Экологические аспекты интенсивного культивирования грибов рода pleurotus в Приамурье

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИНТЕНСИВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГРИБОВ РОДА PLEUROTUS В ПРИАМУРЬЕ

АЗАРОВА Василина Александровна

Специальность 03.00.16. ? экология

Хабаровск ?2010

Работа выполнена в отделе биотехнологий и защиты растений государственного научного учреждения ? Дальневосточного ордена Трудового Красного Знамени НИИ сельского хозяйства РАСХН (г. Хабаровск)

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук,

член-корреспондент РАСХН

Анненков Борис Глебович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кондратьева Любовь Михайловна (ИВЭП ДВО РАН)

кандидат биологических наук, доцент

Рубцова Тамара Александровна (ИКАРП ДВО РАН)

Ведущая организация: Дальневосточный государственный

аграрный университет

Защита состоится «29» апреля 2010 г. в 14-30 часов на заседании диссертационного совета Д 005.019.01 при Институте водных и экологических проблем ДВО РАН по адресу: 680000, г. Хабаровск, ул. Ким Ю Чена, 65.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института водных и экологических проблем ДВО РАН

Автореферат разослан « » марта 2010 г.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные и скрепленные гербовой печатью, просим направлять ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема загрязнения окружающей среды экотоксикантами, оскудение лесных угодий в начале XXI века привели к тому, что население Дальневосточного Федерального округа России все меньше используют дикоросы для пищевых хозяйственных целей (Мухамедшин, 2005). Грибы ? белковая, деликатесно-целебная пища, важный источник адаптогенов, становятся опасными и малодоступными для жителей региона. В то же время во всем мире наблюдается всевозрастающий бум производства и потребления культурных безопасных грибов. В условиях нарастания угрозы глобального продовольственного кризиса, культивируемые грибы призваны мировым сообществом, наряду с соей, птицей, рыбой, решать проблемы дефицита белка и сбалансированного (здорового) питания (Гарибова, 2005; Заикина и др., 2007). Успешное становление регионального культивирования грибов и его научного обеспечения ? актуальная, своевременная задача для дальневосточной агробиологической науки в первой четверти XXI века, отвечающая целям продовольственной безопасности и создания новых рабочих мест в городах и сельской местности.

Современные исследования в областях фунгобиохимии и фунготерапии показали, что вешенка, как и некоторые другие грибы-ксилотрофы, является продуцентом редких целебных и онкостатических соединений: антибиотиков, антиоксидантов, иммуномодулирующих полисахаридов (в-Д-глюканы) и димерных лектинов (Wang et al., 2000; Zhao et al., 2000; Бухман и др., 2003; Меерович и др., 2005; Краснопольская и др. 2006; Заикина и др., 2007).

В последние годы отмечаются отечественные и зарубежные исследования, в которых особое значение придается оптимизации культивирования путем регулирования абиотических и биотических факторов, защите инокулируемых сельскохозяйственных субстратов и мицелия вешенки от конкурентных микромицетов в условиях полустерильной евротехнологии выращивания (Дудка, Вассер, 1978; Павлов, Девочкин, 1987; Бисько, Дудка, 1987; Дудка и др., 1992; Морозов, Тимофеев, 2001; Карпов, Тишенков, 2003; Сычев, Ткаченко, 2003; Морозов, 2004; Матершев, 2006, 2007; Тишенков, 2009).

Ситуация развития грибоводства в Приамурье связана, в первую очередь, с массовым выращиванием вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus) как наиболее перспективного вида (Беляев, 2000; Измоденов, 2008).

Проблемы эффективного интенсивного культивирования грибов во многом обусловлены отсутствием региональных исследований и слабой изученностью многих экологических аспектов (влияние сезонного фактора (освещенность), конкурентных отношений между базидиомицетами и микромицетами и другие), а также недостаточным использованием различных видов и штаммов из рода Pleurotus.

Несмотря на многообразие исследований, выполненных в России и за рубежом, разработка биотехнологических принципов селективных субстратов, создание искусственных фунгоэкосистем и оценка устойчивости различных видов Pleurotus остается одной из основных проблем экологизации дальневосточного культивирования грибов.

Цель исследования: разработать экологические принципы оптимизации процессов функционирования искусственных фунгоэкосистем для интенсивного выращивания вешенки в условиях Хабаровского Приамурья.

Задачи исследования:

1. Определить биологический и хозяйственный потенциал видов и штаммов Pleurotus перспективных для возделывания в условиях Приамурья.

2. Разработать методические основы оптимизации культивирования видов и штаммов рода Pleurotus путем регулирования абиотических и биотических факторов среды.

3. Разработать метод экстенсивного культивирования Pleurotus с оптимизацией процесса путем использования в качестве субстратного посадочного мицелия материал, полученный после стерильного интенсивного процесса выращивания.

4. Выявить новые возможности культивирования Pleurotus ostreatus в условиях полустерильных и нестерильных фунгоэкосистем на основе «селективных живых субстратов» с чистыми культурами Bacillus cereus и Bacillus subtilis.

Защищаемые положения:

1. Разные адаптивные возможности окультуренных видов и коллекционных штаммов рода Pleurotus позволяют выявить условия для оптимизации их культивирования и оценить влияние различных биотических и абиотических факторов на продуктивность грибов.

2. Продуктивность грибов рода Pleurotus зависит от характера конкурентных отношений между микромицетами и термофильными природными микроорганизмами, которые улучшают ферментацию и селективность субстрата. В результате применения селективной среды для посадочного мицелия Pleurotus ostreatus повышается адаптивный потенциал, и создаются условия для эффективного культивирования грибов.

3. Искусственно созданная модельная микроэкосистема (Pleurotus + Bacillus) активизирует ферментацию субстрата и ингибирование роста микромицетов. В этом случае исключается конкуренция за субстрат и необходимость в использовании химических фунгицидов.

Научная новизна. Впервые выполнена научно-исследовательская работа, которая является новой (пионерной) в направлении создания искусственных микроэкосистем на Дальнем Востоке и затрагивает ряд важных аспектов экологии, микологии и биотехнологии. На примере культивирования различных видов и штаммов грибов рода Pleurotus научно обоснованы, разработаны и экспериментально подтверждены экологические принципы функционирования искусственных фунгоэкосистем в Хабаровском Приамурье.

Впервые наиболее перспективным для Приамурья объектом грибоводства определен вид ? вешенка обыкновенная (Pleurotus ostreatus), выделены другие перспективные виды и штаммы Pleurotus, пригодные для использования, как при интенсивном, так и экстенсивном культивировании.

Впервые дана оценка отличительных элементов стерильного (азиатский) и нестерильного (европейский) методов интенсивного культивирования Pleurotu и сформирована научно-технологическая система эффективного массового получения грибов в условиях Хабаровского Приамурья.

Впервые детально разработаны научно-методические основы получения качественных «селективных живых субстратов» с использованием Bacillus subtilis, особенно Bacillus cereus.

Практическая значимость. Разработаны способы, способствующие стабилизировано-прогрессивному выращиванию Pleurotus ostreatus в региональных условиях. Впервые определены рациональные нормы расхода важных компонентов: питательных добавок к соломистому и опилочному субстрату; количество мицелия; объем микроэкосистемы.

Результаты биохимических исследований выявили различие содержания сырого протеина, макро- и микроэлементов у исследуемых видов и штаммов рода Pleurotus в зависимости от времени года.

На основе созданной и сохраняемой генетической коллекции культивируемых видов Pleurotus впервые организовано производство качественного посадочного мицелия на зерне овса. Исследования в области интенсивной культуры Pleurotus, производства качественного посадочного мицелия и сохранения генетической коллекции грибов-ксилотрофов поддержаны грантами Правительства Хабаровского края №15?261 от 30.12.2005 года, №15?353 от 2.02.2007 года и №15?383 от 10.01.2008 года. По материалам диссертационных исследований получен патент РФ на изобретение «Способ интенсивного выращивания вешенок и производство субстратного посадочного мицелия для их экстенсивного культивирования» № 2378821 от 17.04.2008.

Личный вклад автора. Диссертационная работа является результатом исследований автора, выполненных согласно планам НИР ГНУ?ДВ ордена ТКЗ НИИ РАСХН. Фактические данные по разработке эколого-технологических вопросов, связанных с созданием искусственных микроэкосистем, получены автором при его непосредственном участии в лабораторных опытах, включая проведение модельных экспериментов, приготовление питательных сред и субстратов, анализ и обобщение полученных результатов.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и получили положительную оценку на международных научных конференциях: «Дендрарию Дальневосточного НИИ лесного хозяйства ? 110 лет» (Хабаровск, 2006); «Лесные биологически активные ресурсы» (Хабаровск, 2007); на межрегиональной научно-практической конференции «Ресурсы и экологические проблемы Дальнего Востока» (Хабаровск, 2006); на сессии, посвященной 70-летию ГНУ?ДВ ордена ТКЗ НИИ РАСХН «Энергосберегающие технологии возделывания сельскохозяйственных культур в условиях Дальнего Востока» (Хабаровск, 2005); на региональной научной конференции «Природопользование на Дальнем Востоке России» (Хабаровск, 2006); на IV и V Казьминских научных чтениях «Научные основы повышения эффективности сельскохозяйственного производства на Дальнем Востоке России (Хабаровск, 2005), «Современное научное обеспечение дальневосточной аграрной отрасли» (Хабаровск, 2006); на Втором Дальневосточном международном экономическом форуме «Инновационное развитие как приоритет экономической политики в регионах Востока России» (Хабаровск, 2007); на международной научной конференции «Российско-китайское приграничье в интеграционных процессах в СВА: проблемы и перспективы» (Благовещенск, 2007); в региональной конференции «Молодые ученые аграрному комплексу ДФО» (г. Благовещенск, 2005); во всероссийской конференции с международным участием «Состояние лесов Дальнего Востока и актуальные проблемы лесоуправления» (Хабаровск, 2009); на VIII и IX Хабаровских краевых конкурсах молодых ученых и аспирантов (Хабаровск, 2006, 2007; диплом III степени).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 научных печатных работ, в т.ч. в изданиях, рекомендованных ВАК ?2, патент РФ на изобретение ?1.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 153 страницах компьютерного текста, содержит 35 таблиц и 25 рисунков. Состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и рекомендаций. Список литературы включает 194 источника, в т.ч. 23 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

В главе представлен детальный анализ имеющихся научных работ отечественных и зарубежных авторов по разделам связанным с экологией дикорастущих и культивируемых видов вешенок, с научными основами интенсивного культивирования грибов рода Pleurotus как объекта мирового, отечественного и приамурского грибоводства, с перспективами развития интенсивного культивирования.

Глава 2. Объекты и методы исследования

Объектами исследований являлись чистые культуры грибов и бацилл из коллекции, депонированные на питательной среде ? картофельно-глюкозном агаре (КГА). Чистые культуры бацилл и актиномицетов были получены от Тен Хак Муна (ИВЭП ДВО РАН, г. Хабаровск).

Предметом исследований являлись искусственные микроэкосистемы ? фунгоэкосистемы, содержащие различные компоненты: субстраты ? солома пшеницы и овса, мелкодробленые кукурузные стержни, опилки свежие и лежалые и единая крупная партия овсяной половы; мицелий разных видов и штаммов грибов рода Pleurotus; химические, физические и биологические факторы.

В исследованиях использованы общепринятые методы микологии, микробиологии, экологии, биотехнологии, лабораторно-вегетационного опыта (Методы экспериментальной микологии, 1982; Аникиев, Лукомская, 1983; Stamets, 1993; Мюллер, Леффлер, 1995; Анненков 1999, 2002; Никаноров, Хоружая, 2001; Заикина и др., 2007; Журбицкий, 1968). Для инокуляций в разных опытах использованы единые партии стерильного зернового (на овсе) посадочного мицелия, высокое качество которого доказано многолетними испытаниями (Анненков, 1999-2008).

В качестве субстратов выбрана солома пшеницы и овса, мелкодробленые кукурузные стержни, опилки свежие и лежалые и единая крупная партия овсяной половы, полученная от сортировки семенного зерна в ДальНИИСХ. Для точных опытов использовали влажный (70%), тщательно перемешанный и взвешенный на весах субстрат ? 3-5 кг, инокулированный мицелием в количестве от 3 до 15%. Перфорацию субстратных мешков проводили на 2-3 день после инокуляции, делая на упаковке 14 прорезей длиной 6 см. Повторность вариантов опытов - от пяти до восьмикратной.

Стерилизация для получения соломистых субстратов с нулевым титром микрофлоры проводилась путем: автоклавирования (при 1,5 атм, 3 часа); гидротермии (варка 1 час в воде при 100 єС); ксеротермии (многочасовое пропаривание сухого соломистого субстрата, увлажнение и охлаждение чистой водой с фундазолом ? 0,01%).

Для подготовки «живых селективных субстратов» использовали общепринятые схемы для условий аэробной ферментации (Бисько, Билай, 2006) (рис. 1). В нашей работе для получения селективных субстратов применяли наиболее простой способ с анаэробной ферментацией ? заливку кипятком с добавлением фундазола (0,01%) или без него, при медленном остывании до 25-30 єС в течении суток.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Схемы термобациллярной подготовки субстратов

Примечание: 1 ? анаэробная упрощенная (ускоренная) ферментация соломистого субстрата (заливка горячей водой в емкостях и медленным 1,5-суточным остыванием); 2 ? анаэробная ферментация увлажненного соломистого субстрата (в полипропиленовых мешках) в термостате (фаза 2); 3 ? улучшенная анаэробная ферментация соломистого субстрата в термостате, предварительно замоченного в емкостях на 2-2,5 суток (фаза 1+ фаза 2).

Биохимические анализы содержания протеинов в плодовых телах, определение макро- и микроэлементного состава проведено согласно ПДК (СанПиН 2.3.2.560-96), в условиях аккредитованной испытательной лаборатории Центра агрохимслужбы «Хабаровский».

Потенциальным показателем функционирования фунгоэкосистем при интенсивном культивировании Pleurotus является плодоотдача или продуктивность (П%), на сыром (влажность 70%), уплотненном субстрате, которая рассчитывается как отношение массы технически зрелых грибов, получаемых с мешка (или сосуда) к изначальной массе субстрата с мицелием, выраженное в процентах: П% = М плод. тел : М влажн.субстр.Ч100%.

Анализ эффективности фунгоэкосистем для культивирования вешенок, в том числе при создании «селективных живых субстратов», проведен с использованием стандартных методов вариационной статистики: определение достоверности полученных данных в условиях нормального распределения для независимых выборок ? по коэффициенту Стьюдента; ошибка оценивалась с помощью средней квадратической ошибки (М±m) (Минкевич, Хохрякова, 1968; Лакин, 1990; Ермолаев, 2003).

Для математических расчетов использовали статистический пакет SPSS и Microsoft Office Excel 2007.

Глава 3. Научные основы получения посадочного мицелия и культивирования видов и штаммов базидиомицетов рода Pleurotus

Первоосновой научного обеспечения дальневосточного интенсивного культивирования грибов является интродукция, сохранение, оценка, отбор и использование в производстве адаптированных и урожайных штаммов (сортов) Pleurotus и организация производства качественного посадочного материала.

Базисом проведения НИР явилось создание, сохранение и изучение генетических коллекций съедобных базидиомицетов и производство посадочного мицелия на основе видов и штаммов обыкновенной, ильмовой, королевской, розовой вешенки, сохранение его в генетической грибной коллекции ДальНИИСХ. Собраны штаммы вешенки обыкновенной: НК-35, А-77, В-1, Пиньгу, «Флорида», «Гибридный белый» (обыкн. Ч флор.), «Америка» и «Корея» европейской, отечественной, американской, китайской и корейской селекции.

Экспериментальные исследования выявили лучшие качества и общий потенциал биопродуктивности штаммов вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus) из коллекции. Проведено итоговое сравнительное испытание штаммов (табл. 1). Определено, что лучшим для интенсивного культивирования P. ostreatus в региональных условиях является НК-35 как самый высокоурожайный селекционный (гибридный) штамм, хорошо адаптированный к европейским методам культивирования и различным субстратам, что согласуется с литературными данными (Морозов, Тимофеев, 2001; Сычев, Ткаченко, 2003; Тишенков, 2000, 2003; Матершев, 2005).

Наряду с НК-35, широко используется отечественный штамм А-77. Они генетически близкородственны (Шнырева, 2006), морфологически похожи (серая шляпка), но имеются и отличия. Штамм А-77 считается криолабильным, формирует, как правило, более крупные плодовые тела, более адаптирован к опилочным субстратам и к возделыванию экстенсивным методом (на пнях). Штаммы НК-35 и А-77 отличаются жесткой длинной ножкой, особенно во втором сборе сырой массы (М_СЫР) грибов. Этот недостаток характерен также для «Гибридного» штамма, который образует белые плодовые тела, зимой плотные, а летом ? с рыхлой и хрупкой шляпкой. Удлиненной, но более толстой, ножкой отличается также продуктивный криолабильный штамм «Америка», с плотными крупными шляпками серого цвета, высокими эстетическими качествами и хорошей сохранностью при транспортировке.

Характерной особенностью штаммов азиатской селекции является ножка: рыхлая, полупустая (В-1) или нежная, очень мягкая (Пиньгу), толстая, короткая и мясистая («Корея»).

Самым скороспелым является изолят «Корея» (табл. 1), образующий крупные плодовые тела с мясистой шляпкой. Однако этот штамм при увеличенной

Таблица 1 Биопродуктивность коллекционных штаммов вешенки обыкновенной Pleurotus ostreatus в сравнительном испытании (весна, 2008 г.)

Примечание: здесь и далее: достоверность различий от штамма НК-35 показана: p?0,05 (*); p?0,01 (**); p?0,001 (***); количество зернового посадочного мицелия во всех вариантах равнялась 6%; масса полово-опилочного (4:1) субстрата в мешках по 3 кг; субстрат подготовлен кипятком с фундазолом (0,01%) и суточным остыванием.

Таблица 2 Массовая доля белка и макроэлементов (M±m) в составе сухой массы плодовых тел некоторых штаммов P. ostreatus (в %) (зима, лето 2005-2006)

Примечание: здесь и далее: достоверность отличий показателей массовой доли НК-35 в разные сезоны показана: p?0,05 (^); p?0,01 (^^); p?0,001 (^^^); грибы выращены на субстратах из фрагментов стержней кукурузы и соломы зерновых (1:1), по евротехнологии.

Анализ результатов при культивировании штаммов Pleurotus ostreatus из коллекции ДальНИИСХ по интенсивной евротехнологии показал, что масса сухого вещества содержит высокую долю сырого протеина (в среднем от 24,2% зимой, до 31,9% летом), калия, кальция и фосфора ? важных для организма человека нутриентов, в физиологических концентрациях (табл. 2, 3). Содержание тяжелых металлов во всех случаях не превышало ПДК (табл. 3).

Важным фактором оптимизации процессов интенсивного культивирования грибов рода Pleurotus является применение качественного посадочного мицелия, производимого с учетом региональных условий. Мировые образцы посадочного мицелия выращивают на просе. Однако при использовании посадочного мицелия, изготовленного на мелкосеменных зерновых культурах (сорго, просо или пайза) согласно европейским методам культивирования, особых преимуществ не обнаружено. Более того, такой посадочный мицелий менее адаптирован к неселективным, смесовым субстратам. Кроме этого, мелкосеменные культуры в местных условиях практически не выращиваются.

В результате исследования разработаны условия оптимизации выращивания мицелия разных видов и штаммов Pleurotus на автоклавированном овсяном зерне объемом 1-2 литра, в стеклянных банках, покрытых двумя слоями фольги, путем регулирования абиотических и биотических факторов. Мицелий P. ostreatus заращивает зерновой овсяный субстрат объемом 1 л за 25 дней. Его использование в евротехнологии на «селективных живых субстратах» позволяет достичь 20%-го и более уровня плодоотдачи за первый сбор М_СЫР, что делает культивирование P. ostreatus высокопродуктивным в местных условиях.

В России посадочный мицелий на зерне традиционно используют для инокуляций при экстенсивном выращивании Pleurotus на чурках (Нурметов, Девочкин, 2005). В работе представлен способ, позволяющий совместить два отдельных биотехнологических процесса ? интенсивного получения плодовых тел (табл. 4) на объеме субстрата 1л (вариант азиатского культивирования), с использованием стеклянных банок, постоянно прикрытых фольгой, а также использование отработанного субстратного (полово-опилочного) прививочного материала для экстенсивного культивирования. Мелкофрагментированные сельскохозяйственные компоненты субстрата способствуют хорошей биопродуктивности ? 200 г за сбор при объеме субстрата 1л, а 1/3 опилочная часть адаптирует его в последующем к инокулируемой древесине. Два слоя обжатой фольги поддерживают стерильные условия, что положительно отражается на выход М_СЫР грибов.

Таблица 4 Продуктивность первого сбора М _СЫР грибов штамма P. Ostreatus НК-35, в зависимости от объема стерильного субстрата (начало лета, 2005 г.)

Примечание: смесовый субстрат из размола кукурузных стержней и соевой трухи (1:1); достоверность различий в зависимости от объема субстрата, в сравнении с 1 л, показана: при p?0,05 (*); при p?0,01 (**); при p?0,001 (***).

В работе показаны результаты испытания на вирулентность заявленного отработанного субстрата как для весенних инокуляций свеженапиленных осиновых и тополиных обрубков (d > 20 см), так в качестве инокулюма стерилизованного соломистого субстрата при евротехнологии (2006-2007). Анализ полученных данных позволил сделать заключение о том, что инокулюм отработанного субстрата отличается, относительно мицелия на зерне, пониженной силой разрастания, что явно недостаточно для быстрой успешной колонизации стерилизованного соломистого субстрата. После проведенной в весенний период инокуляции 20 обрубков древесины: по пять торцевых отверстий, диаметром 2 см и глубиной 4-5 см, с покрытием вносимого субстрата опилочной пробкой ? на всех привитых обрубках (сентябрь) получено плодоношение, т.о. заявленный субстратный материал пригоден для экстенсивного культивирования.

Глава 4. Перспективные направления защиты субстратов и Pleurotus ostreatus от конкурирующих микромицетов

В системе выращивания вешенки обыкновенной по европейской технологии к числу наиболее конкурентных по освоению субстрата организмов относятся виды микромицетов из родов Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Rhizomukor. В процессе метаболизма большинство из них выделяют сильные токсины (антимикотики), устойчивость к которым отсутствует у не развитого мицелия Pleurotus ostreatus, что приводит к остановке его роста и гибели.

Для получения качественного питательного субстрата при выращивании P. ostreatus по евротехнологии, при любом способе его подготовки, важен тщательный выбор партий качественной злаковой соломы, без очагов прелости. При этом качественная солома злаковых содержит определенную композицию покоящихся форм микроорганизмов (МО), представленную бактериями, актиномицетами и микроскопическими грибами. При увлажнении сырья из соломы активность МО быстро возрастает. Мастерство приготовления качественного «живого селективного субстрата» состоит в сохранении и достаточном наращивании численности полезных (термофильных) МО и, одновременно, в инактивации или уничтожении антагонистичных конкурентных организмов.

Известно множество способов подготовки субстратов для культивирования P. ostreatus полустерильным и нестерильным способом, основанных на термической, химической или микробиологической защите. Некоторые из них обеспечивают получение субстрата с достаточным уровнем селективности, задерживающим развитие конкурентных организмов и позволяющим вешенке более результативно колонизировать его, достигнуть относительно высокого выхода М_СЫР грибов. Анализ проведенного специального эксперимента по сравнению эффективности приемов и способов приготовления субстрата определил наиболее простые, надежные варианты и с лучшим выходом М_СЫР грибов (табл. 5).

При использовании стерилизованного (автоклавированного) субстрата, инокулируемого качественным мицелием, в достаточном количестве (7%), но в нестерильных условиях, наблюдали развитие очагов колонизации конкурентов, которое приводило к существенным потерям урожая и т.д. В первом варианте итогового эксперимента (табл. 5) со стерильной подготовкой субстрата для выращивания P. ostreatus, продолжительность периода от инокуляции до первого сбора М_СЫР грибов была значительной ?32-36 дней, в то время как в остальных вариантах (табл. 5, № 2-5) этот этап грибооборота составлял 24-28 дней. Продуктивность главного первого сбора М_СЫР грибов P. ostreatus в варианте № 1 была невысокая и составляла всего 11,6%.

Согласно литературным данным, в России культивирование P. ostreatus становится высокопродуктивным, если на первом сборе М_СЫР грибов при евротехнологии удается получить плодоотдачу в 15% и более, а при суммарном количестве первых двух главных сборов М_СЫР плодовых тел ? более 20% (Тишенков, 2001). Более высокого уровня продуктивности можно достигнуть, используя субстраты с повышенной селективностью, путем введения в их состав фунгицида фундазола (в концентрации около 0,01 %) или размножения в массе субстрата термофильных бациллярных бактерий при ферментации.

Установлено, что бациллярные метаболиты, не оказывая, зачастую, существенного влияния на вегетативные формы как высших (вешенка), так и низших грибов (микромицетов), негативно воздействуют на них в стадии спор, сдерживая прорастание и снижая скорость развития, аналогично химическим фунгицидам (фундазол, бенлат, беномил). При этом в два раза удлиняется период (с 4-5 до 8-10 дней) до накопления в субстрате вегетативных форм сопутствующих конкурентных микромицетов, но за это время мицелий P. ostreatus успевает колонизировать либо профундазоленный, либо «живой» ферментированный субстрат. На уровень потенциальной продуктивности P. ostreatus, выращенных на ферментированных субстратах, могут оказывать позитивное воздействие водорастворимые полисахариды, различные витамины, стимуляторы роста, выделяемые в субстрат бактериями рода Bacillus. Кроме того, мицелий P. ostreatus способен использовать большую часть накопленных в субстрате клеток термофильных бактерий в качестве источника углерода, азота, фосфора, а совместный комплекс гидролитических ферментов гриба и бацилл ускоряет разложение целлюлозы и лигнина (Камзолкина, 2006).

Согласно результатам наших исследований (табл. 5), в варианте 2 и 3 добиться повышения селективности субстрата наиболее просто, а по эффективности эти варианты практически равноценны. Однако вариант 2 позволяет существенно увеличить выход М_СЫР грибов P. ostreatus. Максимальной продуктивности P. ostreatus удалось добиться на длительно ферментированных субстратах (вариант 4 и 5) (табл. 5). Дальнейшее увеличение продуктивности P. ostreatus возможно, если использовать подобранную чистую культуру термофильных бацилл, особенно когда используется сырье для субстрата с недостаточным исходным титром нужных МО.

Фундазол ? пестицид, действующим веществом которого является беномил ? 500 г/кг. При его применении необходимо соблюдение экологического регламента: запрещается его использование в санитарной зоне вокруг рыбохозяйственных водоемов на расстоянии 500 метров от границы затопления при максимальном уровне паводковых вод. Считается, что мицелий P. ostreatus, обладая активными ферментами, разрушает фундазол к началу плодоношения. Однако, слив влаги с фундазолом из субстратов в окружающую среду приводит к попаданию фунгицида в водоемы и включению в пищевые цепи, что создает экологически опасную ситуацию. В этом плане использование популяции термофильных МО и их метаболитов для ферментативной подготовки селективных субстратов предпочтительно с экологической точки зрения.

Фундазол ? обязательный элемент при ксеротермической подготовке субстратов, но может применяться после любого способа термической стерилизации. Однако использовать фундазол при бациллярной ферментативной подготовке субстрата нерационально, поскольку он проявляет бактериостатическое влияние и сдерживает наработку ценных метаболитов.

В начале третьего тысячелетия все большее внимание уделяется методу аэробной ферментации, который позволяет создавать субстрат, обладающий высокой селективностью. Ферментация субстрата отличается от простой термообработки тем, что при подъеме температуры до 60-62 єС (>10 часов) происходит частичная пастеризация субстрата ? уничтожаются мезофильные формы широкого спектра МО, но сохраняются термофильные спорообразующие бактерии. Постоянная подача свежего воздуха создает благоприятные условия для развития полезных аэробных МО и получения субстрата высокого качества.

Таблица 5 Сравнительная продуктивность P. ostreatus при грибообороте

на стерилизованных (1, 2) и ферментированных субстратах (3, 4, 5) (2007 г.)

Примечание: количество посадочного мицелия составляла 5%, штамм P. ostreatus НК-35; достоверность различий от характеристик с условиями ферментированных субстратов от 1 варианта (стерилизованный субстрат) показана: p?0,05 (*); p?0,01 (**); p?0,001 (***);от характеристик 2 варианта (обработанный фунгицидом субстрат) показана: p?0,05 (^); p?0,01 (^^); p?0,001 (^^^).

В результате работы разработан способ использования эффективной чистой бациллярной культуры (Bacillus cereus) при анаэробной подготовке качественных «живых селективных субстратов» для выращивания P. ostreatus, с упрощением процесса предварительной ферментации и сокращением времени на подготовку субстрата достаточной селективности. Выявлено, что наибольшая эффективность в защите от конкурентов и стимуляции биопродуктивности P. ostreatus, растущей на «живых селективных субстратах» присуща бактериям из рода Bacillus, которые взяли из коллекции чистых культур и искусственно ввели в ферментируемый субстрат (Определитель бактерий Берджи, 1997; Прудникова и др., 2004;). B. subtilis рода Bacillus («сенная» палочка) распространена в атмосфере, переносится с пылью, встречается в почвах, наиболее распространена на пашнях основных зернопроизводящих регионов (Черников и др., 2004). Бактерии подгруппы B. subtilis известны как продуценты антибиотиков биофунгицидного действия субтилина и бацитрацина, использующие углеводы только в аэробных условиях. В России и за рубежом запатентован ряд штаммов B. subtilis, ингибирующих рост фитопатогенных грибов и на основе которых в РФ налажено производство биофунгицидных препаратов (бактофит, бисолбисан, интеграл, фитоспорин-М).

Для B. cereus отличительным признаком является способность использовать сахара как аэробно, так и при отсутствии кислорода воздуха (Прудникова и др., 2004). Этот вид выступает доминантой в экосистемах, где слабо протекают процессы трансформации органического вещества, т.е. на влажных сенокосах и полях с тяжелыми, периодически переувлажненными почвами. Поэтому на злаковой соломе, прошедшей комбайновую уборку и молотьбу, их количество очень мало. Очень важно, что B. cereus является продуцентом термостабильного антибиотика широкого спектра действия цвиттермицина (Handelsman et al., 1996). Вегетативные формы отмеченных термофильных бацилл способны сохранять жизнедеятельность при многочасовом воздействии температурой в 60-62 єС. Это подтверждено экспериментальными исследованиями (табл. 6), в которых использовались чистые культуры факультативного анаэроба B. cereus для создания качественных селективных субстратов в термостате.

Установлено, что при использовании для замачивания и приготовления соломистого субстрата (как в фазе 2 ? ферментация сразу, так и в фазе 1 + фаза 2? ферментация после трехсуточного замачивания) бациллярных суспензий «молодых» (свежих) культур B. subtilis или B. cereus, продуктивность культивируемого гриба существенно возрастает, относительно контроля (табл. 6). Максимально высокая продуктивность P. ostreatus в опыте на анаэробно ферментированной овсяной полове отмечена в вариантах с B. cereus. Обнаружено (вариант 4), что при использовании смеси нескольких культур бациллярных МО для ферментации субстратов, качество готового субстрата понижается (табл. 6). Это связано с конкуренцией за питательный субстрат и взаимным ингибированием роста. Конкуренция искусственно культивируемых МО происходит и с дикими формами, которые присутствуют на соломистом сырье и участвуют в процессе ферментации, однако их исходный титр, по-видимому, существенно ниже, чем у внесенных суспензий B. subtilis или B. cereus.

Таблица 6 Биопродуктивность P. ostreatus (штамм НК-35) за два сбора М_СЫР грибов в грибообороте на субстрате, залитом для ферментации бациллярными суспензиями (весна, 2007 г.)

Примечание: достоверность различий характеристик штамма НК-35 в условиях разных фунгоэкосистем в сравнении с контролем показана: p?0,05 (^); p?0,01 (^^); p?0,001 (^^^); субстрат из половы овса был помещен в термостат для ферментации сразу (фаза 2) или после трехсуточного замачивания (фаза 1+ фаза 2); количество зернового посадочного мицелия 3%.

Глава 5. Сравнительный анализ и оценка стерильной и нестерильной технологий интенсивного культивирования грибов рода Pleurotus

В настоящее время в России для интенсивного культивирования вешенки обыкновенной в основном используется фактически нестерильная европейская (венгерская) технология на крупных полиэтиленовых мешках со специально подготовленным из соломы субстратом. Однако большая часть культурных грибов-ксилотрофов в мире выращивается по стерильной (азиатской) технологии, которая до последнего времени практически не использовалась для культивирования грибов в Европе и России. Возможно, что большое будущее за европейской биотехнологией. Нами разработаны экологические аспекты (объем и качество сырья субстратов, количество вносимого мицелия, питательных добавок, сезонные климатические факторы и т.д.) азиатской и европейской технологий интенсивного выращивания Pleurotus в условиях Хабаровского Приамурья.

В результате исследования определены важнейшие детерминирующие факторы культивирования Pleurotus по стерильному (азиатский) способу, которыми являются: питательные добавки к опилочному субстрату (пшеничные отруби ? 25-30%, овсяные зерновые отходы ? до 30-40%, размол соевой соломы (труха) ? до 50%, смесь 10% отрубей + 20% смеси отработанного субстрата-кекинга), вид и штамм базидиомицета, объем субстрата до 1 литра. К положительным сторонам стерильной технологии, в сравнении с европейской нестерильной технологией, можно отнести применение мицелия менее 1%, незаменимость для культивирования оригинальных видов рода Pleurotus с медленным линейным ростом мицелиальных гиф, а также возможность решения задачи получения посадочного материла для экстенсивного культивирования. Отрицательная сторона касается высоких затрат ручного труда и обязательное создание стерильных условий защиты субстратов от конкурентов на всех этапах культивирования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В исследовании проанализированы варианты оптимизации процессов культивирования расширенного состава видов грибов рода Pleurotus ? P. eryngii (королевская или степная), P. citrinopileatus (дальневосточная ильмовая) и P. flabellatus (субтропическая розовая), в разных сезонах, связанных в первую очередь с разной освещенностью и термическими условиями.

Вешенка королевская (Pleurotus eryngii (ДС.: Fr.) Quel.), отличается длительной сохранностью в свежем виде (3 недели). Ее выращивание обусловлено сезоном года (весна, осень), предполагает применение длительно лежалых опилок и кэкинга, азиатской технологии выращивания, а также прореживание примордиев в сростках (Тишенков, 2006; Вонг-Зи-кьянг, 2008).

Другие виды вешенки: обыкновенная, в т.ч. легочная и флоридская, лимонношляпковая и розовая отличаются более короткой сохранностью плодовых тел (от 2-х до 5-ти дней). Термолабильные виды ? желтая P. citrinopileatus и розовая P. flabellatus, достигают качественного плодоношения при температурах 27-30 єС, что делает возможным стабилизировать процесс интенсивного культивирования в Хабаровском Приамурье в летний период времени.

Установлено (табл. 7), что P. citrinopileatus, и особенно P. flabellatus в летний период содержат больше сырого протеина и минеральных элементов, чем P. ostreatus, а биоаккумуляция тяжелых металлов в термолабильных искусственно культивируемых видах ниже, чем в P. ostreatus и не превышает ПДК.

Таблица 7 Химический состав сухой массы грибов (M±m) разных видов рода Pleurotus (лето, 2006 г.)

Примечание: здесь и далее из табл. 3

Из таблицы 8 видно, что по биопродуктивности за сумму трех сборов М_СЫР грибов, для успешного культивирования P. citrinopileatus и P. flabellatus допустимы высокие температуры для образования и роста плодовых тел. Уровень плодоотдачи P. ostreatus при этом снижается, а плодовые тела хуже по качеству, чем при культивировании в осенний, зимний и весенний периоды. мицелий субстрат pleurotus микромицет

P. citrinopileatus (ильмак) скороплодный, содержит каротин. К недостатку относится хрупкость и короткая сохранность плодовых тел. Используемые для интенсивного культивирования штаммы P. citrinopileatus фактически не отличаются от диких форм. Сравнительные испытания в ДальНИИСХ посадочного материала собственного спорового изолята из Хабаровского края (ВИХ-1) и полученного через научный обмен из северного Китая, показали близкие результаты продуктивности, морфологии и биологии этих штаммов. P. citrinopileatus не переносит ферментированные субстраты, поэтому успешно культивируется по стерильной азиатской технологии.

P. flabellatus по урожайности уступает как P. ostreatus, так и P. citrinopileatus, но, учитывая питательность и целебные свойства, эстетичный вид и вкус, ее считают ценной (Краснопольская и др., 2001). Достоинство P. flabellatus в отсутствии ножки, поэтому вся М_СЫР грибов представлена только шляпками, в то время как у P. ostreatus существенная часть М_СЫР грибов приходится на волокнистые ножки, а у P. citrinopileatus ? на клубневидное основание сростка.

Таблица 8 Продуктивность некоторых видов рода Pleurotus при различном температурном режиме и освещенности (весна-лето, 2006 г.)

Примечание: масса субстрата из половы в мешках по 4 кг; продуктивность представлена по сумме трех сборов М_СЫР грибов с мешков; ? // ? // ?// ? // ?.

Выводы

1. Адаптивные возможности, продуктивность, биохимический состав окультуренных видов и коллекционных штаммов рода Pleurotus, в том числе впервые полученной Pleurotus citrinopileatus ВИХ-1, зависят от факторов культивирования: времени года, освещенности, состава и способа приготовления субстрата, качества и количества посадочного мицелия для инокуляции. Выделен перспективный и продуктивный гриб-ксилотроф Pleurotus ostreatus для культивирования в условиях Хабаровского Приамурья.

2. Использование смесовых субстратов, полученных в местных условиях (фрагменты кукурузных стержней, солома и полова овса) для культивирования разных штаммов и видов Pleurotus, не приводит к превышению ПДК по содержанию элементов, в том числе тяжелых металлов в плодовых телах исследуемых грибов.

3. Применение посадочного мицелия выращенного на стерилизованном (автоклавирование при 1,5 Атм, 120єС, 3 часа) зерне овса в количестве 5% приводит к повышению уровня продуктивности Pleurotus ostreatus на 9,9%, по сравнению с использованием посадочного стерильного мицелия выращенного на мелкосеменных субстратах ? 9,1%.

4. Полово-опилочный материал в соотношении 4:1 полученный после культивирования P. ostreatus в стеклянных банках под двумя слоями фольги пригоден для вторичного использования в качестве посадочного мицелия при экстенсивном культивировании гриба (на пнях и обрубках древесины). Процесс выращивания грибов рода Pleurotus по стерильной технологии можно оптимизировать путем внесения питательных добавок к опилочному субстрату: пшеничные отруби ? 25-30%; овсяные зерновые отходы ? 30-40%; размол соевой соломы ?до 50%; смесь 10% отрубей и 20% отработанного субстрата-кекинга. Количество мицелия для инокуляции в этом случае составляет менее 1%.

5. При определении влияния различных биотических и абиотических факторов на процессы культивирования разных видов и коллекционных штаммов рода Pleurotus были выделены штаммы НК-35, А-77, В-1, «Корея» и «Америка» Pleurotus ostreatus с высоким адаптивным потенциалом для культивирования на селективном субстрате ? соломе и полове овса, обработанной фунгицидом фундазолом с минимально эффективной концентрацией для защиты от конкурентов ?0,01%, или прошедшей ферментацию термофильными природными анаэробными микроорганизмами. Продуктивность на субстратах прошедших химическую обработку фундазолом была ниже, чем после их бактериальной ферментации. Применение фундазола приводит к угнетению термофильных природных анаэробных микроорганизмов.

6. Защита питательного субстрата из соломы от конкурентных микромицетов в искусственно созданной модельной микроэкосистеме с Bacillus subtilis и / или Bacillus cereus в анаэробных условиях (субстрат заливают водой) способствует увеличению продуктивности P. ostreatus до 42%. Высокая селективность анаэробно-ферментируемых субстратов позволяет проводить инокуляцию без соблюдения стерильных условий, предотвращает образование очагов колонизации конкурентных микромицетов и снижает расход инокулюма (посадочного мицелия) до 3%.