Микробиологический метод и технологии детоксикации почв, загрязненных токсичными компонентами ракетного топлива и продуктами их трансформации

Размещено на http://www.allbest.ru/

Микробиологический метод и технологии детоксикации почв, загрязненных токсичными компонентами ракетного топлива и продуктами их трансформации

Жабаева М.У., Нургалиева С.Т., Бектасова А.А.

Кокшетауский университет им. А.Мырзахметова

Annotation

The paper developed a catalytic and microbiological methods for detoxification of soils contaminated with CMT and obtain baseline data to develop a proposal to develop a draft technical regulations field tests.

Целью исследования является выделение микроорганизмов, способных усваивать гептил, из почв верхнего горизонта районов падения ОЧ РН и участков аварийного падения РН «Протон-М» в Улытауском районе Карагандинской области, и составление оптимальных ассоциаций из культур микроорганизмов, обладающих способностью усваивать гептил в качестве единственного источника углерода. Для решения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Наработка биомассы культур микроорганизмов, способных усваивать гептил.

2. Проведение лабораторных опытов по очистке от загрязнения гептилом двух видов почв с помощью подобранных ассоциаций культур микроорганизмов.

Материал и методы исследований. Высев произведен из 30 проб почвы из верхнего горизонта районов падения ОЧ РН «Протон» (РП 15, 25) и участков аварийного падения фрагментов РН «Протон-М» 6 сентября 2007 года в Улытауском районе Карагандинской области:

Взвешивание почвенных образцов проводили на весах 54-S/A, 51g/0,1мг cat.-Mettler-Toledo-Nr. 11103007.

Для выделения микроорганизмов произведен высев почвенных образцов на питательный агар (МПА) следующего состава (г/л): пептон - 5,0; натрия хлорид - 5,0; мясной экстракт - 1,5; дрожжевой экстракт - 1,5; агар - 20,0 и крахмало-аммиачный агар (КАА), г/л: фосфат калия двухзамещенный - 1,0; сульфат аммония - 1,0; сульфат магния - 1,0; хлорид натрия - 1,0; карбонат кальция - 1,0; крахмал нерастворимый - 10,0; агар - 20,0. Для выделения спорообразующих микроорганизмов высев почвенного образца проводили после предварительного его прогрева на водяной бане в течение 15 мин при температуре 870С.

Для выделения актиномицетов использовали среду 2 Гаузе (г/л): бульон Хоттингера - 50 мл; пептон - 5; хлорид натрия - 5; глюкоза - 10; для грибов - среду Чапека (г/л): сахароза - 30; нитрит натрия - 2; фосфат калия двухзамещенный - 1; сульфат магния - 0,5; хлорид калия - 0,5; железо сернокислое - 0,01.

Отсев выросших колоний производили на косяки питательного агара того же состава.

Выращивание микроорганизмов проводили в термостате при температуре 28 - 300С в течение 3 суток (бактерии) и 7 суток (актиномицеты, микромицеты).

Подсчет численности микроорганизмов проводили путем ряда последовательных разведений в стерильной водопроводной воде и высева их в агаризованную питательную среду с последующим подсчетом выросших колоний.

Для определения интенсивности дыхания почвы использовали абсорбционный метод, в котором количество выделившегося из образцов почвы углекислого газа в течение определенного времени определяют по нейтрализации им раствора щелочи.

Для выделения микроорганизмов, способных усваивать гептил, культуры микроорганизмов выращивали на плотной и жидкой питательной среде с добавлением гептила в качестве единственного источника углерода в концентрациях, соответствующих 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75; 2,25; 2,5; 5,0; 10,0 предельно допустимого уровня (ПДУ) в почве, равного 0,1 мг/кг.

Морфологические, культуральные и биохимические свойства отобранных микроорганизмов были изучены общепринятыми методами. Идентификация микроорганизмов проводилась по определителю (Берджи Д., 1997).

Наработку биомассы культур микроорганизмов проводили на шейкере.

Повторность опытов трехкратная.

Выделение микроорганизмов производили из описанных выше образцов почвы.

Установлено, что в исследуемых образцах почв присутствуют различные группы микроорганизмов.

Представленные образцы почв отличаются по количественному и качественному составу микроорганизмов.

Общее количество микроорганизмов, использующих органические формы азота (рост на МПА), варьирует в образцах от 0,2 до 600 млн КОЕ /г почвы, а минеральные (рост на КАА) - от 0,001 до 81 млн КОЕ/г. В большинстве образцов почвы преобладают микроорганизмы, усваивающие органические формы азота. Актиномицеты в исследуемых почвах содержатся в количестве 0,0001 до 90 млн/г КОЕ/г почвы. Наименьшее количество актиномицетов содержат образцы П-15, П-24, П-8, П-20, РБ-4-Ц-1, СТ-Ц-1 и СТ-С-300-1. Микроскопические грибы содержатся в количестве от 0,01 до 50 тыс. КОЕ/г почвы.

Интенсивность дыхания почвы находится в пределах от 184 до 615 мг СО2/м-2/ч-1. Наименьшее дыхание почвы отмечено в образцах СТ-С-300-1 (272), СТ-С-100-1 (275), МВ-Ц-1 (227), КА-В-3-1 (278), КА-Ц-11 (301). Минимальное значение дыхания почвы выявлено у образца П-15 (184).

Из подвергшихся загрязнению компонентами ракетного топлива почвенных образцов СТ-С-300-1, СТ-С-100-1, МВ-Ц-1, КА-В-3-1, КА-Ц-1, П-15 выделено 63 изолята.

Отобранные культуры микроорганизмов выращивали на скошенном питательном агаре. После этого культуры микроорганизмов высевали на плотную питательную среду, содержащую гептил в качестве единственного источника углерода в концентрациях, соответствующих 10,5; 2,5 ПДУ. Культивирование проводили в течение 7 суток в термостате при температуре 30?С. Выросшие колонии (всего 32) микроорганизмов пересеяны в питательный бульон.

Из 32 культур микроорганизмов, повторно высеянных на плотную питательную среду, содержащую гептил в качестве единственного источника углерода, хороший рост отмечен у 4 культур - 7, 15, 26, 29. У остальных культур был слабый рост или отсутствовал. Проведено 5 пассажей отобранных культур на синтетическую питательную среду с гептилом. Выяснена также возможность усвоения выделенными культурами микроорганизмов меньшей концентрации гептила, а именно 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75 ПДУ.

Для выделения большего числа культур микроорганизмов, способных усваивать гептил в качестве единственного источника углерода, был поставлен опыт по их выделению из накопительных культур, полученных из 30 почвенных образцов, засеянных в жидкую среду культивирования ВД с 2% гептила. Культивирование проводили в течение 14 дней в термостате при температуре 300 С. Затем наблюдали картину роста микроорганизмов.

В образцах почв П - 15; П - 8 от 01.07.09; П - 10, П - 20, П - 21, РБ-4-Ц-1 в течение данного времени проявился рост. Из данных образцов производился поверхностный высев на плотную питательную среду с 2% гептила. После культивирования в термостате было выделено 20 колоний микроорганизмов, способных усваивать гептил. Результаты сравнительного анализа отобранных микроорганизмов показали, что четыре первоначально выделенные культуры микроорганизмов 7, 15, 26, 29 являются наиболее активными по накоплению биомассы в питательной среде с гептилом, что позволило отобрать их для использования в очистке загрязненных гептилом почв.

Из отобранных культур микроорганизмов составлены следующие ассоциации:

1. Все четыре культуры микроорганизмов в равных соотношениях - 7+15+26+29 (1:1:1:1).

2. Культуры микроорганизмов- 7+26+15 (1:1:1) в равных соотношениях.

3.Культуры микроорганизмов в равных соотношениях - 7+26+29 (1:1:1) в равных соотношениях.

4. Культуры микроорганизмов - 15+26+29 (1:1:1) в равных соотношениях.

5. Культуры микроорганизмов- 15+26 в равных соотношениях (1:1).

Данные ассоциации проверены на способность накапливать биомассу при использовании гептила в качестве единственного источника углерода.

По результатам сопоставительного анализа по накоплению биомассы ассоциаций при росте на среде с гептилом отобраны 2 ассоциации культур микроорганизмов - 7+15+26+29 и 7+26.

Проведена работа по наработке биомассы культур микроорганизмов 7, 15, 26, 29. Ассоциации составлены из индивидуальных культур в указанных выше соотношениях.

Изучение биологических свойств выделенных культур микроорганизмов, отработка оптимальных условий культивирования микроорганизмов-деструкторов в условиях утилизации КРТ.

С целью проведения изучения биологических свойств выделенных культур проведена их идентификация.

Культура №15 образует колонии округлой формы, выпуклые, кремого цвета, края ровные, поверхность гладкая, блестящая, консистенция пастообразная. Размер колонии 1-3 мм. Бактериальные клетки палочковидные с закругленными концами, спорообразующие, грамположительные. Аэроб. Положительная реакция на каталазу. Оптимальная температура роста 28-30?С.

Такие признаки, как палочковидная форма бактерий, положительная окраска по Граму, положительная реакция на каталазу, способность к образованию спор, позволили отнести изучаемый микроорганизм к Bacillus sp.

Культура №26 представлена гpамоположительными, неподвижными, очень короткими с закругленными концами палочками. В односуточной культуре на минеральной среде преобладают не разошедшиеся в ходе деления клетки с характерным расположением под углом друг к другу. Размер клеток 1,3x0,8 мкм, с возрастом наблюдается их укорачивание. Колонии на картофельном агаре кремоватого цвета, круглые, диаметром 1-1,5 мм, выпуклые с ровным краем, блестящие. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.

Культура каталазоположительная, некислотоустойчивая, желатин не разжижает, казеин не разлагает, крахмал не гидролизуют. Хорошо ассимилирует углеводороды, ацетат, пропионат, этанол, бутанол, пропанол, глюкозу. Хорошо растет на дрожжевом экстракте. Использует аммонийный и нитратный азот. По морфологическим, физиолого-биохимическим признакам культура отнесена к Rhodococcus sp.

Культура №7 представляет собой клетки сферической формы, неподвижные, диаметром 0,6-1,0 мкм; образуют неправильные группы или встречаются поодиночке. Колонии круглые с ровным краем, теплого цвета, непрозрачные, гладкие, блестящие, диаметром 2-5 мм. Усваивает аммонийный и нитратный азот, каталазоположительна, образует желтоватый пигмент, не гидролизует крахмал, не образует индол, образует гидролазы. Использует в качестве источников роста глюкозу, L-валин, аланин, углеводороды. Оптимальная температура 25-370С. По морфологическим, физиолого-биохимическим признакам культура отнесена к Micrococcus sp.

Культура №29 представляет собой палочки размером 0,9-1,6х1,5-2,5 мкм, в стационарной фазе становятся сферическими, обычно в парах и цепочках различной длины. Спор не образует. Окраска по Граму отрицательная. Аэроб. Каталазу образует. Индол и H2S не образует. Растет при 20-300С, оптимальная температура 33-35?С. Культтура отнесена к Acinetobacter sp.

Лабораторные испытания образцов полученных микробиологических культур по детоксикации почв, загрязненных НДМГ

Проведен опыт по очистке серо-бурой пустынной супесчаной и суглинистой почвы от загрязнения гептилом в концентрации 800 мг/кг. Почва отобрана в позиционном района космодрома в районе расположения технологической заправочной площадки 92А 11 и 12 мая 2009 г. до начала спецработ по заправке разгонного блока Бриз-М» компонентами ракетного топлива горючим - гептилом и азотным тетраоксидом и после завершения работ по заправке.

В почву внесены в первом варианте все четыре культуры - 7+15+26+29, во втором - две культуры микроорганизмов, а именно - 7+26. В контрольные почвы препарат не задавали.

В процессе опыта проводили рыхление и увлажнение почвы до 60% в одном случае водопроводной водой, в другом - растворенными в воде минеральными добавками. Через 14 дней отобраны образцы почв, которые анализированы методом жидкостной ионной хроматографии на содержание в них НДМГ.

Результаты анализов по влиянию различных микроорганизмов на процесс разложения гептила приведены в таблице.1 Условия эксперимента: Исходная концентрация НДМГ - 0,8 г/кг почвы, продолжительность - 14 суток.

биомасса микроорганизм гептил почва

Таблица 1 - Влияние различных микроорганизмов на процесс разложения НДМГ в течение 2-х недель (2 типа почв, начальная концентрация НДМГ 800 мг/кг)

Результаты исследований показали, что наибольшая деградация гептила произошла в образце почвы №6 и №1, в последний внесена ассоциация из четырех штаммов - 7+15+26+29, а в процессе опыта почву увлажняли растворенными в воде минеральными добавками. Опыт проводили при температуре окружающей среды 10-150С. При этом содержание гептила в указанном образце через 14 дней составило 0,05 мг/кг почвы по сравнению с 0,393 мг/кг в контроле.

Вышеуказанное наглядно продемонтсрировано на рисунке 1.

Рисунок 1 - Динамика разложения НДМГ для почвы с исходным содержанием НДМГ 0,8 г/кг при действии различных штаммов микроорганизмов (по данным ионной хроматографии с амперометрическим детектированием)

Показана принципиальная возможность наработки биомассы культур микроорганизмов в больших объемах на Биостате С с последующим концентрированием биомассы микроорганизмов.

Таким образом, показано, что после каталитической детоксикации почвы даже при аварийном проливе (10 г/кг почвы) использование биологического метода позволяет снизить концентрацию гептила до 50 мг/кг почвы в течение 2-х недель.

Результаты исследований показали, что наибольшая деградация гептила произошла в образце почвы №1, в который внесена ассоциация из четырех штаммов - 7+15+26+29, а в процессе опыта почву увлажняли растворенными в воде минеральными добавками. Опыт проводили при температуре окружающей среды 10-15 0С. При этом содержание гептила в указанном образце через 10 дней составило 0,05 мг/кг почвы по сравнению с 0,393 мг/кг в контроле.

В результате проведенных исследований показано, что использование растворов комплексонатов железа и меди с трилоном Б в концентрации 0,5% с окислителем гидроперитом позволяет снизить содержание НДМГ с исходных 10 000 мг/кг до 11 - 83 мг/кг в течении первых 10 суток, эти значения позволяют в дольнейшем провести микробиологическую детоксикацию с целью снижения содержания НДМГ в почве до значений меньше 0,05 мг/кг за 14 дней.

Три выбранные в результате экспериментальных исследований культуры: №26 - Rhodococcus sp., №7 - Micrococcus sp., №15 - Bacillus sp. - были переданы в испытательную лабораторию ТОО «Нутритест» (государственная лицензия №0001219, серия АА-4) для проведения исследований на патогенность.

Идентификация культур произведена согласно «Определителю бактерий Берджи».

Культура №26 идентифицирована как Rhodococcus sp. Хемоорганотроф. Аэроб. Сапрофит.

Культура №7 идентифицирована как Micrococcus sp. Хемоорганотроф. Облигатный аэроб.

Культура №15 идентифицирована как Bacillus sp. Хемоорганотроф. Сапрофит. Аэроб.

В опытах, проведенных in vitro на среде СПА с добавлением яичного желтка и крови, установлено, что:

- культуры Rhodococcus sp. и Micrococcus sp. не проявили признаков лецитиназной и гемолитической активности;

- культура Bacillus sp. проявила признаки лецитиназной (5% колоний) активности, гемолитическая активность у данной культуры не выявлена.

В результате исследований и согласно существующей классификации штаммов по Методическим указаниям «Постановка исследований для обоснования ПДК производственных штаммов и на основе готовых форм препаратов в воздухе рабочей зоны», культуры Rhodococcus sp. Micrococcus sp., и Bacillus sp. принадлежат к 4-му классу опасности.

В результате проведенных исследований в работе решены задачи методического, информационного обеспечения экологической безопасности ракетно-космической деятельности применительно к районам падения отделяющихся частей ракет-носителей в условиях ограниченных финансовых ресурсов. Обоснован состав методического обеспечения оценки и прогнозирования экологической обстановки в РП ОЧРН.

С целью получения исходных данных, необходимых для практического применения разработанного методического аппарата, обоснованы состав и основные требования к информационной системе и средствам экологического контроля.

Литература

1. Коптюг В. А. Итоги конференции ООН по окружающей среде и развитию //Мир Науки. - 1993.-№4.

2. Израэль Ю.А. Экология и контроль состояния природной среды. М.: Гид-рометеоиздат, 1984. - 560 С.

3. Красилов В.А. Охрана природы: принципы, проблемы, приоритеты. М.: Институт охраны природы и заповедного дела, 1992.- 174 С.

4. Реймерс Н.Ф. Экология (теория, закономерности, правила, принципы и гипотезы) // Россия молодая. 1994. - 367 С.

5. Экологические системы. Адаптивная оценка и управление / Под ред. К.С.Холинга. М.: Мир, 1981. - 397С.

6. Безель B.C., Кряжинский Ф.В. и др. Экологическое нормирование антропогенных нагрузок. 1. Общие подходы // Экология. 1992. - № 6. - С 3-12.

7. Безель B.C., Кряжинский Ф.В. и др. Экологическое нормирование антропогенных нагрузок. II. Методология // Экология. 1993. - № 1. - С 36-47.

8. Кондратьев К.Я., Лосев К.С., Ушаков С.А. Экологические проблемы современности: возможные концепции развития и решения // Взаимодействие общества с природой: географические проблемы. С-Пб., 1995. - С.67-76.

9. Тишин А.П., Александров Э.Л., Родионов А.В., Шустов Г.Н., Худяков В.А., Артамонов А.К., Упэнэк Л.Б. Воздействие полетов ракет на озонный слой Земли // Химическая физика. 1993. - т. 12, №9. - С. 1184-1225.

10. Порфирьев Б.Н. Экологическая экспертиза и риск технологий// Итоги науки и техники. Серия Охрана природы и воспроизводство природных ресурсов. М.: ВИНИТИ, - 1990. - т.27. - С.204.

11. Любарский С.Д., Хурс С.П. Экологический аспект безопасности ракетно-космических комплексов// Сер. Проблемы безопасности при чрезвычайных ситуациях. М.: ВИНИТИ, - 1998. - Вып. 5. - С.42-59.143

12. Орлов М.Ю., Сныков В.П., Сенилов Н.Б., Позин А.А. Риск неблагополучных последствий при падении отделяющихся частей ракет-носителей// Сер. Проблемы безопасности при чрезвычайных ситуациях. ML: ВИНИТИ, - 1998. - Вып. 6. - С.36-48.

13. Воздействие продуктов сгорания ракетных двигателей на озонный слой атмосферы. НТО № 203-1115-90-1501-11.- ЦНИИМАШ. 1990.- 137 С.

14. Выбросы продуктов сгорания топлив ракетных двигателей при пусках ракет и их воздействие на озонный слой атмосферы. НТО № 9192-1501-91209. ЦНИИМАШ. - 1991. - 210 С.

15. Возможные экологические последствия воздействия ракетно-космической техники на атмосферу и околоземное космическое пространство: НТО № 0043538. Обнинск: НПО "Тайфун", 1989. - 204 С.

16. Исследование экологических последствий антропогенного загрязнения атмосферы и поверхности Земли в результате ракетно-космической деятельности: Отчет о НИР. Обнинск: ИЭМ, 1992. - 68 С.

Размещено на Allbest.ru