор проб производился на 3, 10, 30 и 6о сутки после обработки модельной площадки пестицидами.

На участках, обработанных раствором биологического препарата «Дельта-2» наблюдалась положительная динамика увеличения показателей общего количества коконов и живых червей как на самой площадке, так и на границе с загрязнением. Количество коконов дождевых червей в почве анализируемых площадок на 60 день исследования составило от 152,0±16,0 экз. в дозе 50,0 г/м² (89,1% от количества живых особей на контрольном участке) до 164,8±11,2 экз. в дозе внесения 0,05 г/м² (меньше контрольных показателей на 3,3 %). Количественный учет коконов дождевых червей производился на загрязненных участках и на удалении 1 м от экспериментальных делянок, а также на контрольном участке.

Следует отметить климатический режим в летний период 2010 года, где наблюдались аномально высокие температуры воздуха при почти отсутствии дождей. Предполагается, что уменьшение сообщества дождевых червей по сравнению с предыдущими годами исследования связано с уменьшением почвенной влаги на анализируемых площадках.

Для оценки влияния исследуемых пестицидов во времени был проведен однофакторный дисперсионный анализ, целью которого является изучение влияния одного или нескольких факторов на рассматриваемый признак.

Сравнение экспериментальных данных трех лет исследования показало, что для каждой дозы почвенного внесения в полевых условиях различия в количестве разлагающихся червей оказались значимыми при уровне значимости б=0,05. Сравнивая компоненты дисперсии друг с другом посредством F-критерия Фишера, определяли, какая доля общей вариативности результативного признака обусловлена действием регулируемых факторов; была проверена гипотеза о значимости влияния этих факторов на исследуемый признак. Сопоставление оценок этих дисперсий по критерию Фишера показало, что гипотеза о равенстве факторной и остаточной дисперсий и обоснованна. Степень различия между средними в группах значений зависит от внутригрупповой вариации (дисперсии) переменных. При всех концентрациях препарата «Актара» (д.в. тиаметоксам) f_набл > f_кр и гипотеза о существенном влиянии искомого фактора на результаты принимается, следовательно, различия между значениями количества разлагающихся особей достоверны по годам исследования при б = 0,05. При концентрации «Дельта-2» (на основе дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis) 0,05 и 0,5 г/м² различия между значениями количества разлагающихся особей недостоверны по годам исследования при б = 0,05.

Раздел 3.4. Исследование действия пестицидов на дождевых червей в полевых условиях на участке, засеянном морковью.

Для установления влияния гербицида широкого спектра действия «Гезагард» на представителей мезофауны были использованы участки, засеянные морковью. Оценка воздействия исследуемого пестицида на смертность дождевых червей проводилась в сравнении с биологическим препаратом «Дельта-2» (на основе дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis).

Отбор проб проводили на 3, 10, 30 и 60 сутки исследования в течение 2008-2010 гг. Препараты разводили согласно инструкциям по применению. Использовали следующие концентрации: «Гезагард» (суспензия концентрата прометрина) - 0,05, 0,5, 1,0, 10,0, 50,0 г/м² (при норме расхода от 0,2-1,0 г/м² в зависимости от механического состава почвы и потенциальной засоренности); «Дельта-2» (на основе дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis) - 0,05, 0,5, 1,0, 10,0, 50,0 г/м² (при норме расхода 2-3 г/м²).

По истечении 60 дней эксперимента наблюдалось сокращение разлагающихся червей на анализируемых участках по сравнению с контролем. На глубине до 5 см наблюдалось наибольшее число разлагающихся особей, которое уменьшалось к 10-20 см в 1,04-2,60 раза. Следовательно, воздействие гербицида «Гезагард» на дождевых червей в почвенном горизонте до 5 сантиметров происходит интенсивнее биологического препарата «Дельта-2» (на основе дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis). Анализируя вертикальное распределение численности особей, снижение их количества происходило за счет гибели педобионтов в верхнем 10-сантиметровом слое почвы, где происходит всасывание их корневой системой культур. Сравнивая численность дождевых червей на границе загрязнения, можно сделать вывод о горизонтальном перемещении особей в зону с наименьшей концентрацией токсикантов. Однако судя по экспериментальным данным, в случае с гербицидом «Гезагард» с дозой внесения 10,0 и 50,0 г/м² особи погибали, не доходя до границы загрязнения. Напротив, препарат на основе дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis не оказывает острого токсического эффекта, обусловленного его химическим строением и физико-химическими свойствами, что в первую очередь может указывать на интенсивность токсического действия.

Для получения сведений о токсическом влиянии изучаемых пестицидов полевых условиях в динамике исследования также были проведены в 2009 и 2010 годах по той же методике и схеме. Концентрации препаратов «Гезагард» и «Дельта-2» использованы те же. Отбор проб производился на 3, 10, 30 и 6о сутки после обработки модельной площадки пестицидами.

Максимальное количество коконов на 60-ый день исследования 2009 г. было обнаружено на границе с участком, обработанным раствором «Дельта-2» в дозе 0,05 г/м², и составило 214,0±11,5 экз. (меньше контрольных показателей на 4,4 %). Минимальное - 116,8±8,5 экз. на участке, обработанном препаратом «Гезагард» в дозе 50,0 г/м² (52,2 % от количества коконов, обнаруженных на контрольном участке).

На участках, обработанных раствором биологического препарата «Дельта-2», наблюдалась положительная динамика увеличения показателей общего количества коконов и живых червей как на самой площадке, так и на границе с загрязнением. Количество коконов дождевых червей в почве анализируемых площадок составило от 192,0±11,2 экз. в дозе 50,0 г/м² (85,7 % от количества живых особей на контрольном участке) до 214,0±11,5 экз. в дозе внесения 0,05 г/м² (меньше контрольных показателей на 4,4 %).

Для оценки влияния исследуемых пестицидов был проведен однофакторный дисперсионный анализ, целью которого является изучение влияния одного или нескольких факторов на рассматриваемый признак.

Сравнение экспериментальных данных трех лет исследования показало, что для каждой дозы почвенного внесения в полевых условиях различия в количестве разлагающихся червей оказались значимыми при уровне значимости б=0,05. Сравнивая компоненты дисперсии друг с другом посредством F-критерия Фишера, определяли, какая доля общей вариативности результативного признака обусловлена действием регулируемых факторов; была проверена гипотеза о значимости влияния этих факторов на исследуемый признак. Сопоставление оценок этих дисперсий по критерию Фишера показало, что гипотеза о равенстве факторной и остаточной дисперсий и обоснованна. Степень различия между средними в группах значений зависит от внутригрупповой вариации (дисперсии) переменных. При концентрациях препарата «Гезагард» 1,0; 10,0 и 50 г/м² f_набл > f_кр, т.е. гипотеза о существенном влиянии искомого фактора на результаты принимается, следовательно, различия между значениями количества разлагающихся особей достоверны по годам исследования при б = 0,05. При концентрации «Дельта-2» (на основе дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis) 0,05 и 0,5 г/м² различия между значениями количества разлагающихся особей недостоверны по годам исследования при б = 0,05.

Таким образом, на протяжении трех лет исследований на исследуемых участках с использованием пестицидов «Актара» (д.в. тиаметоксам) и «Гезагард» (суспензия концентрата прометрина) с увеличением концентрации наблюдается уменьшение количества живых дождевых червей и их коконов. При экспозиции препарата «Дельта-2» (на основе дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis) различия этих же значений от контроля недостоверны при всех дозах почвенного внесения, что подтверждает его безопасность для представителей мезофауны на примере дождевых червей Lumbricus terrestris.

ВЫВОДЫ

Проведенные исследования и анализ полученных результатов позволили сделать следующие выводы:

1. Выявлен комплекс поведенческих реакций, характерный при загрязнении почвы пестицидами триазиновой и неоникотиновой групп, который условно разделен на три группы: отсутствие изменений в поведении (95 % особей при экспозиции «Дельты-2»; 65 % - для «Гезагарда»); «пограничный таксис» (30% особей при экспозиции «Актара»; 15 % - для «Гезагарда»); «вертикальный таксис» (25% особей при экспозиции «Актара»; 20 % - для «Гезагарда»).

Гибель червей (смертность возникает как в результате кожного дыхания, так и поглощении загрязненных почвенных частиц) проходящих слой почвы, загрязненной пестицидами, перпендикулярно границе просачивания и выходящих на поверхность, составляет 100%. При увеличении степени загрязненности почвенного профиля растворами пестицидов триазиновой и неоникотиновой групп приводят к массовой элиминации особей в интенсивной зоне загрязнения. Адаптацией к неблагоприятным условиям среды служит реакция избегания и миграции из зоны загрязнения в чистую почву - реакция «пограничного таксиса».

2. С помощью пробит-анализа кривых летальности и метода Прозоровского установлены медианные дозы препаратов LD₅₀ по результатам 7 дневных опытов для популяции дождевых червей: «Актара» (д.в. тиаметоксам) - 1,82 г/кг; «Гезагард» (суспензия концентрата прометрина) - 18,28 г/кг; «Дельта-2» (на основе дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis) - 141,63 г/кг. Менее выраженная токсичность «Гезагарда» по сравнению с «Актарой» обусловлена тем, что данный пестицид является неспецифическим для данной группы организмов. Таким образом, можно сделать вывод о безопасности применения инсектицидного препарата на основе белкового дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на представителей мезофауны на примере дождевых червей.

3. Тест на репродуктивную способность показал, что неоникотиновый препарат «Актара» (д.в. тиаметоксам) в почве в дозах 1,0 г/кг и 0,1 г/кг снижает процент живых коконов на 67,4 % и 28,0 % соответственно. Триазиновый пестицид «Гезагард» в дозе 10,0 г/кг уменьшает процент живых коконов на 73,4 %; количество коконов, отложенных одним червем за неделю, на 62,5 %. При концентрации в субстрате препарата «Дельта-2» 50,0 г/кг общее количество коконов меньше контрольной группы на 83,4 %, причем при такой же дозе «Гезагарда» особи не образовывали коконы.

Анализ полученных результатов позволяет провести градацию по способности пестицидов угнетать способность к воспроизводству потомства: «Актара» > «Гезагард» > «Дельта-2». При загрязнении почвы метаболитами «Актара» (в пределах 0,01-0,1 г/кг), «Гезагард» (до 1,0 г/кг) и «Дельта-2» (в диапазоне 0,1-1,0 г/кг) коконы дождевых червей можно использовать для заселения загрязненных пестицидами территорий.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи в ведущих журналах, рекомендуемых ВАК

Воронцов В.В. Исследование влияния модельного загрязнения почвы пестицидами на дождевых червей в лабораторных условиях /В.В. Воронцов// Фундаментальные исследования. - 2012. - №4. - С. 26-32.

Воронцов В.В. Изучение ростостимулирующего действия дельта-эндотоксина на примере ювенильных растений/ В.В. Воронцов, Л.К. Каменек, И.В. Андреева, Д.А. Терехин, В.М. Каменек// Вестник Новосибирского государственного аграрного университета. - 2010 - №4 (16), С. 13-18.

Публикации в периодических изданиях, сборниках и материалах конференций

Воронцов В.В. Влияние гербицида «Гезагард» на представителей почвенной мезофауны/ В.В. Воронцов, К.В. Кулагина// Ломоносов 2012: XIX международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых; секция «Биология»; 9-13 апреля 2012 г.; Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет: Тезисы докладов/ Отв. ред. А.И. Андреев, А.В. Андриянов, Е.А. Антипов, К.К. Андреев, М.В. Чистякова. - М.: МАКС Пресс, 2012. - С. 108.

Воронцов В.В. Влияние пестицида «Актара» на выживаемость дождевых червей в модельных условиях/ В.В. Воронцов, К.В. Кулагина// Наука в современном обществе: Материалы II Международной научной конференции (г. Ставрополь, 15-20 июня 2012 г.). - Ставрополь: Центр научного знания «Логос», 2012. - С. 10-13.

Воронцов В.В. Влияние загрязнения почв хлорорганическими пестицидами на дождевых червей/ В.В. Воронцов, К.В. Кулагина// Приволжский научный вестник. - 2012. - №6. - С. 3-6.

Воронцов В.В. Оценка влияния биологического препарата «Дельта-2» на дождевых червей в условиях искусственного загрязнения почв/ В.В. Воронцов, К.В. Кулагина, Л.К. Каменек, Е.В. Коровина//«Перспективные инновации в науке, образовании, производстве и транспорте `2012»: Сборник научных трудов по материалам международной научно-практической конференции (г. Одесса, 19-30 июня 2012 г.). - Одесса: Черноморье, 2012. - С. 32-35.

Воронцов В.В. Влияние пестицидов на фауну почвы Ульяновской области/ В.В. Воронцов, Л.К. Каменек// «Биология - наука XXI века»: Сборник материалов 14-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых (г. Пущино, 19-23 апреля 2010). - Пущино, 2010. - Т.2. - С. 17-18.

Размещено на Allbest.ru

...