Размещено на http://www.allbest.ru/

Тульский государственный университет

СВЯЗЫВАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ ТОРФОВ ТУЛЬСКОЙ ОБЛАСТИ В ПРИСУТСТВИИ МИКРООРГАНИЗМОВ НЕФТЕДЕСТРУКТОРОВ РОДА RHODOCOCCUS ПО ОТНОШЕНИЮ К ГЕКСАДЕКАНУ

Каримова В.Т., Дмитриева Е.Д.

г. Тула

Аннотация

Выявлена концентрация гуминовых веществ торфов Тульской области, равная 50 мг/л, связывающая максимальное количество гексадекана, как модельного объекта легкой фракции нефти. Исследована зависимость утилизирующей способности микроорганизмов нефтедеструкторов Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis X5, входящих в состав биопрепарата "МикроБак", который используют для биоремедиации нефтезагрязненных территорий. Установлено, что микроорганизмы штамма максимально способны утилизировать гексадекан в растворе не более 5 %об. Максимальная связывающая способность гуминовых веществ при содержании в растворе гексадекана 2-5%об. Гуминовые вещества тростникового низинного и сфагнового верхового торфа способны связывать до 50% гексадекана при его содержании в растворе 2%об. Системами, содержащими гуминовые вещества и микроорганизмы, связывание гексадекана увеличивается во всем диапазоне его содержания в растворе 2-20%об. Максимальное связывание модельного алкана продемонстрировал комплекс, состоящий из гуминовых веществ тростникового низинного торфа при 50 мг/л и микроорганизмов Rhodococcus erythropolis S67. Данная система способна утилизировать до 95%гексадекана при его содержании в растворе 2%об. и до 35% при 20%об., что служит основанием для создания на его основе эффективного химико-биологического сорбента для очистки от нефтяных загрязнений почвенных и водных сред.

Ключевые слова: гуминовые вещества, Rhodococcus, биодеградация, гексадекан, химико-биологический сорбент.

Применение известных методов ремедиации нефтезагрязненных территорий механических и физико-химических имеют ряд недостатков: не способны очистить от нефтепродуктов территории до уровня ПДК, а так же возможно вторичное загрязнение окружающей среды при их применении. Существующие приемы очистки почв от нефтепродуктов в основном направлены на деградацию одного поллютанта и малоэффективны при совместном загрязнении почвы органическими и неорганическими загрязнителями [1].

В связи с этим в настоящее время является актуальным нахождение эффективных и экологически безопасных способов очистки от нефтяных загрязнений, к которым можно отнести биоремедиацию с использованием иммобилизованных родококков и гуминовых веществ [2].

На сегодняшний день, микроорганизмы рода Rhodococcus, способные к биодеградации широкого спектра гидрофобных субстратов за счёт наличия ферментных систем, чаще всего используются для создания биопрепаратов [3]. Бактерии данного штамма преобладают в углеводородокисляющих микробиоценозах углеводород загрязненных почв [4]. Это обуславливает перспективы использования родококков в качестве основы новых нефтеокисляющих препаратов с расширенными свойствами.

Применение для утилизации нефтеразливов в почвенных средах биопрепаратами на основе микроорганизмов и гуминовых веществ позволяет максимально задействовать и использовать все существующие природные механизмы самоочищения. Внесение препаратов способствует снижению токсичности углеводородов, ускорению процессов их биохимического разложения и восстановлению плодородия почв и растительного покрова на загрязненной территории [1], [5], [6],[7].

Целью данной работы являлось исследование степени утилизации углеводорода-гексадекана гуминовыми веществами торфов различного генезиса и микроорганизмами нефтедеструкторами Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis X5 при их совместном присутствии и разработка химико-биологического сорбента на их основе.

Материалы и методы

Объектами исследования являлись гуминовые вещества торфов: тростникового низинного (ТНТ), черноольхового низинного (ЧНТ), сфагнового верхового (СВТ) и сфагнового переходного (СПТ) [8], выделенные по методике описанной ранее [9], [10].

Штаммы бактерий Rhodococcus erythropolis S67, Rhodococcus erythropolis X5 получены из лаборатории плазмид Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН (г. Пущино). Бактерии входят в состав биопрепарата "МикроБак", который используют для биоремедиации нефтезагрязненных территорий [3],[11].

Методом газовой хроматографии определяли связывающую способность ГВ и гексадекана на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором Кристалл 5000.2 (СКБ Хроматэк, Россия).

Растворы ГВ и ГМК готовили растворением точных навесок препаратов в 0,1 М NaOH с последующим разбавлением нитратом натрия. Нейтрального значения рН растворов добивались добавлением 0,05М НN0₃ или 0,05М NaOH с помощью рН-метра Анион 4154. Эксперимент проводили в жидкой минеральной среде Эванса [12] с добавлением различных концентраций ГВ (25-100мг/л) и гексадекана (в количестве 2-20% по объёму). Остаточное количество гексадекана определяли после 3 суток.

Регистрировали пики в области времени удерживания, соответствующие компонентам градуировочной смеси. По полученным хроматограммам рассчитывали концентрацию гексадекана с использованием градуировочной зависимости (зависимость площади пика от концентрации гексадекана).

Результаты и их обсуждение

На первом этапе работы определяли концентрацию ГВ способную связывать максимальное количество гексадекана. Для этого варьировали концентрацию ГВ от 25 до 100 мг/л и оставляли неизменной концентрацию гескадекана 2%об (рис. 1). Связывающую способность ГВ рассчитывали по формуле 1:

(1)

- начальная концентрация гексадекана в растворе,%

-оставшаяся концентрация гексадекана в растворе,%

Рис.1 Связывание гесадекана гуминовыми веществами

Результаты эксперимента выявили, что максимальную связывающую способность продемонстрировали ГВ (ТНТ) и ГВ (СВТ) 74 и 64% соответственно, причем наиболее оптимальной концентрацией ГВ для связывания гексадекана является концентрация 50 мг/л. ГВ (ЧНТ) имеют наименьшую связывающую способность по отношению к гексадекану во всем диапазоне анализируемых концентрации.

Как известно [5], [13], [14] ГВ представляют собой сложные агрегаты молекул, состоящие из ароматического ядра и гидрофобной периферической части. ИК-спектры ГВ торфов [15] доказывают развитость их периферической части представленной алифатическими фрагментами, так валентные колебания в алифатических CH₃ и CH₂ группах достаточно интенсивны и уменьшаются в ряду ГВ(СВТ)>ГВ(ТНТ)>ГВ(СПТ)>ГВ(ЧНТ) [16]. Инактивакция гексадекана гуминовыми веществами в растворе осуществляется посредством гидрофобных взаимодействий между развитой периферической частью гидрофобных фрагментов ГВ и молекулой н-алкана (гексадекана) (рис 2).

Рис.2 Взаимодействие гидрофобного фрагмента гуминовых веществ с гексадеканом.

Связывание растворенными гуминовыми веществами нефтяных углеводородов аналогично процессу выведения их из свободно растворенного состояния. Данный процесс может приводить к увеличению водной растворимости нефтяных углеводородов, уменьшению их биоаккумуляции и ускорению фотолиза [5].

Задачей следующего этапа работы было выявить максимальную связывающую способность легкой фракции нефти, на примере гексадекана, гуминовыми веществами и микроорганизмами при их совместном присутствии. Работа включала два этапа: на первом - определяли максимальное количество гексадекана от 2 до 20 %об. находящегося в растворе, которое смогут утилизировать микроорганизмы нефтедеструкторы (рис.3), на втором - связывающую способность ГВ при концентрации 50 мг/л по отношению к гексадекану, содержание которого в растворе коррелировали 2-20 %об (рис.4). Связывающую способность гуминовых веществ по отношению к гексадекану рассчитывали по формуле 1.

Рис.3 Доля утилизированного гексадекана микроорганизмами нефтедеструкорами.

Максимально количество (30-47%) микроорганизмы Rhodococcus erythropolis S67 и Х 5 способны утилизировать гексадекана при его содержании в растворе 2-5%об (рис. 3). С целью получения наиболее полной информации о способности данных микроорганизмов утилизировать гексадекан увеличили его содержание в растворе до 20% об. В литературе отсутствует информация о возможности утилизации гексадекана микроорганизмами Rh. erythropolis S67 и Х 5 при его содержании в растворе больше 5%об [4], [17]. Эксперимент показал, что тенденция разлагать гексадекан при повышенном его содержании в растворе микроорганизмами нефтедеструкторами сохраняется: доля связывания гексадекана Rh. erythropolis S67 и Х 5 также сходна (рис.3). Способность бактерий утилизировать гесадекан сокращается в 4 раз при содержании гексадекана в растворе 7% - 10%об. относительно 5%об. Увеличение количества гексадекана в растворе до 20%об. уменьшает его потребление микроорганизмами нефтедеструторами в 23 раз, по сравнению с 2%об. Такое сильное снижение обусловливалось стрессом микроорганизмов и утратой жизнеспособности клеток.

Из результатов эксперимента можно сделать вывод, что для более полной утилизации гексадекана микроорганизмами нефтедеструторами Rh. erythropolis S67 и Х 5, его содержание в растворе не должно превышать 5%об., что является остаточным количеством при загрязнении нефтепродуктами почвенных и водных сред.

Оценивали связывающую способность гуминовых веществ торфов Тульской области по отношению к гексадекану, содержание которого в растворе коррелировали от 2 до 20 %об (рис. 4). Остаточное количество гексадекана в растворе определяли газожидкостной хроматографией.

Рис.4 Связывающая способность гуминовых веществ торфов по отношению к гексадекану

Максимальная связывающая способность ГВ наблюдается при содержании в растворе гексадекана 2-5%об (рис.4) ГВ (ТНТ) и ГВ (СВТ) продемонстрировали максимальную связывающую способность 53% и 49% соответственно при содержании алкана в растворе 2% об. При увеличении содержания гексадекана в растворе до 5% об., связывающая способность гуминовых веществ уменьшается на 7-11%. Дальнейшее увеличение содержания гексадеканадо 7 - 15%об.в растворе приводит к уменьшению доли его связывания в 2 раза всеми анализируемыми ГВ. Минимальное связывание гексадекана отмечено гуминовыми веществами при его максимальном содержании 20% об. в 5 - 12 раз относительно 2%об.

Установлено что с ростом концентрации гексадекана в растворе связывающая способность, как микроорганизмов, так и ГВ уменьшается. Поэтому оптимальным содержанием гексадекана для дальнейшей работы является 2 и 5%.

Определение утилизирующей способности химико-биологического комплекса, состоящего из гуминовых веществ торфов Тульской области и микроорганизмов нефтедеструткоров Rh. erythropolis S67 и Х 5, входящих в запатентованный биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами МикроБак проводили в растворе. Для этого в пробирки вносили 10 мл среды Эванса гуминовые вещества в концентрации 50 мг/л, инокулят микроорганизмов количество посевной дозы 10⁵-10⁶ КОЕ/мл и гексадекан в количестве от 2 до 20% об., как представителя легкой фракции нефти (рис. 5).

Рис.5 Связывающая способность по отношению к различным концентрациям гексадекана а) микроорганизмов Rh. erythropolis S67 и гуминовых веществ б) микроорганизмов Rh. еrythropolis Х 5 и гуминовых веществ

Химико-биологический комплекс, состоящий из гуминовых веществ торфов и микроорганизмов нефтедеструткоров Rh. erythropolis S67 и Х 5, увеличивает утилизацию гексадекана во всем диапазоне его содержания в растворе 2-20% об. Доля связывания гексадекана при совместном присутствии гуминовых веществ и микроорганизмов в растворе в 1,1-1,8 раз выше, чем в присутствии только ГВ и в 1,1-2 раз микроорганизмов.

Максимальной связывающей способностью обладают ГВ тростникового торфа и микроорганизмов Rh. еrythropolis S67 в совместном присутствии. Доля связывания гексадекана достигает 95%при его содержании в растворе 2%об. Следует так же отметить увеличение в 1,5 раза связывающей способности микроорганизмов с ГВ(СВТ), чем в растворе, не содержащем ГВ. Связывающая способность ГВ (ЧНТ) и (СПТ) и микроорганизма Rh. erythropolis S67 по отношению к гексадекану увеличивается на 4-11%.

Совместное присутствие в растворе гуминовых веществ и микроорганизмов Rh.erythropolis Х 5 так же увеличивает связывающую способность по отношению к гексадекану. Максимальное связывание продемонстрировали ГВ (СВТ) и ГВ (СПТ) 90% и 74% соответственно при содержании гексадекана в растворе 2%об. При увеличении содержания алкана в системе до 20%об. связывающая способность химико-биологического сорбента уменьшается, но доля связывания гексадекана выше, чем в системах содержащих только ГВ или микроорганизмы.

Многие авторы [5], [6], [18], [19],[20] утверждают о важности последовательности внесения ГВ в систему, состоящую из токсиканта и микроорганизмов нефтедеструкторов. При добавлении ГВ в систему до внесения токсиканта положительный эффект выше, т.к. успевает сформироваться слой из молекул ГВ, образующий на поверхности клеток активный сетчатый фильтр, способный связывать токсиканты.

Рис.6 Сетчатый фильтр из молекул гуминовых веществ на поверхности клетки микроорганизмов

Гуминовые вещества способны вступать в гидрофобные взаимодействия с гексадеканом, микроорганизмы используют алкан как субстрат [17], и из-за разности строения, как гуминовых веществ, так и микроорганизмов нельзя однозначно описать процесс взаимодействия. Микроорганизмы Rh. erythropolis S67 и ГВ из тростникового торфа при совместном присутствии утилизируют максимальное количество гексадекана в растворе относительно других ГВ и микроорганизма Rh.erythropolis Х 5.

В предыдущих экспериментах, было определено оптимальное содержание гексадекана в системе (2 и 5%об.) для его максимальной утилизации гуминовыми веществами и микроорганизмами нефтедеструкторами. Решили сравнить, насколько увеличивается связывающая способность системы, содержащей ГВ и микроорганизмы относительно однокомпонентной системы, т.к. по результатам газохроматографического анализа данная система утилизирует наибольшее количество гексадекана в растворе (рис. 7)

Рис.7 Связывающая способность по отношению к различным концентрациям гексадекана микроорганизмов Rh. erythropolis S67 и гуминовых веществ тростникового торфа

Установлено, что при совместном присутствии ГВ и микроорганизмов доля связывания гексадекана увеличивается от 49% при содержании гексадекана 2%об. до 33% при содержании гексадекана 20%об., тогда как в присутствии только микроорганизмов утилизации гексадекана практически не наблюдается, а в присутствии только ГВ доля связывания составляет всего 11%. микроорганизм нефтедеструктор торф гексадекан

Утилизация нефтяных загрязнений химико-биологическим сорбентом может протекать следующим образом: молекулы ГВ захватывают своими гидрофобными участками тяжелые и легкие фракции нефти и связывают их в нетоксичные комплексы, причем тяжелые фракции нефти связывается с ароматическими фрагментами ГВ, а легкие - с периферической частью гидрофобных фрагментов-остатков углеводородных радикалов, добавление микроорганизмов нефтедеструкторов способно утилизировать не вступившие в реакцию с ГВ нефтепродукты, а также окислять доступные органические загрязнители на поверхности ГВ.

Таким образом, система на основе гуминовых веществ тростникового торфа и микроорганизмов Rhodococcus S67может быть перспективной для создания химико-биологического сорбента для утилизации легкой фракции нефти.

С целью выявления оптимальной концентрации гуминовых веществ тростникового торфа при создании химико-биологического сорбента для утилизации легкой фракции нефти в присутствии микроорганизма Rh. erythropolis S67 изучали связывающую способность системы в которой варьировали концентрацию ГВ от 25 до 200 мг/л при постоянном содержании гексадекана 2%об. (рис.8).

Рис.8 Связывающая способность микроорганизмов Rh. erythropolis S67 и ГВ (ТНТ) по отношению к гексадекану

Из рисунка видно, максимальная доля связывания гексадекана системой ГВ-микроорганизм, при концентрации гуминовых веществ 50 мг/л.

При данной концентрации наблюдается максимальный стимулирующий эффект на рост микроорганизмов рода Rhodococcus [21]. Образующийся при этом монослой из молекул гуминовых веществ торфов на поверхности клеток является оптимальным. Он, с одной стороны, не препятствуют проникновению субстрата (гексадекана) через ажурный фильтр, состоящий из молекул ГВ, а, с другой стороны, все же минимизирует прохождение избыточного количества гексадекана внутрь клетки. Кроме того, периферические части самих гуминовых веществ выступают в качестве источника питания для микроорганизмов [18].

Таким образом, в ходе экспериментов выявлено: что наиболее перспективными гуминовыми веществами для создания химико-биологического сорбента является гуминовые вещества тростникового торфа при 50 мг/л и микроорганизмы Rh. erythropolis S67. Данная система способна утилизировать до 95% гексадекана при его содержании в растворе 2%об. и до 35% при его содержании 20%об. в растворе.

Список литературы

1. Технология детксикации и рекультивации площадок нефтедобычи, выведенных из промышленного оборота/ Мадякин В.Ф. [и др.] // Вестник Казанского технологического университета. 2012. Т. 15. №. 24. С.118-121.

2. И.Б. Ившина, А.В. Криворучко, М.С. Куюкина Биоремедиация нарушенных углеводородами и тяжелыми металлами почв с использованием Rhodococcus-биосурфактантов и иммобилизованных родококков // Аграрный вестник урала Экология. 2012. №. 8, № 100. С. 65-68.

3. Бактерии-нефтедеструкторы рода Rhodococcus - потенциальные продуценты биосурфактантов / Т.М. Лыонг [и др.]// Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2016. №1. С. 50-60.

4. Нечаева И.А. Биодеградация углеводородов нефти психротрофными микроорганизмами-деструкторами дисс. канд. биол. наук. Пущино, 2009. 175с.

5. Гречищева Н.Ю. Разработка научных основ применнения гуминовых веществ для ликвидации последствий нетезагрязнения почвенных и водных сред дисс. канд. хим. наук. М., МГУ. 2016. 326с.

6. Салеем К.М. Использование гуминовых препаратов для детоксикации и биодеградации нефтяного загрязнения:автореф. дис.канд.хим.наук М., 2004. С.30

7. Изосимов А.А. Физико-химические свойства, биологическая активность и детоксицирующая способность гуминовых препаратов, отличающихся генезисом органического сырья:дисс.канд. биол. наук. М., МГУ. 2016. 148с.

8. Бойкова О.И., Волкова Е.М. Химические и биологические свойства торфов Тульской области // Известия ТулГУ Естественные науки. Вып. 3. 2013. C. 253-264

9. Детоксицирующая способность гуминовых веществ торфов различного происхождения по отношению к ионам тяжелых металлов / Акатова Е.В. [и др.] // Химия растительного сырья. 2016. №. 1.С. 119-127.

10. Дмитриева Е.Д. Биологическая активность гуминовых веществ сапропеля реки Упы Тульской области / Дмитриева Е.Д. [и др.] // Химия растительного сырья. 2016. №. 1. С. 137-144.

11. Патент 2378060 РФ. Биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения / A.E.Филонов [и др.] // Опубл.10.01.2009.Бюл.№1.

12. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.B. The continuous cultivation of microorganisms. 2. Construction of a chemostat // MethMicrobiol. 1970. V.2.P.277-327.

13. Природа биологического действия гуминовых веществ. Часть 1. Основные гипотезы / Демин В.В. [и др.] // Доклады по экологическому почвоведению, 2006, выпуск 1, N 1, С. 72-79.

14. Орлов Д.С., Садовникова Л.К.,Суханова Н.И. Химия почв: Учебник/ М.: Высш. Шк., 2005. - 558 с.

15. Перминова И.В. Анализ, классификация и прогноз свойств гумусовых кислот. Дисс. док.хим. наук, М., МГУ. 2000,359с.

16. Связывающая способность гуминовых веществ торфов и гиматомелановых кислот по отношению к полиароматическим углеводородам (на примере нафталина)/ Дмитриева Е.Д. [и др.] // Вестн. Том. гос. ун-та. Химия. 2017. № 7.С.8-23

17. Влияние физиологических особенностей бактерий рода Rhodococcus на деградацию н-гексадекана / Нечаева И.А. [и др.] // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2016. Вып. 1. 2016. С. 90-98.

18. Природ а биологического действия гуминовых веществ. Часть 2. Локализация биопротекторного действия гуминовых веществ в почвах/ Демин В.В. [и др.] // Доклады по экологическому почвоведению, 2006, выпуск 1, № 1, С. 80-91

19. О механизме антидотного действия гуматов по отношению к нефтепродуктам/ Дагуров А.В. [и др.] // Acta Biomedica Scientifica.2005. №6, С.143-146.

20. Дагуров А.В. Влияние гуматов на токсичность углеводородов нефти:автореф. дис.канд.биол.наук М., 2006. С.20

21. Каримова В.Т., Дмитриева Е.Д., Нечаева И.А. Влияние гуминовых веществ торфов Тульской области на рост микроорганизмов деструкторов нефти Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis X5// Известия ТулГУ. Естественные науки. 2017. №2. С.60-68

Размещено на Allbest.ru